DK165449B - Antibiotikum mf 730-n6, dets fremstilling, mikroorganisme til brug herved, samt dets anvendelse til fremstilling af laegemidler - Google Patents

Description

i

DK 165449 B

o

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt antibiotikum, der produceres af en mikroorganisme af slægten

Kitasatosporia, og som har både antitumoraktivitet og anti- mikrobiel aktivitet, en fremgangsmåde til fremstilling af antibiotiket, en mikroorganisme til brug ved fremgangs-5 måden, samt anvendelse af antibiotiket til fremstilling af et lægemiddel med antitumoraktivitet og antimikrobiel aktivitet.

Forbindelser af anthracyclingruppen (f.eks.

Adriamycin og Acracinomycin) og mange andre nyttige forbindelser er blevet foreslået som antibiotika, der både har antitumoraktivitet og antimikrobiel aktivitet. Det er imidlertid nødvendigt at tilvejebringe betydelig flere nyttige forbindelser med det formål at kontrollere et bredt spektrum af cancerformer.

Flere forbindelser er blevet foreslået og er blevet kendte til opnåelse af dette formål. Substansen PR-1350 (clerocidin) har fysisk-kemiske egenskaber, der minder meget om egenskaberne af antibiotikum MF 720-N6 ifølge den 2Q foreliggende opfindelse (se f.eks. Tetrahedron Letters, bind 25, nr. 4, side 465-468, 1984). Denne substans PR--1350 tilhører en gruppe af oxiderede diterpener og betragtes som et kompleks, hvori en monomer indeholdende hydroxyaldehyd med formlen I og hemiacetal med formlen II 2g er i ligevægt med en dimer med formlen III som vist nedenfor: 1 35

O

2

DK 165449 B

OH 0H

?H o O_✓ • PP - ςα K\ CH0 V CBO ^ ' .^0

15 0(J OH

Q±r

Lo 'm> 20 -

Som ovenfor nævnt er der ifølge kendt teknik blevet tilvejebragt mange antibiotika af en ny gruppe, der både har antitumoraktivitet og antimikrobiel aktivitet. På grund af de mange cancertyper, der er kendt, vil behovet 25 for tilvejebringelse af nye antitumoraktive stoffer fortsætte i mange år fremover.

Det har nu vist sig, at det hidtil ukendte antibiotikum MF 730-N6 har stærke antitumoraktiviteter både in vitro og in vivo mod flere forskellige tumorceller hos 30 laboratoriedyr og bevirker en betydelig hæmning af væksten af grampositive og gramnegative bakterier.

Opfindelsen angår således antibiotikum MF 730-N6, som er ejendommeligt ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

35

DK 165449 B

3 O ...

Opfindelsen angår også anvendelsen af antibioti- ket MF 730-N6 til fremstilling af et lægemiddel med antitumoraktivitet og antimikrobiel aktivitet.

Fysiologiske egenskaber af antibiotikum MF 730-N6 5

Antibiotikum MF 730-N6 anses ligesom det kendte PR-1350 (clerocidin) at være et kompleks af tautomere isomere og vil derfor udvise forskellige fysisk-kemiske egenskaber afhængigt af målebetingelserne og fremgangsmåden til fremstilling af prøver. De fysisk-kemiske egenskaber af MF 730-N6, der er beskrevet nedenfor, er egenskaberne af et hvidt pulver, der er fremstillet ved fremgangsmåden beskrevet i eksempel 1 senere i den foreliggende beskrivelse.

(1) Smeltepunkt:

Antibiotikum MF 730-N6 udviser i almindelighed et smeltepunkt i området 115-119°C.

(2) Drejning:

Drejningsværdien målt umiddelbart efter fremstilling af en 0,46%'s chloroformopløsning af pulveret af MF

730-N6 er [a]^6= -28,5°.

20 D

(3) Opløselighed:

Det hvide pulver af antibiotikum MF 730-N6 er let opløseligt i methanol, ethanol, ethylacetat og benzen, men er i det væsentlige uopløseligt i vand eller n-hexan.

(4) Farvereaktioner: 25

Resultaterne af farvereaktioner med en fraktion indeholdende antibiotikum MF 730-N6 og fremkommet ved sili-cagel-chromatografi af en methanolisk opløsning af det hvide pulver fremstillet ved fremgangsmåden beskrevet i ^ eksempel 1 er følgende:

Triphenyl-tetrazolium-chlorid positiv

Anis-aldehyd-svovlsyre-reaktion positiv loddamp positiv

Fehling’s reagens positiv -c Sølvnitrat-ammoniak (Tollens1 reagens) positiv 8%'s phosphomolybdensyre-ethanol positiv

Dragendorff's reagensopløsning negativ

Ferrichlorid-reagensopløsning negativ.

DK 165449 B

4 0 (5) Infrarødt absorptionsspektrum:

Et hvidt pulver af antibiotikum MF 730-N6 fremstillet ved kaliumbromidtabletmetoden udviser karakteristiske maksimale absorptioner ved 3430, 2960, 1705 og 1635 cm”1.

5 (6) 1H-NMR-spektrum:

Et hvidt pulver af MF 730-N6 udviser umiddelbart efter opløsning i deutero-methanol karakteristiske absorptioner ved 1,35 (s), 1,50 - 1,80 (m), 1,75 (brs), 1,80--2,30 (m) , 2,70-2,85 (m) og 5,30-5,40 (m) udtrykt som <S-10 -værdier.

