DK169904B1 - Anvendelse af esterforbindelser som temporært mikrobicid - Google Patents

Description

i DK 169904 B1

Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af en langkædet alkylester med det formål at opnå en temporær mi-krobicid virkning til desinfektion af produkter eller til anvendelse i produkter til desinfektion, som kommer i 5 kontakt med fødevarer, mennesker og dyr.

Igennem lang tid har man vidst, at amphiphile forbindelser af den kvaternære ammonium-type, udviser en kraftig antimikrobiel virkning, idet artiklen af Domagk fra 1935 10 har haft stor indflydelse på udviklingen inden for dette område. (G. Domagk, Deutsch. Med. Wochenschr. 61, 829 (1935)). Ud fra undersøgelser af såvel akut som kronisk toxicitet er det imidlertid blevet klart, at disse forbindelser kan give anledning til hudirritation og hyper-15 sensitivitet, og derfor kan de ikke uden videre anbefales til visse anvendelser.

Det er derfor et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe antimikrobielle forbindelser, som ikke 20 har den ovennævnte ulempe. Et andet formål med opfindelsen er at gøre det muligt at foretage en hurtig inaktivering gennem en kontrollerbar nedbrydning af den antimikrobielle forbindelse. Det er desuden et formål, at nedbrydningen skal kunne finde sted ved en pH-værdi på mel-25 lem ca. 6 og ca. 8,5, som er en pH-værdi, der ikke giver anledning til hudirritation og lignende fænomener.

Det har nu vist sig, at disse formål kan opfyldes ved anvendelse af en langkædet alkylester med den almene formel 30

R1 R11 R111 N+ CHC^ n (A-) I

'^'0RIV

RV

hvori R1, R11 og R111 hver for sig er hydrogen eller la-IV

35 vere alkyl, R er en langkædet alkylgruppe med 10-18

V

carbonatomer, R er hydrogen eller en gruppe med formlen vi + vi R N Η^, hvor R er en alkylengruppe med 3-4 carbonato- 2 DK 169904 B1 * mer, A er en monovalent mod-ion og n er antallet af ka-tioniske grupper i esterforbindelsen, som temporært mi-krobicid i et vandigt medium ved en pH-værdi på mellem ca. 6 og ca. 8,5 til desinfektion af produkter eller til 5 anvendelse i produkter, der kommer i kontakt med fødevarer, mennesker og dyr, eksempelvis celler og væv fra mennesker eller dyr, men henblik på desinfektion af produktet. Ifølge den foreliggende opfindelse inaktiverer man mikroorganismerne i en første fase ved i et vandigt 10 medium med en pH-værdi på mellem ca. 6 og ca. 8,5 at udsætte mikroorganismerne for den langkædede alkylester, som afgiftes som følge af den hydrolytiske reaktion, som finder sted samtidigt med og efter inaktiveringen af mikroorganismerne, således at indholdet af esteren i løbet 15 af kort tid når ned på et harmløst niveau. De lavere al-kylgrupper R1, R11 og R111 er fortrinsvis alkylgrupper

med 1-4 carbonatomer, især methylgrupper. Fortrinsvis IV

er R en ligekædet alkylgruppe. Mod-ionen A er normalt en halogenidion, såsom chlorid, eller HSO^-. Som eksemp-20 ler på foretrukne forbindelser kan anføres estere med de almene formler II. III.

0 0 25 (CH_),N+CH9C A~ ; H-N+-CH-C^ 2A~ °9

> IV J ' \ IV

OR C-H* N0R

i 3 6 * + N H3 30 IV.

.0

« KT+ CR—C.^ 2A

b3n -ch c

=A 0R

35 N+H3

IV

hvori R og A har de ovenfor anførte betydninger.

i 3 DK 169904 B1

Generelt har sædvanlige alkylester-forbindelser en ekstremt lav hydrolysehastighed ved disse pH-værdier. De ladede langkædede alkylestere med den almene formel 1 ud-5 viser en fordelagtig hydrolysehastighed i et pH-område fra omkring 6 til omkring 8,5, især i pH-området fra omkring 7 til omkring 8, som ifølge opfindelsen med fordel anvendes til at opnå en mikrobicid virkning, som i begyndelsen er fuldstændig, samtidigt med, at der kun udøves 10 en begrænset toxisk virkning overfor mennesker og dyr.

