DK171259B1 - Specifikke ekskretion-sekretions antigener af Toxoplasma gondii, translatiosprodukter deraf, fremgangsmåde til fremstilling deraf og diagnostiske anvendelser deraf - Google Patents

Description

i DK 171259 B1

Den foreliggende opfindelse angår generelt området identifikation af antigener udskilt-afsondret af tachyzoitter af Toxoplasma gondii (TG) og antigener, der er fælles for denne parasits tachyzoitter og bradyzo-itter, translationsprodukter af disse antigener og anvendelser af anti-5 generne og translationsprodukterne, navnlig til immunobeskyttelse mod TG tachyzoitterne og til tidlig diagnose af toxoplasmose, navnlig kongeni-tal toxoplasmose. Mere specielt angår opfindelsen inden for dette område et antigenisk præparat, ES-antigener, translationsprodukter, fremgangsmåde til kloning af translationsprodukterne, serum, monoklonalt anti-10 stof, vaccine, diagnostiske produkter og fremgangsmåder til påvisning af og/eller screening for toxoplasmose.

Den protozoiske parasit Toxoplasma qondii. der tilhører klassen Sporozoa og ordenen Coccidia er en intracellulær parasit, som reproducerer sig i mange forskellige typer af celler i det indre af sine vær-15 ter, som er pattedyr. Hos mennesket finder det mest betydelige angreb, som denne organisme forårsager, sted i fosteret under udvikling og i patienter med immundefekt (AIDS etc.). Toxoplasmose er ansvarlig for alvorlige okkulære og cerebrale og selv dødelige angreb hos nyfødte, der er kontamineret ad transplacental vej, samt hos immundefektpatienter.

20 Hos mennesket er der beskrevet to parasitformer, "tachyzoitten", som er den multi pi i kative form, der optræder under sygdommens akutte fase, og "bradyzoitten", der er den resistente form, som bliver tilbage indkapslet i nervevævet, og som sandsynligvis er ansvarlig for opretholdelsen af en varig immunitet mod reinfektion.

25 Denne parasit er et vigtigt patogen ikke kun hos mennesket, men ligeledes inden for veterinærmedicinen, og dens geografiske udbredelse er meget stor, hvilket den kendsgerning, at det har kunnet fastslås, at nær ved 500 millioner mennesker i hele verden frembyder en positiv serologisk reaktion på infektionen, vidner om.

30 Hughes, "Current Topics in Microbiology and Immunology" bind 120 (1985), Springer Ed., side 105-139, giver en oversigt over de forskellige disponible serodiagnostiske tests: Sabin og Feldmans farvetest, der er standardiseret af Beverly og Beattie (1958) og perfektioneret af Feldman og Lamb (1966), Waldeland (1976) og Balfour et A1. (1982), 35 hvilken kræver levende parasitter, store mængder af normalt humant serum og veluddannede specialister til udførelse af testen; testen til påvisning af antistoffer ved immunofluorescens, hvilken frembyder de samme ulemper som farvetesten, og som er udformet af Remington (1968) og per- DK 171259 B1 2 fektioneret af Karim og Ludlam (1975); hæmagglutineringstestene, hvis resultater er for langsommelige, navnlig til påvisning af tilstedeværelse af parasitten hos gravide kvinder; ELISA-testen til påvisning af Toxoplasmaantistoffer ved isolering af IgM in situ på testmi kropladen 5 (Wiel aard et Al., 1983). Ved serologiske tests, hvortil der anvendes opløselige antigener, opnås sidstnævnte imidlertid ved simpel ekstraktion (lyse med vand, frysning og optøning eller sprængning med ultralyd af tachyzoitter af Toxoplasma). Disse teknikker sikrer kun tilstedeværelsen af membranantigener i testsystemet, hvis de er let opløselige i vand el-10 ler puffer, eller hvis det sidste centrifugeringstrin kun lader lidt af membranfragmenterne bestå i suspension i opløsningen.

De forskellige anvendte tests hviler på dannelsen af antistoffer til påvisning af forskellige antigener, og identifikationen af disse antigener er derfor vigtig med henblik på at forbedre testenes pålide- 15 lighed og følsomhed. Tre Toxoplasmaantigener har kunnet identificeres af

Chordi et Al. (J. Immunol., 93 (1964) side 1034-1044), derefter kunnet bekræftes af Hughes og Balfour (Parasite Immunol., 3, (1981), side 235- 248) og deres intracellulære oprindelse fastslås. Analysen af Toxo- plasmapolypeptider hidrørende fra ultralydsbehandlede organismer ved 125 20 SDS-PAGE og ved fiksering af concanavalin mærket med I har vist eksistensen af ni intracellulære polypeptider af parasitoprindelse med molekylvægte mellem 20.000 og 98.000, hvoraf ingen er glycosyleret. Det er til sidst blevet vist, at ti polypeptider opnået ved lydbehandling efterfulgt af præcipitation med museimmunserum frembød antigeniske egen-25 skaber.

Chemical Abstracts vol. 105, nr. 15, p. 491, beskriver exo-antigener opnået fra cellulære kulturer af Toxoplasma gondii. Ved den foreliggende opfindelser sker inkubationen af TG i et cellefrit medium, og de fremstillede ES-antigener får nogle helt specifikke egenskaber, 30 som ikke opnås ved den kendte teknik.

Kohier og Milsteins teknik til hybridisering med lymfoide celler har gjort det muligt at udvikle monoklonale antistoffer til undersøgelse af den antigeniske struktur af Toxoplasma. Hughes [(1985) anførte sted] nævner, at på udgivelsesdatoen var der beskrevet 32 monoklonale anti-35 stoffer, som reagerer på Toxoplasmamembranantigener. Alle er defineret ud fra et serologisk synspunkt. Fire frembyder på én gang reaktivitet over for membran- og cytoplasmakomponenterne, og 28 er kun positive ved tests til genkendelse af membranantigener. De på disse monoklonale anti- DK 171259 B1 3 stoffer anvendte immunopræcipitations- og SDS-PAGE-tests har vist, at størsteparten af dem har reageret på antigener med molekylvægte på 35KD, 27KD og 14KD. De fra klon 3E6 og 2G11 stammende antistoffer præcipiterer begge antigenerne med molekylvægt 35KD og 14KD [Handman et Al. J.

5 Immunol., (1980) side 2578-2583], og det samme gør de af Johnson et Al.

[J. Exp. Biol. Med. Sci. 52 (1981)» side 303-306] udviklede monoklonale antistoffer FMC 18, FMC 22 og FMC 23, idet alle disse antistoffer er specifikke for tachyzoitmembraner. Kasper et Al. [J. Immunol. (1982), 129. side 1694-1699 og (1983) 13fi, side 2407-2412] har for nylig be-10 skrevet to præcipiterbare antigener med molekylvægt 22KD (P22) og 30KD (P30).

Desuden har Johnson et Al. [J. Protozool (1983), 10, side 351-356] vist at monoklonale antistoffer, som reagerer på samme membranantigen, kan genkende forskellige epitoper, og Hughes foreslår i relation til 15 sidstnævnte arbejder (side 11, anførte sted), at lignende undersøgelser kunne udføres på andre monoklonale antistoffer, som genkender et fælles antigen, og kunne gøre det muligt at definere den molekylære struktur af de omhandlede epitoper.

I sin ret omfattende oversigt (anførte sted) understreger Hughes 20 ligeledes vigtigheden af påvisningen af antigener, som cirkulerer i legemsfluiderne: medens infektionen med Toxoplasma gondii normalt fører til en hurtig humoral reaktion, som kan påvises ved serologiske tests, såsom de ovenfor anførte, kan disse være utilstrækkelige for lægen, når det er nødvendigt hurtigt og nøjagtigt at diagnosticere tilstedeværelsen 25 af en akut infektion på grundlag af en enkelt prøve af serum. Dette er specielt vigtigt i tilfælde af en patient med immundefekt, som udgør en smittefare, eller i tilfælde af underliggende hypogammaglobulinæmi. Hvis påvisningen af en antigenæmi ligesom under den akutte fase af infektionen gør det muligt i dette tilfælde at bekræfte tilstedeværelsen af en 30 aktiv infektion ved den kongenitale toxoplasmose, kan påvisningen af antigener i legemsfluider, såsom fostervandet eller cerebrospinalvæsken, ligeledes give en indikation med hensyn til alvoren af infektionen med Toxoplasma og som følge deraf gøre det muligt at tage beslutninger med hensyn, til hvilken terapeutisk plan og prognose der skal vælges.

35 Dobbeltdiffusionsundersøgelser har vist, at et cirkulerende antigen påvist i serum fra mus angebet af akut toxoplasmose frembyder komponenter, der er fælles med Toxoplasmaekstrakter lyseret med vand, er et termolabilt protein (56°C/30 minutter) og har en molekylvægt (opnået DK 171259 B1 4 efter isolering ved affinitetskromatografi) på mere end 100.000, og det samme gælder cirkulerende antigener, som forefindes i serum fra inficerede rotter.

De cirkulerende antigener kan frigøres på to måder, dels ved aktiv 5 sekretion af parasitten, dels ved immunolyse. Det er blevet vist, at de cirkulerende antigener ikke frembyder immunologisk identitet med simple vandige ekstrakter eller peritoneal skyl ni nger, hvilket medfører, at antigenæmi ikke blot er et resultat af hensygnende parasitter eller frigørelse af antigener fra inficerede celler. Desuagtet er det antigen, 10 der forefindes i de cirkulerende immunkomplekser, der for nylig er beskrevet af Siegel og Remington [Clin. Exp. Immunol. (1983) 5£, side 157-163] endnu ikke blevet identificeret.

I øvrigt understreger Johnson [Pathology (1985), 17, side 9-19], at størsteparten af arbejderne vedrørende dette emne har anvendt parasit-15 tens "tachyzoit"form som antigenkilde, eftersom den naturlige overførsel svej for toxoplasmose er oral indtagelse enten af sporozoitter, som forefindes i oocytterne (som kun findes hos katten), eller brady-zoitter i kapslerne i vævet. Det er blevet påvist, at der findes et fælles antigen for fem former (schizont, gametocyt, sporozoit, tachyzo-20 it, bradyzoit) i Toxoplasmas livscyklus, og at et antiserum mærket med fluorescein fremstillet mod tachyzoitten, reagerer specifikt med de fire andre former. Imidlertid har andre forfattere [Lunde og Jacobs, J.

Parasitol. (1983) 69, 806-808] vist, at der er antigeniske forskelle mellem tachyzoitterne og bradyzoitterne, idet anti-bradyzoitantiserum 25 mærket med fluorescein ikke reagerer over for bradyzoitterne, mens anti-tachyzoitaniserum lige så vel reagerer over for tachyzoitter som over for bradyzoitter. Ligeså har forsøg udført af Kasper et Al. [J. Immunol.

(1984), 132» side 443-449] bekræftet dette resultat, skønt de antigeniske forskelle, som de har påvist mellem sporozoitterne og tachyzoit-30 terne, kunne gøre det muligt at se frem til muligheden for at udvikle diagnostiske tests egnet til at skelne mellem de to typer infektion med Toxoplasma.

