DK166356B

DK166356B - Rensning af interferon og anvendelse af metalchelatharpiks dertil

Info

Publication number: DK166356B
Application number: DK149584A
Authority: DK
Inventors: Erich Hochuli
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1983-03-03
Filing date: 1984-02-29
Publication date: 1993-04-13
Also published as: AU552180B2; IE56981B1; DK166356C; DK149584D0; EP0118808A2; IL71067A0; NZ207273A; IE840511L; EP0118808A3; DK149584A; DE3483619D1; CA1231306A; US4551271A; IL71067A; EP0118808B1; AU2511884A; PH19216A

Description

DK 166356 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til rensning af rekombinante interferoner ved hjælp af metal-chelat-chromatografi samt anvendelse af bestemte metal-chelatharpikser til rensning af rekombinante interferoner.

5 Udtrykket "interferoner” betegner en gruppe af for kroppen særegne proteiner med antiviral og immunregulatorisk virkning. Den antivirale virkning opnås ikke ved direkte indflydelse af selve viraene, men ved en virkning på deres målceller i retning af beskyttelse mod virusinfektionen.

10 Interferonerne kan udøve en observerbar virkning på cancersvulster, hvilket gør dem egnede til anvendelse i cancerterapien og påvirker det for kroppen særegne immunsystem, idet de fx aktiverer makrophager og NK-celler og forstærker ekspressionen af forskellige immunologisk be-15 tydelige bestanddele i cellemembranen.

Humane interferoner (α, β og δ) kan i dag fremstilles i store mængder ved hjælp af rekombinant DNA-teknologi ad mikrobiel vej, hvilke interferoner på trods af de største anstrengelser ikke kan stilles til rådighed ved isolering 20 af naturligt materiale (leukocyter, fibroblaster, lymfocyter) og rensning.

Først denne nye teknologi har derfor åbnet én vej til intensiv klinisk afprøvning og almindelig bred terapeutisk anvendelse af interferonerne, hvilket synes at gøre det 25 muligt at opnå en tilstrækkelig forsyning til de personer, der skal undergå behandling med de aktive stoffer.

Enkeltheder i kloningen af interferon-cDNA og den direkte ekspression deraf, især i E.coli. er i mellemtiden blevet publiceret mange steder. Således er fremstilling af rekom-30 binante interferoner fx kendt fra J. Interferon Res. l, 1981, s. 381-390 (Wetzel et al), Nature 284. 1980, s. 316-320 (Naguta et al.), Nucleic Acids Res. 8. 1980, s. 4057-4074 (Goeddel et al.), Nucleic Acids Res. 10. 1982, s.

2487-2501 (Devos et al.), Nature 295. 1982, s. 503-508 2

DK 166356B

(Gray et al.) samt fra tysk offentliggørelsesskrift nr. 31 25 706, 31 38 096 og 31 44 469.

Da de rekombinante interferoner er af mikrobiel oprindelse (for tiden stammer de fortrinsvis fra E. coli), er de efter 5 deres isolering fra mikroorganismen eller næringsmediet først kontamineret af en række mikrobielle ledsagende stoffer, hvis tilstedeværelse forhindrer terapeutisk anvendelse af de således vundne interferoner. Rensning af det rekombinante materiale spiller derfor en særlig vigtig 10 rolle. Til rensning af rekombinante interferoner blev før hen en række forskellige metoder, især chromatografiske metoder, taget i betragtning, og kombineret med hinanden (jfr. fx tysk offentliggørelsesskrift nr. 31 25 706).

Herved har først og fremmest chromatografi på immunadsor-15 benser, også på anti-interferon-antistoffer, vist sig at være et værdifuldt hjælpemiddel. Således er rensning af rekombinante human- leukocyt-interferoner (HuIFN-α) ved hjælp af monoklonale antistoffer fx beskrevet af Staehelin et al. (J. Biol. Chem. 256. 1981, S. 9750-9754) og af 20 Secher et al. (Nature 285. 1980, s. 446-450). På grund af disse immunadsorbensers høje specificitet måtte man gå ud fra, at det således rensede materiale er praktisk talt fri for kontaminerende stoffer og har en høj renhedsgrad.

