EA006579B1

EA006579B1 - Выявление индуцибельных генов в микроорганизмах

Info

Publication number: EA006579B1
Application number: EA200301036A
Authority: EA
Inventors: Франк Карльсен
Original assignee: Норчип А/С
Priority date: 2001-03-20
Filing date: 2002-03-20
Publication date: 2006-02-24
Also published as: AU2002246244A1; DK1404869T3; EP1404869A2; CY1109547T1; WO2002074991A2; PT1404869E; CN1514882A; ES2329343T3; ATE438738T1; GB0106949D0; EP1404869B1; CN100447252C; EA200301036A1; DE60233228D1; WO2002074991A3

Abstract

Способы выявления наличия микроорганизмов, в частности медленно растущих бактерий, таких как бактерии рода Mycobacterium, с помощью индукции экспрессии мРНК и регистрации индуцированной мРНК. Также представлены олигонуклеотидные праймеры и зонды для применения при выявлении Mycobacterium spp.

Description

Данное изобретение относится к способам выявления наличия микроорганизмов, в частности, медленно растущих бактерий рода МусоЬас!епит, путем индукции экспрессии мРНК и регистрации индуцированной мРНК.

Предпосылка изобретения

Несмотря на эффективную антимикробную терапию, во всем мире туберкулез остается основным источником заболеваемости и смертности и все шире распространяется во всем мире. Ранняя диагностика и немедленное начало лечения туберкулезного менингита улучшает исход заболевания, но выявление МусоЬас!епит !иЬегси1ок1к в спинномозговой жидкости (СМЖ) обычными способами остается сложной проблемой. Проблема диагностики микобактерии состоит в том, что небольшое количество организмов М. !иЬегси1ок1к и их медленный рост ограничивают выявление кислотоустойчивых штаммов и способы культивирования (Мо1ауй А. апб 1.С ЬеРтоск., Меб. Сйп. Ыойй. Ат. 69: 315-331, 1985).

Несколькими группами исследователей описаны РСК-анализы для чувствительного и специфичного выявления МусоЬас!етшт !иЬегси1ок1к в клинических образцах. Прямая идентификация микобатерий в клинических образцах с помощью РСК-амплификации специфичной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени обеспечивает возможность диагностики инфекции в день обращения. Способы РСК применяли на реальных клинических образцах, но они ограничены небольшим размером образцов, которые можно тестировать, и небольшим количеством организмов, присутствующих в клинических образцах, ложно-позитивными результатами вследствие загрязнения и присутствием ингибиторов РСК (Кох е! а1., 1. Сйп Мйсто 32: 672-678, 1994).

Прогностическая ценность выявления в значительной степени зависит от доли М. ШЬегсЫоСпозитивных образцов среди исследуемых клинических образцов. Согласно рекомендациям Сгокке! и Мои!оп РСК не следует использовать для рутинной диагностики туберкулеза до тех пор, пока методика не устоится и не появятся способы внутреннего и внешнего контроля качества (Сгокке! 1. апб Υ. Мои!оп., ТиЬегс1е Ьипд бйк. 76: 183-184, 1995). При совместном международном контрольном исследовании качества из 30 лабораторий только пять лабораторий безошибочно идентифицировали наличие или отсутствие микобактериальной ДНК во всех 20 образцах (Ыоотбйоек С. Т. 1. Сйп. М1стоЬю1о§у 34: 2522-2525, 1996). Это исследование также показало, что отсутствие специфичности было большей проблемой, чем отсутствие чувствительности. Пока способы выявления на основе амплификации не заменили традиционные способы диагностики (Рйеткйтош е! а1., 36: 3601-3604, 1998. 1. Сйп МютоЬю1о§у; смотри также Рйеткйтош е! а1. 35: 193-196, 1997. 1. Сйп. МюгоЬю1о§у).

МусоЬас!етшт рага!иЬегси1ок1к является хроническим кишечным патогеном, который может поражать много различных видов животных, включая приматов (СЫобйий е! а1., Согпе11 Уе!. 74: 218-262, 1984). Впервые организм идентифицировали 100 лет назад в качестве причины хронического воспаления кишечника у коров немецкой породы. Классификация болезни Джона, или паратуберкулеза животных, характеризуется наличием в пораженном кишечнике миллионов кислотоустойчивых микобактерий в бациллярной форме с макрофагами, но с небольшим дополнительным воспалительным клеточным инфильтратом. М. рага!иЬегси1ок1к редко культивируют в бациллярной форме из указанных животных. Указанный клинико-патологический спектр мультибациллярного-паусимикробного паратуберкулеза у животных напоминает критические состояния, представленные лепроматозной и туберкулоидной формами лепры у человека. Прогресс в нашем понимании М. !иЬетси1ок1к и вызываемого им заболевания на протяжении ряда лет в значительной степени задерживался иногда в результате огромных трудностей, связанных с идентификацией данного агента с помощью обычного культивирования в лаборатории (СЫобпй е! а1., Сйп. МйстоЬюк Кеу. 2: 90-117, 1989). В Великобритании может существовать высокий риск, особенно в часы пик, что остаточные М. !иЬетси1ок1к будут присутствовать в продаваемом в розницу пастеризованном коровьем молоке.

Таким образом, остается необходимость в чувствительных, специфичных способах выявления М1стоЬас!етшт крр., в частности М. !иЬетси1ок1к.

Сущность изобретения

Согласно первому аспекту изобретения представлен способ выявления наличия микроорганизма в тестируемом образце, который включает в себя воздействие на тестируемый образец индуктором, который способен индуцировать экспрессию по меньшей мере одного гена в микроорганизме, и тестирование в отношении наличия мРНК, транскрибированной с гена, который индуцирован в результате воздействия указанного индуктора.

В предпочтительном варианте микроорганизмом может быть медленно растущая бактерия. Предпочтительные медленно растущие бактерии включают, например, Вотгейае, Ребюсоссик, Мусор1акта и штаммы МусоЬас!епа.

Способ наиболее предпочтителен для выявления МусоЬас!епа 8рр., в частности МусоЬас!епит !иЬетси1ок1к, МусоЬас!етшт рага!иЬегси1ок1к (например, М. аушт киЬкр. рага!иЬегси1ок1к) и МусоЬас!епит Ьоуйк.

«Тестируемый образец», который предположительно содержит микроорганизм, главным образом, будет переставлять собой клинический образец, взятый у субъекта, которого необходимо тестировать в отношении присутствия микроорганизма.

- 1 006579

Тестирование в отношении наличия специфичных последовательностей мРНК предпочтительно будет осуществляться на препарате нуклеиновой кислоты, выделенной из тестируемого образца. Указанный препарат нуклеиновой кислоты должен содержать мРНК, однако он не обязательно является препаратом очищенной поли А⁺-мРНК, также подходящими в качестве исходного материала являются препараты суммарной РНК или даже препараты суммарных нуклеиновых кислот, содержащие как РНК, так и геномную ДНК, в зависимости от природы способа, используемого для тестирования наличия специфичной мРНК. По существу для того чтобы выделить нуклеиновую кислоту из тестируемого образца можно использовать любой способ, известный в данной области для выделения препарата нуклеиновой кислоты, содержащего мРНК.

Предпочтительным способом является способ выделения по Буму, описанный в патентах И8-А5234809 и ЕР-В-0389063. Указанный способ, который можно использовать для выделения препарата нуклеиновой кислоты, содержащего как РНК, так и ДНК, основан на свойствах частиц диоксида кремния связывать нуклеиновые кислоты в присутствии разобщающего агента тиоцианата гуанидина (Οιι8ί.'Ν).

В предпочтительном варианте стадия тестирования в отношении наличия мРНК, транскрибированной с гена, который индуцирован в результате воздействия индуктора, включает в себя осуществление реакции амплификации, чтобы амплифицировать всю или часть мРНК, и регистрацию специфичных продуктов реакции амплификации. Наиболее предпочтительно реакцией амплификации является обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция (КТ-РСК) или амплификация, основанная на последовательности нуклеиновой кислоты (ΝΑ8ΒΑ).

КТ-РСК хорошо известна в данной области для регистрации специфичных последовательностей мРНК. Протоколы выполнения КТ-РСК и регистрации специфичных продуктов реакций КТ-РСК можно найти в стандартных руководствах, например, таких как РСК Рто!осо1к: А Сшйе ίο МеШойк апй АррНсаПопк, Ейк Ιηηίδ с1 а1., Асайешю Ргекк, 8ап Ωίοβο. СА, 1990; РСК ίη Вюапа1у818: МеШойк ίη Мо1еси1аг Βίο1оду. Уо1. 92, 8. 1. 8теЙ2ег, Ей., Нитапа Ргекк, То!о^а, ΝΤ , 1998. NΑ8ΒΑ является относительно новым способом амплификации РНК (смотри Сотр1оп, №Шге. 350: 91-92 (1991) ) . NΑ8ΒΑ хорошо известна специалистам в данной области и описана, например, в И8-А-5409818. NΑ8ΒΑ является эффективным способом образования больших количеств последовательности РНК-мишени ш уйто, позволяющим регистрировать последовательности РНК-мишени, которые присутствуют в очень низких концентрациях в исходном тестируемом образце.

