DK175799B1 - Fremgangsmåde til præservering og fremgangsmåde til fremstilling af liposomer samt en lyophiliseret sammensætning og en præserveret sammensætning - Google Patents

Description

DK 175799 B1

Fremgangsmåde til præservering og fremgangsmåde til fremstilling af liposomer samt en lyophiliseret sammensætning og en præserveret f sammensætning 5 Den foreliggende opfindelse angår almindeligvis liposomer og mere specielt en fremgangsmåde til præservering af liposomer, som indeholder biologisk aktive molekyler. Denne fremgangsmåde er anvendelig ved anvendelser såsom in vivo medikamentafgivelse og præservering af diagnostiske midler. Endvidere angår opfindelsen en lyophiliseret sammensætning, der er anven-10 delig til lagring af indkapslet materiale.

Liposomer er unilamellare eller multilamellare lipidvesikler, der omslutter et flydende rum. Vesiklemes vægge dannes af et bimolekylært lag af en eller flere lipidkomponenter med polære hoveder og ikke-polære haler. I en vandig 15 (eller polær) opløsning er de polære hoveder i det ene lag orienteret udad og strækker sig ind det omgivende medie, og de ikke-polære haledele af lipider-ne er forbundet med hinanden, hvilket således tilvejebringer en polær overflade og en ikke-polær kerne i vesiklets væg. Unilamellare liposomer har et sådant bimolekylært lag, hvorimod multilamellare liposomer almindeligvis har 20 en flerhed af i det væsentlige koncentriske bimolekylære lag.

Liposomer er anerkendte som anvendelige til indkapsling af medikamenter og andre terapeutiske midler og til at bære disse midler til in vivo steder.

F.eks. omtales der i beskrivelsen til U.S. Patent nr. 3.993.754 til Rahman et 25 al., udstedt 23. november 1976, en forbedret kemoterapeutisk metode, ved hvilken et antitumormedikament indkapsles i liposomer og derpå injiceres. I beskrivelsen til U.S. Patent nr. 4.263.428 til Apple et al., udstedt 21. april 1981, beskrives et anti-tumormedikament, som mere virkningsfuldt kan afgives til selektive cellesteder i en pattedyrorganisme ved at inkorporere medi-30 kamentet i liposomer af en ensartet størrelse. Medikamentindgivelse via liposomer kan have reduceret toksisitet, forandret vævsfordeling, forøget medikamentvirkning og et forbedret terapeutisk indeks.

I DK 175799 B1 I

I 2 I

I Liposomer er også vellykket blevet anvendt til introducering af forskellige I

kemikalier, biokemikalier, genetiske materialer og lign. i levende celler in vitro I

I og som bærere af diagnostiske midler. I

I * M

I 5 En lang række fremgangsmåder til fremstilling af liposomer er kendte, hvoraf

mange er blevet beskrevet af Szoka og Papahadjopoulos, Ann. Rev. Biophv- I

I sies Bioenq. 9: 467-508 (1980). Indenfor patentlitteraturen er der også blevet I

I beskrevet adskillige liposomindkapslingsfremgangsmåder, navnlig i beskri-

I velsen til U.S. Patent nr. 4.235.871 til Papahadjopoulos et al., udstedt 25. I

I 10 november 1980, og i beskrivelsen til U.S. Patent nr. 4.016.100 til Suzuki et I

I ål., udstedt 5. april 1977. I

Selvom indkapsling af terapeutiske midler og biologisk aktive forbindelser i I

I liposomer har væsentlig kommerciel anvendelsesmulighed, har en større I

I 15 vanskelighed, som har vist sig ved kommerciel anvendelse af liposomind- I

I kapsling, været deres stabilitet på langt sigt. Selvom liposomstrukturer kan I

I opretholdes intakte under visse lagerforhold, er disse forhold ofte upassende I