(7) Ultraviolet absorptionsspektrum:

Et hvidt pulver af MF 730-N6 udviser umiddelbart efter opløsning i et af de nedenfor anførte opløsnings- 1% middelsysterner følgende absorptionsmaksima og E^ cm"vær" 15 dier (i parentes): methanol: 203 (60), 280 (3) 0,1N såltsyre-methanol: 203 (58), 280 (3) 0,01N natriumhydroxid-methanol: 207 (124), 267 (48).

20 (8) Derivater af antibiotikum MF 730-N6 og deres fysisk--kemiske egenskaber.

Forsøg 1: Fremstilling af et Wittig-addukt.

Til en opløsning af 30 mg råprodukt af MF 730-N6 25 i 50 ml vandfrit benzen sættes 100 mg carbomethoxymethylen--triphenyl-phosphoran, og blandingen omrøres ved stuetemperatur i 18 timer. Reaktionsblandingen ledes gennem en søjle (15 x 240 mm) pakket med 30 g silicagel, og den ad-sorberede blanding elueres med en blanding af benzen og 30 ethylacetat i forholdet 10:1. De aktive fraktioner forenes og renses ved passage gennem en søjle (20 x 350 mm) pakket med "Sephadex LH-20" (100 ml) efterfulgt af eluering med en blanding af ethylacetat og methanol i forholdet 2:1. Ved disse procedurer fås 125 mg af en ligevægtblanding i 35 forholdet 3:1 af addukterne 1 og 2.

Rf-værdi: 0,44 (benzen/acetone i forholdet 1:1) 0,40 (benzen/ethylacetat i forholdet 3:1).

O

5

DK 165449 B

Addukt 1 (hovedprodukt): XH = NMR (CDC13) 6z 0,99 (3H, d, J = 7,0 Hz) 1,00 (3H, s) g 1,35 (3H, s) 1.47 (IH, dd, J = 10,5 Hz, 15,0 Hz) 1,50 ~ 1,75 (3H, m) 1,76 (4H, brs) 1,95~2,10 (2H, m) 1Q 2,25 (IH, brs) 2,64 (IH, dd, J = 2,0 Hz, 12,0 Hz) 2,85 (IH, d, J = 5,0 Hz) 3,17 (IH, d, J = 5,0 Hz) 3,66 (IH, d, J = 4,0 Hz) 15 3,79 (3H, s) 3,80 (3H, s) 4,20 (IH, brd, J = 13,0 Hz) 4,27 (IH, dd, J = 4,0 Hz, 14,0 Hz) 5,35 (IH, br) 20 6,18 (IH, s) 6,38 (IH, d, J = 16,2 Hz) 8.47 (IH, d, J = 16,2 Hz)

Addukt 2 (biprodukt): 0,84 (3H, s) 25 0,89 (3H, s) 1,26 (3H, d, J = 7,0 Hz) 1,46 (IH, dd, J = 9,5 Hz, 15,0 Hz) 1,50/^ 2,75 (4H, m) 1,81 (3H, brs) 30 1,95^2,10 (2H, m) 2,18 (IH, brs) 2,80 (IH, q, J = 7,0 Hz) 2,85 (IH, d, J = 5,0 Hz) 3,16 (IH, d, J = 5,0 Hz) 3,79 (3H, s) 35

DK 165449 B

6 o

Addukt 2 (biprodukt) (fortsat): 3,81 (3H, s) 3,85 (IH, d, J = 5,0 Hz).

4,03 (IH, brd, J = 9,5 Hz) 5 4,38 (IH, d, J = 5,0 Hz) 5,23 (IH, br) 6,12 (IH, s) 6,37 (IH, d, J = 16,2 Hz) 8,43 (IH, d, J = 6,2 Hz) 10 Forsøg 2: Fremstilling af p-brombenzoylformen.

10 mg af en blanding af addukterne 1 og 2 opløses i 1 ml vandfrit pyridin. Efter tilsætning af 20 mg p--brombenzoylchlorid omrøres blandingen ved stuetemperatur i 18 timer. Reaktionsblandingen koncentreres under vakuum, 15 og remanensen opløses i 30 ml ethylacetat. Opløsningen vaskes med mættede vandige opløsninger af natriumhydrogencar-bonat og natriumchlorid og tørres over vandfrit natriumsulfat. Opløsningsmidlet afdestilleres under vakuum. Remanensen renses ved passage gennem en søjle (15 x 105 mm) 20 pakket med 10 g silicagel efterfulgt af eluering med en blanding af benzen og ethylacetat i forholdet 20:1. Ved disse procedurer fås 8,2 mg af en p-brombenzoylform 3.

Rf = 0,34 (benzen-ethylacetat, 5:1) [a]30 - 66,5° (C 0,2 CHC13)

25 CH,0H

UV λ nm (6) ; 247 (27700) , 268 (17100)

IRaX

CHC1 IR 3 cm-1 2950, 1720, 1280, 1175 max , FD-MS (m/z); 660, 658 (M ) 30 HI-MS (m/z); 660, 1707 (C^H-^OgBr) 658, 1768 (C33H3909Br) H-NMR (CDC13) <£: 0,88 (3H, d, J = 7,0 Hz) 1,04 (3H, s) 35 1,39 (3H, s) 1,55 91H, dd, J = 10,0 Hz, 15,0 Hz) 1,66 (IH, d, J = 15,0 Hz)

O

7

DK 165449 B

1.6 (IH, br) 1,75 (IH, br) 1,74 (3H, br) .