Способ NΑ8ΒΑ основан на применении наборов праймеров, подобных наборам, используемым для РСК, но один праймер модифицирован последовательностью промотора, например промотора Т7. Показано, что чувствительность и специфичность амплификации NΑ8ΒΑ является такой же, как в случае РСК, и лучше, чем в случае большинства протоколов КТ-РСК. Так как способ NΑ8ΒΑ является изотермальным анализом и зависит от РНКазы Н, он не может амплифицировать ДНК.

NΑ8ΒΑ предпочтительно осуществляют согласно следующему способу:

(а) составление реакционной смеси, содержащей пару праймеров NΑ8ΒΑ Р1 и NΑ8ΒΑ Р2, подходящих для применения при амплификации области мРНК-мишени микроорганизма с помощью NΑ8ΒΑ (смотри ниже), РНК-направленную ДНК-полимеразу, рибонуклеазу, которая гидролизует нить РНК гибрида РНК-ДНК, не гидролизуя однонитевые или двунитевые РНК или ДНК, РНК-полимеразу, которая узнает последовательность промотора, присутствующую в праймере NΑ8ΒΑ Р1, и рибонуклеозид- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты;

(й) инкубирование реакционной среды с препаратом нуклеиновой кислоты, выделенной из тестируемого образца, который предположительно содержит микроорганизм, в условиях реакции, которые обеспечивают реакцию амплификации NΑ8ΒΑ; и (с) выявление и/или количественное измерение какого-либо специфичного для микроорганизма продукта реакции амплификации NΑ8ΒΑ.

Выявление специфичного продукта(тов) реакции NΑ8ΒΑ (т.е. смысловых и/или антисмысловых копий РНК-мишени) можно осуществлять с помощью ряда различных способов. В одном из способов продукт(ты) NΑ8ΒΑ можно обнаружить с использованием специфичного для мишени зонда для гибридизации, способного к специфичному отжигу с продуктом NΑ8ΒΑ. Гибридизационный зонд может быть связан с регистрируемой меткой, например флуоресцентным, люминесцентным, радиоактивным или хемилюминесцентным соединением или ферментной меткой или меткой любого другого типа, известной специалистам в данной области. Определенная природа метки не имеет решающего значения, но она должна быть способной давать сигнал, регистрируемый внешними способами, либо посредством самой метки, либо вместе с одним или несколькими дополнительными веществами (например, субстратом для фермента).

Также в объем изобретения входит так называемая <^А8ВА в режиме реального времени», которая позволяет осуществлять непрерывный мониторинг образования продукта реакции NΑ8ΒΑ в ходе реакции. Этого можно достичь с использованием зонда с «молекулярными маячками», содержащего специфичную по отношению к мишени последовательность, способную к отжигу с продуктом NΑ8ΒΑ, олигонуклеотидную последовательность, образующую шпильку, и пару компонентов люминофор/гаситель, которые описаны в XVО 95/13399. Методика молекулярных маячков более полно описана ниже. Если

- 2 006579 зонд с молекулярными маячками добавляют к реакционной смеси до амплификации, то можно осуществлять мониторинг образования продукта ΝΑ8ΒΑ в режиме реального времени (смотри Ьеоие с1 а1., Νυс1е1с Αοΐύδ Кехеатсй, 1998, Уо1. 26, 2150-2155).

В следующем способе молекулярные маячки можно включить в один из олигонуклеотидных праймеров, используемых при амплификации ΝΑ8ΒΑ, как описано ниже, для того чтобы облегчить мониторинг реакции ΝΑ8ΒΑ в режиме реального времени, не нуждаясь в отдельном зонде для гибридизации.

В еще одном способе продукты реакции ΝΑ8ΒΑ можно контролировать с использованием общего меченого зонда для регистрации, который гибридизуется с нуклеотидной последовательностью на 5'конце праймера 2. Это эквивалентно системе регистрации «ШсйЗепх». поставляемой Отдаиои Текшка. В указанной системе специфичность в отношении продуктов ΝΑ8ΒΑ, полученных на основе мРНКмишени, можно придать благодаря использованию специфичных для последовательности иммобилизованных зондов, содержащих олигонуклеотидные зонды, которые приведены в данном описании, прикрепленные к твердому носителю, такому как магнитные микрошарики. Наиболее предпочтительно общий меченый зонд для регистрации является зондом для регистрации ЕСЬ™, поставляемый Отдаиои Текшка. Ампликоны ΝΑ8ΒΑ гибридизуют с НРУ-специфичными иммобилизованными зондами и общим ЕСЬзондом (посредством комплементарной последовательности в праймере 2). После гибридизации можно осуществить захват комплекса шарик/ампликон/ЕСЬ-зонд магнитным электродом автоматического считывающего устройства для ЕСЬ (например, считывающего устройства МюНЗеих¹™, поставляемого 0гдаиои Текшка). Затем импульс напряжения запускает реакцию ЕСЬ™.

«Индуцированным геном или геном(ами)» может быть любой ген(ны), который можно индуцировать внешним стимулом, например, таким как химический агент или изменение окружающей среды. Индукция экспрессии одного или нескольких генов с последующей специфичной регистрацией транскриптов по меньшей мере одного индуцированного гена обеспечивает дополнительный уровень амплификации и таким образом повышает чувствительность по сравнению со способами, которые основаны на регистрации экспрессии мРНК без стадии индукции.

«Индуктором» может быть по существу все, что угодно, что способно индуцировать экспрессию одного или нескольких генов в выбранном в качестве мишени виде микроорганизма. Индуктором может быть химическое вещество или стимул в окружающей среде, например, такой как воздействие света конкретной длины волны.

Исследуемый образец, который необходимо тестировать в отношении наличия микроорганизма, подвергают воздействию индуктора в течение периода времени, достаточного для получения требуемой индукции экспрессии гена. Точное необходимое время воздействия будет варьировать в зависимости от природы индуктора и гена-мишени, который необходимо индуцировать. Для любой данной комбинации индуктор/ген подходящее время воздействия можно определить эмпирически с помощью стандартного эксперимента. После воздействия индуктором нуклеиновую кислоту можно выделить из тестируемого образца, как описано выше.

В одном варианте изобретение относится к способу выявления микроорганизмов, который основан на индукции экспрессии гена, кодирующего фермент супероксиддисмутазу, посредством воздействия на тестируемый образец кислородом или пероксидом водорода, с последующим тестированием наличия транскриптов мРНК, соответствующих данному гену. Указанный способ предпочтителен для выявления микобактерий, наиболее предпочтительно М. 1иЬегси1ох1Х или М. рата!иЬегси1ох1х, но он может быть адаптирован для выявления любого микроорганизма, имеющего ген супероксиддисмутазы, в котором экспрессию данного гена индуцируют воздействием кислорода или пероксида водорода. У М. 1иЬегси1ох1Х ген, кодирующий супероксиддисмутазу, обозначают хобΑ (инвентарный номер в СеиРаик ΑΡ061030; 8ЕО ΙΌ N0: 57 и 58) . У М. аушт хиЬхр. рата1иЬегси1ох1Х ген, кодирующий супероксиддисмутазу, обозначают хоб (инвентарный номер в 6еηΒаик ΑΕ180816; 8Е0 ΙΌ N0: 59 и 60). Гомологи ЗобЛ/хоб у других видов микроорганизмов можно идентифицировать, используя способы, хорошо известные специалистам в данной области, например, путем поиска в общедоступных базах данных последовательностей и/или непосредственно путем скрининга геномной ДНК.

Стадию тестирования в отношении наличия транскриптов мРНК, соответствующих гену супероксиддисмутазы, можно проводить с помощью амплификации целой или части мРНК в КТ-РСК или ΝΑ8ΒΑ и регистрации специфичных в отношении супероксиддисмутазы продуктов амплификации.

Подходящие наборы праймеров для использования в амплификации мРНК хобΑ с помощью КТРСК или ΝΑ8ΒΑ приведены ниже. Указанные наборы праймеров можно использовать при выявлении всех видов МусоЬа1епит, но особенно они подходят для выявления М. ЩЬетси1ох1х и М. Ьоу1х.

