ES2574089T3

ES2574089T3 - Clonación, expresión y empleo de lisofosfolipasas ácidas

Info

Publication number: ES2574089T3
Application number: ES07818345.6T
Authority: ES
Inventors: Khanh Q. Nguyen; Volker Marschner; Kornelia Titze; Bruno Winter
Original assignee: AB Enzymes GmbH
Current assignee: AB Enzymes GmbH
Priority date: 2006-10-02
Filing date: 2007-09-21
Publication date: 2016-06-14
Anticipated expiration: 2027-09-21
Also published as: BRPI0719961A2; EP2084272A1; WO2008040465A1; US8507241B2; AU2007304532B2; AU2007304532B9; US20100119656A1; AU2007304532A1; DK2084272T3; HUE030279T2; US20120219666A1; PL2084272T3; DE102006046857A1; CA2667064C; EP2084272B1; US8202715B2; CA2667064A1

Abstract

Secuencia de ADN que codifica un polipéptido con actividad de lisofosfolipasa, caracterizada por que la secuencia de ADN es seleccionada a partir de a) secuencias de ADN que comprenden una secuencia de nucleótidos según SEQ ID NO: 1, b) secuencias de ADN que comprenden la secuencia codificante según SEQ ID NO: 1, c) secuencias de ADN que codifican la secuencia de proteínas según SEQ ID NO: 2, d) secuencias de ADN que se codifican por el plásmido B6Sma35 con el mapa de restricción según la figura 4, y depositadas bajo el número de depósito DSM 18370, e) secuencias de ADN que, debido a la degenerabilidad del código genético, son análogas a las secuencias de ADN según a), b), c) o d), y f) hebras complementarias a las secuencias según a) a e), siendo derivada la secuencia de ADN preferentemente de Aspergillus, y de modo aún más preferente de Aspergillus fumigatus, y manteniendo el polipéptido con actividad de lisofosfolipasa una actividad de al menos un 80 % a una temperatura de 65ºC, pH 5 en hidrolizado parcial de almidón de trigo, durante al menos 4 h.

Description

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seleccionó, o bien se seleccionaron para la inclusión celular, codifica/n convenientemente una proteína que se exprime en las células (recombinantes) transformadas obtenidas de este modo, lo que conduce a una característica rastreable o seleccionable y/o concede un fenotipo mejorado a las células transformadas.

La construcción de vectores que se pueden emplear según la invención es conocida por un especialista en el campo relativo a la manifestación anterior y al conocimiento técnico general (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y. (1989)).

Un cassette de expresión según la invención puede contener uno o varios puntos de corte de restricción, para situar el polinucleótido que codifica la lisofosfolipasa bajo la regulación de una secuencia reguladora. El cassette de expresión puede contener también una señal de terminación en enlace funcional con el polinucleótido, así como secuencias reguladoras que se requieren para la traducción apropiada del polinucleótido. El cassette de expresión que contiene el polinucleótido según la invención puede ser quimérico, es decir, al menos uno de sus componentes es heterólogo respecto a al menos uno de los otros componentes. La expresión del polinucleótido en el cassette de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo, un promotor inducible, un promotor regulado, un promotor viral, o un promotor sintético.

Los vectores pueden contener ya elementos reguladores, por ejemplo promotores, o las secuencias de ADN según la invención se pueden manipular de modo que contengan tales elementos. Elementos promotores apropiados, que se pueden emplear, son conocidos en el campo técnico y son, a modo de ejemplo para Trichoderma reesei, el promotor cbh1 o el promotor cbh2, para Aspergillus oryzae, el promotor amy, para Aspergillus niger, el promotor xyl, glaA, alcA, aphA, tpiA, gpdA, sucl y el promotor pkiA. Elementos promotores apropiados, que se pueden emplear para la expresión en levaduras, son conocidos en el campo técnico y son, a modo de ejemplo, el promotor pho5 o el promotor gap para la expresión en Saccharomyces cerevisiae y para Pichia pastoris, por ejemplo, el promotor aoxl o el promotor fmd, o el promotor mox para H. Polymorpha.

El ADN que es apropiado para la inclusión en células puede comprender, además de ADN según la invención, también ADN que se obtuvo a partir de cualquier fuente, o se aisló a partir de la misma. Un ejemplo de un ADN derivado es una secuencia de ADN que se identificó como fragmento útil en un organismo dado, y que se sintetizó entonces por vía química en forma sensiblemente pura. Un ejemplo de tal ADN es una secuencia de ADN apropiada, que se obtuvo, a modo de ejemplo, bajo empleo de endonucleasas de restricción, de modo que se puede manipular adicionalmente, a modo de ejemplo amplificar, según la invención. Entre estos cuenta, entre otros, el gen amdS de Aspergillus nidulans empleable como gen marcador, y sus secuencias reguladoras, así como poliengarces.