Ved rensning af større mængder rekombinante leukocyt-inter-25 feroner ved hjælp af monoklonale antistoffer viste det sig dog, at det rensede materiale indeholder både interferonfragmenter (interferon, der mangler en del af den aminoter-minale aminosyresekvens) samt interferon-oligomerer, fx dimerer. Disse uønskede biprodukter har kun ved sammen-30 lignende affinitet til antistoffet en del af det rene interferons biologiske aktivitet.

Nu er der i EP 0 011 435 beskrevet en fremgangsmåde til rensning af human-fibroblast-interferon (HuIFN-jø) ved hjælp af en fra Nature 258, 1975, s. 598-599 (Porath et al.) 35 harpiks med formlen

DK 166356 B

3 OH OH CH«-COO " I I / 2 2+

Agarose - O-C^-CH-C^-O-CCI^^-O-Cl^-CH-C^-N. Me > ch2-coo ‘ i hvor Me betegner cobalt, nikkel, zink eller kobber.

Imidlertid kan der ved denne fremgangsmåde kun opnås et 5 udbytte af IFN-0 på mellem 54% og 72%. Ved fremgangsmåden ifølge nærværende ansøgning opnås et udbytte af IFN-0 på mellem 81% og 92%.

Også Edy et al. (J. Biol. Chem. 252. 1977, s. 5934-5935) har beskrevet den vellykkede rensning af HuIFN-/3 ved den 10 ovennævnte zinkchelatharpiks. Chadha et al. påviser (J. gen. Virol. 43, 1979, s. 701-706), at HuIFN-α ikke kan renses på analog måde med de ved HuIFN-/? med held indsatte zink- eller kobberchelatharpikser og bekræfter således den allerede af Edy et al. floc. cit.) gjorte iagttagelse.

15 Ifølge opfindelsen har det nu vist sig, at rensning af rekombinante interferoner, hvad enten det er IFN-α, I FN-/9 eller IFN-5, lykkes, når man i stedet for den af Porath et al. beskrevne metalchelatharpiks går over til en principielt ens opbygget harpiks med formlen 20

OH .CH--COO

I / ^ 2+

Agarose -0-CH2-CH-CH2-N Me , ch2-coo hvor Me betegner kobber eller nikkel, som også er karakteriseret ved et kort forbindelsessted mellem agarose-matrixen og iminodieddikesyreresten. Denne harpiks og

DK 166356 B

4 fremstillingen deraf er allerede kendt, fx fra J. Chromatography 198. 1980, s. 247-255 (Hubert og Porath). Forfatterne beskriver imidlertid udelukkende dens anvendelighed til -fraktioneringen af oligo- og polynucleotider, en forbindel-5 sesklasse, der er så forskellig fra interferoner, at det på ingen måde er nærliggende for fagfolk at anvende den til løsning af det foreliggende problem med rensning af rekom-binante interferoner, især deres adskillelse fra ledsagende sekvenshomologe fragmenter og oligomerer.

10 Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til rensning af rekombinante interferoner, som er ejendommelig ved, at en i forvejen renset interferonopløsning bringes i kontakt med en metalchelatharpiks med følgende struktur 15 <j>H ^ch2-coo· “

Agarose -0-CH7-CH-CH,-N^ Me2+ 2 \ CH2-C00 hvor Me betegner kobber eller nikkel, og interferonet elueres til en renere form ved behandling af harpiksen, hvorpå interferonet sidder, med en vaske-20 væske, samt anvendelsen af denne metalchelatharpiks til rensning af rekombinante interferoner.

I et andet aspekt angår opfindelsen anvendelse af metalchelatharpiks med ovennævnte struktur, hvor Me betegner kobber eller nikkel til rensning af rekombinante inter-25 feroner.

