DK162390B

DK162390B - Makrocycliske forbindelser, fermenteringsfremgangsmaade til fremstilling heraf, mikroorganisme til brug ved fremgangsmaaden, farmaceutiske praeparater indeholdende forbindelserne, samt anvendelse af forbindelserne til fremstilling af farmaceutiske praeparater og plantebeskyttelsesmidler

Info

Publication number: DK162390B
Application number: DK437886A
Authority: DK
Inventors: Hans Reichenbach; Gerhard Hoefle; Hermann Augustiniak; Norbert Bedorf; Klaus Gerth; Herbert Irschik; Rolf Jansen; Brigitte Kunze; Dietmar Schomburg; Heinrich Steinmetz; Wolfram Trowitzsch-Kienast; Victor Wray
Original assignee: Biotechnolog Forschung Gmbh
Priority date: 1985-09-13
Filing date: 1986-09-12
Publication date: 1991-10-21
Also published as: EP0216731B1; JPS62181281A; EP0216731A1; US4987072A; DK437886D0; DK162390C; ES2001783A6; PT83356A; DE3669515D1; PT83356B; GR862324B; US5096922A; DK437886A; ATE51003T1

Description

i i

DK 162390 B

Opfindelsen angår hidtil ukendte makrocycliske forbin- delser, især sorangicin A, en fermenteringsfremgangsmåde j til fremstilling af disse forbindelser under anvendelse af 5 en ny mikroorganisme af arten Sorangium cellulosum, selve den nye mikroorganisme til brug ved fremgangsmåden, farmaceutiske præparater, som indeholder de hidtil ukendte forbindelser, og anvendelse af forbindelserne til fremstilling af farmaceutiske præparater og plantebeskyttel-10 sesmidler.

De makrocycliske forbindelser ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de har formlen

33 f//R ^»R

yyV

/31\ 4 0 ·=· ·=· JO

47* 3 y S 37 S ΐ 43

;·' /yA

\ Ri” “-O-N A‘A /\vcooh ϊ 0 t ;fe · 25] & ] 2 3 R, A% * * / \ γ \ /Λΐ 4 5 44

HCT S · i 22 I

/V1 i ** *\ A / 17 Γ · 18 hvor RI er hydrogen eller hydroxy, og R2 er hydroxy eller 15 beta-glucopyranosyloxy, og hvor C-22-atomet har S-konfigu-ration, når er hydroxy, samt solvater og salte af disse forbindelser.

j

Konfigurationen af substituenterne ved de chirale carbon-atomer er undersøgt ved hjælp af røntgenstrukturanalyse af | 20 den krystallinske forbindelse med formlen I sorangicin A (Ri = OH, R2 = OH), og fastlagt ifølge sekvensreglerne for R,S-nomenklaturen af Cahn, Ingold og Prelog.

2

DK 162390 B

Opfindelsen angår fortrinsvis hovedkomponenten med formlen I, der kan fremstilles fermentativt, med betegnelsen sorangicin A (R^ = OH, R2 = OH, C-22:S), samt bikompo-5 nenterne sorangicin B (R^ = H, R2 = OH), sorangiosid A (R^ = OH, R2 = beta-glucopyranosyloxy, C-22:S), og sorangiosid B (Ri = H, R2 = beta-glucopyranosyloxy).

Et yderligere foretrukkent aspekt af opfindelsen er den deponerede og i det følgende beskrevne mikroorganisme af 10 arten Sorangium cellulosum, som anvendes ved den fermentative fremstilling af hovedkomponenten sorangicin A samt de nævnte bikomponenter.

Forbindelserne med formlen I kan foreligge som solvater.

F.eks. kan sorangicin A isoleres som krystallinsk ethyl-15 acetatsolvat.

Salte er fortrinsvis farmaceutisk anvendelige eller ikke-toksiske salte af forbindelser med formlen I. Sådanne salte er fortrinsvis egnede alkalimetalsalte, såsom natrium- eller kaliumsalte, eller jordalkalimetalsalte, 20 f.eks. magnesium- eller calciumsalte, samt zinksalte eller ammoniumsalte, herunder sådanne salte, der dannes med organiske aminer, som eventuelt med hydroxy substituerede mono-, di- eller trialkylaminer, f.eks. diethylamin, di(2-hydroxyethyl)amin, triethylamin, N,N-dimethyl-N-(2-25 hydroxyethyl)amin, tri(2-hydroxyethyl)amin eller N-methyl-D-glucamin. Salte, som ikke er farmaceutisk anvendelige, f.eks. tungtopløselige og/eller godt krystalliserende salte, kan anvendes til isolering og rensning.