Tal ADN se denomina habitualmente ADN recombinante. Por lo tanto, un ADN apropiado comprende ADN completamente sintético, ADN semisintético, ADN aislado a partir de fuentes biológicas y ADN derivado de ARN incluido. En general, el ADN incluido no es un componente original del genotipo de ADN receptor, pero, según la invención, también se puede aislar un gen a partir de un genotipo dado, y eventualmente modificar el mismo, y a continuación se pueden incluir copias múltiples del gen en el mismo genotipo, por ejemplo para reforzar la producción de un producto génico dado.

El ADN incluido comprende sin limitación ADN de genes, como por ejemplo de bacterias, levaduras, hongos o virus. El ADN incluido puede comprender genes modificados o sintéticos, partes de genes o genes quiméricos, incluyendo genes del mismo o de diferente genotipo. A tal efecto, por ejemplo también el ADN puede pertenecer a los plásmidos pUC18, pCU19.

El ADN empleado para la transformación según la invención puede ser circular o lineal, de hebra doble o de hebra simple. El ADN se presenta en general en forma de un ADN quimérico, como un ADN plasmídico, que contiene también regiones codificantes, que están flanqueadas por secuencias reguladoras, y favorecen la expresión de ADN recombinnate presente en la célula transformada. A modo de ejemplo, el propio ADN puede contener o estar constituido por un promotor, que es activo en una célula que es derivada de una fuente que se diferencia de la célula, o se puede emplear un promotor que está presente ya en la célula, es decir, la célula objetivo de transformación.

En general, el ADN incluido es relativamente reducido, menos de aproximadamente 30 kb, para minimizar la sensibilidad frente a degradación física, química o enzimática, que aumenta con el tamaño del ADN.

La selección de un vector de expresión apropiado depende de las células hospedantes. Vectores de expresión de levaduras u hongos pueden comprender un origen de replicación, un promotor y un engarce apropiado, y también cualquier punto de enlace ribosómico apropiado, puntos de poliadenilación, puntos donadores y aceptores de unión, secuencias de terminación de transcripción y secuencias no transcritas 5‘-flanqueantes. Son ejemplos de células hospedantes apropiadas: células fúngicas de la especie Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor, Penicillium, etc., como por ejemplo levaduras de las especies Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Hansenula, Pichia y similares. Sistemas

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hospedantes apropiados son, a modo de ejemplo, hongos como Aspergilli, por ejemplo Aspergillus niger (ATCC 9142) o Aspergillus ficuum (NRLL 3135) o Trichoderma (por ejemplo Trichoderma reesei QM6a) y levaduras, como Saccharomyces, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae o Pichia, como por ejemplo Pichia pastoris o Hansenula, por ejemplo H. polymorpha (DSMZ 70277). Tales microorganismos se pueden obtener en puntos de depósito reconocidos, por ejemplo American Type Culture Collection (ATCC), Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) oder Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), o cualquier otro punto de depósito.

Un cassette de expresión puede contener en el sentido de transcripción 5‘-3‘ una región de iniciación de transcripción y translación del polinucleótido según la invención, y una región de transcripción y terminación que es funcional in vivo o in vitro. La región de terminación puede ser nativa respecto a la región de iniciación de transcripción, o puede ser nativa o de otro origen respecto al polinucleótido. Las secuencias reguladoras pueden estar localizadas en línea de entrada (secuencias no codificantes 5‘), en el interior (intron) o en línea de salida (secuencias no codificantes 3‘) de una secuencia codificante, e influir sobre la transcripción, el procesado de ARN o la estabilidad y/o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden comprender sin limitación engarces, promotores, puntos de enlace de represor, secuencias conductoras de traducción, intrones o secuencias de señal de poliadenilación. Estas pueden comprender secuencias naturales y sintéticas, así como secuencias que son una combinación de secuencias naturales y sintéticas.

El vector empleado según la invención peude comprender también secuencias apropiadas para la amplificación de la expresión.