I eller ikke tilgængelige. Den foreliggende fremgangsmåde giver en løsning på H

I dette problem. I

I 20

I Det er derfor et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en I

I kommerciel gennemførlig fremgangsmåde til præservering af liposomer. I

I Det er et andet formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en I

25 kommerciel gennemførlig fremgangsmåde til præservering af liposomer ved I

I hjælp af frysetørring, hvorved de resulterende liposomer efter rehydrering I

I kan tilbageholde så meget som 100% af deres oprindelige indkapslede mate- I

I riale. - I

I 30 Det er endnu et andet formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe I

I en fremgangsmåde til præservering af liposomer ved hjælp af en kulhydrat- H

I forbindelse, som er i stand til at præservere strukturen og funktionen i biolo- I

I giske membraner. I

DK 175799 B1 I 3 i

Det er endnu et yderligere formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en fremgangsmåde til præservering af liposomer ved hjælp af et præ-serveringsmiddel, såsom trehalose, der er til stede enten som et indkapslet materiale indeni liposomet eller udenfor i opløsningen under frysetørringen 5 eller begge dele.

Det er endnu et andet formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en lyophiliseret sammensætning, som efter rehydrering tilbageholder op til 100% af det oprindeligt indkapslede materiale.

10

Yderligere formål og fordele ved den foreliggende opfindelse vil fremgå af den følgende beskrivelse, krav og de tilhørende tegninger.

I et aspekt af den foreliggende opfindelse omfatter den en fremgangsmåde til 15 præservering af liposomer, hvorved der tilvejebringes initielle liposomer med lipidmembraner, hvilke liposomer har en initiel mængde af et heri indkapslet vandopløseligt materiale, hvilket indkapslet materiale omfatter en hvilken som helst af carbonhydraterne trehalose, maltose og sucrose, at disse initielle liposomer bringes i kontakt med en vandig opløsning indeholdende en 20 hvilken som helst af trehalose, maltose og sucrose og, at de initielle liposomer lyophiliseres i den vandige opløsning til dannelse af lyophilisater indeholdende mindst 80% intakte liposomer.

I et andet aspekt af den foreliggende opfindelse omfatter fremgangsmåden 25 fremstilling af liposomer, hvilken fremgangsmåde er karakteriseret ved det, der er angivet i krav 2. Foretrukne vægtforhold mellem totalpræserverings-middel og lipid er fra ca. 0,1:1 til 3,0:1. Et særligt foretrukket vægtforhold er ca. 1,0:1,0.

30 Den foreliggende opfindelse omfatter også en lyophiliseret sammensætning således, at når de resulterende liposomer, at de rekonstitueres ved rehydrering, tilbageholder i det væsentlige alt det oprindeligt indkapslede materiale.

En sådan lyophliliseret sammensætning kan fremstilles ved den fremgangs-

I DK 175799 B1 I

I I

I måde, der er beskrevet ovenfor. Sammensætningen er karakteriseret ved I

I det, der står i krav 5.

I Endvidere omfatter den foreliggende opfindelse præserverede sammensæt- a I

5 ninger ejendommelige ved at de omfatter: lyophilisater med en lipidbestand- I

I del, en disaccharidbestanddel og en initiel mængde af en indkapslet I

I bestanddel, hvorhos disaccharidbestanddelen omfatter trehalose og er til I

I stede i et vægtforhold i forhold til lipidbestanddelen på fra ca. 0,1:1 til ca. I

I 3,0:1, lipidbestanddelen danner lipidmembraner med en inderside og en I

10 yderside, disaccharidbestanddelen er til stede i lyophilisaterne på både ind- I

I ersiden og ydersiden af lipidmembraneme, og i det mindste størstedelen af I

I den initielle mængde af indkapslet materiale er til stede i lyophilisaterne på I

I indersiden af lipidmembraneme. I

I 15 Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til præservering af I

I liposomer, der indeholder biologisk aktive molekyler, under anvendelse af en I

I hvilken som helst af carbonhydrateme trehalose, maltose og sucrose. Frem- I

I gangsmåden involverer enten lyophilisering af liposomer under tilstedeværel- I

I se af en hvilken som helst af carbonhydrateme trehalose, maltose og sucro- I

I 20 se, eller lyophilisering af liposomer, der indeholder en hvilken som helst af