Forbindelserne med formlen I, især hovedkomponenten 30 sorangicin A, som kan fremstilles fermentativt, samt farmaceutisk anvendelige salte deraf, er aktive anti-biobika, der er terapeutisk anvendelige i human- og veterinærmedicin. Virkningen er rettet mod kokker, bakterier og vira. De vira, der kan bekæmpes, er især

DK 162390 B

3 | sådanne, som til formering kræver revers transkriptase (retrovira).

Eksempelvis findes in vitro ved agar-fortyndingstesten 5 (H.M. Ericsson og S.C. Sherris, Acta Path. Microb. Scand.

Section B, Suppl. No. 217, 1-90, 1971) MIC-værdier (Minimum Inhibitory Concentration), som for aerobe, grampositive og gramnegative kokker, f.eks. Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis og 10 Streptococcus spp., er 0,01 til 2 /*g/ml, og for

Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, entero-bakterier, f.eks. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,

Proteus spp., Enterobacter cloacae, Serratia marcescens eller anaerobier, f.eks. Bacteroides fragilis eller 15 Clostridium perfringens, ligger i området fra ca. 0,01 til 16 /-tg/ml. For mycobakterier, f.eks. M. tuberculosis og atypiske mycobakterier bestemmes en MIC-værdi mellem 0,5 og 8 μg/ml, I in vitro test med polymorfkernede humane leukocyter og 20 Staphylococcus aureus stamme Wood 46 er sorangicin A aktiv over for bakterier, der forekommer intracellulært, f.eks. staphylokokker. Forbindelsen udviser en bakteriedræbende effekt i leukocyternes indre.

Den mod retrovira rettede antivirale virkning af forbin-25 delserne med formlen I påvises ved in vitro og in vivo tests, især dog ved et in vitro testsystem, i hvilket hæmningen af enzymet revers transkriptase ved hjælp af de nævnte forbindelser bestemmes kvantitativt.

Poly-A-oligo (dT) hybridiseres med TTP, som er radio-30 aktivt mærket med den reverse transkriptase. Den bundne radioaktivitet måles og er et udtryk for aktiviteten af revers transkriptase. Til bestemmelse af ID50 af forbindelser med formlen I sættes disse i forskellige koncentrationer til testsystemet.

4

DK 162390 B

Sorangicin A har virkning mod revers transkriptase fra Moloney Murine Leucemia Virus. IDgg-Værdien [den dosis, der hæmmer RT-aktiviteten til 50%, jævnfør Wu et al., 5 Proc. Natl. Acad. Sci, 69, 3820 (1972) ] for RT MLV ligger ved 7 /ig/ml.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man dyrker stammen So ce 12 (NCIB 12134) af arten Sorangium cellulosum eller en af denne stamme afledet 10 mutant, der har væsentlig samme egenskaber i en kultur, der indeholder C- og N-kilder og essentielle uorganiske salte, ved ca. 20 til ca. 40eC og en pH-værdi på ca. 4,0 til ca. 8,0 under aerobe betingelser, og isolerer de fremstillede forbindelser med formlen I eventuelt som 15 solvater, og om ønsket omdanner en fremstillet forbindelse til et salt og/eller om nødvendigt omdanner et fremstillet salt til den frie forbindelse eller om ønsket til et andet salt.

Mikroorganismen So ce 12 af arten Sorangium cellulosum er 20 isoleret fra en jordprøve fra området omkring Xcaret, halvøen Yucatan, Mexico, og den kan klassificeres som stamme af myxobakterien Sorangium cellulosum.

Stammen So ce 12 er 1. august 1985 deponeret hos The National Collections of Industrial and Marine Bacteria 25 Ltd. i Aberdeen, Skotland, Storbritannien, under nummeret NCIB 12134 i henhold til forskrifterne i Budapest-traktaten vedrørende den internationale anerkendelse af deponering af mikroorganismer til patentmæssige formål. En levedygtighedsattest er udfærdiget af dette deponerings-30 institut den 12. august 1985.

Isolering og beskrivelse af So ce 12

Jordprøven anbringes på filtrerpapir over Stan 21-agar (0,1% K2HP04, 0,1% KN03, 0,1% MgSo4 · 7 H20, 0,01% MnS04 5

DK 162390 B

| • 7 H2O, 0,1% CaCl2 · 2 H2O, 0,02% FeCl3, standardspor-elementopløsning (bestående f.eks. af Na2Mo04 · 2 H2O, j

Na2B407 *10 H2O, MnS04 · H2O og CUSO4 · H2O, alle 1 en 5 mængde på 20 mg/1, 0,002% gærekstrakt (Difco), 1% agar, 25 mg/1 cycloheximid (Actidion), og der inkuberes i 3 uger ved 30°C.