Наборы праймеров для регистрации с помощью ΝΑ8ΒΑ:

праймер ΝΑ8ΒΑ Р1, содержащий 8Е0 ΙΌ Ν0: 20, и праймер ΝΑ8ΒΑ Р2, содержащий 8Е0 ΙΌ Ν0: 19;

праймер ΝΑ8ΒΑ Р1, содержащий 8Е0 ΙΌ Ν0: 26, и праймер ΝΑ8ΒΑ Р2, содержащий 8Е0 ΙΌ Ν0: 25;

праймер ΝΑ8ΒΑ Р1, содержащий 8Е0 ΙΌ Ν0: 32, и праймер ΝΑ8ΒΑ Р2, содержащий 8Е0 ΙΌ Ν0: 31;

- 3 006579 праймер ΝΆ8ΒΆ Р1, содержащий ЗЕО ГО N0: 38, и праймер ΝΆ8ΒΆ Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 37;

праймер ΝΆ8ΒΆ Р1, содержащий ЗЕО ГО N0: 61, и праймер ΝΆ8ΒΆ Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 62;

праймер ХАЗЕЛ Р1, содержащий ЗЕО ГО N0: 64, и праймер ХАЗЕЛ Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 65;

праймер NАЗΒА Р1 4-86 и праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 61, предпочтительно праймер 4-85;

праймер 4-92 и праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 64, предпочтительно праймер 4-91; праймер 4-104 и праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 19, предпочтительно праймер 4-103; праймер 4-122 и праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 31, предпочтительно праймер 4-115. Наборы праймеров для регистрации с помощью КТ-РСК:

праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 20, и праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 19;

праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 26, и праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 25;

праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 32, и праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 31;

праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 38, и праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 37;

праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 61, и праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 62; или праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 64, и праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 65.

В каждом случае «ЗЕО ГО N0:» относится к последовательностям, указанным в табл. 1, а «номера праймеров» - к праймерам, перечисленным в табл. 2.

Олигонуклеотидные зонды, подходящие для применения при регистрации продуктов реакций NАЗΒА и КТ-РСК, выполняемых с использованием указанных наборов специфичных праймеров, также относятся к данному изобретению, как обсуждается ниже.

В следующем варианте изобретение относится к способу выявления микроорганизмов, который основан на индукции экспрессии гена рпсА путем воздействия на тестируемый образец химическим индуктором, который может представлять собой изопропил-В-Э-тиогалактопиранозид или пиразинамид, с последующим тестированием наличия транскриптов мРНК, соответствующих гену рпсА. Указанный способ также предпочтителен для выявления видов МусоЬас1епа. Полная последовательность кДНК рпсА М. ШЬегсЫокХ имеется в 6епΒапк с инвентарным номером И59967 (смотри также ЗЕО ГО N0: 98 и 99). Гомологи рпсА у других видов микроорганизмов можно идентифицировать с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области.

И опять-таки стадию тестирования в отношении наличия транскриптов мРНК, соответствующих гену рпсА, можно проводить с помощью амплификации целой или части мРНК в КТ-РСК или NАЗΒА и регистрации рпсА-специфичных продуктов амплификации.

Подходящие наборы праймеров конкретно для использования при амплификации мРНК рпсА из МусоЬас1ег1иш 1иЬегси1ок1к с помощью КТ-РСК или NАЗΒА приведены ниже.

Наборы праймеров для регистрации с помощью NАЗΒА:

праймер NАЗΒА Р1, содержащий ЗЕО ГО N0: 2, и праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 1; праймер NАЗΒА Р1, содержащий ЗЕО ГО N0: 8, и праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 7; праймер NАЗΒА Р1, содержащий ЗЕО ГО N0: 14, и праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 13; праймер 4-2 и праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 1, предпочтительно праймер 4-1; праймер 4-8 и праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 7, предпочтительно праймер 4-7; или праймер 4-14 и праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 13, предпочтительно праймер 4-15. Наборы праймеров для регистрации с помощью КТ-РСК:

праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 2, и праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 1; праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 8, и праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 7; или праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 14, и праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 13.

Изобретение, кроме того, относится к специфичным по отношению к мишени праймерам и олигонуклеотидным зондам для применения при выявлении видов МусоЬас1епиш, в частности, для применения при выявлении видов МусоЬабепиш с помощью КТ-РСК или NАЗΒА.

В частности изобретение относится к олигонуклеотидным праймерам и зондам, содержащим последовательности, представленные ЗЕО ГО N0: 1-42, 61-69 и 74-97 в табл. 1:

- 4 006579

Таблица 1. Специфичные для МусоЬас1епиш последовательности для включения в праймеры и зонды


рлсА ΜΪ59967
....... — — ...... Тип праймера/ зонда	—¹ --- Последовательность	Номер последовательности (ЗЕО Ιϋ ΝΟ)	Нуклеотид
ΝΑ5ΒΑ Р2/РСВ	СААССбССббАСТАССАТСА	1	109
ΝΑ3ΒΑ Р1/РСВ	Х_г -СТССАТТССССАССТОТССА	2	254
ЗОНД	САТТесОТСАССССТАСТСС	3
МВ зонд ,	Χ,-ССССАТСАТТССЙТСАССаСТАСТССАТССйС-Хл	4
МВ зонд :	Х₂-<ЗССССАТСАТТСССТСАССеСТАСТССАТСС5СС-Х_э	5
МВ зонд	Х_г-СССССССАТТ6СОТСА(ЗССбТАСТСССеСССС-Х,	6
ΝΑ5ΒΑ Р2/РСВ	ассаассасттссасатсса	7	139
ΝΑ33Α Р1/РСВ	Х_х - Т АССС- АССАСАТСОАССТСА	б	378
зонд	аттссотсасссстастссс .	9	212
МВ зонд	Хг-СбТСвТАТТбССТСАССОСТАСТСССАССАСС-Хэ	10	212
МВ зонд .	Х₂-СбТСССАТТССЗТСАЙССвТАСТССССССАСС-Х_}	11	212
МВ зонд	Х_г-А0СССТАТТСССТСА6СеСТАСТСССАССССТ-Х₃	12	212
ΝΑ3ΒΑ Р2/?СК	ОТСАССАСТТСТСССССАСА .	13	164
ΝΑ5ΒΑ Р1/РСК	Х^бТСТАСЙСАОССТТСТАСАА	14	280
зонд	САСТАТТССТССТССТСССС	15	187
МВ зонд	Х,-СССАТССАСТАТТССТССТССТСССССАТ6СС-Х₃	16	167
МВ зонд	Х_г-ССАСССАСТАТТССТСбТССТСеССССТ<ЗС-Х₂	17	187
МВ зонд	Хг-ТССССОАСТАТТССТССТССТееСССССбА-Хэ	1Θ	187

- 5 006579

зос1А ДРО 61030
ΝΆ3ΒΑ Р2/РСВ	СТеТТТТСЦСССТССАТССА	19	95
ΝΑ3ΒΑ Р1/РСН	Х^САСТТбССаЗССАС&ЗСТАА	20	201
ЗОНД	АТТСССАСТАССАССТССбб	21	123
МВ зонд	Х_а-СССАТЕАТТСССАСТАССАСБТССЕ6САТБСС-Х,	22	123
МВ зонд	Х_г-ССТ6СЕАТТСССАСТАССАССТССБ6СССАСЕ-Х₃	23	123
МВ зонд	Х_;-БСССТАТТСССАСТАССАССТССБЕАБСЕС-Х₃	24	123
ΝΑ3ΒΑ Р2/РСП .	ЕОССТСЙАТССАСТССЕССА	25	103
ΝΑ3ΒΑ Р1/РСВ	Х^ССТСБЕСААСААЕААСТСбА	26	229
ЗОНД	ССССССТССА5САССТССТТ	27	171
ИВ зонд	Х^СЕСАТСССССССТССАЕСАССТССТТСАТ6СС-Х_а	28	171
МВ зонд	Хг-ССОТССеСССССТССАБСАССТССТТССАССЕ-Х,	29	171
МВ зонд	Х;-САС6СССССБСТССАССАССТССТТСССТС-Х₃	30	171
ΝΑ3ΒΑ Р2/РСК	СТССАССАССТССТТССТСА	31	176
ΝΑ5ΒΑ Р1/РСН	Хз-ССАСЗСТЕАТАССАССТСТА	32	347
зонд	АСТТСТТСТТЕСССАСССАС	33	232
МВ зонд	Х_г-С<ЗСАТ6АСТТСТТСТТССССАСССАССАТССС-Х_э	34	232
МВ зонд	Х₂-СССТССАСТТСТТСТТССССАСССАССеАСЕЕ-Х_э	35	232
МВ зонд	' Х_а- САСССАСТТСТТСТТЕСССАСССАСССБТС-Х,	36	232
ΝΑ3ΒΑ Р2/РСК	ССТССТТЕСТСААТТССТТА	37	184
ΝΑ5ΒΑ Р1/РСК	Х^ААБТСААСССТССТССАТСА	38	4 37
зонд '	ТТЕСССАСССДССССАТАБА	39	240
МВ зонд	Х₃-СССАТетТССССАСССАССССАТАСАСАТССС-Х₃	40	240
МВ зонд	Х_г-С6СТСТТССССАСССАССССАТАСАСА6СЙ~Х₃	41	240
МВ зонд	Х_г“СССАТТТаСССАССаАССССАТА5ААТССб-Х₃	42	240
ΝΑ5ΒΑ Р2/РСК	БССЙААТАСАССТТ6ССАЕА	61	545
ΝΑ5ΒΑ Р1/РСК	Хз-СбТйСТбСГТбСТбТббТСА	62	622
зонд	СААТТСАЕСЕСССССЕССАА	63	593
ΝΑ3ΒΑ Р2/РСВ	ДССТССАСТССеАСТАССЕА	64	564
ΝΑ3ΒΑ Р1/РСЯ	Х-.-ТСАТТСССССССТТ’ГАССТА	65	647
зонд '	ААТТСАЕСбССЕССЕССААС	66	594
МАЗ В А Р2/РСК	ТССАСТБЕОАСТАСЕЕДССА	67	567
ΝΑ5ΒΑ Р1/РСК	X, -СЕАЕТТТССССАССЕССТСА	6В	664