2.07 (2H, br) 2.17 (IH, dq, J = 14,0 Hz, 7,0 Hz) 2,29 (IH, br) 2,84 (IH, d, J = 5,0 Hz) 3.18 (IH, d, J = 5,0 Hz) 2,91 (IH, dd, J = 1,5 Hz, 12,0 Hz) 1Q 3,75 (3H, s) 3,77 (3H, s) 4,42 (IH, brd, J = 10,0 Hz) 5,36 (IH, br) 5,81 (IH, d, J = 14,0 Hz) 6.18 (IH, s) 15 6,45 (IH, d, J = 16,5 Hz) 7,59 (2H, d, J = 8,5 Hz) 7,94 (2H, d, J = 8,5 Hz) 8,40 (IH, dd, J = 1,0 Hz, 16,5 Hz) 20 Antibiotikum MF 730-N6 ifølge den foreliggende op findelse minder meget om det kendte stof clerocidin (PR-1350), men det her omhandlede antibiotikum er en hidtil ukendt forbindelse, der klart adskiller sig fra clerocidin ved, at det har 4 methylgrupper og 2 hydroxylgrupper, medens 25 clerocidin har 3 methylgrupper og 1 hydroxylgruppe.

MF 730-N6 udviser overraskende en betydeligt forbedret antibakteriel virkning og antitumorvirkning i forhold til clerocidin.

30 Biologiske egenskaber af antibiotikum MF 73Q-N6.

(1) Antimikrobielt spektrum:

Tabel I viser de minimale koncentrationer af antibiotikum MF 730-N6, der er nødvendige for at inhibere væksten af forskellige bakterier på en almindelig naeringsagar-35 plade.

O

8

DK 165449 B

TABEL I

Mikroorganisme MIC (μς/ιηΐ) 5 Staphylococcus aureus 209P 6,25

Staphylococcos aureus Smith <0,05

Micrococcus albus FDA 16 0,39

Micrococcus lysodeikticus IFO 3333 0,39

Sarcina lutea PCI 1001 0,39 10 Bacillus anthracis 0,2

Bacillus subtilis NRRLB-558 0,1

Bacillus subtilis PCI 219 <0,05

Bacillus cereus ATCC 10702 0,1

Corynebacterium bovis 1810 <0,05 15 Escherichia coli NiHJ 25

Escherichia coli K-12 3,12

Escherichia coli ML 1629 6,25

Shigella dysenteriae JI 11910 <0,05

Shigella flexneri 46JS 11811 1,56 20 Shigella sonnei JS 11746 12,5

Salmonella typhi T-63 3,12

Salmonella enteritidis 1891 0,1

Proteus vulgaris 0X19 12,5

Proteus mirabilis IFMCM-9 12,5 25 Proteus rettgeri GN311 12,5

Proteus rettgeri GN466 6,25

Serratia marcescens 50

Pseudomonas aeruginosa A^ 25

Klebsiella pneumoniae PCI 602 0,39 30 Mycobacter 607 0,39

Xanthomonas citri 3,12

Xanthomonas oryzae 25 35

DK 165449 B

9 o (2) Antitumoraktivitet.

Tabel II viser de terapeutiske effekter af antibiotikum MF 730-N6 mod muse-leukæmi L1210 og muse-Ehrlich's ascites-cancer (EAC).

5

TABEL II

Procentisk levetidsforlængelse*

Dosis -

(pg/mus/dag) L-1210 EAC

1Q-- 125 161 77 62.5 161 188 31,25 170 >354 15.6 200 >369 15 7,8 160 215 * Procentisk levetidsforlængelse = overlevelsestid i dage for behandlede mus χ overlevelsestid i dage for ubehandlede mus 20

De behandlede mus modtager antibiotiket intraperi-tonealt i 10 på hinanden følgende dage umiddelbart efter 5 intraperitoneal indpodning af 1 x 10 L-1210-celler pr.

C

ml eller 2 x 10 EAC-celler pr. ml. Som det fremgår af 25 tabel II udviser antibiotikumet ifølge den foreliggende opfindelse væsentlige levetidsforlængende virkninger.

(3) Akut toksicitet.

Den akutte toksicitet af antibiotikum MF 720-N6 er LDgg « 100 mg/kg ved intraperitoneal indgivelse til mus.

30 Den forbedrede antibakterielle virkning og anti tumorvirkning af MF 730-N6 i forhold til clerocidin fremgår af den følgende sammenligning af virkningerne.

Antibakteriel aktivitet 35 Den minimale inhiberende koncentration (MIC) af forbindelserne mod væksten af forskellige mikroorganismer er vist i tabellen nedenfor. Den antibakterielle aktivitet 10

DK 165449 B

bestemmes ved agar-fortyndingsmetoden, idet der anvendes et medium (pH-værdi 7), som indeholder 3 g/1 Bacto-trypton (Difco Laboratories), 3 g/1 kødekstrakt, 1 g/1 gærekstrakt, 1 g/1 glucose og 16 g/1 agar.

5 MIC tøg/ml)

Mikroorganisme MF 730-N6 Clerocidin

Staphylococcus aureus ATCC 6538P 0,065 0,13 10 Enterococcus faecium ATCC 10541 0,13 0,26

Klebsiella pneumonniae ATCC 10031 0,016 0,065

Som det fremgår af resultaterne, udviser MF 730-N6 en overlegen antibakteriel aktivitet i sammenligning med 15 clerocidin.