Den sidstnævnte fordel vil være mere udtalt, når der er tale om længere kontakttider, eksempelvis en halv time eller mere, imellem på den ene side de desinficerede eller desinficerende produkter og på den anden side menne-15 sker og dyr. Normalt tilsættes de langkædede alkylestere i sådanne mængder, at den effektive koncentration i det vandige medium bliver mindst 2 ppm, fortrinsvis mellem 5 og 200 ppm, selv om det også er muligt at anvende andre koncentrationer i afhængighed af de specifikke anvendel-20 sesbetingelser.

Som eksempler på lavere alkylgrupper i de ovenfor viste formler kan anføres methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, sec-butyl og isobutyl, idet ethyl og især methyl er

IV

25 de foretrukne grupper. Den langkædede alkylgruppe R kan være decanyl, dodecanyl, dodecenyl, tetradecanyl, hexade-canyl, octadecanyl, octadecenyl, octadecandienyl og octa-decantrienyl, og blandt disse grupper foretrækker man især de mættede grupper.

30

Forbindelser med de ovenfor viste formler har tidligere været omtalt i den kemiske litteratur (I. Métayer, Ann pharm. franc. 10, 435, 439 (1952)), og de har endvidere vist sig at have antibakterielle virkninger (A.E.Epstein 35 et al., Khim. Farm. Zh. 14, 23 (1980) og Teruaki Nakamiya et al., Ferment. Technol Vol. 54, No 6, p. 369-376, (1976)). Da findes ingen rapporter, som omtaler, at der 4 DK 169904 B1 > sker et tab af biologisk aktivitet som et resultat af esterhydrolyse i pH-området omkring 7, og derfor findes der heller ingen steder i litteraturen nogen angivelse af de fordele, som er knyttet til anvendelse af disse forbin-5 delser i stedet for de tidligere kendte mikrobicide forbindelser.

Hovedideen, som ligger til grund for den foreliggende opfindelse, hidrører fra den kendsgerning, at der ved pas-10 sende koncentrationsniveauer kun kræves relativt korte tidsrum for at opnå den fuldstændige antimikrobielle virkning. I de fleste praktiske situationer indgives det antimikrobielle middel også i et meget stort overskud.

Ved mange anvendelser vil den toxiske forbindelse derfor 15 være aktiv i et langt tidsrum efter udøvelsen af den antimikrobielle virkning, og denne aktivitet er både uønsket og unødvendig. Den foreliggende opfindelse bygger på et princip, ifølge hvilket den antimikrobielle forbindelse taber sin biologiske aktivitet og sin toxiske virkning 20 gennem en hydrolytisk reaktion. Hydrolysehastigheden kan reguleres gennem små ændringer i pH-værdien og elektrolyt-koncentrationen, som fører til harmløse slutprodukter indenfor det fysiologisk velegnede pH-område fra omkring 6 til omkring 8,5.

25

Opløseligheden af de anvendte estere i polære organiske opløsningsmidler, såsom lavere alkoholer og blandinger af alkohol og vand, er af størrelsesordenen 1 g/ml. Sådanne formuleringer er særdeles stabile, og de kan opbevares 30 over længere tidsrum.

De ifølge opfindelsen anvendte estere er særdeles aktive overfor et bredt spektrum af gram-positive og gram-negative bakterier, ligesom de er aktive overfor svampe. I 35 det følgende er angivet eksempler på testdata.

v

Den temporære desinficerende virkning af de ifølge opfin- * 5 DK 169904 B1 delsen anvendte estere kan udnyttes i hygiejneprodukter såsom bleer, tamponer, masker, servietter og kosmetiske pulvere. Virkningen kan også udnyttes i form af desinficerende midler, eksempelvis i forbindelse med udstyr 5 til fødevareindustrien, i skumbad, i svømmebassiner og i mundskyllemidler, og virkningen kan anvendes i forbindelse med behandling af emballager, udstyr til fødevareindustrien, fødevareprodukter, drikkevand og lignende. De anvendte estere kan påføres væv og klæde ved neddypning i 10 eller sprøjtning med en svagt sur vandig opløsning af de pågældende estere efterfulgt af en hurtig tørring. Cellulosefibre kan imprægneres ved at sætte den anvendte ester til en opslæmning af cellulosepulpen i hovedbeholderen.