Tilstedeværende sværmekolonier med frugtlegemer overpodes på ny på filtrerpapir over Stan 21-agar. Tilstedeværende 10 amøber fjernes ved desinfektion med en 5%’s vandig ammoniakopløsning. Derefter opbevares frugtlegemerne ved 4°C i EBS-opløsning (0,5% pepton fra casein, tryptisk fordøjet,

Merck Darmstadt DE, 0,5% proteosepepton, Difco, 0,1% pepton fra kødekstrakt, Merck, 0,1% gærekstrakt, Difco, 15 steriliseret i autoklave) natten over ved 4°C med antibiotikaopløsning AB-1 (20 mg chloramphenicol, 30 mg streptomycinsulfat, 25 mg tetracyclinhydrochlorid og 20 mg cephalotin opløst i 50 ml vand og sterilfiltreret), og derpå udstryges på vy/2-agar (0,5% bagegær beregnet på 20 friskvægt, 0,1% CaCl2 · 2 H2O, 1,5% agar, pH 7,2).

Fremvoksende, rene sværmekolonier kultiveres videre på det samme medium samt på filtrerpapir over Stan 21-agar med henblik på kontrol af identitet med udgangsisolatet.

De vegetative celler er cylindriske, små stave med runde 25 ender, i reglen ca. 1 /an brede og 3-6 μτα lange. I fasekon-trastmikroskop er de mørke. De har en glidende bevægemåde.

På mange næringssubstrater danner organismen talrige frugtlegemer, således f.eks. på filtrerpapir over mineralsaltagar (Stan 21-agar). Frugtlegemerne ligner 30 rustfarvede puder og består af et større eller mindre antal sporangioler, som er kugleformede eller har polyedrisk form med modstående flade sider, med en fast væg med en diameter på 20 til 30 π/ι. I sporangiolerne findes myxosporerne, som er stavformede hvileceller med 35 lignende opbygning og størrelse som de vegetative celler, men svagt lysbrydende.

! ! 6

DK 162390 B

Stammen So ce 12 kan spontant danne mutanter (naturlige mutanter), eller der kan fremstilles kunstige mutanter, der ligesom den naturlige stamme producerer antibiotisk 5 virksomme forbindelser med formlen 1.

Sådanne mutanter kan man frembringe kemisk, f.eks. ved behandling med visse guanidinderivater, f.eks. N-methyl-N*-nitrosoguanidin, eller med alkalimetalnitrit, f.eks. natriumnitrit, eller fysisk, f.eks. ved energirig strå-10 ling, f.eks. ultraviolet stråling, røntgenstråling eller radioaktiv stråling.

Kulturen, der skal anvendes til dyrkningen, skal indeholde en carbon- og nitrogenkilde samt essentielle uorganiske salte. Som carbonkilde kan eksempelvis anvendes 15 assimilerbare kulhydrater, f.eks. D-glucose, D-xylose, L-arabinose, D-fructose, maltose, maltotriose og stivelse.

Som nitrogenkilder kan anvendes aminosyrer, peptider og proteiner samt deres opbygningsprodukter, såsom pepton eller trypton, samt kødekstrakter, kornmel, f.eks. fra 20 majs eller hvede, bønner, især sojabønner, frø, eksempelvis fra bomuldsplanten, destillationsremanenser fra alkoholfremstilling, gærekstrakter, mv., men også ammoniumsalte og nitrater. Som essentielle uorganiske salte kan næringsopløsningen eksempelvis indeholde 25 chlorider, carbonater, sulfater, phosphater af alkalieller jordalkalimetaller, f.eks. natrium, kalium, magnesium, calcium, jern, zink, mangan, molybdæn og kobber. Dyrkningen udføres fortrinsvis i flydende kulturer, især vandige kulturer.

30 Som flydende kulturmedium egner sig især mediet MD1 (pepton fra casein, tryptisk fordøjet, Merck, 0,3%, CaCl2 • 2 H2O, 0,05%, MgS04 · 7 H2O, 0,2%), som er tilsat en kulhydratkilde, f.eks. glucose, maltose, maltotriose, stivelse eller cellulose i en mængde på 0,1%.

7

DK 162390 B

Et andet anvendeligt flydende kulturmedium indeholder pepton fra casein, 0,1%, CaCl2 · 2 H2O, 0,05%, MgS04 • 7 H2O, 0,2%, majsstøbepulver eller majsklister 0,4%.

5 Stammen kan også dyrkes i et defineret medium, som består af MgS04 · 7 H20 0,15%, FeCl3 · 6 H20 8 mg/1, KNO3 0,2%, Κ2ΗΡ04 0,025%, glucose · H20 0,5%, CaCl2 · 2 H2O 0,15%. Tilsætning af 0,01-0,05% pepton fører til homogen vækst, et bedre celleudbytte og større antibiotikadannelse.