Ifølge Hughes (anførte sted) vil vaccinationen mod toxoplasmose kun kunne forventes at være mere vellykket med monoklonale antistoffer end 35 de hidtidige forsøg (vacciner med dræbte eller svækkede organismer), for så vidt som det vil kunne fastslås, at antigener isoleret ved affinitetskromatografi under anvendelse af de af Johnson et Al. (anførte sted) isolerede antistoffer FMC19 og FMC22 er beskyttende, og at de er egnet DK 171259 B1 5 til at fremkalde en humoral reaktion. De resultater, der er rapporteret indtil da, er ikke tilstrækkelig overbevisende i denne henseende indtil i dag: Johnson et Al. (1983, anførte sted) har fundet, at de monoklonale antistoffer FMC19 og FMC22 kan fremkalde en beskyttelse mod virulente og 5 meget virulente stammer af Toxoplasma ved at reagere med antigenerne med molvægt 35KD og 14KD; imidlertid fremkalder andre monoklonale antistoffer, som fælder de samme antigener ved SDS-PAGE analyse ikke samme grad af beskyttelse, således at forfatterne har formodet, at de genkender forskellige epitoper på samme antigen. De to monoklonale antistoffer, 10 som fremkalder en beskyttelse, er henholdsvis af i sotype IgG3 og IgGl.

De to monoklonale antistoffer, som ikke fremkalder signifikant beskyttelse, er henholdsvis af isotype IgGl (FMC23) og IgG2a (2G11). Hvis, hvad FMC23 angår, fraværet af beskyttelse faktisk skulle tilskrives forskellen mellem de epitoper, der genkendes i forhold til FMC19 eller 15 FMC22, kunne den ligeledes skyldes forskelle i karakteristika mellem underklassen IgG2a og underklasserne IgGl og IgG3.

Kasper et Al. [J. Immunol. (1985) 134» side 3426-3431], har beskrevet forsøg med immunisering af mus med et renset membranprotein fra tachyzoitter af Toxoplasma gondii, proteinet P 30, og et monoklonalt 20 antistof rettet mod dette antigen. De har hos de behandlede mus iagttaget en signifikant statistisk forøgelse af dødeligheden i forhold til ikke-immun i serede kontrolmus, og hos de vaccinerede mus et øget antal af intercerebrale vævsindkapslinger i forhold til en kontrolgruppe. Lignende resultater er blevet opnået ved en passiv immunisering ved overførsel 25 ved hjælp af monoklonalt antistof rettet mod P 30 antigenet. Da bradyzo-itter hverken indeholder P30 antigen eller P 22 antigen, er det ifølge forfatterne ikke udelukket, at dette mislykkede forsøg skyldes parasitternes resistens mod anti-tachyzoitantistoffer.

De seneste arbejder inden for dette område har været genstand for 30 sammendrag publiceret i oversigten "Molecular Strategies of Parasitic Invasion", udgivet af UCLA, januar 1986:

Boothroyd, Burg, Nagel, Ossorio, Perelman, Kasper, Ware, Prince, Sharma og Remington (Sammendrag C19) har anvendt teknikker, der gør brug af re-kombinant DNA og monoklonale antistoffer med det formål bedre at forstå 35 toxoplasmosens biologiske egenskaber og de inducerende egenskaber. Til dette formål har de anvendt monoklonale og polyklonale antistoffer rettet mod parasittens væsentligste overfladeantigener til at isolere og karakterisere de respektive gener. De har frembragt partielle eller kom- DK 171259 B1 6 plette sekvenser af nucleotider for visse af disse gener, og de har ligeledes klonet og delvis sekvensbestemt generne for a- og Ø-tubuliner, som hver især kun forefindes i et enkelt eksemplar i Toxoplasma aondii. Sidstnævnte har været genstand for en mere forceret karakterisering, 5 rapporteret i sammendrag C 59 af Nagel og Boothroyd.

Burg, Perelman og Boothroyd (Sammendrag C 85) beskriver udviklingen af en ekspressionsbank i fagen AGtll under anvendelse af det genome DNA fra Toxoplasma aondii og isolering ud fra denne bank ved hjælp af immun-serummer fra mus inficeret med Toxoplasma gondii af en sekvens med kod-10 ningspotentiel for en væsentlig antigenisk determinant for parasitten, som er genet TgBl. Denne sekvens synes specifik for Toxoplasma aondii. og den i klonen TgBlAgtll frembragte antigeniske determinant genkendes af immunserummet fra mus, rotte og menneske.

Disse forfattere beskriver ligeledes sorteringen af en bank til 15 ekspression af Toxoplasmas cDNA (ligeledes konstrueret ved hjælp af fagen gt11) til isolering af sekvenser, der koder for de antigener, der forefindes på parasittens overflade, ved hjælp af polyklonalt antiserum rettet mod de rensede antigeniske overfladeproteiner P 30 og P 22. Ved anvendelse af cDNA fra P 22 antigenet som probe ved en Northern immuno-20 overførsel påviste de en enkelt type RNA med ca. 1600 nucleotider.

Prince, Remington og Sharma (Sammendrag C 106) har karakteriseret et Toxoplasma gondii antigen, der genkendes af et monoklonalt antistof (mabJFgGj, om hvilket de har bestemt, at det hos mus frembringer en langvarig (mere end 9 måneder) beskyttende immunitet. Kloningen af 25 gener, der koder for Toxoplasma gondii antigenerne er opnået ved arbejde med en bank af cDNA fra tachyzoitter i ekspressionsvektoren gtll efterfulgt af sortering af denne ved hjælp af et polyklonalt museantistof rettet mod antigenet F3G3.

Rekombinante kloner isoleret ved sortering ved hjælp af den mono-30 specifikke antistofprobe indeholder et indskud af DNA fra Toxoplasma gondii, som koder for 1/6 af det intakte protein, og det rekombinante antigen, som fås fra disse kloner, genkendes ligeledes af (mab)F3G3-

De inden for toxoplasmoseområdet udførte arbejder har i vidt omfang vist: behovet for at identificere antigener for tachyzoitstadiet og bra-35 dyzoitstadiet, som frembyder fælles epitoper, for at gøre det muligt at etablere en samtidig immunitet; behovet for at identificere antigener udskilt-afsondret af tachyzoitter og vurdere betydningen af deres rolle i den beskyttende immunitet og behovet for at klarlægge rollen af anti- DK 171259 B1 7 stoffer af IgE typen i den beskyttende immunitet mod toxoplasmose.

Den foreliggende opfindelse angår et antigenisk præparat fra Toxoplasma gondii (TG), hvilket præparat er karakteriseret ved, at det kan opnås ved: 5 - inkubation af en suspension af Toxoplasma gondii tachyzoitter i ca. 3 timer i et cellefrit medium af RPMI 1640 type indeholdende 10% komplementbefri et serum af human eller animalsk oprindelse, - centrifugering af den inkuberede suspension og udvinding af su-pernatanterne fri for parasittiske substanser og indeholdende ekskre- 10 tions-sekretions antigenerne (ES antigener), - filtrering af supernatanterne til opnåelse af det antigeniske præparat, samt eventuelt - koncentrering af det antigeniske præparat og frysning til -70°C, og at 15 det indeholder en blanding af ekskretions-sekretions antigener fra TG tachyzoitter, som er i stand til at fremkalde en beskyttende humoral reaktion af IgE type mod toxoplasmose.

I forbindelse med deres forskning vedrørende humane parasitsygdomme og navnlig toxoplasmose er opfinderne nået frem til at identificere 20 effektormekanismerne og de immunoregulatoriske mekanismer for disse lidelser, og de har navnlig kunnet fastslå betydningen af udskilte-afsondrede antigener ved udviklingen af en immunobeskyttende reaktion, når membranantigener er specielt involveret i fremkaldelsen af såvel effektor- som blokeringsisotyper.

25 Disse opdagelser har fået opfinderne til at forsøge at isolere disse udskilte-afsondrede antigener, navnlig med det formål at opnå en vaccine mod toxoplasmose.

Ifølge opfindelsen foretrækkes et antigenisk præparat, som er karakteriseret ved, at det består af ekskretions-sekretions antigener 30 fra TG tachyzoitter med respektive molekylvægt på ca. 185KDa, 170KDa, 155KDa, 105KDa, 98KDa, 84KDa, 68KDa, 57KDa, 53KDa, 45KDa, 43KDa, 39KDa, 35KDa, 34KDa, 31KDa, 30KDa, 26KDa, 25KDa, 24KDa og 20KDa.

I overensstemmelse med opfindelsen kan ES-antigenerne fra Toxoplasma gondii opnås ud fra det antigeniske præparat ifølge opfindelsen 35 ved - immunopræcipitation af de forskellige i præparatet indeholdte ES antigener, som på forhånd er blevet radiomærket, ved at bringe præparatet i kontakt med et mammalt serum, navnligt et passende humant eller DK 171259 B1 8 animalsk serum udvalgt fra gruppen omfattende sera udtaget fra patienter og erkendt som seropositive (enten fra den akutte fase indeholdende specifikke IgM'er eller fra den subakutte fase indeholdende både IgM'er og IgG'er eller fra den kroniske fase indeholdende IgG'er), og sera opnået 5 ved immunisering ved et antigenisk præparat ifølge krav 1 eller 2 og indeholdende anti-ES antistoffer, - opfangning af de dannede antigen/antistofkomplekser (immunopræci-pitater) på perler af A-Sepharose® protein, som eventuelt er behandlet med henblik på at binde antistofferne af IgG type og antistofferne af 10 IgM type, - separation af ES antigenerne ved centrifugering og udvinding af supernatanterne indeholdende de dissocierede immunopræcipi tater, og eventuelt - polyacrylamidgel elektroforese af immunopræcipitaterne.

15 ifølge en fordelagtig udførelsesform af opfindelsen har antigenerne en molekylvægt på 185KDa, 170KDa, 155KDa, 105KDa, 57KDa, 53KDa, 45KDa, 43KDa, 39KDa, 35KDa, 34KDa, 31KDa, 30KDa, 26KDa, 25KDa og 24KDa. Disse antigener erkendes under den kroniske fase.

Ifølge en anden fordelagtig udførelsesform af opfindelsen identifi-20 ceres har ES antigenet en molekylvægt på 105KDa. Dette svarer til en markør af den kroniske fase af toxoplasmose.

Ifølge endnu en fordelagtig udførelsesform af opfindelsen har ES antigenet en molekylvægt 84KDa. Dette svarer til en transitorisk markør af den kroniske fase af toxoplasmose.

25 Ifølge en anden fordelagtig udførelsesform af opfindelsen har ES - antigenet en molekylvægt 98KDa. Dette svarer til en markør af den akutte fase af toxoplasmose.

Ifølge yderligere en fordelagtig udførelsesform af opfindelsen har ES antigenet en molekylvægt 68KDa. Dette svarer til en markør af den 30 akutte fase af toxoplasmose.