- 6 006579 зонд

ААйТТСССебСССААТТСАб

531

МуйоЬас^егхип каозав!!, ^ийегсиХовлг, ί>ονί5ζ атдшй, ±пЫасеИи1ахе_г1ерх-ае, п»Рп™ (* гсго^игасеиш, дохчЗолае, кПахоЫ,

а.51аЫсит) ζοά А

ΝΑ3ΒΆ Р2/РСК	ССйССААССААСАТСАСТСА	74	693
ΝΑ5ΒΑ Р1/РСК	X, -СССбАСАССТТСТТОСАССА	75	776
ЗОНД	СААТСТАССТТТСДАССТСС	76	733
ΝΑ5ΒΑ Р2/РСЯ	САА66ААСАТСАСТСАСС6А	77	697
ΝΑ3ΒΑ Р1/РСЯ	X!-6ТСАССАСССТТА6СССАСА	78	7Θ9
ЗОНД	АТСТАССТТТСААССТС5СС	79	735
ΝΑ5ΒΑ Р2/РСК	АбССАТСТТССТОААСбААА	80	712
ΝΑ3ΒΑ Р1/РСВ	Х₁-ТС6бСТТ0ТСАССАСС<ЗТТА	81	796
зонд	С6ССАСЙТСААТСАСАССАТ	82	755
МуавЬас&вххит рака£аЬ&хви1оз!б
ΝΑ5ΒΑ Р2/РСН	ттссаостстасйассасса	83	677
ΝΑ5ΒΑ Р1/РСН	Х^ТТСОААСТЗСССССЙСССТА	84	839
зонд	' ААС5СССАТТ?АС6ТСААССС	85	779
ΝΑ5ΗΑ Р2/РСК	СТСГАСеАСОАбСАСйССАА '	86	683
ΝΑ5ΒΑ Р1/РСВ	X, -СТССАССТССССССАСТТСА	87	813
зонд	ААСААССТСААСЕСССАТТА	88	770
ЫА8ВА Р2/РСК	ТАССАССАССАССССААСбТ	89	686
ΝΑ5ΒΑ Р1/РСК.	Х₁-САС6ТСС0СССА6ТТСАССА	90	810
зонд	стасаасаасстсаассссе	91	766
ΝΑ5ΒΑ Р2/РСВ	ТССАССТСССАСТСТСбТСА ,	' 92	988
ΝΑ3ΒΑ Р1/РСК	Х₁-АС<ЗАОАЛТССААС<3£3<5САСА	93	1072
ЗОНД	ААСАСССТСССАТС 6СССТА	94	1046
ΝΑ5ΒΑ Р2/РСВ	ССАСТСТССТСАТТТССАТА	95	996
ΝΑ5ΒΑ Р1/РСН	Х^-АСббСАССАСЙАСААТССАА	96	1080
ЗОНД	ССССССА6СТССАААТС0АА	97	1027

Пояснение:

Х₁ означает нуклеотидную последовательность, содержащую промотор. Олигонуклеотиды, приспособленные для применения в качестве праймеров ΝΆ8ΒΆ Р1, имеют общую структуру «Х|-8ЕО». где «Х₁» означает нуклеотидную последовательность, содержащую промотор, а «8Е0» означает специфичную по отношению к мишени последовательность (8Е0 ГО N0), которая приведена в прилагаемом списке последовательностей. Включение промоторной последовательности важно в случае праймеров ΝΆ8ΒΆ Р1, но не обязательно в случае праймеров РСК, которые обсуждаются ниже. В предпочтительном варианте Х₁ может являться последовательностью, содержащей промотор Т7, наиболее предпочтительно последовательностью ААТ ТСТ ААТ АСО АСТ САС ТАТ АОО ОАО ААОО.

х₂ и х₃ означают флуоресцирующий компонент и компонент-гаситель, способный в значительной степени или полностью гасить флуоресценцию от флуоресцирующего компонента в том случае, когда они оба удерживаются вместе близко друг к другу.

Нуклеотид указывает положение в соответствующей последовательности кДНК.

- 7 006579

Изобретение, кроме того, относится к олигонуклеотидам, перечисленным в табл. 2, при этом олигонуклеотиды, являющиеся праймерами ΝΑ8ΒΑ Р1, содержат конкретную промоторную последовательность, а праймеры ΝΑ8ΒΑ Р2 содержат последовательность для связывания общего зонда для регистрации (см. далее) для применения в случае выявления видов МусоЬас1ег1а с помощью ΝΆ8ΒΆ. Однако это не означает, что объем изобретения следует ограничивать указанными конкретными молекулами.

Таблица 2

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ	НОМЕР ПРАЙМЕРА	ЗЕО Ю N0
САТССААСЗТС0САТАТ0АССААССССС6САСТАССАТСА	4-1	43
ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССА6ААСССТС6АТТ<ЗСС6 АСЙТСТССА	4-2	44
5АТССААССТСЙСАТАТСА2АССАА65АСТТССАСАТС(ЗА	4-7	45

ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАЗЗСАСААЗСТАСССАССАСА ТССАССТСА	4-8	4 6
САТССААСбТСССАТАТСАССТСАССАСТТСТСССССАСА	4-13	47
ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССЗТЗТАСЗСАСС СТТЗТАСАА	4-14	48
САТССААССТСССАТАТСАСССССААТАСАССТТСССАСА	4-85	70
ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААС&СОТССТССТТС СТСТССТСА	4-86	71
САТССААССТСССАТАТСАСТССАСТСССАСТАСССАССА	4-97	72
ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССССАСТТТСССО АСССССТСА	4-98	7 3
САТССААССТСССАТАТСАССТСТТТТЗССССТССАТССА	4-103	49
ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААСССАСТТСССССС САССССТАА	4-104	50
САТССААССТСССАТАТСАСССССТССАТССАСТСССССА	4-109	51
ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААССССТССССААСА АЗААСТССА '	4-] 10	52
САТбСААССТСССАТАТЗАЗСТССАССАССТССТТССТСА	4-115	53
ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАСААЗЗССАСЗСТЗАТА ССАСЗТСТА	4-116	5 4
САТССААССТСЗСАТАТСАСССТССТТьСТСААТТССТТА	4-121	55
ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАСССАЗААЗСААЗТСААСССТ ОСТССАТЗА	4-122	56

- 8 006579

Олигонуклеотидные праймеры и зонды, представленные в изобретении, могут быть сгруппированы в несколько типов. К первому типу олигонуклеотидов относятся праймеры ΝΆ8ΒΆ Р1, которые являются олигонуклеотидами обычно длиной примерно 50 оснований, содержащими в среднем примерно 20 оснований на З'-конце, которые комплементарны области мРНК-мишени.

Олигонуклеотиды, подходящие для применения в качестве праймеров ΝΆ8ΒΆ Р1, обозначены в табл. 1 «ΝΆ8ΒΆ Р1/РСК». 5'-концы олигонуклеотидных праймеров Р1 (обозначенные в данном описании в общем виде как Х₁) содержат промоторную последовательность, которая узнается специфичной РНКполимеразой. Промоторы бактериофагов, например, промоторы Т7, ТЗ и 8Р6, являются предпочтительными для применения в олигонуклеотидах согласно изобретению, так как они обеспечивают преимущества транскрипции на высоком уровне, которая зависит только от связывания соответствующей РНКполимеразы. В предпочтительном варианте 5'-концевая последовательность олигонуклеотидных праймеров Р1 может содержать последовательность ААТТСТААТАССАСТСАСТАТАССС. Указанная последовательность содержит промотор Т7, включая сайт инициации транскрипции для РНК-полимеразы Т7. Специфичные для МусоЬасХетшт последовательности, обозначенные в табл. 1 как «ΝΛ8ΒΛ Р1/РСК» подходят для применения как в качестве праймеров NА§ΒА Р1, так и в качестве стандартных праймеров РСК.. В том случае, когда указанные последовательности используют в качестве основы праймеров NА§ΒА Р1, они имеют общую структуру Х^БЕр, где Х₁ означает последовательность, содержащую промотор, а БЕЦ означает специфичную по отношению к мишени последовательность. Последовательность промотора Х₁ необходима в праймере NА§ΒА Р1. Однако в том случае, когда те же самые последовательности используют в качестве основы стандартных праймеров РСК, не обязательно включать Х₁. Фразу «номер последовательности», которую используют в формуле изобретения, необходимо интерпретировать соответствующим образом.

