EA007530B1

EA007530B1 - Противоопухолевые комбинации

Info

Publication number: EA007530B1
Application number: EA200301319A
Authority: EA
Inventors: Гари Дьюкарт; Джеймс Джозеф Мл. Гиббонс
Original assignee: Уайт
Priority date: 2001-06-01
Filing date: 2002-05-29
Publication date: 2006-10-27
Also published as: NZ529877A; AU2008202690A1; IL158800A0; HUP0400006A2; PL367267A1; CN100496485C; AU2002259309B2; CO5540294A2; SG153647A1; KR100875611B1; BR0210101A; KR20040025923A; NO20035317D0; JP2004532883A; MXPA03010907A; EP1392286A2; NO20035317L; WO2002098416A3; EA200301319A1; WO2002098416A2

Abstract

Настоящее изобретение предусматривает применение комбинации производного рапамицина и противоопухолевого алкилирующего агента для лечения новообразований, при этом новообразованием является саркома мягких тканей или рак ободочной кишки.

Description

Изобретение относится к применению комбинаций ингибитора тТОК (например, сложного рапамицинового 42-эфира с 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислотой (СС1-779)) и противоопухолевого алкилирующего агента для лечения новообразований; к применению ингибитора тТОК и противоопухолевого алкилирующего агента для получения лекарственного средства для лечения новообразований; к продукту, включающему ингибитор тТОК и противоопухолевый алкилирующий агент в качестве комбинированного средства для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении новообразования; а также к фармацевтической композиции, включающей ингибитор тТОК, противоопухолевый алкилирующий агент и фармацевтически приемлемый носитель.

Предпосылки изобретения

Рапамицин представляет собой макроциклический триеновый антибиотик, продуцируемый 81гсрЮтуес5 Йудго8сор1си8, который, как установлено, обладает противогрибковой активностью, в частности, против Саий1йа а1Ысаи8, как ίη νίίτο, так и ίη νΐνο [С. Уехша е! а1., ί. АпЦЬюЕ 28, 721 (1975); 8.Ν. 8ейда1 е! а1., 1. АпЦЬюЕ 28, 727 (1975); Н.А. Вакег е! а1., 1. ΑηίίΜοί. 31, 539 (1978); патент США 3929992 и патент США 3993749]. Кроме того, рапамицин, применяемый отдельно (патент США 4885171) либо в комбинации с пицибанилом (рю1Ьаш1) (патент США 4401653), проявляет противоопухолевую активность.

Иммуносупрессорное действие рапамицина описано в РА8ЕВ 3, 3411 (1989). Циклоспорин А и РК506, другие макроциклические молекулы, также оказались эффективными в качестве иммуносупрессорных агентов, которые могут быть использованы для предотвращения отторжения трансплантата [РА8ЕВ 3, 3411 (1989); РА8ЕВ 3, 5256 (1989); Κ.Υ. СаЫе е! а1., Раисе! 1183 (1978); и патент США 5100899]. К. Маг!е1 е! а1. [Саш 1. Р11У5Ю1. РИатта^. 55, 48 [(1977)] описывают эффективность рапамицина на экспериментальной модели аллергического энцефаломиелита, модели рассеянного склероза; модели адъювантного артрита, модели ревматоидного артрита; а также его эффективность по ингибированию образования 1дЕ-подобных антител.

Рапамицин может быть также использован для профилактики или лечения системной красной волчанки [патент США 5078999], воспаления легких [патент США 5080899], инсулинзависимого сахарного диабета [патент США 5321009], поражений кожи, таких как псориаз [патент США 5286730], поражений кишечника [патент США 5286731], пролиферации клеток гладкой мускулатуры и утолщения интимы вследствие повреждения сосудов [патенты США 5288711 и 5516781], лейкемии/лимфомы Т-клеток у взрослых [заявка на европейский патент 525960 А1], глазных воспалений [патент США 5387589], злокачественных карцином [патент США 5206018], панкардита [патент США 5496832] и анемии [патент США 5561138].

Сложный рапамициновый 42-эфир с 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислотой (СС1-779) представляет собой сложный эфир рапамицина, проявляющий существенное ингибирующее действие на рост опухолей на моделях как ίη νίίτο, так и ίη νΐνο. Получение и применение эфиров гидроксикислоты рапамицина, включая СС1-779, описаны в патенте США 5362718.

СС1-779 обладает цитостатическими свойствами, в противоположность цитотоксическим свойствам, и может отсрочить время развития или рецидива опухолей. Считается, что СС1-779 имеет механизм действия, подобный механизму действия сиролимуса (агеНтш). СС1-779 связывается с цитоплазматическим белком РКВР и образует с ним комплекс, ингибирующий фермент, тТОК (мишень рапамицина у млекопитающих, также известная как РКВР12-рапамицин ассоциированный белок [РКАР]). Ингибирование активности киназы тТОК ингибирует различные пути трансдукции сигнала, включая цитокинстимулированную пролиферацию клеток, трансляцию мРНК для нескольких ключевых белков, регулирующих фазу С1 клеточного цикла, и 1Ь-2-индуцированную транскрипцию, ведущую к ингибированию развития клеточного цикла от 01 до 8. Механизм действия СС1-779, приводящий к блоку фазы 01 8, является новым для противоракового лекарственного средства.