Ligeledes i overensstemmelse med opfindelsen kan ES antigenerne opnås samtidigt med immunopræcipitation af det antigeniske præparat ifølge opfindelsen - med et passende serum udvalgt fra gruppen omfattende sera udtaget 35 fra patienter og sera opnået ved immunisering med et antigenisk præparat ifølge krav 1 eller 2 og indeholdende anti-ES antistoffer, og - med sera opnået ved immunisering med antigener fra bradyzoitter, og DK 171259 B1 9 ved, at de svarer til ES antigener, som er fælles for TG tachyzoitter og bradyzoiiter og har enten en molekylvægt på 25 kDa til 24 kDa eller en molekylvægt på ca. 43 kDa og glycoproteinnatur.

Immunopræcipitationen efterfølges hensigtsmæssigt af en dissocia-5 tion af de dannede immunopræcipi tater, elektroforese i polyacrylamidgel (SDES-PAGE), og autoradiografi af gelerne og fremkaldelsen af disse.

Bradyzoitantigenerne af Toxoolasma oondii kan isoleres fra kapsler udvundet fra sønderdelt væv fra pattedyr, navnlig såsom mus, der er inficeret med den kroniske form af Toxoplasma gondii. hvilke kapsler 10 renses over en passende gradient, lydbehandles og derefter sønderdeles i frosset tilstand og centrifugeres til udvinding af en supernatant indeholdende cytoplasmaantigenerne (fraktion Sj) og bundfaldet, hvorfra membranantigenerne (fraktion Sg) frigøres ved hjælp af en passende detergent.

15 Opfindelsen angår ligeledes translationen af mRNA'er fra tachyzoit ter, som erkarakteriseret ved, at det omfatter mindst et ES antigen ifølge opfindelsen, og at det genkendes af humane sera fra den kroniske fase eller den akutte fase af infektion med Toxoplasma gondii.

Ifølge en fordelagtig udførelesform af opfindelsen kan det ovenfor 20 definerede translationsprodukt af mRNA'er fra tachyzoitter opnås ved in vitro translation mRNA'er ekstraheret fra lysater af tachyzoitter, i reticulocytlysat i nærvær af en blanding af aminosyrer, som er fri for 35 L-methionin og omfatter S-methionin, i et forpufret medium.

Den foreliggende opfindelse angår ligeledes en fremgangsmåde til 25 kloning af translationsprodukterne ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er karakteriseret ved, at den omfatter - ekstraktion af mRNA'er fra tachyzoitlysater, og

- syntese af cDNA'er fra de ovenfor opnåede tachyzoit mRNA'er ved reaktion med revers transkriptase fra AMV, idet det således dannede cDNA

30 bibliotek derefter screenes for at identificere de rekombinante fager, hvis cDNA insertion dirigerer syntesen af et protein eller en proteinfraktion, som bærer epitoper, som genkendes af anti-ES antistofferne, og derfra udvælger de ES kloner, som genkendes af humane sera, idet de udvalgte kloner karakteriseres ved antistofselektion.

35 Den foreliggende opfindelse angår ligeledes serum rigt på IgE anti

stoffer, som er egnet til at give en signifikant beskyttelse mod toxo-plasmose, og navnlig mod tachyzoitter, hvilket serum er krakteriseret ved, at det kan opnås fra dyr immuniseret med antigeniske præparater, ES

DK 171259 B1 10 antigener eller produkter af translationen af mRNA'er fra tachyzoitter ifølge ifølge opfindelsen.

Den foreliggende opfindelse angår endvidere et monoklonalt antistof, som er karakteriseret ved, at det kan fremstilles af hybridomaer 5 opnået ved fusion af celler fra dyr immuniseret med ES antigenerne ifølge opfindelsen med tumorceller.

Opfindelsen angår yderligere en vaccine egnet til fremkaldelse af en signifikant beskyttelse mod toxoplasmose, hvilken vaccine er ejendommelig ved, at den som aktiv bestanddel indeholder et antigenisk præparat 10 eller et ES antigen ifølge opfindelsen.

ES antigenerne ifølge opfindelsen finder ligeledes anvendelse til behandling af toxoplasmose.

Opfindelsen angår endvidere et produkt til diagnose af toxoplasmose, herunder congenital toxoplasmose, hvilket produkt er ejendommeligt 15 ved, at det som aktiv bestanddel indeholder et antigenisk præparat eller antigener ifølge opfindelsen.

Ifølge en fordelagtig udførelsesform af opfindelsen er det diagnostiske produkt karakteriseret ved, at det omfatter antigenet med en molekylvægt på 105 kDa. Dette svarer til en markør af den kroniske fase 20 af toxoplasmose.

Ifølge yderligere en fordelagtig udførelsesform af opfindelsen er det diagnostiske produkt karakteriseret ved, at det omfatter antigenet med en molekylvægt på 84 kDa. Dette svarer til en transitorisk markør af den kroniske fase af toxoplasmose.

25 Ifølge endnu en fordelagtig udførelsesform af opfindelsen er det diagnostiske produkt karakteriseret ved, at det omfatter antigenet med en molekylvægt på 98 kDa. Dette svarer til en markør af den akutte fase af toxoplasmose.

Ifølge yderligere en fordelagtig udførelsesform af opfindelsen er 30 det diagnostiske produkt karakteriseret ved, at det omfatter antigenet med en molekylvægt på 68 kDa. Dette svarer til en markør af den akutte fase.

Ifølge endnu en fordelagtig udførelsesform af opfindelsen er det diagnostiske produkt karakteriseret ved, at det omfatter antigenet med 35 en molekylvægt på 24 kDa. Dette svarer til en sen markør af den kroniske fase af toxoplasmose og til en markør af beskyttende immunitet.

Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til påvisning af og/eller screening for toxoplasmose, som er karakteriseret ved, at den DK 171259 B1 11 omfatter, at man bringer et humant serum i kontakt med et diagnostisk produkt ifølge opfindelsen.

Ud over de foregående udformninger omfatter opfindelsen andre udformninger, som vil fremgå af den følgende beskrivelse.

5 En bedre forståelse af opfindelsen vil kunne fås ved hjælp af den følgende beskrivelse, som angår eksempler på fremstilling af Toxoplasma gondii antigener og specielt ES antigener, karakterisering af disse og fremstilling af anti-ES antistoffer.

Det må imidlertid forstås, at disse eksempler udelukkende er givet 10 med det formål at illustrere opfindelsen og således ikke på nogen måde skal udgøre nogen begrænsning.

EKSEMPEL 1

Fremstilling af ekskretions-sekretions antigener fra tachyzoitter 15 (ES antigener).

a) Ekskretionsbetingelser:

Parasitternes levedygtighed vurderes ved en forudgående test for overlevelse i erythrosin B: 30 mikroliter af tachyzoitsuspensionen og 30 20 mikroliter af en opløsning af erythrosin B på 4 mg pr. ml i 0,01 M PBS puffer, pH 7,2, bringes i kontakt i et isbad i nøjagtigt 5 minutter før mikroskopisk iagttagelse. Derefter bestemmes procentdelen af levende tachyzoitter, som ikke er påvirket af farvestoffet og fremtræder lysbrydende, og døde tachyzoitter, som er gennemtrængt af erythrosinen og 25 farvet lyserøde.

Denne overlevelsestest gør det muligt at fastslå de optimale overlevelsesbetingelser svarende til en aktiv ekskretion uden frigørelse af cytoplasmaantigener ved lyse af parasitterne.

ES antigenerne opnås ved inkubation af tachyzoitterne (i forholdet g 30 1,8 x 10 tachyzoitter pr. rør med 1,5 ml ekskretionsmedium) i 3 timer i RPMI 1640 medium indeholdende 10% komplementbefri et serum af human eller animalsk oprindelse.

Sammenligning af ekskretionskinetikken i nærvær af serummer af forskellig oprindelse har vist, at de bedste resultater opnås i faldende 35 orden med humant serum, kalvefosterserum, kaninserum, rotteserum og museserum. De i nærvær af disse forskellige serummer udskilte antigener er kvalitativt identiske.

Ved afslutningen af de 3 timers inkubation gør en centrifugering DK 171259 B1 12 ved 2800 omdrejninger pr. minut i 10 minutter det muligt at fraskille de ES antigenhol dige supernatanter. Disse supernatanter filtreres derefter ved hjælp af en Mill i poremembran (0,22 (m) og koncentreres så 10 gange ved centrifugering ved 5000 omdrejninger pr. minut i 40 minutter i rør 5 af typen Centricon 10 (Amicon). Disse ES antigenpræparater konserveres ved frysning til -70°C efter tilsætning af en opløsning af proteaseinhi-bitorer med følgende sammensætning: - til 100 ml 10 mM PBS, pH 7,2,

- phenylmethylsulfonylfluorid (PMFS) (Sigma): 100 /il af en 40 mM

10 opløsning i absolut ethanol, - 7,3 mg N-p-tosyl-L-lysin-chlormethylketon (TLCK) (Sigma), - 75 mg ethylendiamintetraeddikesyredinatriumsalt (EDTA) (Prolabo), og - 7 mg N-tosyl-L-phenylalanin-chlormethylketon (TPCK) (Sigma) 15 35 b) Metabolisk mærkning med S methionin.

Efter filtrering ved hjælp af Nucleporemembran (3 μια) og vaskn i nger med RPMI medium bringes tachyzoitterne i suspension i forholdet 1,2 x

G

10 tachyzoitter/ml i RPMI 1640 medium uden methionin og cystin inde-20 holdende 10% komplementbefri et serum ved opvarmning til 56°C i 30 minutter. Dette serum blev på forhånd dialyseret én nat ved +4°C over for en opløsning af 9 °/oo NaCl og filtreret gennem Mill i poremembran (0,22 μπι).

Tachyzoitsuspensionen fordeles i et volumen på 1,5 ml i hæmolyserør anbragt ved 37°C og underkastes en forsigtig rystning i 30 minutter.

25 Derefter sættes den mærkede methionin (225 millicurie pr. rør) til dyrkningsmediet, og der reinkuberes ved 37°C under forsigtig rystning.

Efter en time sættes 15 mikroliter methionin og 15 mikroliter kold cystin fra RPMI sættet (Difco) til hvert rør, før rørene igen anbringes ved 37°C under rystning i 11/2 time. Efter centrifugering ved 2800 om-30 drejninger pr. minut i 10 minutter adskilles supernatanterne indeholdende ES antigenerne fra bundfaldene bestående af de hele parasitter for forskellig behandling.

Efter filtrering gennem Mill i poremembran (0,22 /im) efterfulgt af passage gennem Sephadex G25 M søjler (PD 10 fra Pharmacia) til el i -35 minering af den frie methionin, koncentreres supernatanterne 10 gange ved centrifugering ved 5000 omdrejninger pr. minut i 40 minutter i Centricon 10 rør (Amicon). ES antigenerne konserveres ved frysning til -70°C efter tilsætning af proteaseinhibitorer som ovenfor beskrevet.