Cytotoksisk aktivitet H-ras-transf icerede muse-BALB 3T3/H-ras-celler dyrkes i Dulbecco1 s modificerede Eagle’s medium indeholdende 10% 20 kalvefosterserum, 100 enh./ml penicillin og 100 /ig/ml streptomycin. Til bestemmelse af cytotoksisk aktivitet af forbindelserne forinkuberes BALB 3T3/H-ras-cellerne i en C02-in-kubator i 24 timer ved 37°C i 96-brønds plastplader og inkuberes derefter i medium med forskellige fortyndinger af 25 forbindelserne i 3 dage. Koncentrationerne af forbindelserne, som giver en 50%’s inhibering af cellevækst (IC5Q), bestemmes ved Gimsa-farvningsmetoden som beskrevet af Miabelli et al., J. Antibiotics 38» 758 (1985). Resultaterne er vist i tabellen nedenfor.

30 IC50 (jttg/ml)

Mikroorganisme MF 730-N6 Clerocidin BALB 3T3/H-ras 0,03 0,28 35 Som det fremgår af resultaterne, udviser MF 730-N6 en overlegen cytotoksisk aktivitet i sammenligning med clerocidin.

11

DK 165449B

Antibiotikum MF 730-N6, der er karakteriseret ovenfor, kan fordelagtigt fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er ejendommelig ved, at mikroorganismen Kitasa-tosporia setae MF 730-N6 (FERM BP-1045) dyrkes på et nærings-5 medium, og antibiotiket udvindes fra kulturen ved sædvanlige metoder med opløsningsmiddelekstraktion og/eller chromato-grafi.

Mikroorganismen ifølge opfindelsen er stammen Kita-satosporia setae MF 730-N6, som er en mikroorganisme af 10 slægten Actinomycetes og er isoleret fra en jordprøve taget nær Umawatashi-broen over Iwaigawa-floden, Nara, Japan og er deponeret hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, under FERM P-No.

8247 og senere er overført til deponering i overensstemmelse 15 med Budapest-traktaten og tildelt nummeret FERM BP-1045.

Mikroorganismen kan dyrkes med enhver næringskilde, som er almindeligt anvendt ved dyrkning af actinomyce-ter, såsom kulhydrater, nitrogenkilder, uorganiske salte og andre assimilerbare kilder. Anvendelige carbonkilder 20 omfatter kulhydrater, såsom glucose, glycerol, maltose, saccharose, melasse, dextrin og stivelse, og fedtstoffer og olier, såsom sojaolie og jordnøddeolie. Anvendelige nitrogenkilder omfatter pepton, kødekstrakt, bomuldsfrøpulver, sojabønnepulver, gærekstrakt, casein, majsstøbevæske, NZ-25 -amin, ammoniumsulfat, ammoniumnitrat og ammoniumchlorid. Anvendelige uorganiske salte omfatter dikaliumphosphat, natriumphosphat, natriumchlorid, calciumcarbonat, magnesiumsulfat og manganchlorid. Om fornødent kan der tilsættes spormetaller, såsom cobalt og jern. Der kan anvendes 30 enhver anden kendt næringskilde, som kan udnyttes af den MF 730-N6-producerende mikroorganisme til produktion af det ønskede antibiotikum.

Andelene af næringskilderne, der er illustreret ovenfor, er ikke begrænset til nogle bestemte værdier og 35 kan varieres indenfor et bredt område. De optimale næringskilder til vækst af den antibiotikum MF 730-N6-producerende mikroorganisme og andelene af de bestemte kilder kan let bestemmes af en fagmand på basis af simple forsøg i lille skala.

12

DK 165449B

O ...

Næringsmediet indeholdende de ovenfor anførte næ— ringskilder kan steriliseres før dyrkningen. Det er fordelagtigt, at pH-værdien af mediet indstilles i området 6-8, især 6,5-7,5, enten før eller efter sterilisering.

Dyrkningen af den antibiotikum MF 730-N6-pro-5 ducerende mikroorganisme på næringsmediet kan gennemføres ved enhver af de metoder, der er almindeligt anvendte til produktion af antibiotika ved hjælp af actinomyceter. Dyrkning under aerobe betingelser er i almindelighed fordelag-tig, og den kan ledsages af omrøring og/eller beluftning.

Der kan anvendes en stationær kultur, en rystekultur eller en submers kultur med beluftning og omrøring, og sub-mers dyrkning er egnet til masseproduktion af antibiotikum MF 730-N6.

Dyrkningstemperaturen er ikke begrænset til nogen bestemt værdi, så længe den er indenfor det område, som tillader væsentlig vækst af den antibiotikum MF 730-N6--producerende mikroorganisme, således at der sikres produktion af det tilsigtede antibiotikum. En særlig fore-trukken dyrkningstemperatur er i området 25-30°C.

Dyrkningen kan fortsættes, indtil der er sket en væsentlig akkumulering af det ønskede antibiotikum MF 730-N6. Dyrkningstiden vil variere med sammensætningen af mediet, dyrkningstemperaturen og omgivelsestemperaturen. Sædvanligvis 25 er en dyrkning i 12-24 timer tilstrækkelig til opnåelse af det ønskede antibiotikum.

Mængden af antibiotikum MF 730-N6, der er opsamlet i kulturen, kan bestemmes med pneumobacillus-stamme KP PCI 606 ved cylinder-plade-metoden, der er gængst an-30 vendt ved antibiotikum-bestemmelser.