Было установлено, что ίη νίίτο СС1-779 ингибирует рост ряда гистологически различных опухолевых клеток. Наиболее чувствительными к СС1-779 заболеваниями являются рак центральной нервной системы (ЦНС), лейкоз (Т-клеток), рак молочной железы, рак предстательной железы и линии меланомы. Соединение останавливает развитие клеток в фазе 01 клеточного цикла.

Исследования голых мышей ίη νΐνο показали, что СС1-779 проявляет активность против опухолевых ксенотрансплантатов человека различных гистологических видов. Особенно чувствительными к СС1-779 оказались глиомы, поскольку соединение проявило активность на ортотопической модели глиомы у голых мышей. СС1-779 заметно подавляет (индуцируемую тромбоцитами) стимуляцию фактора роста клеточной линии глиобластомы человека ίη νίίτο. СС1-779 также ингибирует рост некоторых опухолей поджелудочной железы человека у голых мышей, равно как и одной из двух линий рака молочной железы, исследованных ίη νΐνο.

Описание изобретения

Данное изобретение предусматривает применение комбинаций производного рапамицина и противоопухолевого алкилирующего агента в противоопухолевой комбинаторной химиотерапии. В частности, такие комбинации могут быть использованы для лечения рака мягких тканей или рака ободочной кишки. Данное изобретение также охватывает комбинации производного рапамицина и противоопухолевого алкилирующего агента для использования в противоопухолевой комбинаторной химиотерапии, при этом

- 1 007530 используемое количество производного рапамицина или противоопухолевого алкилирующего агента, или обоих препаратов равно субтерапевтически эффективным дозам.

В соответствии с другим аспектом данное изобретение предусматривает применение комбинаций производного рапамицина и противоопухолевого алкилирующего агента для получения лекарственного средства для лечения новообразований. В соответствии с дальнейшим аспектом данное изобретение охватывает продукт, включающий производное рапамицина и противоопухолевый алкилирующий агент в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения для лечения новообразования у млекопитающего. В соответствии со следующим аспектом данное изобретение охватывает фармацевтическую композицию, включающую производное рапамицина и противоопухолевый алкилирующий агент и фармацевтически приемлемый носитель.

В соответствии с данным изобретением термин «лечение» означает лечение млекопитающего, имеющего опухолевое заболевание, путем введения указанному млекопитающему эффективного количества комбинации производного рапамицина и противоопухолевого алкилирующего агента с целью ингибирования роста опухоли у такого млекопитающего, ликвидации опухоли или достижения паллиативного эффекта у млекопитающего.

В соответствии с данным изобретением термин «введение» относительно введения комбинации означает либо введение непосредственной комбинации, либо введение пропрепарата, производного или аналога одного или обоих компонентов комбинации, обеспечивающее наличие эффективного количества комбинации в организме.

В соответствии с настоящим изобретением термин «рапамицин» означает класс иммуносупрессорных соединений, содержащих основное ядро рапамицина (показано ниже). Рапамицины в соответствии с данным изобретением включают соединения, которые могут быть химически или биологически модифицированы как производные ядра рапамицина, сохраняя при этом иммуносупрессорные свойства. Соответственно, термин «рапамицин» включает сложные эфиры, простые эфиры, оксимы, гидразоны и гидроксиламины рапамицина, а также рапамицины, в которых функциональные группы ядра рапамицина подверглись модификации, например, в результате восстановления или окисления. Термин «рапамицин» также включает фармацевтически приемлемые соли рапамицинов, способные образовывать такие соли благодаря наличию кислотного или основного остатка.

РАПАМИЦИН

Предпочтительно, чтобы сложные и простые эфиры рапамицина включали гидроксильные группы в положении 42 и/или 31 ядра

Вторичное козий антикроличий конъюгат (8ап1а СТи/ Са! антитело: Ι§Θ-ΗΚΡ Й8С-2004)

Способы:

A. Получение клеточных лизатов

Клеточные линии выращивают в оптимальной базальной среде, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой и пенициллином/трептомицином. С целью исследования фосфорилирования клетки пересевают в 6-луночные планшеты. После полного прикрепления клеток их выращивают на минимальном количестве сыворотки. Обработка ингибиторами шТОК продолжается от 2 до 16 ч. После обработки лекарственным средством клетки промывают один раз, РВ8 (забуференный фосфатом физиологический раствор (ЗФР) без Мд'' и Са⁺⁺), а затем лизируют в 150-200 мкл буфера для образца ΤΏ8 на лунку. Лизаты подвергают краткому воздействию ультразвука, а затем центрифугированию в течение 15 мин при 14000 об./мин. До использования лизаты хранят при температуре -80°С.

Процедура теста также может включать инкубирование клеток в среде для выращивания в течение ночи после их полного прикрепления. Результаты, получаемые при обоих наборах условий, должны быть одинаковыми для ингибитора тТОК.

B. Вестерн-блот анализ

1) Получают образцы, состоящие из одного белка, помещая 22,5 мкл лизата в одну пробирку, а затем добавляя 2,5 мкл восстанавливающего агента для образца ΝπΡΑΘΕ. Нагревают образцы до 70°С в течение 10 мин. Осуществляют электрофорез, используя гели ΝπΡΑΘΕ и буферы ΝπΡΑΘΕ 8Ώ8.