35 DK 171259 B1 13 c) Mærkning af antigener indeholdt i bundfaldet med S methionin.

De ovenfor opnåede bundfald vaskes to gange i 0,01 M PBS, pH 7,2, og igen med destilleret vand, før de underkastes 6 successive cykler af frysning (i flydende nitrogen) og optøning (i mariebad på 37°C).

5 En ny centrifugering (2800 omdrejninger pr. minut i 10 minutter) gør det muligt at adskille supernatanterne (indeholdende cytoplasmaanti-generne) fra bundfaldene, ud fra hvilke membranantigenerne ekstraheres.

Ekstraktionen og opløsningen af membranantigenerne udføres ved behandling med Nonidet P 40 eller CHAPS ([(3-cholamido-propyl)-dimethyl -10 ammonio]-propansulfonat) (FLUKA) efterfulgt af en centrifugering ved 5000 omdrejninger pr. minut i 30 minutter. De opløste membranantigener er indeholdt i supernatanten.

Cytoplasma- og membranantigenerne konserveres ved frysning til -70°C i nærvær af en opløsning af proteaseinhibitorer.

15 125 d) Mærkning af tachyzoitmembranantigener med I (Iodogen).

Den anvendte mærkningsmetode er en modifikation af den af Howard et Al. [Howard, R.J., Kavshal, D.C., Carter, R., J. Protozool., (1982) 22, 114 ] beskrevne metode, hvortil I0D0-GEN anvendes. De ved peritoneal-20 skylning af mus inficeret med R.H. stammen af T. gondii opnåede tachy-zoitter vaskes to gange med 0,01 M PBS, pH 7,2, efter filtrering gennem Nuclepore filter, 3 pm.

1 mg I0D0-GEN (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) opløses i 10 ml chloroform, og 625 mi kroli ter af denne opløsning overføres til et glas-

O

25 rør. Opløsningsmidlet afdampes derefter under en nitrogenstrøm, og 10 tachyzoitter tilsættes. Efter 10 minutters kontakt ved 4°C med 500 pc 125

I, overføres blandingen til et andet rør indeholdende 0,1 M PBS, pH

7,2, 10 mM Nal for at standse reaktionen. Derefter vaskes tachyzoitterne tre gange i 0,1 M PBS, pH 7,2. Membranantigenerne ekstraheres derefter i 30 Nonidet P40 eller CHAPS.

EKSEMPEL 2

Fremstilling af bradyzoitantigener.

35 a) Fremstilling af bradyzoitter; ekstraktion af antigener.

Bradyzoitterne, et indkapslet stadium af Toxoplasma, frembringes ved infektion ad intraperitoneal vej af SWISSmus med ca. 30 kapsler af stammen "kronisk" 76 K af Toxoplasma gondii. Efter 4 til 6 uger har de DK 171259 B1 14 inficerede mus 1000 til 2000 intracerebrale kapsler.

Kapsler udvundet ud fra sønderdel te hjerner fra inficerede mus renses først over en gummi arabicum gradient i henhold til Nakabayashi og Motomuras teknik (1968). Den valgte teknik til ekstraktion af bradyzoit-5 antigener (som forefindes i kapslerne) er som følger: kapslerne ultralydbehandles (fire gange 1 minut) sønderdeles derefter i frosset tilstand ved 17 passager af X-pressen. Efter centrifugering ved 32.000 g i 2 timer ved +4°C udvindes supernatanten indeholdende cytoplasmaanti-generne (fraktion S^) og bundfaldet behandles med CHAPS detergent, som 10 frigør membranantigenerne (fraktion S£). De forskellige etaper udføres i nærvær af en opløsning af proteaseinhibitorer.

125 b) Mærkning af bradyzoitantigener med I.

Mærkningen udføres i henhold til Hunter og Greenwoods teknik 15 (chloramin T) [(1962) Nature, London, 194, 495-496].

Fraktionerne Sj og Sg (indeholdende 250 til 500 μg proteiner) anbringes i et lille volumen natriumphosphatpuffer, 0,5 M til slut, pH 7,4 (300 til 400 jul).

Mærkningsreaktionen er den samme i de to tilfælde: 125 20 - tilsætning af 500 /iCi Na I (Amersham) + 100 μΐ af en opløsning af 2 mg/ml chloramin T (Merck) - inkubation ved omgivelsestemperatur i 11/2 time under forsigtig rystning - tilsætning af 100 μΐ af en opløsning af 4 mg/ml 25 natriummetabisulfit (Prolabo) - dialyse på en PD10 søjle (Pharmacia) over for PBS til eliminering af frit i od.

EKSEMPEL 3 30 Isolering af ES antigener med fælles epitoper for tachyzoitter og brady-zoitter ved immunopræcipitering og SDS-PAGE elektroforese.

a) Immunisering med ekskretions-sekretionsantigener af tachyzoitter: - Fischerrotter 35 Immunisering ved 4 subkutane injektioner udført med 10 til 14 dages mellemrum.

Injiceret produkt: ES antigener opnået i Eksempel 1 svarende til

O

ekskretion af 10 tachyzoitter i et volumen på 300 μΐ tilsat 300 μΐ DK 171259 B1 15 ukomplet Freunds adjuvans .

- Balb/C mus

Immunisering ved 4 subkutane injektioner udført med 10 dages mellemrum.

5 Injiceret produkt: ES antigener opnået i Eksempel 1 svarende til ekskretion af 0,5 x 10® tachyzoitter i et volumen på 100 μΐ tilsat 100 μ1 ukomplet Freunds adjuvans .

- Kaniner

Kaniner immuniseres ifølge Vaitukaitis et Al.'s teknik [J. Cl in.

10 Endocr. (1971), 33, 988-991]. 40 intradermale injektioner udføres med 1

O

ml ES antigener (svarende til ekskretion af 8 x 10 tachyzoitter tilsat 1 ml komplet Freunds adjuvans ) + 1 intramuskulær injektion af 1 ml kig-hostevaccine (Vaxicoq, Institut Mérieux). Boostere med 1/10 af udgangsdosen foretages af intramuskulær vej hver tredie uge efter én måned.

15 b) Immunisering med bradyzoitantigener.

- Fischerrotter 4 subkutane injektioner med 10 til 14 dages mellemrum.

- Opløselige antigener (SI) 20 Ved injektion: ca. 60 pg opløselige antigener (SI) opnået i Eksempel 2 i 300 /il 10 mM PBS, pH 7,2, + 300 /il ukomplet Freunds adjuvans.

- Membranantigener (S2)

Ved injektion: 130 μg membranantigener (opnået i Eksempel 2) i 300 /il ukomplet Freunds adjuvans.

25 - Balb/C mus 4 sukutane injektioner med 10 dages mellemrum.

- opløselige antigener (SI)

Ved injektion: 15 /ig antigener (opnået i Eksempel 2) i 75 /il 10 mM PBS, pH 7,2, + 75 /il ukomplet Freunds adjuvans.

30 - Membranantigener (S2)

Ved injektion: 60 μg membranantigener (opnået i Eksempel 2) i 75 μ^ 10 mM PBS, pH 7,2, + 75 /ti ukomplet Freunds adjuvans.

c) Immunisering med antigener fra hjerner fra SWISSmus (kapselfrem-35 stillere):

En hjerne fra SWISSmus sønderdeles, underkastes derefter på samme måde som bradyzoitterne 17 passager af X-pressen. Immunisering af Fischerrotter og Balb/C mus med opløselig ekstrakt udføres på samme måde som DK 171259 B1 16 med SI antigenerne fra bradyzoitter.

d) Infektionsforskrift for rotter og mus:

Infektion af Fischerrotter 5 7 5 Infektion ad intraperitoneal vej med 10 eller 10 tachyzoitter af RH stammen i 500 μΐ 10 mM PBS, pH 7,2. Infektion af Nu/Nu rotter [jvf.

Santoro et Al., (C. R. Acad. Sci. (1987), 304, 297-300)].

Infektion af Balb/C mus

Infektion ad intraperitoneal vej i forholdet 5 til 30 kapsler af stammen 10 "kronisk" 76 K i 250 μΐ 10 mM PBS, pH 7,2.

e) Humane serummer 741 serummer opsamlet på Laboratoire Saint-Camille i Lille med henblik på diagnose karakteriseredes ved de klassiske serologiske tests: 15 direkte agglutinering før og efter behandling med 2-mercaptoethanol (Couzineaus teknik) og indirekte immunofluorescens ved hjælp af et G-A-M antihumant immunoglobulin gedeserum (IPP réf. n°, Weller og Coons' teknik) og et antihumant IgM gedeserum (IPP réf. n°, Remingtons teknik).

20 Opfinderne har således katalogiseret 139 "akutte" serummer karak teriseret ved tilstedeværelsen af specifikke IgM'er, der genkendes ved mindst 2 ud af de 3 anvendte metoder, 462 "kroniske" serummer uden specifikke IgM'er og 140 serummer, som var negative ved alle teknikkerne.

25 f) Immunopræcipitation af antigener f).l - Serumprøver, som på forhånd er steriliseret ved filtrering gennem Milliporemembran (0,22 μπι) er portioner på 10 mikroliter i silikonerør (Eppendorf). Til disse rør sættes 500 mikroliter adsorptionspuffer (10 mM Tris, 2 mM EDTA, 0,15 M NaCl, 0,5% Nonidet P40, indeholdende 30 100 enheder aprotinin Kallikrein pr. ml og indstillet til pH 7,4) efterfulgt af den passende dosis mærket antigen beregnet som funktion af an- 35 tallet af cpm i udgangspræparatet (40.000 cpm for de med S methionin 35 mærkede ES prøver, 250.000 cpm for de med S methionin mærkede cyto- 125 plasma- eller membranantigener, 400.000 cpm for de med I mærkede 35 35 tachyzoit- eller bradyzoitantigener og 60.000 cpm for de med S methionin mærkede translationsprodukter). Der henstilles ved omgivelsestemperatur i 3 timer under rystning.

f).2 - En suspension af Sepharose A protein (Pharmacia) frem- DK 171259 B1 17 stilles. Sepharose A proteinet kvældes i én time i adsorptionspufferen i forholdet 10 mg produkt pr. prøve, som skal analyseres. Suspensionen fordeles i en ny række silikonerør, som opdeles i to grupper. Den første undergår ikke manipulation i første omgang og svarer til de prøver, hvor 5 protein A ikke skal forbehandles, mens den anden svarer til de prøver, hvori man ud over antistofferne af IgG type, som af sig selv fikseres til protein A, vil opfange antistofferne af IgM type, hvis opfangning kræver et kunstgreb. Rørene i den anden gruppe centrifugeres således (1000 omdrejninger i ét minut) og supernatanten fjernes. Til bundfaldet 10 sættes 200 mikroliter adsorptionspuffer og 50 mikrogram antistof af IgG type og af anti-IgM specificitet. Fikseringen af dette antistof sikres ved en kontakttid på én time under omrøring ved omgi vel sestemperatur. Endelig vaskes Sepharose-A proteinkuglerne to gange i adsorptionspuffer.