Den ifølge opfindelsen anvendte metalchelatharpiks kan fremstilles på kendt måde - som fx beskrevet af Hubert og Porath i J. Chromatoa. 198. 1980, s. 247 - ud fra agarose ved behandling med epichlorhydrin, omsætning af det vundne 30 epoxid med iminodieddikesyre-dinatriumsalt og omdannelse

DK 166356 B

5 til kobber- eller nikkelsaltet ved vask med en kobber(II)-eller nikkelsaltopløsning, fx med kobbersulfat eller nik-kelchlorid. I stedet for epichlorhydrin kan der også anvendes epibromhydrin. Som agarose anvendes hensigtsmæssigt 5 et standardiseret produkt, fortrinsvis Sepharose® fra firmaet Pharmacia, Uppsala, Sverige. Særligt foretrukken er Sepharose® 4B.

I det følgende beskrives en fremstilling af en egnet kob-berchelatharpiks i detaljer: 10 1 liter agarosegel (Sepharose® 4B, Pharmacia) blev vasket med 2x1 liter vand på en glasfritte, overførtes til en 4-liters reaktionsbeholder og bragtes med vand op til et volumen på 2000 ml. Efter tilsætning af 150 ml 4N NaOH og 40 ml epibromhydrin blev blandingen omrørt i 5 timer ved 15 30°C. Den aktiverede harpiks blev vasket neutralt med vand på en glasfritte, der tilsattes 650 ml vandig 2N Na2CC>3-opløsning, og opløsningen bragtes op på et volumen på 2000 ml med vand. Derefter tilsattes 100 g iminodieddikesyre-dinatriumsalt, og blandingen blev omrørt i 20 timer ved 20 65“C. Derefter blev harpiksen vasket i en søjle successivt med hver gang 2000 ml vand, vandig CuS04.5H20 (0,5 vægtprocent), vand, 0,2M eddikesyre (0,2M NaCl, 0,1 vægt/volumen-procent Tween® 20), og vand. Koncentrationen af kobberioner var ca. 9 μΐϊΐοΐ/ml harpiks.

25 Før påsætningen af interferon ækvilibreres metalchelat- søjlen fortrinsvis med en vandig puffer (pH-værdi ca. 5-8), der selv ikke danner chelater med kobber eller nikkel, fortrinsvis en phosphatpuffer med en pH-værdi på 7. Ækvili-breringspufferen kan (som også elueringspufferen) indeholde 30 en stabilisator eller emulgator, fx af polyoxyethylen-fedtalkohol-typen, polyoxyethylen-sorbitan-fedtsyreester-typen eller Triton®. Tilsætning af en sådan stabilisator muliggør problemfrit arbejde også ved højere interferonkoncentrationer .

6

DK 166356B

På analog måde kan der ved anvendelse af et nikkelsalt, fx nikkelchlorid, fremstilles nikkelchelatharpiks.

Elueringen sker med vandige, med kobber eller nikkel ikke-chelatiserende pufferopløsninger på i og for sig kendt 5 måde, fortrinsvis med phosphat-eller acetatpuffere, hvorved tilbageholdelsen af interferonfragmenterne, de monomere interferoner og oligomererne er en funktion af pH-værdien og ionstyrken. Med faldende pH-værdi og stigende ionstyrke elueres først interferonfragmenterne, derefter det monomere 10 interferon og til slut oligomererne, fx med fortyndet eddikesyre. Inden for bestemte, for fagmanden velkendte grænser gælder det, at jo højere elueringspufferens ionstyrke vælges, desto højere kan også pH-værdien deraf være. Pufferens ionstyrke kan forhøjes ved tilsætning af neutrale 15 salte såsom NaCl. Ved hensigtsmæssig indstilling af pH-værdien af interferonopløsningen, som indeholder fragmenterne og oligomererne, fx til en pH-værdi på ca. 5, adsor-beres kun monomeren og oligomererne, medens fragmenterne flyder igennem.