2) Переносят гель на нитроцеллюлозную мембрану с гибридизационным буфером ΝπΡΑΘΕ. Мем

- 2 007530 брану блокируют в течение часа блокирующим буфером (забуференный Тгь физиологический раствор с 0,1% Т\уееп и 0,5% обезжиренного молока). Промывают мембраны 2х буфером для промывания (забуференный Тгь физиологический раствор с 0,1% Т\уееп).

3) Блот/мембрану инкубируют с первичным антителом Р-р70 86К (Т389) (1:1000) в блокирующем буфере в течение ночи при температуре 4°С на вращающейся платформе.

4) Каждый блот промывают 3х в течение 10 мин в буфере для промывания и инкубируют со вторичным антителом (1:2000) в блокирующем буфере в течение 1 ч при комнатной температуре.

5) После связывания вторичного антитела каждый блот промывают 3х в течение 10 мин буфером для промывания и 2х в течение 1 мин забуференным Тгь физиологическим раствором с последующим хемилюминесцентным (ЕСБ) анализом и проявлением на пленках для хемилюминесценции.

РАПАМИЦИН

Предпочтительно, чтобы сложные и простые эфиры рапамицина включали гидроксильные группы в положении 42 и/или 31 ядра рапамицина, сложные и простые эфиры - гидроксильную группу в положении 27 (после химического восстановления кетона 27), а оксимы, гидразоны и гидроксиламины - кетон в положении 42 (после окисления гидроксильной группы 42) и кетон 27 ядра рапамицина.

Предпочтительные простые и сложные эфиры 42 и 31 описаны в следующих патентах, приводимых здесь в качестве ссылки: сложные алкиловые эфиры (патент США 4316885); сложные аминоалкиловые эфиры (патент США 4650803); сложные фторированные эфиры (патент США 5100883); сложные амидные эфиры (патент США 5118677); сложные эфиры карбамата (патент США 5118678); сложные силиловые эфиры (патент США 5120842); сложные аминоэфиры (патент США 5130307); ацетали (патент США 551413); сложные аминодиэфиры (патент США 5162333); сложные эфиры сульфоната и сульфата (патент США 5177203); сложные эфиры (патент США 5221670); сложные алкоксиэфиры (патент США 5233036); сложные эфиры О-арила, -алкила, -алкенила и алкинила (патент США 5258389); сложные эфиры карбоната (патент США 5260300); карбаматы арилкарбонила и алкоксикарбонила (патент США 5262423); карбаматы (патент США 5302584); сложные гидроксиэфиры (патент США 5362718); блокированные сложные эфиры (патент США 5385908); сложные гетероциклические эфиры (патент США 5385909); гемдизамещенные сложные эфиры (патент США 5385910); сложные эфиры аминоалкановой кислоты (патент США 5389639); сложные эфиры фосфорилкарбамата (патент США 5391730); сложные эфиры карбамата (патент США 5411967); сложные эфиры карбамата (патент США 5434260); сложные эфиры амидинокарбамата (патент США 5463048); сложные эфиры карбамата (патент США 5480988); сложные эфиры карбамата (патент США 5480989); сложные эфиры карбамата (патент США 5489680); блокированные сложные эфиры Ν-оксида (патент США 5491231); сложные эфиры биотина (патент США 5504091); сложные эфиры О-алкила (патент США 5665772) и сложные эфиры ПЭГ рапамицина (патент США 5780462). Получение данных сложных и простых эфиров описано в вышеуказанных патентах.

Предпочтительные сложные и простые 27-эфиры рапамицина описаны в патенте США 5256790, приведенном здесь в качестве ссылки. Получение данных сложных и простых эфиров описано в вышеуказанных патентах.

Предпочтительные оксимы, гидразоны и гидроксиламины рапамицина описаны в патентах США 5373014, 5378836, 5023264 и 5563145, приводимых здесь в качестве ссылки. Получение данных оксимов, гидразонов и гидроксиламинов описано в вышеуказанных патентах. Получение 42-оксорапамицина опи

- 3 007530 сано в патенте 5023263, приводимом здесь в качестве ссылки.

Особенно предпочтительные рапамицины включают рапамицин [патент США 3929992], СС1-779 [сложный 42-эфир рапамицина с 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислотой; патент США 5362718] и 42-О-(2-гидрокси)этилрапамицин [патент США 5665772].

При необходимости фармацевтически приемлемые соли рапамицина могут быть получены из органических и неорганических кислот, например, уксусная, пропионовая, молочная, лимонная, винная, янтарная, фумаровая, малеиновая, малоновая, миндальная, яблочная, фталевая, соляная, бромистоводородная, фосфорная, азотная, серная, метансульфоновая, нафталинсульфоновая, бензолсульфоновая, толуолсульфоновая, камфорсульфоновая кислота и подобные известные приемлемые кислоты в случае, когда рапамицин содержит подходящий основный остаток. Соли могут быть также получены из органических и неорганических оснований, таких как соли щелочных металлов (например, натрия, лития или калия), соли щелочно-земельных металлов, соли аммония, соли алкиламмония, содержащие 1-6 атомов углерода, или соли диалкиламмония, содержащие 1-6 атомов углерода в каждой алкилгруппе, а также соли триалкиламмония, содержащие 1-6 атомов углерода в каждой алкилгруппе в случае, если рапамицин содержит подходящий кислотный остаток.