Umiddelbart før anvendelse centrifugeres rørene i de to grupper, og 15 supernatanten fjernes. Immunopræcipi taterne overføres til disse rør og efterlades i kontakt natten over ved 4°C under forsigtig rystning.

Derefter udføres en cyklus af 8 vaskninger med 1 ml adsorptionspuffer. Kvaliteten af vaskningerne bekræftes ved måling af den ottende supernatants radioaktivitet. Der udføres nye vaskninger, hvis denne er for 20 høj. Til alle bundfaldene sættes så 60 mikroliter 125 mM TRIS puffer, 3% SDS, 20% saccharose, 0,1% bromphenolblåt og 20 % Ø-mercaptoethanol.

Efter omrøring underkastes rørene to successive kogninger i 11/2 minut adskilt af en ny periode af kraftig rystning (Vortex).

Endelig centrifugeres alle rørene ved 3000 omdrejninger pr. minut i 25 15 minutter, og supernatanterne indeholdende de dissocierede immunopræ-cipitater overføres til en ny række rør. Radioaktiviteten af hver af supernatanterne måles på 5 mikroliter, hvilket giver en omtrentlig idé om den af serumantistofferne opfangede mængde.

Alle prøverne underkastes så en elektroforese på polyacrylamidgel.

30 f) Elektroforese (SDS-PAGE) af immunopræcipitater og autoradiografi.

Elektroforese af polyacrylamidgel erne (SDS-PAGE) udføres i henhold til den af Laemmli beskrevne forskrift [(1970) Nature (London) 256, 495-497)] i et apparat af typen BioRad til vertikal elektroforese.

35 De behandlede prøver adskilles i en homogen gel af 10% polyacryl- amid (dimensioner: 14 x 16 cm). Elektroforesen udføres med en strømstyrke på 7mA i 16 til 18 timer i en TRIS-glycin puffer, pH 8,3, indeholdende 1% SDS.

DK 171259 B1 18

Efter fiksering af proteinerne med en blanding af methanol og eddikesyre dehydratiseres gelen på Whatmanpapir (vakuumtørrer, BioRad).

35

Hvis de undersøgte antigener er mærket med $ methionin imprægneres gelen i en fotografisk emulsion (Amplify Amersham) i 20 minutter.

5 Autoradiografi af gelerne foretages mod en film af typen Kodak X-Omat RP, og filmene fremkaldes efter eksponering i 3 (antigener mærket med 125I) til 6 (antigener mærket med 35S methionin) dage ved -70°C.

g) Beregning af antigenernes molekylmasser.

10 Gelerne kalibreres ved hjælp af en blanding af på forhånd farvede proteiner af kendt molekylmasse (bragt på markedet af BRL, USA). Den afstand, som disse proteiner har gennemløbet i gelen under elektroforesen, måles. De opnåede værdier gør det muligt at foretage den korrekte kalibrering d - F(log MM) og dermed bestemme molekyl massen af de i de ana-15 lyserede prøver tilstedeværende proteiner.

Molekylmasserne af de i den efterfølgende tabel nævnte antigener repræsenterer en middelværdi bestemt ud fra 30 geler. 1 35

TABEL I

ES ANTIGENER PAVIST UNDER HUMAN TOXOPLASMOSE

Molekylmasse Specificitet

185.000 I

25 170.000 Påvist under den kroniske fase ill· 00Q , 105.000 -r markør af den kroniske fase "dublet", der karak- 98.000 -* markør af akutte* fase teriserer den kro niske fase 30 84.000 -► transitorisk markør af den kroniske fase 68.000 _» markør af den akutte fase, af mindre specificitet end 95 KD antigenet, idet det påvises svagt ved negative serummer DK 171259 B1 19 57.000 " 53.000 45.000 43.000 5 39.000 l 35.000 f Påvist under den kroniske fase 34.000 31.000 30.000 10 26.000 25.000 , 24.000 -tsen markør af den kroniske fase; markør af beskyttende immunitet 20.100 15 * 98 KD antigenet, som forefindes under hele sygdommens udvikling, er det første snævert specifikke antigen, som er blevet påvist.

EKSEMPEL 4 20 Sandsynliggørelse af påvisning af ES antigener med animalske serummer.

35 ES antigener mærket med S methionin (som beskrevet i Eksempel l.b) og immunopræcipiteret med forskellige animalske serummer genkendes af disse som vist i Tabel II nedenfor.

I denne tabel svarer de understregede tal til de væsentligste bånd.

25 De i tabellen forekommende tal henviser til molekylmasser i dalton af de påviste ES antigener.

30 o 35 35 DK 171259 B1 20

TABEL II

Oversigt over (S Met) ESA'er genkendt af serummer Human Mus Mus Inficeret Rotte 5 Inficeret kronisk kronisk anti-ES rotte anti-ES nøgen rotte 185.000 185.000 185.000 170.000 170.000 170.000 170.000 155.000 155.000 155.000 10 98-105000 98-105000 / 98-105000 98-105000 98-105000 (dublet) 84.000 84.000 84.000 84.000 84.000 68.000 68.000 68.000 68.000 68.000 68.000 (svag) 15 65.000 62.000 62.000 57.000 57.000 56.000 55.000 55.000 53.000 53.000 45.000 45.000 45.000 20 43.000 43.000 42.000 42.000 42.000 39.000 39.000 39.000 35.000 35.000 35.000 35.000 35.000 34.000 34.000 34.000 34.000 34.000 31.000 31.000 31.000 31.000 31.000 25 (svag) 30.000 26.000 25.000 25.000 25.000 25.000 25.000 25.000 (svag) 30 24.000 24.000 24.000 24.000 20.100 125 Væsentligste tachyzoitmembranantigener ( I) genkendt af serummer fra rotter og mus immuniseret med ES antigener /43.000 35 (JO. 000 DK 171259 B1 21 EKSEMPEL 5

Fremkaldelse af antistoffer af IgE type og deres rolle ved eksperimentel toxoplasmose hos rotte.

Hos den normale Fischerrotte fremkalder infektion med Toxoplasma 5 gondii som hos størsteparten af ikke-immunoskadede pattedyrsværter en permanent immunitet.

Den immunologiske hukommelses mekanismer er kendt for at være T-af-hængige, og de kræver for at blive opretholdt vedvarende cerebrale ind-kapslede (bradyzoit)former.

10 Imidlertid kendes de samlede mekanismer, som er ansvarlige for fremkaldelsen af denne permanente immunitet, dårligt.

Hos Nu/Nu Fischerrotten, som repræsenterer en immunoskadedisposi- ς ti onsmodel, er 10 tachyzoitter af RH stammen af Toxoplasma gondii injiceret I.P. tilstrækkeligt til at dræbe 100% af dyrene på 12 til 15 dage.

15 10 til 12 uger gamle Fischerrotter inficeredes med 10^ tachyzoitter af RH stammen af Toxoplasma gondii. For bedre at indkredse udskilte/af-sondrede (ES) antigeners rolle, inokuleres dyrene enten med levende tachyzoitter, bestrålede tachyzoitter (10.000 rad afgivet ved 10 mn) eller ES antigener fremstillet som tidligere beskrevet.

20 Forøgelsen af mængden af specifikt IgE i serummet (målt ved radio- allergosorbent test eller RAST) og på overfladen af visse blodceller (analyseret ved fluxcytometri) blev fulgt med regelmæssige mellemrum.

Yderligere blev disse specifikke IgE'ers beskyttelsesevne undersøgt c ved overførsel til immunosvækkede Nu/Nu rotter før infektion af 10 25 Toxoplasma gondii.

Figur 1 viser forekomstkinetikken for serum IgE hos normale Fischerrotter efter forskellige behandlinger.

De levende tachyzoitter fremkalder en specifik IgE reaktion. Denne reaktion er ekstremt tidlig og kan påvises fra den syvende dag efter 30 infektionen. Den maksimale reaktion iagttages på den 21. dag. Injektion af ES antigener til normale rotter medfører ligeledes en signifikant IgE reaktion.

Det kan bemærkes, at ES antigenerne fremkalder samme type reaktion, men mindre intens. Efter en boosterinjektion en måned efter den første 35 injektion er forøgelsen af de specifikke IgE'er endnu mere betydelig.

Det kan bemærkes, at anvendelsen af adjuvanser af IgE reaktionen (Borde-tella pertussis) med ES'erne fremkalder en signifikant forøgelse af IgE'erne under den primære reaktion, mens injektion af adjuvansen alene DK 171259 B1 22 ikke medfører nogen specifik reaktion.

Figur 2 viser resultatet af overførsler af forskellige typer serum til Nu/Nu Fischerrotter. Alle de anvendte serummer blev udtaget under den primære reaktion på dag nr. 2.

5 Når dyrene får 2 ml serum rigt på specifikt IgE hidrørende fra nor male rotter inficeret med levende tachyzoitter eller immuniseret med ES antigener, ses det, at forøgelsen i overlevelsestid er betydelig for de dyr, som har modtaget serummer hidrørende fra rotter immuniseret med bestrålede tachyzoitter, eller som har modtaget fysiologisk serum.

10 Denne forøgelse af overlevelsen skyldes virkelig IgE, da fjernelse af disse ved immunoadsorption bringer overlevelsesvarigheden tilbage på værdier nær kontrol prøvernes.

Figur 3 viser, at blodplader hidrørende fra dyr inficeret med levende tachyzoitter eller immuniseret med ES giver Nu/Nu rotter samme 15 type beskyttelse som de tilsvarende animalske serummer. Det kan ligeledes bemærkes, at blodplader hidrørende fra dyr immuniseret med bestrålede tachyzoitter ikke beskytter Nu/Nu rotterne signifikant.

Figur 4 viser, at kinetikken for forekomsten af IgE på overfladen af blodplader er sammenlignelig med kinetikken for serum IgE. Graden af 20 IgE på overfladen af blodpladerne varierer alt efter den anvendte antigentype på samme måde som for serum IgE. Overlevelsesvarigheden er dosisafhængig, og en dosis på 5 x 10^ celler er tilstrækkelig til at give en signifikant beskyttelse.

Den af blodpladerne tildelte beskyttelse viser sig at være knyttet 25 til fænomener af typen antistofafhængig cellecytotoxicitet (ADCC). Det ses således (jvf. figur 5), at blodplader hidrørende fra normale dyr inficeret med levende tachyzoitter eller immuniseret med ES, men ikke med dræbte tachyzoitter, er i stand til at ødelægge tachyzoitter in vitro. Mekanismerne for denne ødelæggelse er endnu ikke klarlagt.

30 EKSEMPEL 6

Humoral reaktion mod ES antigener under de akutte, subakutte og kroniske faser af human toxoplasmose.

Anvendt teknik: radioimmunopræcipitation og analyse af immunopræ-35 cipitater i SDS-PAGE (10% polyacrylamidgel).

Antigener: cytoplasma- og membran-ES antigener af tachyzoitter 35 mærket med S methionin.