10 Dyrkningen kan udføres portionsvis, f.eks. ved en eller flere tilsætninger af næringsopløsning, eller kontinuerligt gennem vedvarende tilsætning af næringsopløsning.

Hensigtsmæssigt dyrker man i flere trin, idet man fremstiller en forkultur (Inoculum), f.eks. i et af de oven-15 for nævnte kulturmedier, som man derefter efter ca. en til to dages fermentering overpoder i den egentlige hovedkultur, fortrinsvis i et fortyndingsforhold på 1:10.

Denne forkultur fremstiller man eksempelvis af en række af forkulturer. Den første kultur i denne række opnår man ved 20 14 dages vækst af den pågældende stamme på fast eller flydende næringssubstrat, f.eks. agar + MD1 + 0,1% stivelse. Bakteriemassen overpodes derpå i en næringsopløsning og inkuberes flere dage, f.eks. 4-5 dage. Såfremt det ønskes, kan denne næringsopløsning overpodes i en anden 25 næringsopløsning, f.eks. MDl + 0,1% stivelse, eller med en forskydelse på ca. 4-5 dage overpodes i flere næringsopløsninger, f.eks. i et fortyndingsforhold på ca. 3% (r/r), og inkuberes under de ovenfor nævnte betingelser.

Fermenteringsforløbet kan følges analytisk ved udtagning 30 af prøver under fermenteringen, f.eks. ved måling af pH-værdien i kulturen, som under fermenteringen falder fra ca. 7,2 til ca. 6,0-6,5 og derefter stiger til ca.

7,5-8,0, eller af den optiske tæthed, som er et mål for væksten af den respektive stamme, samt gravimetrisk på 8

DK 162390 B

basis af tørvægten af den dannede cellemasse, ved tyndt-lagskromatografi eller ved bestemmelse af den antibiotiske aktivitet af de i kulturfiltratet værende kompo-5 nenter.

Isoleringen af forbindelserne med formlen I, især af hovedkomponenten sorangicin A, fra kulturblandingen foretages på kendt måde under hensyntagen til de kemiske, fysiske og biologiske egenskaber hos stofferne. Til 10 bestemmelse af antibiotikakoncentrationen i de enkelte isoleringstrin - tillige også i kulturmediet - kan tyndtlagskromatografi anvendes, f.eks. på silicagel (f.eks. med methylenchlorid/methanol), og/eller aktiviteten overfor forskellige mikroorganismer, f.eks.

15 Staphylococcus aureus, og/eller hæmningen af revers transkriptase.

Til isolering af forbindelser med formlen I fra den rå fermentationsblanding egner sig to metoder: a) Flere timers omrøring af fermentationsblandingen med 20 makroporøse, ikke-ioniske adsorberharpikser, f.eks. syntetiske harpikser med aromatisk grundstruktur, eksempelvis harpikser på polystyrenbasis, f.eks. styren-di-vinylbenzen-copolymerer. Sådanne harpikser kan karakteriseres ved forskellige almindelige statistiske data, 25 f.eks., porevolumen, specifik overflade, gennemsnitlige porediameter, hyppigste porediameter, porestørrelsesfordeling, kornstørrelsesfordeling og lignende.

Egnede adsorberharpikser har et porevolumen på ca. 0,5 til ca. 4,5 ml/g, en specifik overflade på ca. 100-1000 m^/g 30 og en gennemsnitlig porediameter på ca. 4 til ca. 130 nm og kan eksempelvis fås under handelsnavnene "AMBERLITE"® XAD-1, XAD-2, XAD-4, XAD-1180 og ER-180 fra Rohm & Haas, "DIAION"® HP-10, HP-20, HP-21, HP-30, EP-40, HP-50 fra

Mitsubishi, "DUOLITE"® S-861, S-862, S-863 og ES 866 fra 9

DK 162390 B

Dia-Prosim, "IMAC"® Syn 46 og Syn 72 fra Akzo Chemie, "KASTEL" S-lll, S-112, S-114 fra Montedison, "LEWATIT"® OC. 1031 fra Bayer og "RELITE"® ADS fra Resindion.