Ved anvendelse i tør form kan de omhandlede estere have 15 form af pulvere eller tabletter, f. eks. brusetabletter.

Esterne II kan fremstilles ved en konventionel metode, hvorved man omsætter et chlor- eller bromacetylhalogenid med en alkohol i et halogeneret carbonhydrid under dan-20 nelse af et alkylchlor- eller -bromacetat. Denne ester omdannes derefter til en ester med formlen II ved omsætning med en gasformig trialkylamin i et opløsningsmiddel såsom acetone eller toluen. Esterne III og IV kan fremstilles ved direkte esterificering af de tilsvarende ami-25 nosyrer med en langkædet fedtalkohol under anvendelse af p-toluensulfonsyre som katalysator.

Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler.

30

Eksempel 1

Den baktericide virkning af tre estere med formlen 35 + (CH3)3 n ch2co2ch2(ch2)p CH3 6 DK 169904 B1 r hvor p var henholdsvis 10, 12 og 14, blev bestemt og sammenlignet med cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), som er et velkendt baktericid. Virkningen blev målt som den koncentration, som var nødvendig for at reducere antallet af 5 5 levedygtige bakterier med en faktor 10 under anvendelse af E. coli (NCTC 10418) som testorganisme ved en kontakttid på 5 minutter. Resultaterne fremgår af den nedenstående tabel: 10 Tabel 1

Forbindelse Koncentration _E_PPm 10 50 15 12 12,5 14 >100 CTAB 12,5

Af disse resultater fremgår det klart, at de omhandlede 20 estere har en tilpas kraftig baktericid virkning.

Eksempel 2

Aktiviteten overfor en række forskellige mikroorganismer 25 blev bestemt for den forbindelse fra eksempel 1, som ialt indeholdt 14 carbonatomer i alkylkæden (p=12). De relevante testdata fremgår af den nedenstående tabel. Aktiviteten er udtrykt som log (cfu/ml) på et 12,5 ppm niveau og ved en kontakttid på 5 minutter i saltvand indeholden-30 de en phospha tpuf fer ved stuetemperatur. De fundne virkninger er sammenlignet med en kontrol (uden baktericid) og med CTAB. Ved G+ og G- forstås henholdsvis gram-positive og gram-negative arter.

35 s.

Tabel 2 7 DK 169904 B1

Mikroorganismer (type) log (cfu/ml)

kontrol betain- CTAB

5 ester

Bacillus megaterium (G+) 6,7 <3,3 <3,3 E. coli (G-) 7,0 <3,3 <3,3

Candida albicans (gær) 6,2 6,2 5,7 10 Pseudomonas aeruginosa (G-) 7,4 7,5 7,5

Staphylococcus aureus (G+) 5,8 <3,3 <3,3

Salmonella typhimurium (G-) 5,5 3,9 3,8

Virkningerne af betainesteren og af CTAB er de samme in-15 denfor den eksperimentelle usikkerhed. Med undtagelse af den mere resistente pseudomonas aeruginosa og gærtypen Candida albicans fandt man høje aktiviteter, selv ved disse lave koncentrationer.

20 Eksempel 3

Hastigheden af den basiske hydrolyse af de omhandlede be-tainestere blev bestemt for den forbindelse fra eksempel 1, som i alt indeholdt 14 carbonatomer i alkylkæden 25 (p=12). De anvendte forsøgsbetingelser og de opnåede re sultater fremgår af den nedenstående tabel: 30 35

Tabel 3 8 DK 169904 B1 t

Hydrolyse (angivet i %) ved forskellige pH-værdier og reaktionstider ved 30 °C 5

Tid, pH

timer_2,6_3_4_5_6_7_8_9 0,25 96 0,5 12 100 10 1 5 60 100 1,5 87 2 2 10 3 100 4 37 100 15 8 <1 <1 1 80 18 16 20 98 24 <12 3 5 46 85 20 48 <12 5 10 120 144 1 6 12 22 25 Hydrolysehastigheden er også temperaturafhængig. Ved en forøgelse af temperaturen fra 25 - 30 eC aftog halveringstiden ved pH 7,0 således fra 9 til 5 timer.