Det således akkumulerede antibiotikum MF 730-N6 i kulturen kan udvindes i isoleret og ren form ved at underkaste kulturfiltratet eller den ovenstående væske enten opløsningsmiddelekstraktion (ved hjælp af et egnet 35 organisk opløsningsmiddel) eller chromatografi (ved adsorption eller ionbytning), der anvendes enkeltvis eller

O

13

DK 165449 B

i kombination. Filtratet eller den ovenstående væske fra kulturen, som er fri for celler, kan fås ved en kendt fra-skillelsesmetode, såsom filtrering eller centrifugering. Organiske opløsningsmidler, som kan anvendes ved ekstrak-5 tionsmetoden, omfatter chloroform, ethylacetat og ethvert andet opløsningsmiddel, som kan opløse antibiotikum MF 730--N6, og som i det væsentlige er uopløseligt i vand. Eksempler på den chromatografiske bærer, der har adsorptionsegenskaber eller ionbytningsegenskaber, omfatter aktivt kul, 10 silicagel, porøs polystyren-divinylbenzen-harpiks og mange andre ionbytterharpikser.

Ved anvendelse af de ovenfor beskrevne procedurer fås antibiotikum MF 730-N6, som har de allerede anførte karakteristika.

15 Opfindelsen illustreres ved de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Fremstilling af antibiotikum MF 730-N6.

Stammen Kitasatosporia setae MF 730-N6 (FERM BP-1045) 20 dyrkes på et agarmedium i skråkultur. Et flydende medium (500 ml, pH-værdi 7,2) indeholdende 1% glucose og 1% gærekstrakt hældes i to kolber i mængder på 110 ml og steriliseres på sædvanlig måde ved 120°C i 20 minutter. Hvert af de steriliserede medier podes med de dyrkede celler af 25 MF 730-N6 og underkastes rotationsrystekultur (180 o/m) ved 27°C i 48 timer til fremstilling af en podekulturop-løsning.

Podekulturopløsningen (110 ml) overføres til en 30 liters kar-fermenteringsbeholder indeholdende 15 liter 30 af et MF 730-N6-producerende medium (vedrørende dets sammensætning, se nedenfor) og underkastes dyrkning i 30 timer ved 27°C og 150 o/m, medens der tilføres luft med en hastighed på 15 liter/minut. Under dyrkningen tilføres der nogle få dråber af "Silicone KM-75" (antiskummiddel, 35 Shinetsu Chemical Industry Co., Ltd) til mediet.

O

14

DK 165449 B

En kulturopløsning fremstillet i to enheder af kar-fermenteringsbeholderen sugefiltreres ved anvendelse af et filtreringshjælpemiddel, hvorved der fås 24 liter af et kulturfiltrat (på de følgende sider er der anført 5 materialebalancer baseret på den antagelse, at 1 ml af filtratet har en antibakteriel aktivitet på 1 U mod Pneumobacillus-stamme KP PCI 606) .

Filtratet indstilles til en pH-værdi på 5,0 og ekstraheres to gange med 12 liter chloroform (total ak-10 tivitet af ekstrakten: 15.000 U/T).

Ekstrakten koncentreres til et volumen på 1 liter under vakuum. Koncentratet dehydreres med Glauber's salt og affarves efter filtrering med 0,5% aktivt kul. Efter frafiltrering af det aktive kul koncentreres filtratet 15 under vakuum. Koncentratet underkastes silicagel-chromato-grafi (3,5 x 11 cm) ved eluering med en blanding af chloroform og methanol i forholdet 100:3. De forenede aktive fraktioner koncentreres under vakuum, og koncentratet underkastes søjlechromatografi (3,5 x 11 cm) under anvendelse 20 af "Diaion HP-20" (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd) og elueres med en lineær densitetsgradient af 50% vandig methanol til 100% methanol. De aktive fraktioner forenes, befries for methanol under vakuum og frysetørres, hvorved der fås 108 mg af et bleggult pulver (6.500 U/T).

25 Dette pulver underkastes revers-fase-TLC, idet der elueres med en blanding af acetonitril og vand i forholdet 7:3. De forenede aktive fraktioner underkastes ekstraktion med ethanol, hvorved der fås 39 mg (840 U/T) af den rene form af antibiotikum MF 730-N6. Dette materi-30 ale er karakteriseret ved de allerede anførte fysisk-ke-miske egenskaber.

Sammensætning af MF 730-N6~producerende medium.

Glucose 0,08% galactose 0,16% 35 maltose 0,16% dextrin 0,32% 15

DK 165449B

o "Bactosoytone" 0,16% ammoniumsulfat 0,16% antiskummiddel 1 eller 2 dråber pH-værdi 7,2 (PR).

5 Mycoloqiske egenskaber;

Stammen MF 730-N6 (FERM 3P-1045>, der anvendes i eksempel 1, har følgende mycologiske egenskaber.

1. Morphologi

Stamme MF 730-N6 som observeret under et mikro-10 skop har relativt lange, lige (restifleksible) luft mycelier, der udstrækker sig fra forgrenede lufthyfer, men der observeres ikke skruelinieformede eller spiralformede svingtråde. Modne sporekæder har en påviselig kæde på ikke mindre end 10-20 sporer. Sporestørrelsen er i 15 området 0,4-0,6 x 0,8-1,4 μπι. Sporerne har en glat overflade, men SEM-observation viser tydelige rynker på sporeoverfladen.

2. Væksttilstand på medier.

I den følgende beskrivelse er farvestandarderne 20 anført i firkantet parentes, og de er i overensstemmelse med Color Harmony Manual fra Container Corporation of America.

(1) Saccharose-nitrat-agarmedium (inkuberet ved 27°C).

Vedhæftende lyst brungråt [3dc, Natural - 3fe,

Silver Gray] luftmycelium dannes på en farveløs vækst.