Anvendte serummer: humane serummer udtaget under forskellige af DK 171259 B1 23 sygdommens perioder: akut, subakut og kronisk. De opnåede resultater er vist i figur 6.

De mærkede ES antigener immunopræcipiteredes med humane serummer udtaget: 5 - i akut fase (spor 1) - i subakut fase (spor 2) - i kronisk fase (spor 3 og 4) og med negative serummer (spor 7 og 8).

Cytoplasmaantigener (opløselig ekstrakt af tachyzoitter lyseret med 10 vand) og membranantigener (NP40 ekstrakter) blev i sammenligningsøjemed immunopræcipi teret med kroniske serummer: - spor 5: cytoplasmaantigener - spor 6: membranantigener.

De første antigener, som påvises er 68 og 98 KDa antigenerne, som 15 forefindes i den akutte og den subakutte fase (afsnit A).

I den kroniske fase (afsnit B) genkender serum fra patienter antigener med omtrentlig masse på 105, 84, 57, 45, 39, 35, 25, og 24 KDa.

105 KDa båndet danner sammen med 98 KD båndet en "dublet", som er specifik for den kroniske fase.

20 EKSEMPEL 7 125 Påvisning (efter mærkning med I) af et 43 KD antigen, der er fælles for tachyzoitter og bradyzoitter og udskilles/afsondres af tachyzoitter.

25 Immunopræcipiterede antigener: 125 - membranekstrakt fra tachyzoitter mærket med I (Iodo-Gen) 125 - opløselige antigener fra bradyzoitter (SI) mærket med I (chloramin T) - membranantigener fra bradyzoitekstrakter (S2) med CHAPS efterfølgende 125 30 mærket med I (chloramin T).

Anvendte serummer: - serum fra kanin immuniseret med ES antigener - serum fra Balb/C mus immuniseret med membranantigener (S2) fra bradyzoitter 35 - serum fra Balb/C mus immuniseret med antigener fra hjerneceller fra SWISSmus (de fra SWISSmus hidrørende bradyzoitter er kontamineret med hjerneceller).

De opnåede resultater er vist i figur 7: DK 171259 B1 24

Spor 1 og 2: Immunopræcipi tering med et anti-ES kaninserum: - tachyzoitmembranantigener (spor 1) - bradyzoitmembranantigener (S2) (spor 2)

Spor 3 til 5: Immunopræcipitation med et anti-bradyzoit Balb/C museserum 5 (fraktion S2) - en tachyzoitmembranekstrakt (spor 3) - en opløselig ekstrakt (SI) af bradyzoitter (spor 4) - en membranekstrakt (fraktion S2) af bradyzoitter (spor 5)

Spor 6 til 8: Immunopræcipitation med et anti-hjerne Balb/C museserum 10 - en opløselig ekstrakt (SI) af bradyzoitter (spor 6) - en membranekstrakt (S2) af bradyzoitter (spor 7) - en tachyzoitmembranekstrakt (spor 8) 43 KD antigenet af tachyzoitter og bradyzoitter, som genkendes af anti-ES og anti-bradyzoitserummer genkendes ligeledes af humane serummer.

15 Antigenet omkring 55 KD, der genkendes af anti-hjerne museserum merne synes ikke specifikt for bradyzoitter.

EKSEMPEL 8 35 Påvisning (efter mærkning med S Met) af et antigen på ca. 35 KD, 20 som er fælles for tachyzoitter og bradyzoitter og udski11es/afsondres af tachyzoitter.

35 - Immunopræcipiterede antigener (mærket med S methionin) - ES antigener - Cytoplasmaantigener fra tachyzoitter (fraktion HgO) 25 - Totale antigener fra tachyzoitter (behandling af hele parasitter med CHAPS) - Anvendte serummer - serummer fra Balb/C mus immuniseret med opløselige antigener (SI) eller membranantigener (S2) fra bradyzoitter 30 - serum fra Balb/C mus immuniseret med en hjernecelleekstrakt fra SWISSmus - serum fra Fischerrotter immuniseret med opløselige antigener (SI) eller membranantigener (S2) fra bradyzoitter.

De opnåede resultater er vist i figur 8.

35 Spor 1 til 3: Immunopræcipitation med et anti-bradyzoit Balb/C museserum (fraktion S2) - ES antigener (spor 1) - cytoplasmaantigener (fraktion Η£θ) af tachyzoitter (spor 2) DK 171259 B1 25 - totale antigener (CHAPS fraktion) af tachyzoitter (spor 3).

Spor 4 til 5: Immunopræcipitation med et anti-bradyzoit Balb/C museserum (fraktion SI) - ES antigener (spor 4) 5 - cytoplasmaantigener fra tachyzoitter (spor 5) - totale tachyzoitantigener (spor 6).

Spor 7 til 9: Immunopræcipitation med et anti-SWISSmusehjernecelle Balb/C museserum - ES antigener (spor 7) 10 - cytoplasmaantigener fra tachyzoitter (spor 8) - totale antigener fra tachyzoitter (spor 9).

Spor 10 til 12: Immunopræcipitation med et anti-bradyzoit Fischerrotte-serum (fraktion S2) - totale tachyzoitantigener (spor 10) 15 - tachyzoitcytoplasmaantigener (spor 11) - ES antigener (spor 12).

EKSEMPEL 9 Påvisning af 43 KD antigenets giycoproteinnatur.

125 20 Tachyzoitoverfladeantigener mærket med I (Iodo-Gen) absorberedes på ConA-Sepharose eller på WGA-U1trogel ved at gå frem som følger:

Fikseringen på lectiner udførtes i henhold til Colman et Al.'s forskrift [(1981) Eur. J. Biochem., 113, 339-348]

Koblingspuffer 25 150 mM NaCl 0,7 mM MgCl2 1 mM dithiothreitol 0,7 mM MnCl2 0,7 mM CaCl2 30 0,05% natriumdodecylsul fat 20 mM Tris/HCl, pH 7,5

Lectiner: Concanavalin A: ConA-Sepharose (Pharmacia)

Hvedekimagglutinin = WGA-Ultrogel (IBF)

Antigener: 125 35 1) membranekstrakt (NP40) af tachyzoitter mærket med I (Iodogen) 35 2) H90 ekstrakt af tachyzoitter mærket med S methionin c 35 3) membranekstrakt (CHAPS) af tachyzoitter mærket med S methio 1 DK 171259 B1 26

Anvendt teknik:

Reaktionerne udføres i Eppendorfrør.

- Til 150 /ti ekstrakt 1) eller til 200 /il ekstrakt 2) og 3) sættes 1 ml koblingspuffer og 5 - 250 /il gel (ConA-Sepharose eller WGA-Ultrogel), der på forhånd er 1 igevægtsindstil let i fikseringspuffer.

Efter 15 minutters kontakt ved omgivelsestemperatur under hyppig rystning centrifugeres rørene. Supernatanten indeholder de ikke tilbageholdte antigener. Bundfaldet vaskes først tre gange i koblingspuffer, 10 ekstraheres så med 3 x 200 /il koblingspuffer indeholdende 0,4 M 0- methyl-α-D-mannopyranosid (IBF) i tilfælde af fiksering på Concanavalin A, og 0,2 M N-acetyl-giucosamin (Sigma) i tilfælde af WGA. Disse tre successive ekstrakter udgør eluat 1, 2 og 3.

Radioaktiviteten tælles i de forskellige prøver, hvorefter de ikke-15 behandlede antigener, de ikke-tilbageholdte fraktioner og eluaterne (1 + 2) immunopræcipiteres med forskellige serummer.

Såvel udgangsantigenerne som de på de to lectiner tilbageholdte fraktioner (eluater) immunopræcipiteres med et kaninblodsserum og et anti-ES kaninserum.

20 Figur 9 viser: - spor 1, 2 og 3: Immunopræcipitation med et anti-ES kaninserum.

- Spor 2, 4 og 6: Immunopræcipitation med et kaninbi odserum.

- spor 1 og 3: tacyzoitmembranantigener før behandling.

- spor 3 og 4: ConA-Sepharoseeluat (fikserede antigener).

25 - spor 5 og 6: WGA-Ultrogelel uat.

Spor 3 og 5 viser, at 43 KD antigenet fikseres på Concanavalin A og (svagt) på WGA (hvedekimsagglutinin) og viser således dets glycoprotein-natur.

30 EKSEMPEL 10

Fremstilling af translationsprodukter af tachyzoitbudbringer RNA'er.

a) Ekstraktion af totalt RNA: 35 Auffray og Rougeons metode [(1980) Eur. J. Biochem, 107, 303] an vendes. Tachyzoitterne lyseres ved tilsætning (10 gange volumenet af parasitbundfaldet) af en opløsning af 3 M LiCl, 200 /ig/ml Heparin, 10 mM natriumacetat, pH 5, 0,1% SDS.

DK 171259 B1 27

Efter homogenisering på et Potterapparat og konservering ved +4°C hele natten for udfældning af RNA'er centrifugeres lysatet ved 16.300 g i 40 minutter ved +4°C. Bundfaldet vaskes to gange ved resuspendering i en opløsning af 4 M LiCl, 8 M urinstof og centrifugeres så påny ved 5 16.300 g i 40 minutter ved +4°C. Derefter opløses bundfaldet i RNAse- frit H^O. Denne opløsning bringes på 0,1 M med natriumacetat, pH 5, 0,1% SDS for successivt at blive ekstraheret med et volumen phenol mættet med HgO og et volumen phenol-chloroform. Den vandige fase bringes endelig på 0,2 M med natriumacetat, pH 5, til udfældning af RNA med 2,5 volumener 10 absolut ethanol ved -20°C i løbet af en nat.

b) Rensning af budbringer RNA'er

Arnemann et Al.'s metode [(1977), Nuel. Acids Res. 4, 4023-4026] anvendes.

15 Denne metode består i adskillelse af poly A+ RNA'er fra totalt RNA

ved 2 successive kromatografi er på oligo (dT) cellulose.

c) Translation in vitro af m RNA'er i kaninreticulocytlysat [Pelham og Jackson, (1986), Eur. J. Biochem, 67, 247].

20 RNA'erne (0,5 /xg) translateres i 30 /il reticulocytlysat (N-150

Amersham) i nærvær af kaliumacetat (110 mM), magnesiumacetat (1 mM), en 35 cocktail af aminosyrer uden L-methionin (50 mM) og 50 /iCi S methionin (Amersham).

25 d) Immunopræcipitation af translationsprodukterne

Immunopræcipitationen udføres som beskrevet i Eksempel 3-d) ovenfor. I korte træk adsorberes immunkomplekserne efter inkubation af translationsprodukter (60.000 cpm) med serummer (10/il) på 10 mg sepha-rose-A protein (Pharmacia) og elueres derefter for at blive analyseret 30 ved SDS-PAGE (Laemmli, 1970, Nature, 227, 680).

EKSEMPEL 11

Immunopræcipitation af translationsprodukter af mRNA fra tachyzoit- ter.