Son ejemplos de promotores, que se pueden emplear según la invención, promotores de los que se sabe que controlan la expresión en las células eucariotas. Se puede emplear cualquier promotor con la capacidad de expresión en hongos filamentosos. Son ejemplos un promotor que se induce en gran medida por almidón o celulosa, por ejemplo un promotor para glucoamilasa o α-amilasa de la especie Aspergillus o celulasa (celobiohidrolasa) de la especie Trichoderma, un promotor para enzimas en la vía metabólica glicolítica, como por ejemplo fosfogliceratoquinasa (PGK) y 3-fosfato-dehidrogenasa de glicerinaldehído (GPD), etc. Es preferente el promotor de celobiohidrolasa-I, de celobiohidrolasa-II, de amilasa, de glucoamilasa, de xilanasa o de enolasa.

Adicionalmente al empleo de un promotor especial, otros tipos de elementos pueden influir sobre la expresión de transgenes. En especial se mostró que los intrones poseen el potencial para el refuerzo de la expresión transgénica.

El cassette de expresión puede comprender aún otros elementos, a modo de ejemplo aquellos que se pueden regular mediante elementos endógenos o exógenos, como proteínas Zink finger, incluyendo proteínas Zink finger presentes naturalmente, o proteínas Zink finger quiméricas.

El cassette de expresión empleado según la invención puede contener además elementos de engarce o elementos promotores en línea de entrada.

Vectores para empleo según la invención se pueden construir de modo que contengan un elemento de engarce. Por consiguiente, los segmentos según la invención comprenden el gen de interés junto con una secuencia de 3‘-ADN, que actúa como señal, para terminar la transcripción, y permiten la poliadenilación del mARN obtenido de este modo. Se puede emplear cualquier secuencia de señal que posibilite la secreción a partir del organismo hospedante seleccionado. Una secuencia de señal preferente es la secuencia de señal de lisofosfolipasa de Aspergillus fumigatus o secuencias de señal derivadas de la misma para la secreción de hongos filamentosos.

También se puede emplear una secuencia conductora especial, ya que la secuencia de ADN entre el punto de iniciación de transcripción y el inicio de la secuencia codificante, es decir la secuencia conductora no traducida, puede influir sobre la expresión génica. Secuencias conductoras preferentes comprenden secuencias que controlan la expresión óptima del gen adherido, es decir, comprenden una secuencia conductora de consenso preferente, que aumenta o mantiene la estabilidad del mARN, e impide una iniciación de traducción inapropiada. La selección de tales secuencias es convenientemente conocida por un especialista en este campo.

Para mejorar la posibilidad de identificación de los transformantes, se puede alojar un gen marcador seleccionable o rastreable en el cassette de expresión. Tales genes marcadores son convenientemente conocidos por un especialista en este campo.

El cassette de expresión o un segmento vectorial, que contiene la cassette de expresión, se introduce en una célula hospedante. Una pluralidad de técnicas se encuentran disponibles y son convenientemente conocidas para un especialista en el campo de la inclusión de segmentos en una célula hospedante. La transformación de células microbianas se puede llevar a cabo bajo empleo de polietilenglicol, cloruro de calcio, infección viral, dextrano DEAE, infecciones por fagos, electroporación y otros métodos conocidos en el campo técnico. La transformación de hongos se puede llevar a cabo según Penttilä et al., Gene 61: 155-164, 1987. La inclusión de un vector recombinante en

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ensayo de color enzimático optimizado para la determinación de ácidos grasos libres (Non-Esterified Fatty Acids, NEFA, Best. Nr 1383 175 de la firma Boehringer-Mannheim). Como tiempo de reacción se utiliza el intervalo de tiempo entre la 1ª y la 2ª toma de muestras.

Ejemplo de referencia 2

Determinación de la actividad de fosfolipasa

1 unidad de fosfolipasa corresponde a la cantidad de enzimas que libera 1 µmol de ácido graso por minuto bajo condiciones estándar a partir de fosfatidilcolina. Reactivos Disolución de substrato Se homogeneiza 1 g de Epikuron 200 (fosfatidilcolina purificada a partir de soja de LUCAS MEYER, BestNr.

139029), 100 ml de agua desionizada y 5 ml de disolución de CaCl2 0,32 M con un Ultra Turrax 2 min a 24000 rpm. La disolución de substrato es estable 3-4 días a 4ºC-8ºC.

Otras disoluciones Disolución de MgCl2 0,32 M, disolución fresca de ácido cítrico monohidrato 3,3 mM, disolución de KOH 10 mM, disolución al 1 % de Triton X100 (firma Fluka) en agua completamente desalinizada.

Disolución enzimática Los preparados enzimáticos se disuelven en agua desionizada. La concentración de enzimas en la carga no debe sobrepasar 2,5 U g-1 .