Ингибитор тТОК, который может быть использован в противоопухолевых комбинациях в соответствии с данным изобретением, предпочтительно представляет собой рапамицин, более предпочтительно, ингибитор тТОК представляет собой рапамицин, СС1-779 или 42-О-(2-гидрокси)этилрапамицин.

Согласно приведенному описанию СС1-779 подвергали испытаниям в качестве характерного ингибитора тТОК в ингибиторе тТОК плюс антиметаболические комбинации в соответствии с данным изобретением.

Получение СС1-779 описано в патенте США 5362718, приводимом здесь в качестве ссылки. При использовании СС1-779 в качестве противоопухолевого средства предполагается, что первоначальная доза для внутривенной инъекции составляет приблизительно 0,1-100 мг/м² при ежедневной схеме введения (ежедневно в течение 5 дней, каждые 2-3 недели), и приблизительно 0,1-1000 мг/м² при введении один раз в неделю. Предпочтительными способами введения являются пероральный или внутривенный, при этом более предпочтительным является внутривенный путь.

В соответствии с данным изобретением термин «противоопухолевый алкилирующий агент» означает вещество, вступающее во взаимодействие (или реакцию алкилирования) со многими обогащенными электронами атомами в клетках с образованием ковалентных связей. Наиболее важными реакциями относительно их противоопухолевой активности являются реакции с основаниями ДНК. Некоторые алкилирующие агенты являются монофункциональными и взаимодействуют только с одной цепью ДНК. Другие являются бифункциональными и взаимодействуют с атомом на каждой из двух цепей ДНК, образуя «перекрестную связь», ковалентно соединяющую две цепи двойной спирали ДНК. Без репарации такое повреждение препятствует эффективной репликации клетки. Летальность монофункциональных алкилирующих агентов происходит в результате распознавания повреждения ДНК клеткой и ответа клетки на данное повреждение. (СоМп ОМ. АиШитот А1ку1айпд АдспК Ιη Сапсег ΡΓίηοίρΙοδ & Ртасйсе о£ Опсо1оду, 6^4Ь ЕбШоп, еб. ИеУйа УТ, Не11тап 8, КокепЬетд 8А. Ырршсой ЭДИИатз & ХУПкпъ. РЫ1абе1рЫа 2001, р.363).

Противоопухолевые алкилирующие агенты приблизительно разделены в соответствии с их структурой или реакционноспособным остатком, на несколько категорий, включающих азотистые иприты, такие как мустарген, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан и хлорамбуцил; азидины и эпоксиды, такие как тиотеф, митомицин С, диангидрогалактитол и дибромдульцитол; алкилсульфонаты, такие как бусульфан; нитрозомочевины, такие как бисхлорэтилнитрозомочевины (ВСИИ), циклогексилхлорэтилнитрозомочевина (ССИИ) и метилциклогексилхлорэтилнитрозомочевина (МеССИИ); производные гидразина и триазина, такие как прокарбазин, дакарбазин и темозоломид; а также соединения платины. Соединения платины представляют собой содержащие платину агенты, которые взаимодействуют предпочтительно в положении N7 остатков гуанина и аденина, образуя различные монофункциональные и бифункциональные аддукты. (1ойи8оп 8^, 81еуеп§оп 1Р, О'О\\уег РЕ СйркЮп апб Й8 Апа1одие§. 1п Сапсег Ρπποΐр1е§ & Ртасйсе о£ Опсо1оду, 6^4Ь Ебйюп, еб. ИеУйа УТ, Не11тап 8, КокепЬетд 8А. Ырршсой ^ййатк & ХУПкпъ. РЫ1абе1рЫа 2001, р. 378). Данные соединения включают цисплатин, карбоплатин, соединения платины 1У и многоядерные платиновые комплексы.

Ниже приведены характерные примеры противоопухолевых алкилирующих агентов в соответствии с данным изобретением.

Меклоретамин доступен коммерчески в виде инъекций (Ми8ТАКСЕИ).

Циклофосфамид доступен коммерчески в виде инъекций (циклофосфамид, лиофилизированный СУТОХАИ или ИЕО8АК), а также в виде таблеток для перорального приема (циклофосфамид или СУТОХАИ).

Ифосфамид доступен коммерчески в виде инъекций (ΙΕΕΧ).

Мелфалан доступен коммерчески в виде инъекций (АЬКЕВАИ), а также в виде таблеток для перорального приема (АЬКЕВАИ).

Хлорамбуцил доступен коммерчески в виде таблеток для перорального приема (ЪЕиКЕКАИ).

- 4 007530

Тиотеф доступен коммерчески в виде инъекций (тиотеф или ТНЮРЬЕХ).

Митомицин доступен коммерчески в виде инъекций (митомицин или МЦТЛМУСШ).

Бусульфан доступен коммерчески в виде инъекций (ΒϋδϋΕΕΕΧ), а также в виде таблеток для перорального приема (ΜΥΕΕΚΑΝ).

Ломустин (^Νϋ) доступен коммерчески в виде капсул для перорального приема (СЕЕМ.’).

Кармустин доступен коммерчески в виде внутричерепного имплантата (ΟΕΙΑΌΕΕ), а также в виде инъекций (В1СЫи).