25 Der observeres intet opløseligt farvestof.

(2) Glucose-asparagin-agarmedium (27°C).

Vedhæftende lyst brungråt [3fe, Silver Gray] luftmycelium dannes på en blegt gulbrun [2ec, Oatmeal] vækst.

Der observeres ikke opløseligt farvestof.

30 (3) Glycerol-asparagin-agarmedium (ISO-medium 5, inkuberet ved 27°C).

Vedhæftende lyst brungråt [3dc, Natural] luftmycelium dannes på en farveløs vækst. Der observeres ikke opløseligt farvestof.

35 (4) Stivelse-uorganisk salt-agarmedium (ISP-medium 4, inkuberet ved 27°C).

O

16

DK 165449 B

Vedhæftende lyst brungråt [3fe, Silver Gray -5fe, Ashes] luftmycelium dannes på en blegt gulbrun [3gc, Bamboo] vækst. Der observeres ikke opløseligt farvestof.

(5) Tyrosin-agarmedium (ISP-medium 7, inkuberet ved 27°C).

5 Vedhæftende lyst brungråt [5fe, Ashes] luft mycelium dannes på en farveløs vækst. Der observeres ikke opløseligt farvestof.

(6) Næringsagarmedium (inkuberet ved 27°C).

Blegt gulbrun [2gc, Bamboo] vækst. Intet vedhæf-10 tende luftmycelium. Der observeres ikke opløseligt farvestof.

(7) Gær-malt-agarmedium (ISP-medium 2, inkuberet ved 27°C).

Vedhæftende lyst brungråt [3fe, Silver Gray] luftmycelium dannes på en blegt gulbrun [2ie, Lt Mustard Tan] 15 vækst. Der observeres ikke opløseligt farvestof.

(8) Havremel-agar-medium (ISP-medium 3, inkuberet ved 27°C) .

Vedhæftende lyst brungråt [5fe, Ashes] luftmycelium dannes på en farveløs vækst. Der observeres ikke opløseligt farvestof. ^ 20 (9) Glycerol-nitrat-agarmedium (inkuberet ved 27°C).

Vedhæftende lyst brungråt [3dc, Natural - 3fe,

Silver Gray] luftmycelium dannes på en farveløs vækst.

Der observeres ikke opløseligt farvestof.

(10) Stivelse-agarmedium (inkuberet ved 27°C).

25 Et tyndt lag af vedhæftende hvidt luftmycelium dannes på en bleggul [3ca, Shell] vækst. Der observeres ikke opløseligt farvestof.

(11) Calciummalat-agarmedium (inkuberet ved 27°C).

Et tyndt lag af vedhæftende hvidt luftmycelium 30 dannes på en farveløs til bleggul [2caf Lt Ivory] vækst.

Der observeres ikke opløseligt farvestof.

(12) Cellulose (inkuberet ved 27°C i en syntetisk opløsning indeholdende filtrerpapirstykker).

Farveløs vækst og lyst brungråt luftmycelium. Der 35 observeres ikke opløseligt farvestof.

O

17

DK 165449 B

(13) Gelatine-stikkultur.

Ved både inkubering på et simpelt gelatinemedium ved 20°C og inkubering på et glucose-pepton-gelatine--medium ved 27°C er væksten farveløs, og der dannes intet 5 vedhæftende luftmycelium. Der observeres ikke farvestof.

(14) Skummet komælk (inkuberet ved 37°C).

Farveløs vækst og intet vedhæftende luftmycelium.

Der observeres ikke opløseligt farvestof.

3. Fysiologiske egenskaber.

10 (1) Væksttemperaturområde.

Der gennemføres vækstprøver på glucose-asparagin--agarmedier ved forskellige temperaturer, nemlig 20, 24, 27, 30, 37 og 50°C. Bortset fra ved 50°C vokser mikroorganismen ved alle de undersøgte temperaturer, men en op-15 timal temperatur vil være i området 27-30°C.

(2) Forflydning af gelatine (på 15%'s simpelt gelatinemedium ved 20°C eller på glucose-pepton-gelatine-me-dium ved 27°C).

Med det simple gelatinemedium begynder forflydnin-20 gen efter ca. 5 dages inkubering, og graden af forflydning er moderat til stærk.

Med glucose-pepton-gelatine-mediet begynder forflydningen efter ca. 2 dages inkubering, og graden af forflydning er temmelig stærk.

25 (3) Hydrolyse af stivelse (inkuberet ved 27°C på både et stivelse-uorganisk salt-agarmedium og et stivelse--agarmedium).

Der observeres hydrolyse af stivelse på begge medier efter ca. 5 dages inkubering, og graden af hydrolyse 30 er moderat.

(4) Koagulering og peptonisering af skummet komælk (inkubering på skummet komælk ved 37°C).

Koagulering af skummet komælk starter efter ca.

2 dages inkubering og er hurtigt tilendebragt og efter-35 følges af peptonisering, der er fuldstændig på den femtende dag af inkuberingen. Graden af koagulering og peptonisering er temmelig stærk.

DK 165449B

la

O

(5) Dannelse af melaninlignende pigment (med trypton-gær--næringsvæske, ISP-medium 1; pepton-gær-jern-agar, ISP-medium 6; eller tyrosin-agar, ISP-medium 7, ved 27°C).

5 Der observeres ikke melaninlignende pigment i no gen af disse medier.

(6) Udnyttelse af carbonkilder (på Pridham-Gottlieb-agar-medium, ISP-medium 9, ved 27°C).