35 mRNA'erne fremstilles ved den i Eksempel 10 ovenfor beskrevne metode (spor 1 og 3 i figur 11) eller ved Chirgwin et Al.'s metode [(1978) Biochemistry, 18, 5294-5299] (spor 2 og 3 i figur 11). Denne figur viser ligeledes profilerne af de med humant serum fra infektionens DK 171259 B1 28 kroniske fase immunopræcipiterede translationsprodukter (spor 3 og 4).

24 KD, 37 KD og 80 KD translationsprodikterne, som genkendes eller påvises med de to serummer, er markeret ved en pil.

Immunopræcipi tationen af translationsprodukterne med en række 5 humane serummer fra kronisk og akut fase er desuden vist i sammen- ligningsøjeemed i figur 12. Det gælder nærmere bestemt deres immunopræ-cipitation: - med en række humane serummer fra den kroniske fase (IgG)(spor 1, 3, 4, 5 og 6), 10 - med et humant serum fra slutningen af den akutte fase (IgG +

IgM)(spor 2), - med et negativt humant serum (spor 7).

Genkendelsen af 24 KD og 37 KD translationsprodukterne med alle de kroniske serummer er symboliseret ved en pil. Disse to antigener gen-15 kendes ikke af serummet fra den akutte fase.

EKSEMPEL 12

Karakterisering af 24 KD antigenet Påvisning af 24 KD antigenets proteinnatur.

20 En total ekstrakt af tachyzoitter (CHAPS ekstraktion) mærket med 35 S methionin adsorberedes på ConA-Sepharose eller på WGA-Ultrogel. Såvel udgangsekstrakten som eluaterne af de to lectiner immunopræcipitere-des med et anti-ES kaninserum.

De opnåede resultater er vist i figur 10A.

35 25 Intet antigen mærket med S methionin tilbageholdtes på WGA.

Spor 1: Immunopræcipi teret af den totale tachyzoitekstrakt.

Spor 2: Immunopræcipi teret af ConA-Sepharoseeluatet.

Visse antigener (navnlig de med masse på ca. 170 KD, 39 KD og 25 KD) har glycosylerede grupper, som fikseres til Concanavalin A. 24 KD 30 antigenet tilbageholdes derimod ikke.

Figur 10B: Denne figur viser identiteten af molekylmassen mellem ES antigenet på 24 KD og det væsentligste translationsprodukt af tachyzoit mRNA'er.

35

Spor 1: Immunopræcipitation af ES antigener mærket med S methio-35 nin med et anti-ES museserum.

35

Spor 2: Immunopræcipitation af translationsprodukter mærket med S methionin med et anti-ES kaninserum.

I betragtning dels af 24 KD i antigenets proteinnatur (figur loA) DK 171259 B1 29 og dels dets migration nær ved translationsproduktet er der en stærk formodning om, at de to molekyler er identiske.

EKSEMPEL 13 5 Immunokompetition mellem tachyzoittranslationsprodukterne og det på 2% SDS ekstraherede bradyzoitantigen over for et anti-ES kaninserum.

Denne immunokompetition er vist i figur 13, hvor: - spor 1 viser immunopræcipitation af translationsprodukterne i nærvær af 50 μg bradyzoitekstakt, 10 - spor 2 viser immunopræcipitation af translationsprodukterne i nærvær af 50 μς S mansoniekstrakt og - spor 3 viser immunopræcipitation af translationsprodukterne alene.

Bradyzoitantigenet er i stand til at formindske fikseringen af 24 KD og 37 KD translationsprodukterne med anti-ES antistoffer.

15 Der er desuden udført en undersøgelse i diagnistisk øjemed ved hjælp af et serotek af 350 vel karakteriserede serummer, hvoraf visse er udtaget under de forskellige faser af toxoplasmose og viser en sero-omdannelse, andre mere langsomme, der gør det muligt at følge antistofreaktionen, og yderligere andre, svarende til moder-barn "par", der er 20 udtaget under præ-, peri- og postnatale perioder.

Immunopræcipitationen med disse serummer af ES antigener (mærket 35 med S methionin) har gjort det muligt at fastslå kinetikken for tilsynekomsten af antistoffer og navnlig at påvise: - at serummer fra akut fase (IgM) genkender ES antigener på meget mere 25 intens måde end de somatiske antigener eller membranantigenerne, - at to ES antigener med masse på ca. 98.000 og 68.000, der genkendes stærkere og tidligere, vil kunnme anvendes som markører for sero-omdannelse, og - at andre antigener, som genkendes på meget langsommere måde navnlig de 30 med masse på 24.000 derimod ser ud til at udgøre reelle markører af immuniteten ved toxoplasmose.

Dette antigen med en masse på 24.000, som ikke ser ud til at være glycosyleret (fikseres ikke på Concanavalin A og WGA) ser ud til at svare til tachyzoit RNA translationsproduktet med masse 24. Dette trans-35 lationsprodukt immunopræcipi teres faktisk ligeledes af de sene serummer ved human infektion og ikke af de tidlige serummer (IgM + IgG).

DK 171259 B1 30 EKSEMPEL 14

Kloning af transi ationsprodukter.

a) Fremstilling af cDNA bank ud fra tachyzoit mRNA.

5 Syntesen af cDNA udføres i henhold til Gubier og Hoffmans metode [(1983) Gene, 25, 263]. Den første komplementære DNA-streng syntetiseres ved hjælp af AMV revers transkriptasen. DNA'et, som er gjort dobbeltstrenget ved fælles virkning af RNAseH og polymerasel behandles derefter med T4 DNA polymerase for at gøre dens ender stumpe. Efter methylering 10 med enzymet EcoRI methylase tilføjes EcoRI koblere "linkers" til cDNA enderne ved indvirkning af DNA ligase. cDNA'erne nedbrydes derefter med enzymet EcoRI og renses ved kromatografi på en ACA34 søjle (o,2 x 0,30 cm) [Watson, C.J. og Jackson, J.F. (1985) In Glover DM ed.: "DNA Cloning" vol. I. A Practical Approach: Oxford, Washington: IRL Press, p 15 49]. Der indføres cDNA (500 til 7000 bp) på EcoRI stedet i GT11 fagen [Huynh et Al., (1985) In Glover D.M., ed. "DNA Cloning" vol I. A Practical Approach: Oxford, Washington: IRL Press, p. 49].

Efter ligering indhylles de rekombinante fager in vitro. En bank på 3 x 10® fager tilvejebringes således.

20 b) Sortering af banken og valg af "ES" kandidater.

GT11 fag derivatet muliggør ekspression af fremmede gener under kontrol af Lac promotoren efter fusion af cDNA'et med Ø-galactosidase-genet fra E. col i (Young og Davis, 1983).

25 En prøve af GUI banken inokuleres i E. col i stammen Y1090 til en 4 fortynding svarende til 1 x 10 fager/skål på 90 mm i diameter.

Fremkaldelse af ekspression af proteinet under kontrol af Lac promotoren igangsættes ved 42°C i nærvær af isopropyl-Ø-D-thiogalactopy-ranosid (IPTG).

30 De syntetiserede proteiner absorberes på nitrocellulosefilter for at blive inkuberet i nærvær af anti-ES kaninantistoffer (opnået som beskrevet i Eksempel 3.a ovenfor).

De fikserede antistoffer påvises med et andet anti-IgG kaninantistof mærket med peroxydase, og dette kompleks fremkaldes endelig ved 35 farvning med 4-chlor-l-naphtol i nærvær af H2O2.

Denne påvisning gør det muligt at identificere de rekombinante fager, hvis cDNA indskud dirigerer syntese af et protein eller en proteinfraktion, som bærer epitoper, der genkendes af anti-ES antistof- DK 171259 B1 31 ferne.

En første udvælgelse førte til isolering af 100 kloner (ES). Efter rensning blev 20 af disse igen differentieret med to humane serummer ( se fig. 7): et IgGjg serum, der genkender 24 og 37 KD translations-5 produkterne, hvilket det andet IgG20 ikke gør, 3 kloner ES8, ES10 og ES11 i soleredes for deres genkendelse med IgG10 serum.

lo c) Karakterisering af klonerne i ES8, ES10, ESI1 ved antistofudvælgelse.

Den anvendte antistofudvælgelsesmetode er den af Olmsted [(1981), 10 J. BIOL. CHEM., 226, 11955] beskrevne.

En prøve af hver klon inokuleres i E. coli, stamme Y1090 i for-4 5 holdet 10 til 10 fager/skål på 90 mm i diameter.

Fremkaldelsen af expression udføres ved 42°C i nærvær af IPTG og de syntetiserede proteiner absorberes på cellulosenitratfiltre. Filtrene 15 inkuberes med et anti-ES kaninserum (1/125) ved omgivelsestemperatur i 3 timer.

Efter 3 vaskninger frigøres de til fusionsproteinerne specifikt fikserede antistoffer i nærværelse af HC1-glycocolpuffer, pH 2,8, 0,1 M, 0,15 M NaCl i 3 minutter.

20 Opløsningen neutraliseres hurtigt med 1 M Tris.

De udvalgte antistoffer koncentreres på 10 mg Sepharose-A protein (Phamacia) og anvendes til immunopræcipitation af translationsprodukter.

De med fusionsproteinerne fra 3 kloner udvalgte antistoffer genkender 24 KD translationsproduktet således som det fremgår af figur 14, der viser 25 immunobeskyttelse af translationsprodukter med antistoffer udvalgt med klonerne ES8, ES10 og ESI1.

Spor 1: Antistoffer fra et anti-ES kaninserum udvalgt med klon ESI 1.

Spor 2: Antistof fra et hyperimmun kaninserum udvalgt med klon 30 ES11.

Spor 3: Antistof fra et anti-ES kaninserum udvalgt med klon ES10.

Spor 4: Antistof fra anti-ES kaninserum udvalgt med klon ES-8.

o EKSEMPEL 15 35 Subkloning af "indskud" fra klon E0 8, 10 og 11 1 vektoren pUC13.

1) Opnåelse af DNA fagen (GUI)

Bakteriofager svarende til hver af klonerne adsorberes på E. coli Y1090 i 20 minutter ved omgivelsestemperatur. Inkubatet udspredes i aga- DK 171259 B1 32 roseskåle i nærvær af ampicillin (i forholdet 20.000 pfU/skål). Efter én nat ved 37°C elueres bakteri of agerne i SM (100 mM NaCl, 8 mM MgSO^.y^O, 50 mM Tris pH 7,5, 0,01% gelatine).

Eluatet behandles først med chloroform og derefter med DNAase og 5 RNAase (1 /tg/ml) for at eliminere bakteriekomponenterne.

Derefter præcipi teres fagerne i 10% PEG og 1,25 M NaCl ved 4°C.

En ultracentrifugering til ligevægt i CsCl gradient udføres i 24 timer ved 108.000 g (Beckman L8 70 rotor SU 55 Ti).