Eksempel 4 30

Hydrolysehastigheden og derigennem varigheden af den biologiske aktivitet af de omhandlede estere kan ifølge opfindelsen også reguleres gennem indstilling af mediets saltkoncentration. Hydrolysehastigheden aftager således 35 betydeligt, hvis man forøger natriumchloridkoncentratio-nen. I den nedenstående tabel vises indvirkningen af na-triumchloridkoncentrationen på hydrolysen af forbindelsen 9 DK 169904 B1 fra eksempel 2 ved pH 7,9 og ved en temperatur på 30 6C.

Tabel 4 5 -

Hydrolyse, %

Molaritet af NaCl t, timer 0 0,1 0,5 1,0 10 1 51 9 6 2 2 95 56 9 4 5 100 100 28 12 48 95 77 15

Eksempel 5

En opløsning af 150 ppm af forbindelsen fra eksempel 1 i 10 mM phosphatpuffer (pH 8,0) blev analyseret på forskel-20 lige tidspunkter med hensyn til graden af hydrolyse såvel som med hensyn til den baktericide virkning over for E. coli (NCTC 10418). Graden af hydrolyse blev bestemt ved at analyse den frigjorte 1-tetradecanol ved gaschromato-grafi (pakket 121,9 cm glaskolonne med 3 % SP-2100 på 25 80/100 Supelcoport; isotermisk ved 130 ’C). Man isolerede 1-tetradecanolen ved forsigtig ekstraktion med hexan. Den interne standardisering blev gennemført ved hjælp af 1-hexadecanol. Man bestemte den baktericide virkning ved at fortynde en 1 ml prøve til 25 ppm med 5 ml af en steril 30 puffer, hvorefter man tilsatte 60 ul af bakteriesuspensionen. Efter 5 minutters forløb ved stuetemperatur fortyndede man prøven 100 gange og udspredte fortyndingen på en agarplade ved hjælp af et "Spiral Plater" system. Pladerne blev incuberet ved 37 °C i 20 timer og derefter op-35 talt. Data fra disse forsøg er anført i den efterfølgende tabel:

Tabel 5 10 DK 169904 B1 *

Hydrolyse og indvirkning på bakterieaktiviteten 5

Tid, min Hydrolyse, % Levende tællinger, cfu/ml (kontrol: 7,1 x 10®) 5 0 10 23 3 30 4,1 x 103 64 25 109 3,0 x 106 118 55 15 149 86 158 7,9 x 106 179 89 199 7,8 x 106 217 100 20 238 100

Eksempel 6 25 De nedenfor angivne forbindelser blev testet på et 25 ppm niveau overfor fem forskellige mikroorganismer i en vandig pufferopløsning (10 mM, pH 7,4). Det ene sæt opløsninger blev omgående podet, mens det andet sæt blev opbevaret ved 30 °C i 24 timer inden podning. Kontakttiden 30 var 5 minutter. Man fandt de i tabellen angivne resultater: 35 -j *

Tabel 6 11 DK 169904 B1

Forbindelse Mikroorganisme Δ log cfu/ml 0 timer 24 timer 5 - LE 16 E.c. 4,3 3,2 C.a. 6,1 0,7 ORN 14 E.c. 7,1 0 10 St.a. 5,2 0 S.t. 6,7 0

Ps.a. 8,2 <3,2 C.a. 6,1 0 15 BE 14 E.c. 7,1 0,2

St.a. 6,5 0,2 S.t. 6,7 0,1

Ps.a. 8,2 <3,2 C.a. 3,3 0 20 CTAB E.c. 7,1 7,1

St.a. 6,5 6,4 S.t. 6,7 6,5

Ps.a. 8,2 8,2 25 C.a. 6,1 6,0

O

30 LE 16 = N+H3~CHC^^ 2Cl“ I ^OC16H33 <ρΗ8

N+H

35 3 12 * DK 169904 B1 ORN 14 = N+H-.-CHC^ 2Cl" C3Hfi 5 NH3 o BE 14 * (CH-) -N^-CH.-C^^' Cl" 3 3 2 s.