Mikroorganismen vokser under udnyttelse af D-glu-10 cose, D-xylose og L-arabinose, men udnytter ikke D-fruc-tosef saccharose, inositol, rhamnose eller D-mannitol. Mikroorganismen udnytter formentlig ikke raffinose.

(7) Opløsning af calciummalat (på calciummalat-agar ved 27°C).

15 Der observeres ikke opløsning af calciummalat.

(8) Reduktion af nitrat (i en vandig peptonopløsning indeholdende 0,1% kaliumnitrat, ISP-medium 8, ved 27°C).

Negativ.

4. Kemiske egenskaber.

20 (1) 2,6-Diaminopimelinsyre, DAP.

Meso-2,6-diaminopimelinsyre og en lille andel af LL-2,6-diaminopimelinsyre observeres i den hele celle.og i cellevæggen.

Luftmyceliumfraktioner fås ved metoden ifølge 25 Ohmura et al. (Journal of Antibiotics, 3Λ, 1633, 1981), og de indeholder en større andel af LL-2,6-diaminopimelinsyre og en mindre andel af meso-2,6-diaminopimelinsyre.

Lufthyfefraktioner fås også ved den samme metode, og de viser sig at indeholde en større mængde meso-2,6-diamino-30 pimelinsyre og en spormængde af LL-formen.

(2) Sukkerarter.

Mannose, galactose, glucose og ribose findes i den hele celle, medens mannose og galactose observeres i cellevæggen. Både de hele celler og cellevæggene giver en 35 lille mængde af uidentificerbare pletter ved en farvereaktionsprøve .

O

15

DK 165449 B

(3) Indhold af GC (guanin og cytosin) i DNA (deoxyribo-nucleinsyre).

Der bestemmes et GC-indhold på 70,8% ved UV-ab-sorptionsmetoden beskrevet af S. Ulitzur, Biochimica et 5 Biophysica Acta, 272, 1972.

(4) LCN-A (lipid karakteristisk for Nocardia - A) .

Der observeres ikke LCN-A ved analyse ved tyndt-lagschromatografimetoden beskrevet af H. Mordarska og M. Mordarski: Journal of General Microbiology, 71., 1972.

10 (5) Acyleringstype af aminosukkerarter i cellevæg.

Aminosukkerarterne i cellen viser sig at være af acetyltypen ved metoden ifølge Uchida et al. beskrevet i Kinya Uchida og Κδ Aida: Journal of General Applied Microbiology, 23_, 249 - 260, 1977.

15 (6) Glycin i cellevæg.

Der observeres glycin i cellevæggen.

De ovenfor anførte observationer kan sammenfattes som følger: morphologisk har luftmyceliet af stamme MF 730-N6 hverken dannelse af spiraler eller hvirvler. En 20 moden sporekæde har mindst 10-20 sporer. Organismen har sporer med glat overflade. Den vokser på forskellige medier, idet den i stor udstrækning giver lyst brungråt luftmycelium på farveløse til blegt gulbrune vækster. Der observeres ikke opløseligt farvestof. Der dannes ikke me-25 laninlignende pigment. Organismen har en stærk evne til at nedbryde protein. Graden af stivelseshydrolyse er moderat.

Meso- og LL-2,6-diaminopimelinsyre samt glycin og galactose observeres i cellevæggen af stamme MF 30 730-N6. Den overvejende del af 2,6-diaminopimelinsyren i luftmyceliet er LL-formen, medens 2,6-diaminopiraelin-syre i lufthyfefraktioner er meso-formen. Acyleringstypen af aminosukkerarterne i cellevæggen er af acetyltypen.

Der observeres ikke LCN-A. GC-indholdet af DNA er 70,8%.

35 På basis af disse observationer er det blevet be kræftet, at stamme MF 730-N6 ikke tilhører nogen af typer- 20

DK 165449 B

0 ne I til IX, der er foreslået af Lechevalier et al. (International Journal of Systematic Bacteriology, 20, 435, 1970) til klassificering af de overvejende komponenter af cellevægge.

5 Stamme MF 730-N6 udviser egenskaber, der ligger nær egenskaberne af mikroorganismer af slægten Kitasato-sporia, der er etableret af Ohmura et al. i 1982 (The Journal of Antibiotics, 3f>, 1013, 1982, fulgt op af Bulletin of Nippon Hosenkin Kenkyukai, nr. 45, december 1984).

10 Især har den kendsgerning, at denne stamme danner morpho-logisk særskilte submerse sporer i en væskekulturopløs-ning, været en stærk grund til at klassificere stammen som faldende inden for slægten Kitasatosporia. Blandt de fire kendte arter af Kitasatosporia udviser Kitasatosporia 15 setae egenskaber, som mest ligner egenskaberne af stamme MF 730-N6 [se Ohmura et al., ibid, og "Hosenkin no Dotei Jikkenho (Experimental Methods for Identification of Actinomycetes)", udg. af Nippon Hosenkin Kenkyukai, 1985, s. 246].

2o Stammen Kitasatosporia setaruba (i øjeblikket be tegnet setae) dyrkes til sammenligning med MF 730-N6. Resultaterne er anført i tabel III.