I carbonhydrateme trehalose, maltose og sucrose sammen med indkapslede . I

I medikamenter, eller begge dele. I

Trehalose er en naturligt forekommende sukkerart, som findes i høje koncen- I

I 25 trationer i de organismer, der er i stand til at overleve dehydrering. Trehalose I

I er især effektiv ved præservering af strukturen og funktionen i tørre biologi-

ske membraner. De liposomer, som lyophiliseres under tilstedeværelse af I

I trehalose, og som yderligere indeholder indkapslet trehalose udviser særlig i I

I god tilbageholdelse at det indkapslede materiale. Det vil sige, at når liposo-

I 30 mer udsættes for trehalose både indvendigt og udvendigt under lyophiliserin- I

I gen, kan de tilbageholde så meget som 100% af det oprindeligt indkapsiede I

I indhold ved rehydrering. Dette står i skarp kontrast til de liposomer, som I

5 DK 175799 B1 lyophiliseres uden noget præserveringsmiddel, og som viser omfattende fusion mellem liposomer og tab af indhold til det omgivende medium.

Repræsentative phospholipider, som anvendes til dannelse af de liposomer, 5 der kan anvendes i den foreliggende fremgangsmåde, indbefatter phosphati-dylcholin, phospatidylserin, phosphatidinsyre og blandinger heraf. Der kan med held anvendes både naturlige og syntetiske phospholipider.

Det indkapslede biologisk aktive eller terapeutiske materiale er fortrinsvis 10 vandopløseligt. Eksempler på egnede terapeutiske midler, hvormed denne præserveringsmetode vellykket kan udføres, indbefatter sympathomimetiske medikamenter, såsom amphetaminsulfat, epinephrinhydrochlorid eller ephedrinhydrochlorid; antispasmodicum, såsom atropin eller scopalamin; bronchodilatorer, såsom isoprotemol; vasodilatorer, såsom dilthiazen; hor-15 moner, såsom insulin, og antineoplastiske medikamenter, såsom adriamycin. Egnede biologisk aktive molekyler indbefatter f.eks. RNA, DNA, enzymer og immunoglobuliner.

Små unilamellare vesikler (SUV’er) fremstilles som udgangsmateriale forud 20 for indkapsling af trehalose, og de kan fremstilles ved enhver af de til rådighed værende fremgangsmåder. Egnede fremgangsmåder indbefatter injektion af lipidet i et organisk opløsningsmiddel i vand, ekstrusion fra en “fransk trykcelle” og lydbehandling. Det materiale, som skal indfanges, kan tilsættes i ethvert trin under fremstillingen af de små unilamellare vesikler, men i praksis 25 er det mest passende at blande de små unilamellare vesikler med en vandig opløsning at det materiale, som skal fanges, umiddelbart før fremstilling af store unilamellare vesikler. Foretrukne vægtforhold mellem det indkapslede og lipidet ligger på ca. 1,0:1,0.

30 Store unilamellare vesikler (LUV'er) med forøget indfangningsvirkning kan derpå fremstilles ved enten frysetørring eller rotationsfordampning. Et eksempel på en rotationsfordampningsfremgangsmåde, og en fremgangsmåde som især er virkningsfuld i forbindelse med den foreliggende fremgangsmå-