20 Elueringen kan udføres ved en konstant pH-værdi eller med lineært eller diskontinuerligt faldende pH-gradienter. De optimale elueringsbetingelser afhænger af mængden og arten af de pågældende urenheder, mængden af materiale, der skal renses, søjledimensionerne, etc. og kan hensigtsmæssigt 25 bestemmes fra det ene tilfælde til det andet.

Hvis elueringspufferne indeholder stabilisatorer, kan disse fjernes ved chromatografi af eluaterne på egnede bærere, fx på cellulose. Ifølge opfindelsen renset interferon kan endelig krystalliseres af polyethyleriglycol/vand.

30 Rensningen af leukocyt-interferon sker fortrinsvis på en kobberchelatsøjle, og rensning af fibroblast-interferon sker fortrinsvis på nikkelchelatsøjle.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler.

7

DK 166356B

Det som udgangsmateriale anvendte rekombinante human-leuko-cyt-interferon A (rIFN-αΑ) blev vundet ved rensning på monoklonale antistoffer ifølge den af Staehelin et al. beskrevne metode (J. Biol. Chem. 256. 1981, s. 9750-9754).

5 Det som udgangsmateriale anvendte rekombinante human-fi-broblast-interferon (rIFN-/3), fremstillet ifølge den af Goeddel et al. beskrevne metode fNucleic Acids Res. 8, 1980, s. 4057-4074), blev forrenset ved chromatografi på immobiliserede triazinfarvestoffer (fx Blue-Sepharose® 10 CL-6B fra firmaet Pharmacia eller Blue Trisacryl® M fra firmaet LKB) ifølge den af Friesen et al. beskrevne metode (Arch. Biochem. Biophvs. 206. 1981, s. 432-450).

Bestemmelsen af proteindholdet blev udført i henhold til den af Lowry et al. beskrevne metode (J. Biol. Chem. 193.

15 19851, s. 265-275) under anvendelse af serumalbumin som standard.

Den kvantitative bestemmelse af urenhederne (fragmenter og oligomerer) blev udført ved hjælp af SDS-PAGE som beskrevet af Laemmli et al. iNature 277. 1970, s. 680-685), med den 20 ændring, at elektroforesen blev udført under ikke-redu-cerende betingelser (dvs. uden tilsætning af 2-mercapto-ethanol til prøven).

EKSEMPEL 1

En kobberchelat-søjle (169 ml, 5 x 8,5 cm) blev ækvili-25 fareret med 500 ml phosphatpuffer (0,05M, pH-værdi 7,0, 0,1 vægt/volumenprocent Tween® 20). Søjlen blev ved 4°C fyldt med 1480 ml af et ifølge Staehelin et al. (loc. cit.) vundet eluat af en monoklonalt rIFN-aA-antistofsøjle, der indeholdt 0,28 mg/ml protein (kontamineret med 23,5 vægt-30 procent af et 15 kd interferonfragment), og som var blevet indstillet til en pH-værdi på 7 med 4N NaOH. Søjlen blev vasket successivt med 300 ml ækvilibreringspuffer, 300 ml 8

DK 166356B

ækvilibreringspuffer, der yderligere indeholdt 0,2M NaCl, samt med 300 ml 0,05M acetatpuffer med en pH-værdi på 5,6 (indeholdende 0,2M NaCl og 0,1% Tween® 20). Derefter blev interferonfragmentet udvasket med 0,05M acetatpuffer (inde-5 holdende 0,2M NaCl og 0,1% Tween® 20) ved en fra 5,6 til 4,0 faldende pH-gradient. Derefter blev 256 mg monomert interferon (renhed over 95%) elueret med den samme acetatpuffer, pH-værdi 4,0.

Opløsning af det monomere interferon, der indeholdt 0,1 10 vægt/volumenprocent Tween®, blev til fjernelse af stabilisatoren chromatograferet på en CM 52-cellulosesøjle med en 0,1M ammoniumacetatpuffer (pH-værdi 5).