Прокарбазин доступен коммерчески в виде капсул для перорального приема (ΜΑΤϋΕΑΝΕ). Темозоломид доступен коммерчески в виде капсул для перорального приема (ΤΕΜΟΌΑΚ). Цисплатин доступен коммерчески в виде инъекций (цисплатин, ΡΕΑΤΙΝΟΕ или ΡΕΑΤΙΝΟΕ-ΑΡ). Карбоплатин доступен коммерчески в виде инъекций (ΡΑΚΑ.ΡΕΑΤΙΝ).

Следующая таблица вкратце суммирует некоторые из рекомендуемых дозировок вышеперечисленных противоопухолевых алкилирующих агентов.

Таблица 1. Рекомендуемые дозировки противоопухолевых алкилирующих средств

Лекарственный Препарат	Дозировка	Схема введения
Мустарген	0,4 мг/кг	Каждый курс проводят в виде разовой дозы либо в виде разделенных доз, составляющих 0,1 - 0,2 мг/кг/день.
Циклофосфамид	40-50 мг/кг в/в 10-15 мг/кг в/в 3-5 мг/кг в/в 1-5 мг/кг перорально	В виде разделенных доз в течение 2-5 дней Каждые 7-10 дней Два раза в неделю Ежедневно
Ифосфамид	1,2 г /м² в/в	Ежедневно в течение 5 дней подряд; повторяют каждые 3 недели либо после устранения гематологической токсичности.

- 5 007530

Мелфалан	6 мг	Ежедневно в течение 2-3 недель с
	перорально	последующим перерывом 4	недели,
		затем поддерживающая доза	2 мг в
		день.
	10 мг	Ежедневно в течение 7-10	дней с
	перорально	последующей ежедневной
		поддерживающей дозой 2 мг	после
		восстановления количества	белых
		кровяных телец.
	0,15 мг/кг	Ежедневно в течение 7 ,	дней с
	перорально	последующим перерывом по	меньшей
		мере в 14 дней,	затем
		поддерживающая ежедневная	доза
		0,005 мг/кг.
	16 мг/м²	Разовое введение в течение 15-20
	в/в	минут каждые 2 недели 4	доз с
		последующим перерывом,	затем
		введение с 4-недельными
		интервалами для поддержания.
Хлорамбуцил	0,1-0,2	Ежедневно в течение 3-6 недель
	мг/кг
	перорально
Тиотеф	0,3-0,4	Каждые 1-4 недели
	мг/кг в/в
Митомицин	20 мг/м²	Каждые 6-8 недель
	в/в
Бусульфан	1,8 мг/м²	Ежедневно
	перорально
Ломустин	130 мг/м²	Каждые 6 недель
	перорально
Кармустин	150-200	Каждые 6 недель
	мг/м² в/в

- 6 007530

Прокарбазин	2-4 мг/кг перорально 1-2 мг/кг перорально	Ежедневно в течение первой недели, затем 4-6 мг/кг до получения максимального ответа Поддержание
Темозоломид	150 мг/м² перорально	Один раз в день в течение 5 дней на 28-дневной цикл лечения
Цисплатин	20 мг/м² в/в	Ежедневно в течение 5 дней на цикл
75-100 мг/м² в/в	Один раз на каждый 4-недельный цикл
Карбоплатин	360 мг/м² в/в	Один раз на каждый 4-недельный цикл

Предпочтительные комбинации в соответствии с данным изобретением тТОК ингибитора плюс противоопухолевый алкилирующий агент включают СС1-779 плюс цисплатин; СС1-779 плюс циклофосфамид; СС1-779 плюс карбоплатин; и СС1-779 плюс ИСХИ.

Противоопухолевую активность комбинаций тТОК ингибитора плюс противоопухолевый алкилирующий агент подтверждают, применяя СС1-799 в качестве характерного ингибитора тТОК в стандартных фармакологических методиках тестов ΐη νΐίτο и ίπ νΐνο, применяя комбинации СС1-779 плюс цисплатин; СС1-779 плюс циклофосфамид; и СС1-779 плюс 1)СМ.’ в качестве характерных комбинаций в соответствии с данным изобретением. Ниже вкратце описаны применяемая методика и полученные результаты.

Для комбинаторных исследований ίη νΐίτο с СС1-779 и алкилирующими агентами используют линии рабдомиосаркомы человека К1130 и КЬ1, а также линию глиобластомы человека 8Ι-0ΒΜ2. Для исследований ίη νΐνο используют линию нейробластомы человека (ΝΒ1643) и линию ободочной кишки человека 0С3.

Для каждого представляющего интерес лекарственного средства определяют кривые ответа на дозы. Клеточные линии К1130, КЫ и 81-02 помещают в шестилуночные агглютинационные планшеты в количестве 6х10³, 5х10³ и 2,5х10⁴ клеток/лунка, соответственно.