Во избежание неясности, фразу «праймер NА§ΒА Р1, содержащий БЕЦ ГО N0: 1» необходимо интерпретировать как требование наличия последовательности X! с 5'-стороны специфичной по отношению к МусоЬасХетшт последовательности, указанной в списке как БЕЦ ГО N0: 1, тогда как фраза «праймер РСК содержащий БЕЦ ГО N0: 1» относится к любому подходящему праймеру РСК, содержащему специфичную по отношению к МусоЬасХетшт последовательность, при этом X! не является необходимым признаком праймера РСК.

Ко второму типу олигонуклеотидов, представленных в изобретении, относятся олигонуклеотиды праймера 2 NА§ΒА, которые обычно содержат последовательность примерно из 20 оснований, в значительной степени идентичную области мРНК-мишени. Олигонуклеотидные последовательности, обозначенные в табл. 1 как <^А8ВА Р2/РСК», подходят для применения как в качестве праймеров NА§ΒА Р1, так и в качестве стандартных праймеров РСК. Олигонуклеотиды, предназначенные для применения в качестве праймеров NА§ΒА Р2, могут в конкретном, но не ограничивающем варианте, кроме того, содержать последовательность нуклеотидов на 5' -конце, которая не родственна мРНК-мишени, но которая способна гибридизоваться с общим зондом для регистрации. Зонд для регистрации предпочтительно будет меченым, например, флуоресцентной, люминесцентной или ферментной меткой. В одном варианте зонд для регистрации метят меткой, которая позволяет проводить регистрацию с использованием методики ЕСЬ™, хотя будет понятно, что изобретение никоим образом не ограничено указанным конкретным способом регистрации. В предпочтительном варианте 5'-конец олигонуклеотидных праймеров 2 может содержать последовательность САТССААССТСССАТАТСАС. Указанная последовательность способна гибридизоваться с общим зондом ЕСЬ™, коммерчески доступным из Огдапоп Текпка, имеющим следующую структуру: Ки(Ьру)₃ ²⁺ -САТ ОСА АСС ТСС САТ АТС АС-3'.

В другом варианте получение олигонуклеотидного праймера 2 может включать в себя технологию «молекулярных маячков», которая известна в данной области и описана, например, в \УО 95/13399 Туащ апб Кгатег, №11иге ВюХесйпо1оду, 14: 303-308, 1996, чтобы обеспечить мониторинг реакции NА§ΒА в режиме реального времени.

К третьему типу олигонуклеотидных молекул, представленных в изобретении, относятся специфичные по отношению к мишени олигонуклеотидные зонды (обозначенные «зонд» в таблице 1). Олигонуклеотидные зонды, как правило, содержат последовательность примерно из 20-25 оснований, в значительной степени идентичную области мРНК-мишени. Олигонуклеотидные зонды можно использовать в качестве специфичных для мишени гибридизационных зондов для регистрации продуктов реакции NА§ΒА или РСК. В этой связи олигонуклеотидные зонды могут быть связаны с твердым носителем, таким как парамагнитные шарики, чтобы получить иммобилизованный зонд (смотри ниже). В предпочтительном варианте 5'-конец олигонуклеотидного зонда можно метить биотином. Добавление биотиновой метки облегчает связывание зонда с твердым носителем с помощью связи биотин/стрептавидин или биотин/авидин.

К четвертому типу олигонуклеотидных молекул, представленных в изобретении (обозначенных «МВ-зонд» в табл. 1), относятся специфичные для мишени зонды, полученные на основе технологии включения «молекулярных маячков», которая известна в данной области и описана, например Туащ апб Кгатег, №1Шге ВюХесйпо1оду, 14: 303-308, 1996 и в \УО 95/13399. Применение технологии молекулярных

- 9 006579 маячков позволяет проводить мониторинг в режиме реального времени реакций амплификации, таких как реакции ΝΛ8ΒΛ или КТ-РСК.

Зонды с молекулярными маячками обычно содержат кроме специфичной для мишени последовательности дополнительные основания, которые позволяют формировать структуру петли в виде шпильки, флуоресцирующий компонент и компонент-гаситель, при этом флуоресцирующий компонент и компонент-гаситель обозначены в данном описании Х₂ и Х₃. Как будет понятно специалисту флуоресцирующий компонент и компонент-гаситель выбирают так, чтобы компонент-гаситель был способен в значительной степени или полностью гасить флуоресценцию от флуоресцирующего компонента в том случае, если оба компонента находятся в непосредственной близости, например, когда зонд находится в «замкнутой» конформации в виде шпильки в отсутствии последовательности-мишени. Зонды с молекулярными маячками, показанные в табл. 1, содержат комплементарные фланкирующие последовательности на 5'- и З'-концах, фланкирующие последовательности, специфичные для микобактерий, которые способны гибридизоваться с образованием дуплекса в виде ствола. Точная нуклеотидная последовательность указанных фланкирующих последовательностей не является предметом изобретения за исключением требования, что они должны обладать способностью образовывать дуплекс в виде ствола в том случае, когда зонд не связан с последовательностью-мишенью НРУ. Таким образом, специалисту будет понятно, что указанные последовательности в большой степени могут варьировать, не оказывая влияния на функцию зондов с молекулярными маячками. Любую из последовательностей, обозначенных «зонд» в таблице 1, можно использовать в качестве основы зонда с молекулярными маячками, добавляя подходящие комплементарные фланкирующие последовательности и гасящий и флуоресцирующий компоненты.

В данной области известно большое количество примеров подходящих пар гаситель/флуоресцирующий компонент, которые можно использовать в зондах с молекулярными маячками (смотри \νϋ 95/13399, Туащ апб Кгатег, там же). Можно использовать широкий круг флуорофоров разных цветов, включая, например, 5-(2'-аминоэтил)аминонафталин-1-сульфоновую кислоту (ΕΌΆΝ8), флуоресцеин, ТАМ и техасский красный (смотри Туащ. ВгаШ апб Кгатег, 1998, №1Шге Вю1есйпо1о§у, 16, 49-53). Применение зондов, меченых флуорофорами разных цветов, дает возможность для «множественной» регистрации двух или более различных зондов в одном реакционном сосуде. Предпочтительным гасителем является 4-(4'-диметиламинофенилазо)бензойная кислота (ПАВСУЬ), нефлуоресцентный хромофор, который служит в качестве «универсального» гасителя для широкого круга флуорофоров. Флуоресцирующий и гасящий компоненты могут быть ковалентно связаны с зондом в любой ориентации, либо с флуоресцирующим агентом на 5'-конце или вблизи 5'-конца и гасителем на З'-конце или вблизи 3'конца, либо наоборот. Протоколы синтеза зондов с молекулярными маячками известны в данной области. Подробный протокол синтеза представлен в работе, озаглавленной «Мо1еси1аг Веасопк: НуЬпб|/абоп РгоЬек £ог Ое1есбоп о£ №.1с1ею Ас1бк ίη Нотодепоик 8о1и1юпк» 8ап)ау Туад е1 а1., Эераг1теп1 о£ Мо1еси1аг Сепебск, РиЬйс Неа1111 Кекеагсй 1пкШи1е, 455 Είτκΐ Ауепие, Νο\ν Уогк, ΝΥ 10016, И8А, которая находится в оперативном доступе на веб-сайте РНК1 (\\л\л\\р11п.пуи.еби или \\л\л\\то1еси1агЬеасоп5.огд.).

Подходящие комбинации олигонуклеотидных молекул праймера 1 и праймера 2 можно использовать для регистрации мРНК-мишени с помощью NА8ΒА. Для того чтобы направлять реакцию амплификации NА8ΒА олигонуклеотиды праймера 1 и праймера 2 должны быть способными праймировать синтез двунитевой ДНК с области мРНК-мишени. Чтобы это происходило олигонуклеотидные праймеры 1 и праймера 2 должны содержать специфичные для мишени последовательности, которые комплементарны областям смысловой и антисмысловой нити мРНК-мишени, соответственно.

В первой фазе цикла амплификации NА8ΒА, так называемой «нециклической» фазе, олигонуклеотидный праймер 1 отжигается с комплементарной последовательностью в мРНК-мишени и его 3'-конец удлиняется в результате действия РНК-зависимой ДНК-полимеразы (например, обратной транскриптазы) при этом происходит синтез первой нити кДНК. Затем РНК-нить полученного в результате гибрида РНК:ДНК расщепляют, например, за счет действия РНКазы Н, чтобы оставить однонитевую ДНК. Олигонуклеотидный праймер 2 отжигается с последовательностью, комплементарной по отношению к 3'концу полученной однонитевой ДНК, и его 3'-конец удлиняется (за счет действия обратной транскриптазы) с образованием двунитевой ДНК. После этого РНК-полимераза способна транскрибировать множественные копии РНК с новой транскрипционно активной промоторной последовательности в двунитевой ДНК. Полученный РНК-транскрипт, который является антисмысловым по отношению к исходной мРНК-мишени, может действовать в качестве матрицы для следующего раунда реакций NА8ΒА с праймером 2, который отжигается с РНК и праймирует синтез первой нити кДНК, и праймером 1, который праймирует синтез второй нити кДНК. Общие принципы реакции NА8ΒА хорошо известны в данной области (смотри СотрФп, ί. №1иге, 350: 91-92).