DK 175799 B1 I

de, er illustreret i Deamer, D.W., “A Novel Method for Encapsulation of I

Macromolecules in Liposomes” i Gregoriadis, G. (redaktør) Liposome Tech- I

noloov (1984). Fremgangsmåden omfatter tilvejebringelse af en polær opløs- I

ning med initielle liposomer og en mængde-af det materiale, som skal ind- ' I

5 kapsles. I det væsentlige fjernes al opløsning, og de resulterende liposomer I

genvindes ved hydrering af den koncentrerede blanding. Denne fremgangs- I

måde er også omtalt i beskrivelsen til U.S. Patent nr. 4.515.736 til Deamer, et I

al. De resulterende vesikler kan derpå gøres mere ensartet ved filtrering, I

centrifugering eller gelgennemtrængningschromatografi. I

Trehalose kan tilsættes i ethvert trin under fremstillingen at de store unilamel- I

lare vesikler, men en meget forbedret præservering opnås når trehalose er til I

stede på begge sider af phospholipidbilaget. Trehalose tilsættes derfor for- I

trinsvis før de store unilamellare vesikler fremstilles, således at trehalose H

15 fanges i det indre. Det foretrukne vægtforhold mellem total trehalose og lipid I

er af størrelsesordenen på fra ca. 0,1:1 til ca. 3,0:1, et særligt foretrukket

vægtforhold er ca. 1,0:1,0. De store unilamellare vesikler fryses derpå i fly- I

dende nitrogen og frysetørres. I visse tilfælde, som når der anvendes lipider, I

der er følsomme over for skade på grund af tilstedeværelse af oxygen, er det I

20 ønskeligt at forsegle de tørre præparationer under vacuum. Rehydrering ud- I

føres simpelthen ved at tilsætte vand til den tørre blanding. I

Selvom liposomerne i en foretrukken udførelsesform af den foreliggende op- I

findelse udsættes for trehalose, bør det forstås, at en lang række præserve- I

25 ringsmidler kan erstatte trehalose, indbefattende kulhydratforbindelser, der I

består af mindst to monosaccharidenheder. Især er sucrose og maltose eg- I

nede alternativer. I

De følgende eksempler illustrerer visse aspekter og udførelsesformer af den I

30 foreliggende opfindelse, og har ikke til hensigt at begrænse rækkevidden af I

opfindelsen, der er defineret i de efterfølgende krav. I

7 DK 175799 B1

Eksempel 1

En phospholipidblanding bestående af ca. 40 mg dipalmitoyl- ( phosphatidylcholin og phosphatidinsyre i et molfortiold på 95:5 blev lydbe-5 handlet til optisk klarhed i et bad-tydbehandlingsapparat. Store unilamellare vesikler blev fremstillet ved frysetørring i en 50 mM opløsning at isocitronsyre i vand som den forbindelse, der skal indkapsles. Overskud af isocitronsyre blev fjernet ved dialyse. Trehalose (2,0:1,0, trehalose: phospholipid-vægtforhold) blev tilsat enten før eller efter frysetørring til tilvejebringelse at 10 nogle store unilamellare vesikler kun med trehalose udvendigt og nogle vesikler med trehalose både indvendigt og udvendigt. I socitronsyren blev analyseret ved at tilsætte isocitratdehyd rogenase og NADP til ydersiden af ve-siklerne i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Plaut, et al. (redaktører), Methods ifl Enzymoloav. Volume 5 (New York, Academic Press).

15 Det isocitrat, der var udenfor vesikleme, blev oxideret af isocitratdehydroge-nase resulterende i reduktion af NADP til NADPH, hvilken hastighed og mængde kan bestemmes fluorometrisk. Total isocitronsyre i vesiklerne blev analyseret efter tilsætning af Triton X-100 (octylphenoxypolyethoxyethanol, en detergent og et emulgeringsmiddel, der fremstilles at Rohm & Haas Co., 20 Philadelphia, PA, “TRITON” er et registreret varemærke fra Rohm & Haas Co.), som frigiver det fangne isocitronsyre til det omgivende medium. Den isocitronsyre, som var fanget i vesikleme, blev analyseret både før og efter frysetørring og rehydrering, og der tilvejebringes således et estimat af den virkning, hvormed det indfangne isocitrat tilbageholdes. Som det fremgår af 25 tabel 1 viser resultaterne, at over 60% af det indfangne isocitrat blev tilbageholdt, når vesiklerne blev frysetørret med trehalose både udenfor og indeni vesikleme. Når trehalose kun var til stede udenfor, var der stadig en signifikant stigning i virkningen af tilbageholdelse, men til en mindre grad end den i det tilfælde, hvor trehalose var til stede på begge sider af lipidmembranen.