- OC14H29 10 E.c. = E. coli NCTC 10418

St.a.= Staphylococcus aureus NCTC 10788 S.t. = Salmonella typhimurium

Ps.a.= Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 C.a. = Candica albicans ATCC 10231 15

Af disse resultater fremgår det klart, at den antimikro-bielle virkning af de forskellige langkædede alkylestere var af samme størrelsesorden som virkningen af cetyltri-methylammoniumbromid. Efter 24 timers forløb i vandig op-20 løsning er virkningen aftaget betydeligt for mikrobici-derne ifølge opfindelsen. De estere, som er betegnet ORN 14 og BE 14, udviste særligt fordelagtige egenskaber.

Eksempel 7 25

Lysin-tetradecylester, betain-tetradecylester og betain-tetradecylester og betain-hexadecylester blev testet ved forskellige koncentrationer med henblik på desinfektion af drikkevand. Drikkevandet indeholdt Salmonella typhimu-30 rium 395 MS og Shigella sonnei. Ved en koncentration af mikrobicidet på 10 ppm og en pH-værdi på omkring 7 blev de ovennævnte bakterier inaktiveret fuldstændigt i løbet af 10 minutter. En fuldstændig inaktivering betyder, at over 99,99% af bakterierne blev dræbt. 1 nærværelse af et 35 kontaminerende materiale (0,2% bovint serumalbumin) var koncentrationer på 100 ppm tilstrækkelige til at fremkalde en fuldstændig inaktivering i løbet af 10 minutter.

4 DK 169904 B1 13

Også organismen Campylobacter jejuni blev inaktiveret i samme udstrækning under disse betingelser.

Eksempel 8 5

En desinfektion af vand indeholdende Pseudomonas aerugi-nosa-stammen 10783 blev gennemført ved tilsætning af be-tain-tetradecylester og lysin-tetradecylester. Arten Pseudomonas aeruginosa er velkendt for sin resistens 10 overfor kationiske overfladeaktive desinfektionsmidler.

Ved en koncentration af esteren på 100 ppm blev bakterierne inaktiveret fuldstændigt i løbet af et minut. Man opnåede de samme resultater i nærværelse af et kontamine-rende organisk materiale (0,2% bovint serumalbumin).

15 20 25 30 35

Claims (7)

1. Anvendelse af en langkædet alkylester med den almene 5 formel R1 R11 R111 N+ CHC^^ n(A~) I ^0RIV 10 ^ hvori R1, R11, og R111 hver for sig er hydrogen eller la- IV vere alkylgrupper, R er en langkædet alkylgruppe med 15 10-18 carbonatomer, RV er hydrogen eller en gruppe med formlen R^1 N+Hg, hvori R^* er en alkylengruppe med 3-4 carbonatomer, A er en monovalent mod-ion og n er antallet af kationiske grupper i esterforbindelsen, som temporært mikrobicid i et vandigt medium ved en pH-værdi på mellem 20 ca. 6 og ca. 8,5 til desinfektion af produkter eller til brug i produkter til desinfektion, hvilke produkter kommer i kontakt med fødevarer, mennesker og dyr.

2. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, 25 at esteren har den almene formel (ch) n+ch2c; a"" \riv 30 IV hvori R og A har de i krav 1 angivne betydninger.

3. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at esteren har den almene formel DK 169904 B1 O H.N+-CH-C// 2A~ I Nriv ?3H6 5 1 + N H3 IV hvori R og A har de i krav 1 angivne betydninger.

4. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at esteren har den almene formel 0 ic + S

15 H-N -CH-C 2A c4b8Nor1v 4* N h3 20 IV hvori R og A har de i krav 1 angivne betydninger.

5. Anvendelse ifølge ethvert at kravene 1-4, kende- IV tegnet ved, at R er en ligekædet alkylgruppe. 25

6. Anvendelse ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at man bekæmper bakterier eller svampe.

7. Anvendelse ifølge krav 6, kendetegnet ved, 30 at bakterierne er gram-negative eller gram-positive bakterier. 35