EKSEMPEL 2

Den samme ækvilibrerede kobberchelat-søjle som i eksempel 1 15 blev ved 4°C fyldt med 2168 ml af et ifølge Staehelin et al. (loc. cit.) vundet eluat af en monoklonal rIFN-aA-antistofsøjle, som indeholder 0,33 mg/ml protein (kontami-neret med 27 vægtprocent 15 kd interferonfragmenter), og som var indstillet til en pH-værdi på 4,5 med 4N NaOH.

20 Søjlen blev derefter vasket med en 0,05M acetatpuffer (pH-værdi 5,6; indeholdende 0,2M NaCl og 0,1% Tween®). Under disse betingelser adsorberedes det komplette 18,5 kd rlFN·^ aA, men ikke det 15 kd lange fragment, og det blev derefter elueret med en 0,05M acetatpuffer (pH-værdi 4; 0,2M NaCl og 25 0,1% Tween® 20), hvilket gav 402 mg interferon med en renhed på 95%.

EKSEMPEL 3

Den samme ækvilibrerede kobberchelat-søjle som i eksempel 1 blev ved 4°C fyldt med 1260 ml af et ifølge Staehelin et 30 al. (loc. cit.) vundet eluat af en monoklonal rIFN-aA-antistofsøjle, som indeholdt 0,5 mg/ml protein (kontami- 9

DK 166356B

neret med 34 vægtprocent interferon-oligomerer: en 37 kd dimer, en 55,5 kd trimer og en 74 kd tetramer), og som var indstillet til en pH-værdi på 7 med 4N NaOH. Søjlen blev først valket med 300 ml af en 0,05M phosphatpuffer (pH-5 værdi 7; 0,1% Tween®) og blev derefter elueret med en 0,05M acetatpuffer (pH-værdi 4,7; indeholdende 0,2M NaCl og 0,1% Tween® 20), hvilket gav monomert interferon med en renhed på 95%. 150 mg dimert interferon blev elueret med 0,05M acetatpuffer med en pH-værdi på 4,0 (indeholdende 0,2M NaCl 10 og 0,1% Tween® 20), de højere oligomerer med 0,2M eddikesyre (indeholdende 0,2M NaCl og 0,1% Tween® 20).

EKSEMPEL 4

En kobberchelat-søjle (295 ml, 5 x 15 cm), blev ækvili-breret med 600 ml phosphatpuffer (0,05M, pH-værdi 7, 0,1% 15 Tween® 20). Søjlen blev ved 4°C fyldt med 3200 ml af et ifølge Staehelin et al. Qoc. cit.) vundet eluat af en monoklonal rIFN-aA-antistofsøjle, som indeholdt 0,33 mg/ml protein (kontamineret med 24 vægtprocent af et 15 kd interferonfragment og med 11 vægtprocent interferonoligomerer).

20 Ved vask med en 0,005M acetatpuffer (pH-værdi 4; 0,025M NaCl, 0,1% Tween® 20) blev det 15 kd lange fragment fjernet. Monomert interferon blev elueret med 0,025M acetatpuffer (pH-værdi på 3,4; 0,025M NaCl, 0,1% Tween® 20), hvilket gav i alt 470 mg med en renhed på over 95%. Til 25 slut blev oligomererne elueret med 0,2M eddikesyre (0,2M NaCl, 0,1% Tween® 20).