30 Estimering af lipidkoncentrationen ved tidspunktet for frysning viste, at denne ikke havde nogen signifikant virkning på tilbageholdelse af det indfangne materiale efter frysetørring.

I DK 175799 B1 I

I I

I Tabel 1 I

I Fremgangs- A I

I måde til Koncen- g Treha- Trehalose I

fremstilling tration lose/g % Reten- I

I af LUV'er af lipid lipid udvendigt indvendigt tion I

(mg/ml) I

I FT* 10,8 o - - 0 I

I FT 11,1 0,08 - + 0 I

I FT 10,8 1,78 + 42

I FT 11,1 1,78 + + 61 I

I 5 *FT = frysetørring H

I Eksempel 2 H

I 10 Små unilamellare vesikler blev fremstillet ved lydbehandling af 43 mg æg- I

I gephosphatidylcholin i 4 ml vand. Store unilamellare vesikler blev fremstillet H

I ved rotationstørring af phospholipidet under tilstedeværelse af 32 mg treha- H

I lose og 13 mg isocitronsyre. Vægtforholdene mellem phospholi- I

pid:trehalose:isocitronsyre var ca. 4:3:1. Overskud af isocitronsyre og treha- I

I 15 lose blev fjernet ved dialyse mod destilleret vand, og den mængde isocitron- I

syre, der er fanget i vesikleme, bestemmes ved den enzymanalyse, som er I

beskrevet i eksempel 1. Der blev tilsat trehalose til de dialyserede liposomer I

I til opnåelse af et endeligt vægtforhold mellem phospholipid:trehalose på I

I 1,0:1,4, og prøven blev frysetørret. Prøven blev derpå rehydreret med destil- I

I 20 leret vand, og den resterende isocitronsyre i liposomerne blev bestemt ved I

I enzymanalyse. De lyophiliserede vesikler tilbageholdt 75% af deres oprinde- H

I lige indhold. I

9 DK 175799 B1

Eksempel 3 f En phospholipidblandi ng af palmitoyloleoylphosphatidylcholin (90%) og phosphatidylserin (10%) blev hydreret til 10 mg/ml, og små unilamellare ve-5 sikler blev fremstillet ved lydbehandling. Store unilamellare vesikler blev fremstillet ved rotationstørring under tilstedeværelse at isocitronsyre, som tjente som det indkapslede molekyle. Der blev i det væsentlige anvendt de samme metoder som tidligere beskrevet i eksempel 1 og 2. Effektiviteten af isocitronsyrens retention efter frysetørring og rehydrering blev registreret, 10 som tidligere nævnt i forbindelse med store unilamellare vesikler, der først er blevet frysetørret under tilstedeværelse af og derpå uden trehalose. Som det fremgår af Tabel 2 viser resultaterne at 100% af det indfangne isocitronsyre tilbageholdes, når store unilamellare vesikler frysetørres og rehydreres under de fastlagte forhold. Som vist i de tidligere eksempler er trehalose fortrinsvis 15 tilstede både udenfor og indenfor for at optimere retentionen at det indkapslede.