Puesta en práctica de la determinación Valores principales Se pipetean

10 ml de disolución de substrato, 10 ml de disolución al 1 % de Triton X100, 5 ml de disolución de ácido cítrico monohidrato 3,3 mM,

en un matraz Erlenmeyer de 25 ml y se tempera 10 min a 40ºC. El valor de pH se ajusta a aproximadamente 3,3-3,5. Tras la adición de 0,1 ml de disolución enzimática se incuba la carga de análisis 10 min a 40ºC. Una vez transcurrido

el tiempo de incubación se titra con KOH 0,01 M a pH 10,0, añadiéndose rápidamente los primeros 5 ml de KOH (tiempo: aproximadamente 1 min). Se registra el consumo en KOH. Valores obtenidos mediante ensayo en blanco. Se calienta, y por consiguiente se desactiva la disolución madre enzimática 15 min a 95ºC. Tras el enfriamiento a

temperatura ambiente se efectúa el tratamiento subsiguiente, como en los valores principales. No es necesaria una incubación de los valores obtenidos mediante ensayo en blanco. Valoración:

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VKOH: [ml] Diferencia de consumo entre valor obtenido mediante ensayo en blanco y valor principal

c KOH: [mol l-1] Concentración de KOH

t: [min ] Tiempo de incubación

cS: [g ml-1] Concentración de muestra

v: [ml] Volumen empleado

Ejemplo 1

Obtención de lisofosfolipasa con Aspergillus fumigatus

Se cultivó Aspergillus fumigatus RH3949 en un matraz vibratorio de 200 ml, cargado con 50 ml de medio a 28ºC, 200 rpm, durante 5 días. El medio estaba constituido por un 0,5 % de Epicuron 200 (Lucas Meyer), 0,5 % de polvo de maíz hinchado, un 0,2 % de NH4NO3, KH2PO4 100 mM y un 0,1 % de Triton X100. El valor de pH se ajustó a pH 6 antes de la esterilización. El medio se inoculó con una suspensión de esporas. Después de 5 días se separó el exceso de cultivo de la micela mediante filtración, y se midió la actividad de lisofosfolipasa en el líquido.

Ejemplo 2

Clonación y expresión del gen lisofosfolipasa (lpl) a partir de la cepa Aspergillus fumigatus RH3949

a) Síntesis de la primera hebra de ADN

Se inocularon y se cultivaron a 45ºC durante 2 a 5 días aproximadamente 1 x 107 esporas de la cepa Aspergillus fumigatus RH3949 en 100 ml de medio (3,75 % de Glucidex, 3 % de polvo de maíz hinchado, 0,5 % de (NH4)2H2PO4). La micela obtenida se empleó para la preparación de ARN por medio de la columna Qiagen (Rneasy Mini Plant Kit, Qiagen).

La síntesis de la primera hebra de cADN se efectuó según la prescripción del fabricante (BRL). En este caso se pipetearon conjuntamente en una carga de reacción de 20 µl 4 µl de tampón 5 x BRL (250 mM Tris/HCl, pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2), 1 µl de 10 mM dNTP, 2 µl de 100 mM DTT, 50 µMol de cebador EA13, 1 µl de RNA (2 µg de RNA total) y 2000 U RTase Super Script (BRL). La carga de reacción se incubó durante 50 min a 45ºC.

Para la posterior amplificación de cADN de lisofosfolipasa por medio de la reacción en cadenas de polimerasa se diluyó la carga con 20 µl de agua bidestilada, y se conservó a -20ºC.

La secuencia de ADN del cebador EA13 es la siguiente:

5'-gAC TCg AgT CgA CAT CgA (T)20 (A/C/g)-3' (SEQ ID NO: 3)

b) Amplificación de una secuencia parcial de cADN de lisofosfolipasa por medio de la reacción en cadenas de polimerasa (PCR)

A partir de la comparación de la secuencia de aminoácidos de lisofosfolipasa de S. cerevisiae (Lee et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 19725-19730), P. notatum-(Masuda et al., 1991, Eur. J. Biochem., 202, 783-787) y Aspergillus awamori RH3312, se deducieron diversos oligocebadores para la amplificación de cADN de lisofosfolipasa. En este caso se motró que el par de cebadores 3949/875 y 3949/4710iv conduce al fragmento génico de cADN de lisofosfolipasa correcto.

3949/875 5'-GAT GGC GGC GAG GAT GGA CAG AA-3' (SEQ ID NO: 4)

3949/8710iv 5'-AGT GCC GTT CCA GCA ATA-3'(SEQ ID NO: 5)

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