Специфичные по отношению к мишени олигонуклеотидные зонды, приведенные в данном описании, также можно связать с твердым носителем, таким как магнитные микрошарики, и использовать в качестве «иммобилизованных зондов», чтобы иммобилизовать продукт реакции амплификации NА8ΒА (однонитевую РНК).

Специфичные по отношению к мишени зонды с «молекулярными маячками», приведенные в данном описании, можно использовать для мониторинга реакции NА8ΒА в режиме реального времени.

- 10 006579

Кроме того, изобретение будет понятно при обращении к следующим экспериментальным примерам со ссылками на сопровождающие фигуры, где на фиг. 1 показана временная кривая амплификации мРНК 5обЛ М. 1иЬегси1о8Щ и М. όονίδ с использованием амплификации ΝΆ8ΒΆ в режиме реального времени с применением зондов с молекулярными маячками. X - ось флуоресценции (относительные единицы), у - ось времени (секунды).

Пример 1. Индукция экспрессии бактериального гена.

1) Обработка кислородом.

Образец, содержащий медленно растущие микобактерии, инокулируют в жидкую среду. Бактерии подвергают воздействию газообразного кислорода (барботирование) в течение 10 и 60 мин.

Образцы.

Из-за варьирующего количества собранных бактерий образцы разводят в жидкой среде, используемой для культивирования, перед тем как их переносят в лизирующий буфер. Разведения - 1:1 и 1:100.

2) Инокуляция в ростовые среды.

Бактериальный образец помещают в среду, оптимальную для роста рассматриваемой бактерии, на ночь при 37°С. Даже если бактерии не размножаются в значительной степени, этого будет достаточно для индукции генов для начала реакции амплификации ΝΆ8ΒΆ.

Лизис бактерий.

Лизирующий буфер (0,9 мл с низким значением рН) хранят при 2-8°С. Перед использованием буфер должен быть нагрет до 37°С в течение 30 мин, так чтобы растворились все кристаллы.

100 мл бактериальной культуры добавляют к 0,9 мл буфера. Тщательно перемешивают. Лизирующий буфер с бактериями инкубируют при 37°С в течение 10 мин.

Лизированные бактерии хранят при -70°С или сразу же экстрагируют нуклеиновые кислоты.

3) Экстракция ДНК/РНК из образца индуцированных бактерий.

Следующую процедуру выполняли согласно руководству ШсГОещ™. Огдапоп Текшка:

- к каждому образцу добавляют 50 мкл частиц диоксида кремния и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Содержимое пробирок перемешивают каждые 2 мин.

Весь материал переносят из образца в картридж, используемый в экстракторе №с118еп8™.

Следуют руководству для способа: «Экстракция 1 мл плазмы».

Тестирование праймеров для регистрации супероксиддисмутазы видов МусоЬасЮпиш.

X гранулы реагентов

X 80 мкл растворителя тщательно перемешивают, затем добавляют мкл воды ΝΆ8ΒΆ мкл КС1 (Все реагенты из системы №с118еп8™, поставляемой Огдапоп Текшка).

Распределяют в 8 пробирок по 27,5 мкл в каждую пробирку. Праймеры добавляют следующим образом. (Номера праймеров соответствуют праймерам, перечисленным в табл. 2).

№ пробирки Праймеры

1,25 мкл 4-85 (8ЕО ГО N0:70)

1,25 мкл 4-86 (81Т) ГО N0:71)

1,25 мкл 4-85 (8ЕО ГО N0:70)

1,25 мкл 4-98 (8Е0 ГО N0:73)

1,25 мкл 4-97 (8Е0 ГО N0:72)

1,25 мкл 4-86 (81Т) ГО N0:71)

1,25 мкл 4-97 (81Т) ГО N0:72)

1,25 мкл 4-98 (81Т) ГО N0:73)

1,25 мкл 4-115 (81Т) ГО N0:53)

1,25 мкл 4-116 (81Т) ГО N0:54)

1,25 мкл 4-115 (81Т) ГО N0:53)

1,25 мкл 4-122 (81Т) ГО N0:56)

1,25 мкл 4-121 (81Т) ГО N0:55)

1,25 мкл 4-116 (81Т) ГО N0:54)

1,25 мкл 4-121 (81Т) ГО N0:55)

1,25 мкл 4-122 (81Т) ГО N0:56)

Образцы: М. 1иЬегси1о8щ и М. Ьоущ.

Амплификацию выполняли при 41°С в течение 2,5 ч. Продукты регистрировали на биоанализаторе АдПепк

Результаты: Праймеры выявляли как М. 1иЬегси1о818, так и М. Ьоущ, как и ожидалось на основании их последовательности.

Пример 3. Амплификация МусоЬас1етшт 1иЬегси1о8Щ из образца пациента.

Образцы.

1) Штамм бактерии АТТС, выращенный в культуре (контроль).

- 11 006579

2) Образец от пациента. Основная смесь:

гранулы реагентов

X 80 мкл растворителя гранул реагентов Перемешивают в одной пробирке, добавляют мкл воды ΝΆ8ΒΆ мкл праймера 1 (4-122; 8ЕО ΙΌ N0: 56) мкл праймера 2 (4-115; 8ЕО ΙΌ N0: 53) мкл молекулярных маячков (4-125; 8ЕР ΙΌ N0: 41) мкл КС1

Прогон образцов:

	№ образца
в	1а
с	2а
г	1Ь
с	2Ь

Результаты, увеличение сигнала

	1
В	2,38
С	1,72
г	2,17
с	2,25

Пример 4. Амплификация ΝΑ8ΒΑ с молекулярными маячками МусоЬаскепиш 1иЬегси1о§18. 2 X гранулы реагентов

X 80 мкл растворителя

1) добавляют к 11,5 мкл воды мкл праймера 4-115 (8ЕР ΙΌ N0: 53) мкл праймера 4-122 (8ЕР ΙΌ N0: 56) мкл КС1

2) и также добавляют к

11,5 мкл воды мкл праймера 4-121 (8ЕР ΙΌ N0: 55) мкл праймера 4-116 (8ЕР ΙΌ N0: 54) мкл КС1

Две смеси праймеров разделяют в 4 пробирки (всего 8), по 29,5 мкл в каждую пробирку. Добавляют молекулярные маячки; по 0,63 мкл в каждую пробирку:

la) 4-118 (8Ер ΙΌ N0:34) lb) 4-119 (8Ер ΙΌ N0:35) lc) 4-124 (8Ер ΙΌ N0:40)

и) 4-125 (8Ер ΙΌ N0:41)

2а) 4-118 (8Ер ΙΌ N0:34)

2Ь) 4-119 (8Ер ΙΌ N0:35)

2с) 4-124 (8Ер ΙΌ N0:40)

2й) 4-125 (8Ер ΙΌ N0:41)

X фермент разбавляют в 2 X 55 мкл разбавителя.

Реагенты из ^с118еп§, 0гдапоп Текшка.

Образцы.

Образец 2 и 24 являются М. 1иЬегси1о§18.

Образец 7 является М. Ьоу18._____________________________________________

	1	2	3
А	1а	2	1с	24	2Ь	7
В	1а	7	13	2	2Ь	24
С	1а	24	13	7	2с	2
ϋ	1Ь	2	13	24	2с	7
Е	1Ь	7	2а	2	2с	24
Г	1Ь	24	2а	7	23	2
С	1с	2	2а	24	23	7
^н	1с	7	2Ь	2	23	24

- 12 006579

Амплификацию и регистрацию в считывающем устройстве проводят при 41°С при положении таймера 2,5.

Результаты, кратность увеличения сигнала.

Увеличение в 1,5 раза считается позитивным.______________________________________

	1	2	3
А	1а	1,94	1с	2,46	2Ь	1,62
В	1а	1,97	1ά	2,70	2Ь	1, 64
С	1а	1,92	1ά	2,46	2с	2,63
О	1Ь	1,63	1ά	2,53	2с	2,67
Е	1Ь	1,73	2а	1, 92	2с	2,55
Е	1Ь	1, 69	2а	1,95	2ά	2,71
<3	1с	2,63	2а	1,87	2а	2,61
Н	1с	2,49	2Ь	1,70	2ά	2,52

Амплификацию регистрировали во всех образцах - наилучшие результаты зарегистрированы для основной смеси № 16.

Оптимальные результаты получены для следующей комбинации праймеров и молекулярных маячков:

праймер 2: 4-115 (8Ер ΙΌ ΝΟ: 53) праймер 1: 4-122 (зЕр ΙΌ ΝΟ: 5б) молекулярный маячок: 4-125 (ЗЕР ΙΌ ΝΟ: 41)

Графическое изображение амплификации показано на фиг. 1.