Eksempel 4 20

Et at de skadelige forhold, som antages at forekomme under frysetørringen, er tæt forbindelse af de store unilamellare vesikler med hinanden, hvilket fører til fusion og udstrømning af de vesikulære indhold. Fusionen er blevet analyseret ved resonansenergioverførelse, der er en fluorescensmetode, 25 som afhænger af energioverførelse fra en exiteret probe (“donor probe") til en anden probe ("acceptor probe”). Acceptorproben flourescerer når energioverførelsen sker. For at overførslen sker, må de to prober være i umiddelbar nærhed af hinanden. Probesammenblanding blanding kan således anvendes som en analyse for fusion mellem vesikleme under frysetørring. Der blev 30 fremstillet store unilamellare vesikter med donorprobe i et præparat og ac-ceptorprobe i et andet, og de to præparater blev blandet før frysetørring. Efter frysetørring og rehydrering blev probesammenblandingen målt med opnåelse af de resultater, som er angivet i Tabel 3. Resultaterne viser, at med i

I DK 175799 B1 I

I I

I stigende trehalosekoncentration er der et fald i probeblanding. Ydermere re- I

ducerer tilstedeværelsen af trehalose alene inden i liposomeme væsentlig I

I probeblanding. Anvendelse af trehalose har således en tendens til at reduce-

I re vesikelfusion. * I

I I

I Tabel 2 I

I Fremgangs- I

I måde til g Treha- Trehalose I

I fremstilling lose/g % Reten- I

I af LUV’er lipid udvendigt indvendigt tion H

I RD* 0,06 + o I

I RD 3,2 + + 100 I

I RO 0 - .0 I

I RD 3,9 + 26 I

I RD 0,11 + +22 I

I RD 0,19 + + 49 I

I RD 0,33 + + 69 I

I RD 0,63 + + 76 I

I RD 0,91 + + 86 I

I RD 1,76 + + 99 I

I RD* = rotationstørring I

11 DK 175799 B1

Tabel 3 , Fremgangsmåde til g Treha- Trehalose fremstilling lose/g % Probe- åf LUV’er lipid udvendigt indvendigt blanding RD* 0,05 - + 72 RD 0,15 + + 39 RD 0,25 + +29 RD 0,50 + + 12 RD 0,95 + +8 FT** 0, - - 93,0 FT 0,4 + + 79,0 FT 0,8 + + 59,0 FT 1,2 + + 54,0 FT 1,6 + + 38,0 FT 2,0 + + 15,0 *RD = rotationstørring 5 **FT = frysetørring

Fusion mellem palimtoyloleoylphosphatidylcholin:

Phospatidylserin (90:10) store unilamellare vesikler, som analyseret ved resonansenergioverførsel mellem flourescensprober.

10

Eksempel 5

Der blev udført et yderligere forsøg, som var identisk med det, der er beskrevet i eksempel 3, først med maltose og derpå med sucrose som præserve-15 ringsmiddel. Resultaterne er anført i Tabel 4 og 5. Som det kan konkluderes af disse tabeller, tilvejebringer både maltose og sucrose god retention af det indkapslede materiale efter frysetørring.

DK 175799 B1 I

Tabel 4 I

Fremgangs- H

måde til Maltose * H

fremstilling g Maltose % Reten- H

af LUV’er /g lipid udvendigt indvendigt tion H

RD 0,05 + 3

RD 0,15 + +41 I

RD 0,25 + + 88 I

RD 0,49 + + 95 I

RD 0,64 + + 100 I

Tabel 5 I

Fremgangs- H

måde til Sucrose H

fremstilling g sucrose % Reten-

af LUV’er /g lipid udvendigt indvendigt tion H

RD 0,07 - + 20 I

RD 0,35 + + 57 I

RD 0,49 + + 89 I

RD 0,83 + + 86 I

RD 1,15 + + 91 I

Claims (11)

1. Fremgangsmåde til præservering af liposomer, kendetegnet ved, 5 at der tilvejebringes initielle liposomer med lipidmembraner, hvilke liposomer har en initiei mængde af et heri indkapslet vandopløseligt materiale, hvilket indkapslet materiale omfatter en hvilken som helst af carbonhydraterne trehalose, maltose og sucrose, 10 at disse initielle liposomer bringes i kontakt med en vandig opløsning indeholdende en hvilken som helst af trehalose, maltose og sucrose og, at de initielle liposomer lyophiliseres i den vandige opløsning til dannelse af lyophilisater indeholdende mindst 80% intakte liposomer. 15