5 Efter adskillelse af fermentationsblandingen fra absorberharpiksen, f.eks. ved sining, vaskes denne med vand og derefter elueres med en blanding af vand med en stigende andel af et organisk opløsningsmiddel, som er indifferent over for den anvendte adsorberharpiks, f.eks. en vand-10 methanolblanding, hvorved hovedmængden af forbindelserne med formlen I elueres med 80-100%'s methanol. Eluaterne inddampes i vakuum og separeres ved hjælp af HPLC, som beskrevet nedenfor under fremgangsmåden b).

b) Kulturvæsken separeres fra cellemassen på sædvanlig 15 måde, f.eks. ved filtrering eller centrifugering, og kulturfiltratet ekstraheres med et organisk opløsningsmiddel, der kun er lidt eller slet ikke blandbart med vand, f.eks. methylenchlorid, chloroform eller fortrinsvis eddikesyreethylester. Efter inddampning af den organiske 20 fase i vakuum opnår man en råekstrakt. Ved fordeling af råekstrakten i et tofasesystem bestående af to ikke blandbare organiske opløsningsmidler, f.eks. methanol-heptan, går fermentationsprodukterne, især antibiotika med formlen I', over i den polære fase. Efter afdampning af 25 det polære opløsningsmiddel opløses remanensen i fortyndet vandig ammoniakopløsning og vaskes med et organisk opløsningsmiddel, der ikke er blandbart med vand, f.eks. diethylether. I vakuum fjernes den flygtige ammoniak, og den vandige fase ekstraheres efter syrning med en orga- 30 nisk syre, f.eks. myresyre eller eddikesyre, med et af de ovenfor nævnte opløsningsmidler, der ikke eller kun i ringe grad er blandbart med vand, f.eks. methylenchlorid. Derefter renses de fremstillede antibiotika ved hjælp af omvendt fasekromatografi. Man opnår flere fraktioner, som 35 kan indeholde sorangiosid A og B i blanding eller i ren form og sorangicin A og B i blanding eller i ren form.

DK 162390 B

10

Enkeltkomponenterne sorangiosid A og sorangiosid B samt sorangicin B opnår man ved adskillelse af de respektive fraktioner ved hjælp af HPLC, medens hovedkomponenten 5 sorangicin A kan opnås af den pågældende fraktion på krystallinsk form.

Hovedkomponenten sorangicin A kan også opnås ved hjælp af andre varianter af disse kendte separationsmetoder, f.eks. ved anvendelse af andre opløsningsmidler eller opløsnings-10 middelblandinger eller anvendelse af andre kromatografiske metoder.

Salte af forbindelser med formlen I kan fremstilles på en i sig selv kendt måde. Således kan man fremstille salte af forbindelser med formlen I f.eks. ved behandling med 15 metalforbindelser, såsom alkalimetalsalte af egnede organiske carboxylsyrer, f.eks. natriumsaltet af æ-ethyl-capronsyre, eller med et uorganisk alkalimetal- eller jordalkalimetalsalt, f.eks. natriumhydrogencarbonat, eller med ammoniak eller en egnet organisk amin, idet man for-20 trinsvis anvender støkiometriske mængder eller kun et lille overskud af det saltdannende middel.

Salte kan på sædvanlig måde omdannes til de frie forbindelser. Metal- og ammoniumsalte f.eks. ved behandling med egnede syrer.

25 Stereoisomerblandinger, især diastereomerblandinger, kan på kendt måde, f.eks. ved fraktioneret krystallisation og kromatografi, adskilles i de enkelte isomerer.

Racemater kan adskilles på i sig selv kendt måde, f.eks. efter omdannelse af de optiske antipoder til de diaste-30 reomerer, eksempelvis ved omsætning med optisk aktive syrer eller baser, eller med specifikke mikroorganismer.

11

DK 162390 B

De farmakologisk anvendelige forbindelser ifølge opfindelsen kan f.eks. anvendes til fremstilling af farmaceutiske ! præparater, som indeholder en virksom mængde aktivt stof 5 fortrinsvis i en blanding med en signifikant mængde af uorganiske eller organiske, faste eller flydende, farmaceutisk anvendelige bærestoffer. Farmaceutiske præparater er ligeledes omfattet af opfindelsen.

De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen kan anven-10 des til parenteral, f.eks. i.v., i.m., eventuelt også oral eller topisk administration.

Eksempelvis anvendes de aktive stoffer med formlen I ifølge opfindelsen i form af injicerbare, f.eks. intravenøst, administrerbare præparater eller infusionsopløs-15 ninger. Sådanne opløsninger er fortrinsvis steriliserede isotoniske vandige opløsninger eller suspensioner, sådanne, f.eks. af lyofiliserede præparater, som indeholder det aktive stof, salte til regulering af det osmotiske tryk, resorptionsforstærker og/eller puffer. De 20 foreliggende farmaceutiske præparater, der, såfremt det ønskes, kan indeholde yderligere farmakologisk betydningsfulde stoffer, f.eks. andre aktive stoffer, indeholder ca.

0,1% til 100%, især ca. 1% til og med 100%, af det aktive stof.

25 De farmaceutiske præparater fremstilles på i sig selv kendt måde, f.eks. ved hjælp af konventionelle opløsningseller lyofiliseringsfremgangsmåder beskrevet i farmakopeer .