После 24-часового инкубирования лекарственные средства добавляют в 10%РВ8+КРМ1 1640 для К1130 и К111 или 15%ΡΒ8+ΌΜΕ для 81-02. После семидневного пребывания в содержащей лекарственное средство среде ядра высвобождают, обрабатывая клетки вначале гипотоническим раствором, а затем детергентом. После этого ядра подсчитывают с помощью счетчика ΟουίΙβΓ. Результаты экспериментов изображают в виде графика и для каждого лекарственного средства экстраполяцией определяют 1С₅₀ (концентрация лекарственного средства, обеспечивающая 50% ингибирование роста). Из-за того, что значения 1С₅₀ от эксперимента к эксперименту слегка варьируются, при исследовании взаимодействия используют две величины, заключающие в скобки 1С₅₀ каждого лекарственного средства. Точка максимального взаимодействия между двумя лекарственными средствами достигается при их наличии в соотношении 1:1 в том случае, если изобола имеет стандартную форму. Поэтому каждую из трех приблизительных концентраций 1С₅₀ СС1-779 смешивают в соотношении 1:1 с каждым из трех приблизительных 1С₅₀ цисплатина, В(.'ХВ и мелфанана. Таким образом, в каждом эксперименте получают по девять 1:1 комбинаций лекарственных средств плюс три концентрации для СС1-779 и другого лекарственного средства. Данный протокол обычно обеспечивает по меньшей мере одну комбинацию для каждого лекарственного средства, имеющего величину 1С₅₀. Затем используют 1:1 комбинацию концентраций 1С₅₀ для СС1-779 и каждого лекарственного средства для химиотерапии с целью определения аддитивности, синергизма или антагонизма, применяя формулу ВегепЬаит: х/Х₅₀+у/У₅₀, = 1,<1, > 1. В том случае, если три концентрации испытываемого отдельно СС1-779 не дают 1С, подходящий к любому из трех 1С другого испытываемого отдельно соединения, то проверке подвергают все 1:1 комбинации, чтобы удостовериться в том, попадают ли их значения 1С между нужными значениями 1С испытываемых отдельно лекарственных средств. В положительном случае эффект считают аддитивным.

Результаты проведения стандартной фармакологической процедуры ίη νΐίτο при испытании против опухолевой линии К1130 показывают, что комбинация СС1-779 плюс цисплатин является синергической; данная комбинация является более чем аддитивной, но не достигает уровня математического синергизма против опухолевой клеточной линии КЫ, а является аддитивной против опухолевой клеточной линии 81-02. Комбинация СС1-779 плюс ΒΓΝΕ является синергической против опухолевой клеточной линии

- 7 007530

81-02 и более чем аддитивной, но не достигает уровня математического синергизма против клеточной линии РЬ30 и аддитивности против клеточной линии РЬ1. Комбинация СС1-779 плюс мелфанан является аддитивной против каждой из клеточных линий.

Самок мышей СВА/Са1 (Таеккои ЬаЬога1опе8, Ваг НагЬог, МЕ) в возрасте 4 недель лишают иммунитета в результате тимоэктомии, а через 3 недели их тела полностью подвергают облучению (1200 сОу), применяя источник ¹³⁷Ск. В течение 6-8 ч облучения мышам вводят 3х10⁶ ядросодержащих клеток костного мозга. Части опухолей размером приблизительно 3 мм³ имплантируют в область дорсального бокового пространства мышей, инициируя рост опухолей. Перед началом лечения мышей с опухолями случайным образом делят на группы по семь особей. Когда опухоли достигают приблизительно 0,20-1 см в диаметре, каждая мышь получает лекарственное средство. Размеры опухолей определяют каждые 7 дней с помощью цифрового циркуля Уегшет, соединенного с компьютером. Объемы опухолей подсчитывают, предполагая, что они имеют сферическую форму, по формуле [(π/6) х 6³], где 6 означает средний диаметр. СС1-779 вводят по схеме в течение 5 дней подряд в течение 2 недель, повторяя данный цикл каждые 21 день 3 раза. Таким образом, СС1-779 вводят в дни 1-5, 8-12 (цикл 1); 21-25, 28-32 (цикл 2); и 4246, 49-53 (цикл 3). Схема введения другого химиотерапевтического лекарственного средства в каждом исследовании следующая:

циклофосфамид в 1-й и 8-й день каждые 21 день в течение 3 циклов.

Комбинация СС1-779 и циклофосфамида оценивают на примере рабдосаркомы человека (Р1118). применяя вышеописанную методику теста ксенотрансплантата мыши. При использовании данной методики теста активность СС1-779 с циклофосфамидом (44 мг/кг) является аддитивной. Комбинирование субоптимальных доз СС1-779 плюс циклофосфамид оказывает такое же действие, как и оптимальная доза циклофосфамида.

Исходя из результатов проведения вышеописанных фармакологических испытаний, комбинации ингибитора тТОВ плюс противоопухолевый алкилирующий агент могут быть использованы в противоопухолевой терапии. В частности, такие комбинации могут быть использованы для лечения карциномы почек, саркомы мягких тканей, рака молочной железы, нейроэндокринной опухоли легкого, рака шейки матки, рака матки, рака головы и шеи, глиомы, рака больших клеток легких, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, лимфомы, меланомы, рака малых клеток легких, рака яичников, рака ободочной кишки, рака пищевода, рака желудка, лейкоза, колоректального рака и первичного рака неизвестного происхождения. Поскольку указанные комбинации содержат по меньшей мере два активных противоопухолевых агента, применение таких комбинаций также обеспечивает применение комбинаций каждого из агентов, в которых один или оба агента применяют в субтерапевтически эффективных дозах, тем самым снижая токсичность каждого отдельного химиотерапевтического средства.