2. Fremgangsmåde til fremstilling af liposomer, kendetegnet ved, at der tilvejebringes initielle liposomer med lipidmembraner, hvilke liposomer har en initiei mængde af et heri indkapslet vandopløseligt materiale, hvilket indkapslet materiale omfatter en hvilken som helst af carbonhydraterne tre-20 halose, maltose og sucrose at disse initielle liposomer bringes i kontakt med en vandig opløsning indeholdende en hvilken som helst af trehalose, maltose og sucrose, 25 at de initielle liposomer lyofiliseres i den vandige opløsning til dannelse af lyophilisater indeholdende mindst 80% intakte liposomer, og at lyofilisaterne bringes i kontakt med en vandig opløsning til dannelse af re-hydrerede liposomer. 30 I DK 175799 B1 I I I

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at de rehydrerede I I liposomer indkapsler op til ca. 100% af den initielle mængde af indkapslet ! I materiale. I I 'I I 5

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, k e n d e t e g n e t ved, at vægtfor- I I holdet mellem den indkapslede carbonhydrat og liposomernes lipid er fra ca. I I 0,05:1 til ca. 0,10:1. I

5. Lyofiliseret sammensætning, der er anvendelig til lagring af indkapslet ma- I I 10 teriale, k e n d e t e g n e t ved, at det er fremstillet ved en fremgangsmåde, I som omfatter: I I at der tilvejebringes initielle liposomer, hvilke liposomer har en initiel mængde I af et heri indkapslet materiale, hvilket materiale omfatter en trehalose- eller I 15 maltosemængde, I I at de initielle liposomer bringes i kontakt med en trehalose- eller maltose- I I mængde i vandig opløsning, I I 20 at de initielle liposomer lyofiliseres under tilstedeværelse af trehalose eller H I maltose til dannelse af lyophilisater. I

6. Sammensætningen ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det indkap- I siede materiale omfatter et vandopløseligt terapeutisk middel eller en biolo- . I I 25 gisk aktiv forbindelse. I

7. Sammensætningen ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det indkap- I I siede materiale omfatter et macromolekyle. I

8. Sammensætningen ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det indkap- I siede materiale omfatter et sympathomimetisk medikament, et antispas- I DK 175799 B1 modisk, et vasodilatorisk og/eller et antineoplastisk medikament, RNA, DNA, et enzym eller et immunoglobulin.

9. Præserveret sammensætning, kendetegnet ved, at den omfatter 1 5 lyophilisater med en lipidbestanddel, en disaccharidbestanddel og en initiel mængde af en indkapslet bestanddel, hvorhos disaccharidbestanddelen omfatter trehalose og er til stede i et vægtforhold i forhold til lipidbestanddelen på fra ca. 0,1:1 til ca. 3,0:1, lipidbestanddelen danner lipidmembraner med 10 en inderside og en yderside, disaccharidbestanddelen er til stede i lyo-philisateme på både indersiden og ydersiden af lipidmembranerne, og i det ' mindste størstedelen af den initielle mængde af indkapslet materiale er til stede i lyophilisateme på indersiden af lipidmembranerne.

10. Sammensætning ifølge krav 9, kendetegnet ved, at trehalosen i disaccharidbestanddelen er til stede i lyophilisateme på både indersiden og ydersiden af lipidmembranerne og er effektiv til tilbageholdelse af det meste af den initielle mængde af indkapslet materiale på indersiden af lipidmem-braneme under rekonstituering af lyophilisateme. 20

11. Sammensætning ifølge krav 9 eller 10, kendetegnet ved, at det indkapslede materiale omfatter et vandopløseligt terapeutisk middel, en biologisk aktiv forbindelse eller et diagnostisk middel, og at lyophilisateme ‘ kan indvindes som liposomer, der indkapsler mindst størstedelen af den ini- l 25 tielle mængde af den indkapslede bestanddel, ved at blande lyophilisateme med en vandig opløsning. i I 30