Пример 5. Специфичность праймеров МусоЬас1егшш 1иЬегси1о§18 в отношении §о6А. Образцы:

Название (номер)

МусоЬас1егшт 1иЬегси1о8»з (3)

МусоЬасЮпит 6ονϊ$ (8)

МусоЪасгепит ау1ит-т1гасс11и1агс (16)

МусоЬас1епшп зресгез (22)

МусоЬас1ег1ит цогдопае (19)

МусоЪасГепит та1оепзе(21)

МусоЪасБепит χβπορί (23)

Мюгососсиз 1и1еиз

За1топе11а ®а111пагшп

81ар1гу1ососси5 аигсиз

Васй1и$ те§а£епит

ЕШегсмгиз

вода

Основная смесь:

гранулы реагентов гранулы ферментов

X 80 мкл растворителя гранул реагентов

X 55 мкл растворителя ферментов

Смешивают в одной пробирке, затем добавляют мкл воды ΝΑ3ΒΑ мкл праймера 1 (4-122; ЗЕС) ΙΌ ΝΟ: 56) мкл праймера 2 (4-115 ЗЕС) ΙΌ ΝΟ: 53) мкл молекулярных маячков (4-125; ЗЕС) ΙΌ ΝΟ: 41) 32 мкл КС1.

Прогон образцов

	1	2	3
А	М. (иЬегси1о518	М. вогбопае	8а1топе11а
В	М: 1иЬегси1оз15	М. еогбопас	8а1топе11а
С	Μ. Ηονίδ	М. та1оеп5е	81арЬу1ососсиз
•п	Μ. Εόνίδ	И таЗоспзе	51арЬу1ососсиз
Е	М. аУ1ит-1п(га.	Μ. χβηορΐ	ВасШиз
Р	Μ. &νϊυπι-ϊηίΓ3.	Μ. хепор!	ВасШиз
О	— зресгёз '	Мюгососсиз	ΕηίβΓονίπΐδ
н	— 5рес1ез	Мхсгососсив	Вода

- 13 006579

Результаты

Кратность увеличения сигнала (позитивный сигнал: выше 1,5).

	1
А	2,77
В	2,59
С	2,65
ϋ	2,63
Е	1,08
Е	1,00
6	0,98
Н	0, 98

2	3
1,09	1,09
1,09	1,11
1,08	1,09
1,07	1,10
1,05	1,08
1,05	1,08
1, 07	1,09
1,06	1,06

Заключение: праймеры специфичны в отношении М. 1иЬегси1оз1з или М. Ьоу1з и не будут реагировать с другими микобактериями или родственными бактериями, подобными Мюгососсиз 1и1еиз.

Список последовательностей

8РО ГО N0: 57. Нуклеотидная последовательность для зобА М. 1иЬегси1оз1з.

8РО ГО N0: 58. Аминокислотная последовательность для зобА М. 1иЬегси1оз1з.

8РО ГО N0: 59. Нуклеотидная последовательность для зоб М. аушш зиЬзр. рага!иЬегси1оз1з.

8РО ГО N0: 60. Аминокислотная последовательность для зоб М. аушш зиЬзр. рага!иЬегси1оз1з.

8РО ГО N0: 98. Нуклеотидная последовательность для рпсА М. 1иЬегси1оз1з.

8РО ГО N0: 99. Аминокислотная последовательность для рпсА М. 1иЬегси1оз1з.

Claims

1. Способ выявления наличия микроорганизма в тестируемом образце, предусматривающий воздействие на тестируемый образец индуктором, который способен индуцировать экспрессию по меньшей мере одного гена в микроорганизме, и тестирование наличия мРНК, транскрибированной с гена, который индуцирован посредством воздействия указанным индуктором.

2. Способ по п.1, где микроорганизмом является медленно растущая бактерия.

3. Способ по п.2, где медленно растущая бактерия выбрана из группы, состоящей из ВоггеПае, Ребюсоссиз, Мусор1азта и рода МусоЬас1епит.

4. Способ по любому из пп.1-3, где стадия тестирования наличия мРНК, транскрибированной с гена, который индуцирован посредством воздействия указанным индуктором, предусматривает осуществление реакции амплификации, чтобы амплифицировать всю или часть мРНК, и регистрацию специфичных продуктов реакции амплификации.

5. Способ по п.4, где реакцией амплификации является КТ-РСК или амплификация, основанная на последовательности нуклеиновой кислоты.

6. Способ по любому из пп.3-5, где индуктором является кислород или пероксид водорода, а ген, который индуцируют посредством воздействия индуктором, представляет собой ген, кодирующий супероксиддисмутазу.

7. Способ по п.6, где стадия тестирования наличия мРНК, транскрибированной с гена, кодирующего супероксиддисмутазу, предусматривает:

(а) составление реакционной смеси, содержащей пару праймеров NА8ВА Р1 и NА8ВА Р2, подходящую для применения при амплификации области указанной мРНК по методу NА8ВА, РНК-зависимую ДНК-полимеразу, рибонуклеазу, которая гидролизует нить РНК гибрида РНК-ДНК, не гидролизуя однонитевые или двунитевые РНК или ДНК, РНК-полимеразу, которая узнает последовательность промотора, присутствующую в праймере NА8ВА Р1, и рибонуклеозид- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты;

(Ь) инкубирование указанной реакционной среды с препаратом нуклеиновой кислоты, выделенной из тестируемого образца, который предположительно содержит микроорганизм, в условиях реакции, которые обеспечивают реакцию амплификации NА8ВА; и (с) выявление и/или количественное измерение какого-либо специфичного продукта реакции амплификации NА8ВА.

8. Способ по п.7 для применения при выявлении видов МусоЬас1епиш, где пара праймеров NА8ВА Р1 и NА8ВА Р2 является одной из следующих пар:

19;

праймер NА8ВА Р1, содержащий 8РО ГО N0: 20, и праймер NА8ВА Р2, содержащий 8РО ГО N0:

25;

праймер NА8ВА Р1, содержащий 8РО ГО N0: 26, и праймер NА8ВА Р2, содержащий 8РО ГО N0:

31;

праймер NА8ВА Р1, содержащий 8РО ГО N0: 32, и праймер NА8ВА Р2, содержащий 8РО ГО N0:

9. Способ по п.6, где стадия тестирования наличия мРНК, транскрибированной с гена, кодирующего супероксиддисмутазу, включает в себя амплификацию части мРНК по методу КТ-РСК.

10. Способ по п.9 для применения при выявлении видов Мусойас1егшт, где амплификацию части мРНК по методу КТ-РСК осуществляют с использованием одной из следующих пар праймеров:

праймер РСК, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 20, и праймер РСК, содержащий 8Е0 ΙΌ N0:19;

праймер РСК, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 26, и праймер РСК, содержащий 8Е0 ΙΌ N0:25;

праймер РСК, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 32, и праймер РСК, содержащий 8Е0 ΙΌ N0:31;

праймер РСК, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 38, и праймер РСК, содержащий 8Е0 ΙΌ N0:37;

праймер РСК, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 61, и праймер РСК, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 62; или праймер РСК, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 64, и праймер РСК, содержащий 8Е0 ΙΌ N0:65.

11. Способ по любому из пп.3-5, где индуктором является изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид или пиразинамид, а ген, который индуцируют посредством воздействия индуктором, представляет собой ген рпсА.

12. Способ по п.11, где стадия тестирования наличия мРНК, транскрибированной с гена рпсА, предусматривает (а) составление реакционной смеси, содержащей пару праймеров NΑ8ΒΑ Р1 и NΑ8ΒΑ Р2, подходящую для применения при амплификации области указанной мРНК по методу NΑ8ΒΑ, РНК-зависимую ДНК-полимеразу, рибонуклеазу, которая гидролизует нить РНК гибрида РНК-ДНК, не гидролизуя однонитевые или двунитевые РНК или ДНК, РНК-полимеразу, которая узнает последовательность промотора, присутствующую в праймере NΑ8ΒΑ Р1, и рибонуклеозид- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты;

(й) инкубирование указанной реакционной среды с препаратом нуклеиновой кислоты, выделенной из тестируемого образца, который предположительно содержит микроорганизм, в условиях реакции, которые обеспечивают реакцию амплификации NΑ8ΒΑ; и (с) выявление и/или количественное измерение какого-либо специфичного продукта реакции амплификации NΑ8ΒΑ.

13. Способ по п.12 для применения при выявлении МусойасЮпит 1иЬегси1о818, где пара праймеров NΑ8ΒΑ Р1 и NΑ8ΒΑ Р2 является одной из следующих пар:

праймер NΑ8ΒΑ Р1, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 2, и праймер NΑ8ΒΑ Р2, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 1; праймер NΑ8ΒΑ Р1, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 8, и праймер NΑ8ΒΑ Р2, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 7; праймер NΑ8ΒΑ Р1, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 14, и праймер NΑ8ΒΑ Р2, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 13;

праймер 4-2 и праймер NΑ8ΒΑ Р2, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 1, предпочтительно праймер 4-1; праймер 4-8 и праймер NΑ8ΒΑ Р2, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 7, предпочтительно праймер 4-7; или праймер 4-14 и праймер NΑ8ΒΑ Р2, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 13, предпочтительно праймер 4-15.

14. Способ по п.11, где стадия тестирования наличия мРНК, транскрибированной с гена рпсА, включает в себя амплификацию части мРНК по методу КТ-РСК.

- 14 006579 праймер NΑ8ΒΑ Р1, содержащий 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 38, и праймер NΑ8ΒΑ Р2, содержащий 8ЕО ΙΌ N0: 37;

праймер NΑ8ΒΑ Р1, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 61, и праймер NΑ8ΒΑ Р2, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 62;

праймер NΑ8ΒΑ Р1, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 64, и праймер NΑ8ΒΑ Р2, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 65;

праймер NΑ8ΒΑ Р1 4-86 и праймер NΑ8ΒΑ Р2, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 61, предпочтительно праймер 4-85;

праймер 4-92 и праймер NΑ8ΒΑ Р2, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 64, предпочтительно праймер 4-91;

праймер 4-104 и праймер NΑ8ΒΑ Р2, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 19, предпочтительно праймер 4-103; или праймер 4-122 и праймер NΑ8ΒΑ Р2, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 31, предпочтительно праймер 4-115.

- 15 006579 (ίν) праймера NАЗΒА Р2, который является праймером номер 4-1, 4-7, 4-13, 4-85, 4-97, 4-103, 4-109, 4-115 или 4-121;

(ν) праймера РСК, содержащего одну из ЗЕО ГО N0: 1, 2, 7, 8, 13, 14, 19, 20, 25, 26, 31, 32, 37, 38, 61, 62, 64, 65, 67, 68, 74, 75, 77, 78, 80, 81, 83, 84, 87, 88, 89, 90, 92, 93, 95 или 96.

17. Олигонуклеотидный зонд, используемый для регистрации мРНК, экспрессированной у вида МусоЬас1епит. мРНК которого транскрибирована с индуцируемого гена, при этом молекула олигонуклеотида выбрана из (ί) олигонуклеотидного зонда, содержащего одну из ЗЕО ГО N0: 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 63, 66, 69, 76, 79, 82, 85, 88, 91, 94, 97;

(ίί) олигонуклеотидного зонда с молекулярными маячками, который является ЗЕО ГО N0: 4, 5, 6, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 22, 23, 24, 28, 29, 30, 34, 35, 36, 40, 41 или 42.

18. Набор праймер/зонд для регистрации методом NАЗΒА мРНК, экспрессированной у вида МусоЬас1епшп, мРНК которого транскрибирована с индуцируемого гена, при этом набор праймер/зонд выбран из следующих наборов:

праймер NАЗΒА Р1, содержащий ЗЕО ГО N0: 2, праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 1 и либо зонд, содержащий ЗЕО ГО N0: 3, либо по меньшей мере один зонд с молекулярными маячками, выбранный из ЗЕО ГО N0: 4, 5 и 6;

праймер NАЗΒА Р1, содержащий ЗЕО ГО N0: 8, праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 7, и либо зонд, содержащий ЗЕО ГО N0: 9, либо по меньшей мере один зонд с молекулярными маячками, выбранный из ЗЕО ГО N0: 10, 11 и 12;

праймер NАЗΒА Р1, содержащий ЗЕО ГО N0: 14, праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 13, и либо зонд, содержащий ЗЕО ГО N0: 15, либо по меньшей мере один зонд с молекулярными маячками, выбранный из ЗЕО ГО N0: 16, 17 и 18;

праймер 4-2, праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 1, предпочтительно праймер 4-1, и либо зонд, содержащий ЗЕО ГО N0: 3, либо по меньшей мере один зонд с молекулярными маячками, выбранный из ЗЕО ГО N0: 4, 5 и 6;

праймер 4-8, праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 7, предпочтительно праймер 4-7, и либо зонд, содержащий ЗЕО ГО N0: 9, либо по меньшей мере один зонд с молекулярными маячками, выбранный из ЗЕО ГО N0: 10, 11 и 12;

праймер 4-14, праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 13, предпочтительно праймер 4-15, и либо зонд, содержащий ЗЕО ГО N0: 15, либо по меньшей мере один зонд с молекулярными маячками, выбранный из ЗЕО ГО N0: 16, 17 и 18;

праймер NАЗΒА Р1, содержащий ЗЕО ГО N0: 20, праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 19, и либо зонд, содержащий ЗЕО ГО N0: 21, либо по меньшей мере один зонд с молекулярными маячками, выбранный из ЗЕО ГО N0: 22, 23 и 24;

праймер NАЗΒА Р1, содержащий ЗЕО ГО N0: 26, праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 25, и либо зонд, содержащий ЗЕО ГО N0: 27, либо по меньшей мере один зонд с молекулярными маячками, выбранный из ЗЕО ГО N0: 28, 29 и 30;

праймер NАЗΒА Р1, содержащий ЗЕО ГО N0: 32, праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 31, и либо зонд, содержащий ЗЕО ГО N0: 33, либо по меньшей мере один зонд с молекулярными маячками, выбранный из ЗЕО ГО N0: 34, 35 и 36; или праймер NАЗΒА Р1, содержащий ЗЕО ГО N0: 38, праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 37, и либо зонд, содержащий ЗЕО ГО N0: 39, либо по меньшей мере один зонд с молекулярными маячками, выбранный из ЗЕО ГО N0: 40, 41 и 42.

праймер 4-104 и праймер NАЗΒА Р2, содержащий ЗЕО ГО N0: 19, предпочтительно праймер 4-103.

19. Набор праймеров для регистрации методом КТ-РСК мРНК, экспрессированной у вида МусоЬас1епшп, мРНК которого транскрибирована с индуцируемого гена, при этом набор праймер/зонд выбран из следующих наборов:

праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 2, и праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 1;

праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 8, и праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 7;

праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 14, и праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 13;

праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 26, и праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 25; праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 32, и праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 31; или праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 38, и праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 37.

20. Набор праймер/зонд для регистрации методом КТ-РСК мРНК, экспрессированной у вида МусоЬас1епшп, мРНК которого транскрибирована с индуцируемого гена, при этом набор праймер/зонд выбран из следующих наборов:

праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 2, праймер РСК, содержащий ЗЕО ГО N0: 1, и зонд, содержащий ЗЕО ГО N0:3;

15. Способ по п.14, используемый для выявления Мусойас1егшт 1ийегси1о818, где амплификацию части мРНК по методу КТ-РСК осуществляют с использованием одной из следующих пар праймеров:

праймер РСК, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 2, и праймер РСК, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 1;

праймер РСК, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 8, и праймер РСК, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 7; или праймер РСК, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 14, и праймер РСК, содержащий 8Е0 ΙΌ N0: 13.

16. Олигонуклеотидный праймер, используемый для регистрации мРНК, экспрессированной у вида Мусойас1егшт, мРНК которого транскрибирована с индуцируемого гена, при этом олигонуклеотидный праймер выбран из (ί) праймера NΑ8ΒΑ Р1, содержащего одну из 8Е0 ΙΌ N0: 2, 8, 14, 20, 26, 32, 38, 62, 65, 68, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93 или 96;

(ίί) праймера NΑ8ΒΑ Р1, который является праймером номер 4-2, 4-8, 4-14, 4-86, 4-98, 4-104, 4-110, 4-116 или 4-122;

(ίίί) праймера NΑ8ΒΑ Р2, содержащего одну из 8Е0 ΙΌ N0: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 61, 64, 67, 74, 77, 80, 83, 86, 89, 92 или 95;

- 16 006579 праймер РСК, содержащий 8ЕР ГО N0: 8, праймер РСК, содержащий 8ЕР ГО N0: 7, и зонд, содержащий 8ЕР ГО N0:9;

праймер РСК, содержащий 8ЕР ГО N0: 14, праймер РСК, содержащий 8ЕР ГО N0: 13, и зонд, содержащий 8ЕР ГО N0: 15;

праймер РСК, содержащий 8ЕР ГО N0: 20, праймер РСК, содержащий 8ЕР ГО N0: 19, и зонд, содержащий 8ЕР ГО N0: 21;

праймер РСК, содержащий 8ЕР ГО N0: 26, праймер РСК, содержащий 8ЕР ГО N0: 25, и зонд, содержащий 8ЕР ГО N0: 27;

праймер РСК, содержащий 8ЕР ГО N0: 32, праймер РСК, содержащий 8ЕР ГО N0: 31, и зонд, содержащий ВЕС) ГО N0: 33; или праймер РСК, содержащий 8ЕР ГО N0: 38, праймер РСК, содержащий 8ЕР ГО N0: 37, и зонд, содержащий 8ЕР ГО N0: 39.