Anvendelse 30 Forbindelser med formlen I, deres solvater eller farmaceutisk anvendelige salte, kan anvendes som antibiotika i form af farmaceutiske præparater til terapeutisk behand- i ling af menneskers eller dyrs krop, f.eks. som antibak- j 12

DK 162390 B

terielle antibiotika til behandling af infektioner, som er forårsaget af grampositive eller gramnegative bakterier, såsom Neisseria gonorrhoeae eller meningitidis, Staphylo-5 coccus aureus eller epidermidis, streptokokker, inkl.

enterokokker, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, eller anaerobe sygdomsfremkaldere, som f.eks. Bacteroides fragilis eller Clostridia spp., infektioner, som er forårsaget af bakterier, som overlever i cellerne, 10 f.eks. leukocyterne, som f.eks. stafylokokker eller listerier, tuberkulose eller infektioner, der er forårsaget af atypiske mycobakterier, som f.eks. Mycobacterium intracellulare avium.

Forbindelserne ifølge opfindelsen kan også anvendes som 15 antivirale antibiotika, især til behandling af infektioner, som forårsages af vira med revers transkriptase-aktivitet, som f.eks. retrovira (bl.a. AIDS-fremkaldende HTLV III), eller Hepatitis vira. Ud over infektioner med HTLV III (også betegnet LAV I eller HIV) kan der endvidere 20 være tale om HTLV I, HTLV II og HILV IV (også betegnet LAV

II).

Afhængigt af typen, sværhedsgraden og varigheden af infektionen, patientens tilstand og administrationsmåden anvendes daglige doser på ca. 0,3 g til ca. 10,0 g s.c., 25 i.m., i.v., p.o. eller pr. inhalation til behandling af mennesker eller varmblodede dyr med en legemsvægt på ca.

70 kg.

Andre anvendelsesmuligheder er inden for plantebeskyttelse, f.eks. til bekæmpelse af bakteriesygdomme hos 30 væksthuskulturer, til behandling af inficerede træer, mv.

Til denne anvendelse egner sig f.eks. aerosoler.

De efterfølgende eksempler illustrerer opfindelsens eksperimentelle udførelse og generelle gennemførlighed.

13

DK 162390 B

Eksempel 1 a) Fremstilling af forkulturens Inoculum

Fra en ca. 14 dage gammel agarplade indeholdende mediet 5 MD1 (0,3% pepton fra casein, tryptisk fordøjet, Merck DE, 0,05% CaCl2 · 7 H20, 0,2% MgSC>4 · 7 H20) og 0,1% stivelse overpodes bakterier af stammen So ce 12 i 100 ml flydende MDl-medium med 0,1% stivelse, og blandingen inkuberes på et rystebord ved 30°C og 160 o/m (omdrejninger pr. minut).

10 Efter 5 dages inkubationstid overpodes den fremvoksede kultur i et fortynding s for hold på 3% (r/r) i et nyt næringsmedium MD1. Efter 4 dages inkubationstid kan der så ofte det er nødvendigt i et fortyndingsforhold på 3% (r/r) overpodes i et nyt næringsmedium MDl.

15 Den sidste forkultur i denne række anvendes i et fortyndingsforhold på 10% (r/r) som inoculum til 4 l af en anden forkultur med MDl-næringsopløsning. Denne forkultur inkuberes ved 30°C, omrøres og beluftes ved svag lufttilførsel. Efter 2 dages inkubationstid overføres dette 20 inoculum til en 70 1 fermenter til fremstilling af den egentlige forkultur.

b) Fremstilling af forkultur 70 1 fermenter, fabrikat Giovanola, Monthey VS, Schweiz, bladomrøringssystem, medium MDl (1,0 M) med 0,1% stivelse, 25 t = 30°C. Omrøringshastighed 320 o/m. Lufttilførsel 0,3 Nm^/t. Det procentuelle oxygenpartialtryk falder i løbet af fermenteringen og når efter 2 dage en værdi på 10-20%. 0Dg23: ca. 2. En 700 1 fermenter tilføres denne forkultur under sterile betingelser.

14

DK 162390 B

c) Hovedkultur 700 1 fermenter med bladomrøringssystem fra det under b) nævnte firma. Medium: 0,15% magnesiumsulfatheptahydrat, 5 8 mg/1 jern(III)-chloridhexahydrat, 0,05% pepton, 0,2% KNO3, 0,025% K2HPO4, 0,5% glucose, 0,15% calciumchlorid-dihydrat, pH 7,3. Omrøringshastighed ved begyndelse: 150 o/m. Omrøringshastighed efter 23 timer: 100 o/m.