25 1 35 21

DK 165449 B

O

TABEL III

Kitasatosporia setaruba IMC-A-0122 (IFO 14126)_ g Data i _MF 730-K6__Forsøgsdata_litteraturen_

Sporeoverflade glat (med glat (med glat (med rynker) rynker) rynker

Form af luft- lige lige lige mycelium 10

Farve af luft- lyst hvidt til hvidt til mycelium brungråt brunlig lysegråt hvidt til lyst brungråt

Sporekæde >10-20 >10-20 >20 sporer sporer sporer 15

Farve af farveløs farveløs farveløs vækst til blegt til blegt til blegt gulbrun gulbrun gulbrun

Opløseligt intet til intet til intet til farvestof bleggult bleggult bleggult 20

Dannelse af melaninlig-nende pigment ISP-medium 1 - ISP-medium 6 - ISP-medium 7 - 25

Hydrolyse af stivelse + + +

Koagulering og peptonisering af komælk + stærk + stærk + 30

Forflydning af gelatine + stærk + stærk

Reduktion af nitrat - + 35 22

DK 165449 B

O

TABEL III (fortsat)

Kitasatosporia setaruba IMC-A-0122 (IFO 14126)_ 5 Data i _MF 730-N6__Forsøgsdata_litteraturen_

Udnyttelse af carbonkilder D-glucose + + + L-arabinose + + + 10 D-xylose + + + D-fructose -

Saccharose - L-rhamnose -

Haffinose + - - 15 D-mannitol - Væksttem-

peraturområde 20-37°C 20-37°C 22-37°C

Optimal temperatur 27-30°C 24-30°C

20 2.6- Tliamino- meso- og meso- og meso- og pimelinsyre/- LL-former, LL-former, LL-former, sukker i den overvejende overvejende galactose hele celle galactose, galactose, (xylose) mannose og mannose og ribose ribose 25 2.6- diamino- meso- og meso- og meso- og pimelinsyre/- LL-former, LL-former, LL-former, sukker i den galactose galactose galactose hele celle og mannose og mannose

Glycin + + +

Acyltype af aminosukker acetyltype acetyltype acetyltype 2.6- diamino- overvejende overvejende LL-form pimelinsyre/- LL-form LL-form sukker i luftmycelium 35 23

DK 165449 B

O

TABEL III (fortsat)

Kitasatosporia setaruba IMC-A-0122 (IFO 14126)_ g Data i _MF-730-N6__Forsøgsdata_litteraturen_ 2,6-diamino- overve j ende overvej ende pimelinsyre/- meso-form meso-form meso-forxn sukker i lufthyfer 10 GC-indhold af DNA 70,8% - 73,1%

LCN-A

Produceret anti- terpenticin setamycin biotikum 15__ + : mulig

Som det fremgår af tabellen ligner stamme MF 730--N6 Kitasatosporia setae meget, idet der kun foreligger 20 forskelle med hensyn til reduktion af nitrat, GC-indhold af DNA, sukkerkomponenter (rhamnose og ribose) af hele celler. Af disse fire forskelle betragtes forskellen vedrørende reduktion af nitrat ikke at være væsentlig på baggrund af data i litteraturen. Betydningen af forskellen 25 med hensyn til GC-indhold af DNA er vanskelig at vurdere, fordi den i stort omfang afhænger af målemetoden. Med hensyn til sukkerindholdet af den hele celle viser stamme MF 730-N6 sig at indeholde en lille mængde rhamnose, og Kitasatosporia setaruba indeholder en meget lille mængde 30 ribose. Stammen MF 730-N6 antages derfor at være en art, der er snævert homolog med Kitasatosporia setae (tidligere setaruba).

35

Claims (4)

1. Antibiotikum, betegnet MF 730-N6, kendetegnet ved, at det er et hvidt pulver med følgende egenska- 5 ber: A) smp. 115-119°C, b) drejningsevne målt umiddelbart efter fremstilling af en opløsning af antibiotikumet: [a]p6= -28,5° (c = 0,46, chloroform)

10 C) opløselighed: opløseligt i methanol, ethanol, ethylacetat og benzen, i det væsentlige uopløseligt i vand og n-hexan, D) farvereaktioner: triphenyl-tetrazoliumchlorid-reaktion positiv 15 anisaldehyd-svovlsyre-reaktion positiv ioddamp positiv Fehling's reagens positiv sølvnitrat-ammoniak (Toliens' reagens) positiv 8% phosphomolybdensyre-ethanol . positiv

20 Dragendorff's reagensopløsning negativ ferrichlorid-reagensopløsning negativ E) ultraviolet absorptionsspektrum: 25 λ££0Η <Ei%c»> - 203 “ <60>' 280 ™ <3> Xmax*1 HC1 1 ^308 ^cm1 = 203 nm <58>' 280 <3> λ0,0!Η NaOH i CH3OH (E fcm, . 20? „ (124); 30 267 nm (48) F) infrarødt absorptionsspektrum: tydelige karakteristiske absorptionsmaksima ved bølgetallene 3430, 2960, 1705 og 1635 cm”1 ved kalium-bromidtabletmetoden, og 35 G) -^H-NMR-spektrum (CH30D) : 6=1,35 (s), 1,50-1,80 (m), 1,75 (brs), 1,80-2,30 (m), 2,70-2,85 (m) og 5,30-5,40 (m) .

2. Fremgangsmåde til fremstilling af antibiotikumet MF DK 165449 B 73O-N6 ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mikroorganismen Kitasatosporia setae MF 730-N6 (FERM BP-1045), dyrkes på et næringsmedium, og antibiotikumet udvindes fra kulturen ved sædvanlige metoder med opløsningsmiddelekstrak-5 tion og/eller chromatografi.

3. Anvendelse af antibiotikumet MF 730-N6 ifølge krav 1 til fremstilling af et lægemiddel med antitumoraktivitet og antimikrobiel aktivitet. 10

4. Mikroorganisme til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den er stammen Kitasatosporia setae MF 730-N6 (FERM BP-1045).