При осуществлении химиотерапии в качестве составных частей химиотерапевтического «коктейля» обычно используют разнообразные агенты, оказывающие различные виды действия. Предполагается, что комбинации в соответствии с данным изобретением будут использоваться как часть коктейля для химиотерапии, который может содержать один или более дополнительных противоопухолевых агентов в зависимости от природы подвергаемой лечению неоплазии. Например, данное изобретение также охватывает применение комбинации ингибитор шТОР/алкилирующий агент вместе с другими химиотерапевтическими агентами, такими как антиметаболиты (т.е. 5-фтороурацил, флоксурадин, тиогуанин, цитарабин, флударабин, 6-меркаптопурин, метотрексат, гемцитабин, капецитабин, пентостатин, триметрексат или кладрибин); гормональные агенты (т.е. эстрамустин, тамоксифен, торемифен, анастрозол или летрозол); антибиотики (т.е. пликамицин, блеомицин, митоксантон, идарубицин, дактиномицин, митомицин или даунорубицин); иммуномодуляторы (т.е. интерфероны, 1Ь-2 или ВСО); антимитотические агенты (т.е. винбластин, винкристин, тенипозид или винорелбин); ингибиторы топоизомеразы (т.е. топотекан, иринотекан, этопозид или доксорубицин); а также другие агенты (т.е. гидроксимочевина, трастузумаб, алтретамин, ретуксимаб, паклитаксел, доцетаксел, Ь-аспарагиназа или озогамицин гемтузумаба).

В соответствии с данным изобретением комбинация может быть введена одновременно или по частям, при этом во время курса химиотерапии ингибитор тТОВ вводят в другое время, чем алкилирующий агент. Такой промежуток между введением двух агентов может составлять несколько минут, часов, дней, недель или более. Поэтому термин «комбинация» не обязательно означает одновременное введение или введение в составе единой дозы, а означает введение каждого компонента на протяжении желательного периода лечения. Агенты также могут быть введены различными способами. Например, что касается комбинации «ингибитор тТОВ плюс алкилирующий агент», предполагается, что ингибитор тТОВ вводят пероральным или парентеральным способом, при этом предпочтительным является парентеральное введение, в то время как алкилирующий агент может быть введен парентеральным, пероральным или другими приемлемыми способами. Такие комбинации могут быть введены ежедневно, еженедельно или ежемесячно. Как характерно для химиотерапевтических схем, курс химиотерапии может быть повторен через несколько недель и может следовать за такой же временной схемой введения двух агентов или может быть модифицирован в зависимости от реакции пациента.

Как это обычно происходит при химиотерапии, схемы введения лекарственных средств тщательно контролируются лечащим врачом с учетом многих факторов, включая тяжесть заболевания, реакцию на

- 8 007530 заболевание, общую токсичность, связанную с лечением, возраст, здоровье пациента и другие сопутствующие нарушения или курсы лечения.

Исходя из результатов, обеспечиваемых применением комбинаций СС1-779 плюс алкилирующий агент, предполагается, что начальная доза для внутривенной инъекции ингибитора тТОК составляет приблизительно 0,1-100 мг/м², при этом предпочтительная доза составляет приблизительно 2,5-70 мг/м². Предпочтительным также является внутривенное введение ингибитора тТОК, обычно в течение 30 мин и приблизительно один раз в неделю. Первоначальные дозы такого компонента, как алкилирующий агент, зависят от применяемого компонента и вначале основаны на опыте работы врача с выбранными агентами. Через один или более циклов лечения дозы могут быть повышены или понижены в зависимости от получаемых результатов и наблюдаемых побочных эффектов.

Коммерчески доступные алкилирующие агенты могут иметь известные лекарственные формы, при этом дозы могут быть разделены в зависимости от необходимости. Альтернативно, такие агенты или алкилирующие агенты, недоступные коммерчески, могут быть получены в соответствии с обычной фармацевтической практикой. Составы для перорального введения, содержащие активные соединения в соответствии с данным изобретением, могут включать любые обычно используемые пероральные формы, включая таблетки, капсулы, трансбуккальные формы, пастилки, лепешки и жидкости, суспензии или растворы для перорального использования. Капсулы могут содержать смеси активного соединения (активных соединений) с инертными наполнителями и/или разбавителями, такими как фармацевтически приемлемые крахмалы (к примеру, кукурузный, картофельный крахмал или крахмал тапиока), сахара, искусственные подсластители, измельченные в порошок целлюлозы, такие как кристаллическая и микрокристаллическая целлюлозы, различные виды муки, желатины, смолы и т. д. Применимые составы таблеток могут быть получены путем обычного прессования, мокрого или сухого гранулирования и включать фармацевтически приемлемые разбавители, связующие агенты, смазывающие агенты, расщепляющие агенты, модификаторы поверхности (включая поверхностно-активные вещества), суспендирующие или стабилизирующие агенты, включая, но не ограничиваясь ими, стеарат магния, стеариновую кислоту, тальк, лаурилсульфат натрия, микрокристаллическую целлюлозу, кальций карбоксиметилцеллюлозы, поливинилпирролидон, желатин, альгиновую кислоту, смолу акации, ксантановую смолу, цитрат натрия, сложные силикаты, карбонат кальция, глицин, декстрин, сахарозу, сорбит, дифосфат кальция, сульфат кальция, лактозу, каолин, маннит, хлорид натрия, тальк, сухие крахмалы и порошковый сахар. Предпочтительные модификаторы поверхности включают неионные и анионные модифицирующие поверхность агенты. Характерные примеры модификаторов поверхности включают, но не ограничиваются ими, полоксамер 188, хлорид бензалкония, стеарат кальция, цетостериловый спирт, цетомакроголэмульгирующий воск, сложные эфиры сорбита, коллоидный диоксид кремния, фосфаты, додецилсульфат натрия, силикат магния алюминия и триэтаноламин. Составы для перорального введения могут включать известные пролонгированные или высвобождающие через определенное время составы с целью изменения абсорбции активного соединения (активных соединений). Составы для перорального использования также могут быть предназначены для введения активного ингредиента в воде или фруктовом соке, содержащем соответствующие необходимые солюбилизаторы или эмульгаторы.