Procentvise oxygenpartialtryk ved slutningen af fermen-10 teringen: 10%. Fermenteringen er slut efter 40 timer. Ved slutningen af fermenteringen udviser supernatanten en hæmningszonediameter over for Staphylococcus aureus på ca.

14-15 mm. Cellemassen separeres fra kulturblandingen ved centrifugering. De antibiotisk aktive komponenter findes i 15 kulturfiltratet. Samtlige trin i fremgangsmåden gennemføres under sterile betingelser.

d) Oparbejdning af kulturfiltratet

Kulturfiltratet ekstraheres med eddikesyreethylester.

Efter afdampning af det organiske opløsningsmiddel opnår 20 man en råekstrakt. Ved fordeling i tofasesystemet heptan-methanol går forbindelser med formlen I over i methanol-fasen. Efter inddampning opløses remanensen i 12%Vs vandig ammoniakopløsning, opløsningen vaskes flere gange med ethér og befries i vakuum fra ammoniak. Efter syrning af 25 den vandige fase med myresyre ekstraheres med methylen-chlorid. Efter inddampning af ekstrakten separeres ved hjælp af omvendt fasekromatografi. Søjle: "Labochrom"® PGC-søjle 647 x 37 mm (Labomatic), pakket med "LiChroprep"® RP-18 (25-40 μ) (Merck), elueringsmiddel = 30 methanol/puffer 68:32, puffer = 0,5% myresyre i vand indstillet med triethylamin på pH 7, strømningshastighed: 30 ml/min, detektion: UV-absorption ved 313 nm. Man opnår følgende fraktioner: i i 15

DK 162390 B

Fraktion 1: Maksimalværdi ved tR = 31 min: sorangiosid A +

B

Fraktion 2: Maksimalværdi ved tR = 40 min: sorangiosid B

5 Fraktion 3: Maksimalværdi ved tR = 50 min: sorangicin A

Fraktion 4: Maksimalværdi ved tR = 69 min: sorangicin B

Efter fjernelse af det organiske opløsningsmiddel ekstra-heres komponenterne, der findes i de enkelte fraktioner, af den vandige, pufrede fase med dichlormethan eller 10 ethylacetat.

Fraktion 1:

Blandingen af sorangiocid A og B separeres ved HPLC: søjle 250 x 16 mm (Knauer), pakket med "LiChrosorb"® Si 100 (10 μ) (Merck), detektion ved hjælp af UV-absorption ved 313 15 nm, elueringsmiddel = dichlormethan/heptan/i-propanol/ kone. puffer 52:4:7:1, kone. puffer af methanol/myresyre 1:2 neutraliseret med triethylamin, strømningshastighed = 18 ml/min. Der opnås sorangiosid B med en retentionstid tR = 9,4 min og sorangiosid A med en retentionstid tR = 20 13,8 min.

Sorangiosid A: HPLC: Søjle 250 x 16 mm (Knauer), pakket med "Nucleosil"® 7 CgHg (Machery-Nagel), elueringsmiddel = methanol/vand 65/35 + 0,5% myresyre, strømningshastighed = 10 ml/min, 25 detektion: UV-absorption ved 313 nm: tR = 26,4 min.

Tyndtlagskromatografi (kiselgel Si 60 F 254 (Merck), elueringsmiddel methylenchlorid/methanol 8:2): Rf = 0,44 -, 90 16

DK 162390 B

[a]D = +42,0 (c = 0,9 i methanol) UV (methanol): Xmax (lge) = 301 (4,34) -13c-NMR se tabel - 5 Fraktion 2:

Den sorangiosid B-holdige fraktion renses ved HPLC: søjle 250 x 16 mm (Knauer), pakket med "Nucleosil"® 7 CgHs (Macherey-Nagel), detektion: UV-absorption ved 313 nm: elueringsmiddel = methanol/vand 70 : 30 + 0,5% myresyre, 10 strømningshastighed = 14 ml/min: tj* = 10,2 min.

Sorangiosid B:

Tyndtlagskromatografi (kiselgel 60 F 254 (Merck), elueringsmiddel methylenchlorid/methanol 8:2): Rf = 0,62 -22 [<x]D = +5,1 (c = 1,8 i methanol) - 15 UV (methanol): Xmax (lge) = 301 (4,41) 13qnmr se tabel

Fraktion 3: udkrystalliseret af ethylacetat:

Sorangicin A:

Smp.: 105-107°C - 20 [«]ρ2 = +60'9 (c = °'7 1 methanol) - UV (MeOH): Xmax(lge) = 301 (4,33) -ISp-NMR se tabel - FAB-MS [neg. ioner, xenon ved 9 keV (Iontect), acceleration 8 kV, efteracceleration 11 kV]: m/e = 805 (M-H)-25 897 (M-H+glycerol)“ - EI-MS (70 eV, 245°): m/e % = 806 (M+, 0,3), 789 (0,6), 788 (1,5), 770 (0,8), 373 (2), 303 (2,5), 301 (3,5), 249 (44), 231 (5), 197 (15), 149 (20), 135 (21), 133 (22), 121 (35), 109 (40), 107 (43), 105 (100) - 17

DK 162390 B

Forbindelsen foreligger som ethylacetatsolvat. Den kan også omkrystalliseres af acetone.