EKSEMPEL 5

En kobberchelat-søjle (1000 ml, 10 x 13 cm), blev ækvili-breret med 2500 ml phosphatpuffer (0,05M, pH-værdi 5, 0,2M 30 NaCl, 0,1% Tween® 20) og blev ved 4°C fyldt med 10.000 ml af et ifølge Staehelin et al. (loc. cit.i vundet eluat af en monoklonal rIFN-aA-antistofsøjle, som indeholdt 0,21

DK 166356 B

10 mg/ml protein (kontamineret 3 vægtprocent af et 15 kd interferonfragment og med 7 vægtprocent med interferonoli-gomerer), og som var indstillet til en pH-værdi på 7 med 6N NaOH. Fragmentet blev fjernet ved vask med ækvilibrerings-5 pufferen. 1700 mg monomert interferon (renhed >95%) blev elueret med 0,05M acetatpuffer (pH- værdi på 4,5, 0,2M NaCl, 0,1% Tween® 20). Oligomererne vandtes ved eluering med 0,2M eddikesyre (0,2M NaCl, 0,1% Tween® 20). Opløsning af det monomere interferon blev til koncentration og fjer-10 nelse af 0,1 vægt/volumenprocent Tween® .20 chromatograferet på en CM 52 cellulosesøjle med 0,1M ammoniumacetatpuffer (pH-værdi 5).

Til 195 ml af eluatet af cellulosesøjlen indeholdende 4 mg/ml protein sattes ved 4°C under let omrøring langsomt 15 48,7 ml af en vandig opløsning af polyethylenglycol 4000 (0,3 g/ml). Efter ca. 5 timer dannedes de første krystaller, som efter 3 dage i kulde blev skilt fra remanensen ved centrifugering, vasket med kold, vandig polyethylenglycol 4000 (0,3 g/ml) og tørret under reduceret tryk, udbytte 520 20 mg. Ved hjælp af gelelektroforese og bioassay af en ved opløsning af nogle krystaller i 0,1M ammoniumacetatpuffer (pH-værdi 5) opnået prøve kunne det påvises, at det ved de vundne krystaller drejede sig om rent, intakt rIFN-aa.

EKSEMPEL 6 25 Kobberionerne af en kobberchelatsøjle (12 ml, 1,6 x 6 cm) blev udvasket med 20 ml af en 0,1 molær vandig opløsning af ethylendiamin-tetraeddikesyre-dinatriumsalt og derefter med 100 ml vand. Derefter blev søjlen vasket successivt med hver gang 36 ml 0,05M NaCl2.6H20 i vand, vand, 0,05M eddi-30 kesyre (indeholdende 0,5M NiCl) og vand.

Den således vundne nikkelchelatsøjle blev ækvilibreret med 36 ml phosphatpuffer (0,05M, pH-værdi 7,2, 10 vægt/volumenprocent ethylenglycol, 0,2M NaCl). 38 ml af et ifølge

Claims

1. Fremgangsmåde til rensning af rekombinante interferoner, kendetegnet ved, at en i forvejen renset inter- 15 feronopløsning bringes i kontakt med en metalchelatharpiks med følgende struktur OH CH,-C00 I / 7+ Agarose -O-Ci^-CH-Ci^-N ^ Me ch2-coo hvor Me betegner kobber eller nikkel, 20 og interferonet elueres i renere form ved behandling af harpiksen, hvorpå interferonet siddet, med en vaskevæske.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes en kobberche-latharpiks.

3. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendetegnet ved, at der anvendes en nikkelche-latharpiks. DK 166356B 12 ·

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at agarosen er Sepharose® 4B.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at rekombinant leukocyt-inter-5 feron renses.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at rekombinant fibroblast-interferon renses.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 2, 10 kendetegnet ved, at det renere interferon fås ved gradienteluering.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 5 og 7, kendetegnet ved, at elueringen sker med en fra 5,6 til 4,0 faldende pH-gradient.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at elueringen sker med en acetatpuffer med en pH-værdi på 3,5.

10. Anvendelse af en metalchelatharpiks med strukturen OH CHo-C00 1 / 2 . .2+ Agarose — O-C^-CH-C^-N v ch2-coo 20 hvor Me betegner kobber eller nikkel, til rensning af rekombinante interferoner.

11. Anvendelse af en kobberchelatharpiks ifølge krav 10 til rensning af leukocyt-interferon.

12. Anvendelse af en nikkelchelatharpiks ifølge krav 10 til rensning af fibroblast-interferon.