В некоторых случаях может возникнуть необходимость введения соединений непосредственно в дыхательные пути в виде аэрозоля.

Соединения также могут быть введены парентеральным или интраперитонеальным способом. Растворы или суспензии таких активных соединений в виде свободного основания или фармакологически приемлемой соли могут быть получены в воде, соответствующим образом смешанной с поверхностноактивным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсии также могут быть получены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях в маслах. При обычных условиях хранения и использования данные препараты содержат консервант, предотвращающий рост микроорганизмов.

Фармацевтические формы, подходящие для инъекций, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для незапланированного получения стерильных растворов или дисперсий для инъекций. В любом случае форма должна быть стерильной и жидкой до такой степени, чтобы обеспечить ее легкое набирание в шприц. Она должна быть стойкой в условиях производства и хранения и должна быть ограждена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Носителем может служить растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль), их подходящие смеси и растительные масла.

В данном описании под трансдермальным введением подразумеваются все виды введения через поверхность организма и внутренние выстилки проходов тела, включая эпителиальные и слизистые ткани. Такое введение может быть осуществлено с применением данных соединений или их фармацевтически приемлемых солей в виде лосьонов, кремов, пены, накладок, суспензий, растворов и суппозиториев (ректальных и вагинальных).

Трансдермальное введение может быть осуществлено путем применения трансдермальной накладки, содержащей активное соединение и носитель, который инертен к активному соединению, нетоксичен для кожи и обеспечивает доставку агента для системного всасывания в ток крови через кожу. Носитель

- 9 007530 может иметь различные формы, такие как кремы и мази, пасты, гели и окклюзионные устройства. Кремы и мази могут представлять собой вязкие, жидкие или полутвердые эмульсии типа «масло-в-воде» или «вода-в-масле». Также подходят пасты из абсорбирующих порошков, диспергированных в вазелине или гидрофильном вазелине, содержащем активный ингредиент. Для высвобождения активного ингредиента в ток крови могут быть использованы различные окклюзионные устройства, такие как полупроницаемая мембрана, закрывающая емкость, содержащая активный ингредиент с носителем или без него, или матрица, содержащая активный ингредиент. Другие окклюзионные устройства описаны в литературе.

Составы для суппозиториев могут быть изготовлены из традиционных материалов, включая масло какао, с добавлением различных видов воска или без них с целью изменения температуры плавления суппозитория, а также глицерин. Могут быть также использованы водорастворимые основы для суппозиториев, такие как полиэтиленгликоли с различным молекулярным весом.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ лечения новообразования у нуждающегося в этом млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества комбинации, включающей производное рапамицина и противоопухолевый алкилирующий агент, при этом новообразованием является саркома мягких тканей или рак ободочной кишки.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что производным рапамицина является сложный 42-эфир рапамицина 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислоты (СС1-779).
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что противоопухолевый алкилирующий агент выбран из группы, состоящей из циклофосфамида, кармустина и цисплатина.
4. Способ лечения опухоли у нуждающегося в этом млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества комбинации, включающей производное рапамицина и противоопухолевый алкилирующий агент, при этом производное рапамицина, или алкилирующий агент или оба соединения вводят в субтерапевтически эффективных количествах.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что производным рапамицина является сложный 42-эфир рапамицина 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислоты (СС1-779).
6. Способ по пп.1, 3 или 4, отличающийся тем, что производным рапамицина является 42-0-(2гидрокси)этилрапамицин.
7. Применение производного рапамицина и противоопухолевого алкилирующего агента для получения лекарственного средства для лечения новообразования, при этом новообразованием является саркома мягких тканей или рак ободочной кишки.
8. Применение по п.7, отличающееся тем, что производным рапамицина является сложный 42-эфир рапамицина 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислоты (СС1-779).
9. Применение по п.7 или 8, отличающееся тем, что противоопухолевый алкилирующий агент выбран из группы, включающей циклофосфамид, кармустин и цисплатин.
10. Применение по любому из пп.7-9, отличающееся тем, что производное рапамицина, или алкилирующий агент или оба соединения вводят в субтерапевтически эффективном количестве.
11. Продукт, включающий производное рапамицина и противоопухолевый алкилирующий агент, выбранный из циклофосфамида и кармустина в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного использования для лечения новообразования у млекопитающего, при этом новообразованием является саркома мягких тканей или рак ободочной кишки.
12. Продукт по п.11, отличающийся тем, что производным рапамицина является сложный 42-эфир рапамицина 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислоты.