DK2084272T3 - Kloning, ekspression og anvendelse af sure lysophospholipaser - Google Patents

Claims (14)

1. DNA-sekvens der koder for et polypeptid med lysophospholipaseaktivitet, kendetegnet ved at DNA-sekvensen er valgt fra a) DNA-sekvenser der omfatter en nukleotidsekvens ifølge SEQ ID NO: 1, b) DNA-sekvenser der omfatter den kodende sekvens ifølge SEQ ID NO: 1, c) DNA-sekvenser der koder for protein sekvensen ifølge SEQ ID NO: 2, d) DNA-sekvenser der er kodet af plasmidet B6Sma35 med restriktionskortet ifølge figur 4 og deponeret under accessionsnummer DSM 18370, e) DNA-sekvenser der er relateret til DNA-sekvenserne ifølge a), b), c) eller d) på grund af degenerationen af den genetiske kode, og f) strenge komplementære med sekvenserne ifølge a) til e), hvor DNA-sekvensen fortrinsvis er afledt fra Aspergillus, og mere foretrukket fra Aspergillus fumigatus; og hvor polypeptidet med lysophospholipaseaktivitet bibeholder en aktivitet på mindst 80% ved en temperatur på 65°C, pH 5 i delvis hydrolysat af hvedestivelse i mindst 4 timer.

2. Nukleinsyresekvens der omfatter en analog af én af sekvenserne ifølge krav 1, kendetegnet ved at sekvensen koder for et polypeptid med lysophospholipaseaktivitet, og a) har mindst 89% identitet med én af disse sekvenser, eller b) hybridiserer med én af disse sekvenser under stringente betingelser eller c) er en streng komplementær med sekvenserne ifølge a) til b) hvor sekvensen kan opnås ved substitution, deletion, insertion, addition eller mutation af én eller flere nukleinsyre(r) af DNA-sekvensen ifølge SEQ ID NO: 1, og hvor polypeptidet med lysophospholipaseaktivitet bibeholder en aktivitet på mindst 80% ved en temperatur på 65°C, pH 5 i delvis hydrolysat af hvedestivelse i mindst 4 timer.

3. Ekspressionskonstrukt der omfatter en sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 2 i operabel kobling med én eller flere sekvens(er) til at styre ekspressionen af polypeptidet med lysophospholipaseaktivitet i en passende værtscelle, hvor sekvensen til at styre ekspressionen af polypeptidet fortrinsvis er en promotor valgt fra glucoamylase- eller a-amylasepromoteren af slægten Aspergillus, cellulase (cellobiohydrolase) promotoren af slægten Trichoderma, en promotor for et enzym i den glycolytiske metaboliske pathway såsom phosphoglyceratkinase eller glycerolaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, xylanasepromotoren eller enolasepromotoren, og kan omfatte en sekretorisk ledersekvens.

4. Rekombinant værtscelle, kendetegnet ved at den transformeres med ekspressionskonstruktet ifølge krav 3.

5. Rekombinant værtscelle ifølge krav 4, kendetegnet ved at den er afledt af en funguscelle af slægten Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor eller Penicillium eller en gærcelle af slægten Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Hansenula eller Pichia.

6. Plasmidet B6Sma35 med restriktionskortet ifølge figur 4 og deponeret under accessionsnummer DSM 18370.

7. Polypeptid med lysophospholipaseaktivitet valgt fra a) polypeptid der kodes for af den kodende del af DNA-sekvensen ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 2, b) polypeptid med en sekvens, der har mindst 89% identitet med aminosyrerne 16 til 611 af SEQ ID NO: 2, hvor polypeptidet med lysophospholipaseaktivitet bibeholder en aktivitet på mindst 80% ved en temperatur på 65°C, pH 5 i delvis hydrolysat af hvedestivelse i mindst 4 timer.

8. Polypeptid med lysophospholipaseaktivitet ifølge krav 7, kendetegnet ved at det - har en molekylvægt i området på 64 til 78 kDa, - kan hydrolysere fedtsyren fra lysolecithin, - viser et højt forhold mellem lysophospholipaseaktivitet og phospholipaseaktivitet - kan isoleres fra en organisme af slægten Aspergillus. - er immunologisk reaktiv med et antistof rettet mod sekvensen SEQ ID NO: 2.

9. Polypeptidet ifølge 8, kendetegnet ved at det kan isoleres fra Aspergillus fumigatus.

10. Polypeptidet ifølge et hvilket som helst af kravene 8 to 9, kendetegnet ved at det omfatter sekvensen ifølge SEQ ID NO: 2.

11. Lysophospholipasesammensætning, kendetegnet ved at den omfatter et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 7 til 10 sammen med additiver, og kan yderligere omfatte ét eller flere enzym(er) til nærings- eller fodermiddel.

12. Anvendelsen af et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 7 til 10 eller en lysophospholipasesammensætning ifølge 11 til forbedringen af filtreringen af sirup, fortrinsvis valgt fra glucosesirup og maltosesirup.

13. Anvendelsen af et polypeptid ifølge et hvilket som helst af kravene 7 til 10 eller en lysophospholipasesammensætning ifølge krav 11 til transforestring af lysolecithiner.

14. Fremgangsmåden til fremstillingen af et polypeptid med lysophospholipaseaktivitet ifølge et hvilket som helst af kravene 7 til 10, kendetegnet ved at en værtscelle ifølge et hvilket som helst af kravene 4 eller 5 vokser under betingelser der fremmer ekspressionen af polypeptidet og efterfølgende genvindes polypeptidet.