DK2139997T3 - Asparaginasevarianter og anvendelser deraf - Google Patents

Claims (18)

1. Asparaginasepolypeptidvariant, der har mindst 80 % identitet med polypeptidsekvensen ifølge SEQ ID NO: 3, hvor varianten har en aminosyresekvens, der, når den opstillet parallelt med sekvensen ifølge SEQ ID NO: 3, omfatter mindst én substitution af en aminosyrerest svarende til en hvilken som helst af aminosyrerne 53, 63, 66 eller 88, hvilke positioner defineres ifølge SEQ ID NO: 3; og hvor varianten har en specifik aktivitet, der er højere ved mindst ét pH end aktiviteten for polypeptidet ifølge SEQ ID NO: 3 målt ved det samme pH, og/eller hvor varianten har et pH-optimum, der er højere end pH-optimummet for polypeptidet ifølge SEQ ID NO: 3.

2. Variant ifølge krav 1, hvor varianten har en aminosyresekvens, der omfatter mindst én substitution af en aminosyrerest svarende til en hvilken som helst af positionerne 63 eller 88, hvilke positioner defineres ifølge SEQ ID NO: 3.

3. Variant ifølge krav 1 eller 2, hvor varianten har en specifik aktivitet, der er højere ved mindst ét pH mellem pH 4 og pH 8 end aktiviteten for polypeptidet ifølge SEQ ID NO: 3 målt ved det samme pH.

4. Variant ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, hvor varianten har en aminosyresekvens der omfatter en eller flere af Tyr i position 53, Gly eller Val eller Ser i position 63, Pro i position 66 eller Tyr eller Pro i position 88, hvilke positioner defineres ifølge SEQ ID NO: 3.

5. Variant ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4, hvor varianten har en aminosyresekvens ifølge en hvilken som helst af SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 eller SEQ ID NO: 16.

6. Variant ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 5, der yderligere omfatter en eller flere substitutioner af aminosyrerester ud over de, der er defineret i krav 1.

7. Nukleinsyresekvens, der koder for varianten ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 6.

8. Nukleinsyrekonstruktion, der omfatter en nukleinsyresekvens, der koder for varianten ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 6, der er operabelt koblet til en eller flere kontrolsekvenser, der er i stand til at styre ekspressionen af en asparaginase i en egnet ekspressionsvært.

9. Rekombinant ekspressionsvektor, der omfatter nukleinsyrekonstruktionen ifølge krav 8.

10. Rekombinant værtscelle, der omfatter ekspressionsvektoren ifølge krav 9.

11. Fremgangsmåde til produktion af en asparaginase, der omfatter dyrkning af værtscellen ifølge krav 10 under betingelser, der bidrager til produktion af asparaginasen, og indvinding af asparaginasen.

12. Fremgangsmåde til produktion af en asparaginasepolypeptidvariant, hvilken fremgangsmåde omfatter: a) selektion af et moder-asparaginasepolypeptid, der har en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NO: 3; b) substitution af mindst én aminosyrerest svarende til en hvilken som helst af 53, 63, 66 eller 88, hvilke positioner defineres ifølge SEQ ID NO: 3; c) eventuelt substitution af en eller flere yderligere aminosyrer som defineret i b); d) fremstilling af varianten, der opnås fra trin a)-c), hvor varianten har mindst 80 % identitet med SEQ ID NO: 3; e) bestemmelse af den specifikke aktivitet ved mindst ét pH og/eller pH-optimum for varianten; og f) selektion af en variant, der har en forøget specifik aktivitet ved mindst ét pH sammenlignet med moder asparaginasepolypeptidet og/eller et forøget pH-optimum sammenlignet med moder asparaginasepolypeptidet, til derved produktion af en asparaginasepolypeptidvariant.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, hvor der i trin b) substitueres mindst én aminosyrerest svarende til en hvilken som helst af 63 eller 88, hvilke positioner defineres ifølge SEQ ID NO: 3.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 12 eller 13, hvor den substituerede aminosyre i trin b) svarer til en eller flere af Tyr i position 53, Gly eller Val eller Ser i position 63, Pro i position 66 eller Tyr eller Pro i position 88, hvilke positioner defineres ifølge SEQ ID NO: 3.

15. Sammensætning, der omfatter varianten ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 6 eller asparaginasen, der kan opnås ved hjælp af en fremgangsmåde ifølge krav 11 til 14.

16. Anvendelse af en asparaginase ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 6 eller af en sammensætning ifølge krav 15 til produktion af et fødevareprodukt.

17. Anvendelse af en asparaginase ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 6 eller af en sammensætning ifølge krav 15 til reducering af mængden af acrylamid, der dannes i et termisk forarbejdet fødevareprodukt, der er baseret på et asparaginholdigt råmateriale.

18. Fremgangsmåde til produktion af et fødevareprodukt, der inddrager mindst ét opvarmningstrin, der omfatter tilsætning af en eller flere asparaginaser ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 6 eller en sammensætning ifølge krav 15 til en mellemform af fødevareproduktet i produktionsprocessen, hvorved enzymet tilsættes til opvarmningstrinet i en mængde, der er effektiv til reducering af niveauet af asparagin, der er til stede i mellemformen af fødevareproduktet.