Fagbåndet udvindes ved hjælp af en nål, og opløsningen af fager 10 dialyseres to gange i én time overfor 10 mM Tris puffer, pH 7,4, 20 mM MgCl2, 0,15 M NaCl. Fag DNA'et opnås derefter ved behandling med 10 mM Tris HC1, 1 mM EDTA og 0,1% SDS og renses ved ekstraktion med phenol/chloroform. Indskuddene adskilles derefter fra fag DNA'et ved nedbrydning med EcoRI og migrering på 1,2% agarosegel med lavt smelte-15 punkt. Efter farvning af gelen i en ethidiumbromidopløsning (10 øg/ml) er nedbrydningsfragmenterne synlige i ultraviolet lys. Det er således muligt på grundlag af migreringsafstanden at bestemme størrelsen af de forskellige indskud : ES8 indskuddet er på 900 basepar, ES10 indskuddet er på 1900 basepar og ES11 indskuddet er på 1300 basepar.

20 Indskuddene ekstraheres derefter fra agarosen ved hjælp af "GENECLEAN" teknikken (BiolOl).

2) Subkloning i pUC13

Plasmidet pUC13 (Pharmacia), som er lineariseret ved EcoRI nedbrydning har 5'-phosphorylerede ender for at minimere recirkulation af plas-25 midet. Ligeringsreaktionen mellem pUC13 og indskuddet udføres ved anvendelse af en enhed fag T4 DNA ligase (Genofit). Vektor/indskud molforholdet bør være af størel sesordenen 1. Ligeringsblandingen anvendes endelig til transformering af E. coli stamme JM103 efter HANAHANs klassiske metode [J. Mol. Biol., (1983), 166, 553]. De transformerede 30 celler udspredes i LB agar skåle i nærvær af ampicillin, XGal og IPTG.

De hvide kolonier er dem, som har integreret de rekombinerede pi asmider.

For hver af klonerne ES8, ES10 og ES 11 udvalgtes en hvid koloni: pUC13 ES 8.10, ES 10.2, ES 11.7. Restriktionskort for 3 kloner pUC13 ES

8.10, ES 10.2, ES 11.7 35 1) Fremstilling af plasmid DNA

Dette trin gør det muligt at adskille plasmid DNA fra bakterie DNA.

Det udføres ved centrifugering i isopyknisk gradient af CsCl ved BULHER og TREICH's metode (som iværksat af Service de Biochemie).

DK 171259 B1 33 2) Nedbrydning med endonucleaser

Det rensede plasmid DNA nedbrydes derefter med forskellige restriktionsenzymer (EcoRI, Accl, PsTI, PvUII og SacI). Efter analyse af nedbrydningsfragmenterne på 1,2% agarosegel blev der etableret restrik-5 tionskort for de 3 indskud, som er afbildet i figur 15, som viser sub-kloning af indskuddene af de 3 TG kloner, ES 8.10 (900 bp), ES 10.2 (1900 bp) og ES 11.7 (1300 bp) på EcoRI stedet i plasmidvektor pUC13 (2700 bp).

På denne figur er A = Accl, E = EcoRI, P = PstI, Pv = PvuII, S = 10 SacI.

Claims (23)

1. Antigenisk præparat fra Toxoplasma gondii (TG), KENDETEGNET ved, at 5 det kan opnås ved: - inkubation af en suspension af Toxoplasma gondii tachyzoitter i ca. 3 timer i et cellefrit medium af RPMI 1640 type indeholdende 10% komplementbefri et serum af human eller animalsk oprindelse, - centrifugering af den inkuberede suspension og udvinding af su- 10 pernatanterne fri for parasittiske substanser og indeholdende ekskre- tions-sekretions antigenerne (ES antigener), - filtrering af supernatanterne til opnåelse af det antigeniske præparat, samt eventuelt - koncentrering af det antigeniske præparat og frysning til -70°C, 15 og at det indeholder en blanding af ekskretions-sekretions antigener fra TG tachyzoitter, som er i stand til at fremkalde en beskyttende humoral reaktion af IgE type mod toxoplasmose. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

2. Antigenisk præparat ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at det be 2 står af ekskretions-sekretions antigener fra TG tachyzoitter med respek 3 tive molekylvægte på 185 kDa, 170 kDa, 155 kDa, 105 kDa, 98 kDa, 84 kDa, 4 68 kDa, 57 kDa, 53 kDa, 45 kDa, 43 kDa, 39 kDa, 35 kDa, 34 kDa, 31 kDa, 5 30 kDa, 26 kDa, 25 kDa, 24 kDa og 20 kDa. 6 7

3. ES-antigener fra Toxoplasma gondii, KENDETEGNET ved, at de kan 8 opnås fra det antigeniske præparat ifølge krav 1 eller 2 ved 9 - immunopræcipitation af de forskellige i præparatet indeholdte ES 10 antigener, som på forhånd er blevet radiomærket, ved at bringe præpara- 11 tet i kontakt med et mammalt serum, navnligt et passende humant eller 12 animalsk serum udvalgt fra gruppen omfattende sera udtaget fra patienter 13 og erkendt som seropositive (enten fra den akutte fase indeholdende 14 specifikke IgM'er eller fra den subakutte fase indeholdende både IgM'er 15 og IgG'er eller fra den kroniske fase indeholdende IgG'er), og sera op- 16 nået ved immunisering ved et antigenisk præparat ifølge krav 1 eller 2 og indeholdende anti-ES antistoffer, - opfangning af de dannede antigen/antistofkomplekser (immunopræci-pi tater) på perler af A-Sepharose® protein, som eventuelt er behandlet DK 171259 B1 med henblik på at binde antistofferne af IgG type og antistofferne af IgM type, - separation af ES antigenerne ved centrifugering og udvinding af supernatanterne indeholdende de dissocierede immunopræcipitater, og 5 eventuelt - polyacrylamidgel elektroforese af immunopræcipi taterne.

4. ES antigener ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at de har en molekylvægt på 185 kDa, 170 kDa, 155 kDa, 105 kDa, 57 kDa, 53 kDa, 45 kDa, 10 43 kDa, 39 kDa, 35 kDa, 34 kDa, 31 kDa, 30 kDa, 26 kDa, 25 kDa og 24 kDa.

5. ES antigen ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at det har en molekylvægt på 105 kDa. 15

6. ES antigen ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at det har en molekylvægt på 84 kDa.

7. ES antigen ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at det har en mole- 20 kyl vægt på 98 kDa.

8. ES antigen ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at det har en molekylvægt på 68 kDa. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

9. ES antigener ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at de kan opnås 2 samtidig ved immunopræcipitation af det antigeniske præparat ifølge krav 3 1 eller 2 4 - med et passende serum udvalgt fra gruppen omfattende sera udtaget 5 fra patienter og sera opnået ved immunisering med et antigenisk præparat 6 ifølge krav 1 eller 2 og indeholdende anti-ES antistoffer, og 7 - med sera opnået ved immunisering med antigener fra bradyzoitter, 8 og 9 ved, at de svarer til ES antigener, som er fælles for TG tachyzoitter og 10 bradyzoiiter og har en molekylvægt på 25 kDa til 24 kDa. 11

10. ES antigener ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at de kan opnås samtidig ved immunopræcipitation af antigenpræparatet ifølge krav 1 eller 2 - med et passende serum udvalgt fra gruppen omfattende sera udtaget DK 171259 B1 fra patienter og sera opnået ved immunisering med et antigenisk præparat ifølge krav 1 eller 2 og indeholdende anti-ES antistoffer, og - med sera opnået ved immunisering med antigener fra bradyzoitter, og 5 ved, at de svarer til ES antigener, som er fælles for TG tachyzoitter og bradyzoitter og har en molekylvægt på ca. 43 kOa og glycoproteinnatur.

11. Produkt af translationen af mRNA'er fra tachyzoitter, KENDETEGNET ved, at det omfatter mindst et ES antigen ifølge et hvilket som 10 helst af kravene 3-10, og at det genkendes af humane sera fra den kroniske fase eller den akutte fase af infektion med Toxoplasma gondii.

12. Produkt af translationen af mRNA'er fra tachyzoitter ifølge krav 11, KENDETEGNET ved, at det kan opnås ved in vitro translation af 15 mRNA'er ekstraheret fra lysater af tachyzoitter, i reticulocytlysat i nærvær af en blanding af aminosyrer, som er fri for L-methionin og om-35 fatter S-methionin, i et forpufret medium.

13. Fremgangsmåde til kloning af translationsprodukterne ifølge 20 krav 11 eller 12, KENDETEGNET ved, at den omfatter - ekstraktion af mRNA'er fra tachyzoitlysater, og - syntese af cDNA'er fra de ovenfor opnåede tachyzoit mRNA'er ved reaktion med revers transkriptase fra AMV, idet det således dannede cDNA bibliotek derefter screenes for at identificere de rekombinante fager, 25 hvis cDNA insertion dirigerer syntesen af et protein eller en proteinfraktion, som bærer epitoper, som genkendes af anti-ES antistofferne, og derfra udvælger de ES kloner, som genkendes af humane sera, idet de udvalgte kloner karakteriseres ved antistofselektion. 1 2 3 4 5 6

14. Serum rigt på IgE antistoffer, som er egnet til at give en sig 2 nifikant beskyttelse mod toxoplasmose, og navnlig mod tachyzoitter, KEN 3 DETEGNET ved, at det kan opnås fra dyr immuniseret med antigeniske præ 4 parater, ES antigener eller produkter af translationen af mRNA'er fra 5 tachyzoitter ifølge et hvilket som helst af kravene 1-12. 6

15. Monoklonalt antistof, KENDETEGNET ved, at det kan fremstilles af hybridomaer opnået ved fusion af celler fra dyr immuniseret med ES antigenerne ifølge et hvilket som helst af kravene 3-10, med tumorceller. DK 171259 B1

16. Vaccine egnet til fremkaldelse af en signifikant beskyttelse mod toxoplasmose, KENDETEGNET ved, at den som aktiv bestanddel indeholder et antigenisk præparat eller et ES antigen ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10. 5

17. Produkt til diagnose af toxoplasmose, herunder congenital toxopl asmose, KENDETEGNET ved, at det som aktiv bestanddel indeholder et antigenisk præparat eller antigener ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10. 10

18. Diagnostisk produkt ifølge krav 17, KENDETEGNET ved, at det omfatter antigenet med en molekylvægt på 105 kDa.

19. Diagnostisk produkt ifølge krav 17, KENDETEGNET ved, at det om- 15 fatter antigenet med en molekylvægt på 84 kDa.

20. Diagnostisk produkt ifølge krav 17, KENDETEGNET ved, at det omfatter antigenet med en molekylvægt på 98 kDa.

21. Diagnostisk produkt ifølge krav 17, KENDETEGNET ved, at det om fatter antigenet med en molekylvægt på 68 kDa.

22. Diagnostisk produkt ifølge krav 17, KENDETEGNET ved, at det omfatter antigenet med en molekylvægt på 24 kDa. 25

23. Fremgangsmåde til påvisning af og/eller screening for toxoplasmose, KENDETEGNET ved, at den omfatter at man bringer et humant serum i kontakt med et diagnostisk produkt ifølge et hvilket som helst af kravene 17-22. 30 o 35