Analyse: 5 C47HggOn x C4HgO beregnet C 68,43 H 8,33 O 23,23 fundet C 68,11 H 8,35 O 23,61

Fraktion 4:

Efterrensning ved HPLC: søjle 250 x 16 mm (Knauer), pakket med "Nucleosil"® 7 CgHg (Macherey-Nagel), detektion: UV-10 absorption ved 313 mn. Elueringsmiddel =methanol/vand 75:25 + 0,5% myresyre, strømningshastighed = 14 ml/min, retentionstid: t^ = 11,7 min -

Sorangicin B: [atø = +49,1 (c = 1,6 i methanol) - 15 UV (methanol): \may (lge) = 301 (4,41) -13-C-NMR se tabel - FAB-MS [neg. ioner, xenon ved 9 keV (Iontect), acceleration -8 kV, efteracceleration 11 kV]: m/z = 789 (M-H)~, 881 (M-H+glycerol)” - 20 Ei-MS (70 eV, 270°): m/z (% = 790 (M+,1), 773 (3), 772 (5), 755 (2), 754 (3), 643 (1), 250 (20), 249 (100), 197 (22), 191 (11), 181 (12), 169 (10), 163 (11), 161 (11), 159 (11), 149 (22), 133 (22), 123 (23), 121 (29), 107 (31), 105 (61) - 25 Højopløsning: C47H66O10 beregnet 790,4656 fundet 790,4618.

18

DK 162390 B

Tabel

l^c-NMR data for sorangicin og soranciosid i CD3OD

nr. Sorangiosid^ Sorangicin C-Atom A_B_ A_B_ 1 178.01s 177.69s 177.85s 177.72s 2 35.38t 35.14t 35.28t 35.20t 3 26.27t 26.27t 26.29t 26.54t 4 28.20t 28.18t 28.20t 28.21t 5 38.52t 38.34t 38.51t 38.24t 6 32.90d 32.98d 32.96d 33.02d 7 3 SI Ql St 8 131.26s 131.68s 131.24s 131.48s 9 74.44d 74.72d 74.42d 74.45d 10 66.95d 67.03d 66.90d 66.91d 11 123.91d 123.70d 123.79d 123.68d 12 136.94d 136.89d 136.85d 136.86d 13 75.37d 74.72d 75.33d 75.07d 14 b b b b 15 a a a a 16 a a a a 17 b b b b 18 b b b b 19 136.41d 134.42d 134.36d 137.37d 20 127.23d 132.41d 130.16d 132.88d 21 83.21d 80.45d 74.36d c 22 7 6.04d 43.05t 77.77d 45.08t 23 74.05d 71.10d 74.87d c 24 31.40t 35.4lt 30.86t 35.40t 25 70.98d 70.82d 71.07d 71.lid 26 38.03d 37.81d 38.51d 38.42d 27 74.44d 74.18d 75.05d 74.71d 28 b b b b 29 a a a a 30 a a a a 31 81.15d 81.06d 81.17d 81.09d 32 42.lid 42.02d 42.15d 42.10d 33 81.06d 80.94d 81.03d 80.95d 34 39.80t 39.93t 39.85t 39.92t 35 77.53d 77.12d 77.59d 77.35d 36 82.03d 81.77d 82.26d 82.13d 37 134.91d 134.77d 134.88d 134.66d 38 127.76d 127.22d 127.84d 127.55d 39 137.57d 137.70d 137.57d 137.72d 40 127.OOd 126.82d 126.98d 126.89d 41 139.14d 139.39d 139.05d 139.21d 42 119.72d 119.44d 119.69d 119.49d 43 167.67s 167.33s 167.68s 167.51s 44 21«73q 21.54q 21.67q 21.54q 45 14.30q I4.24q 14.30q 14.23q 46 10.62q 10.62q 10.89q 10.82q 47 15.36q 15.32q 15.36q 15.33q 19

DK 162390 B

Fortsættelse tabel 2 Fodnoter: a) sorangiosid A: 134.28d, 133.77d, 133.06d, 132.41d, 5 128.31d, sorangiosid B: 135.06d, 133.76d, 133.Ild, 132.41d, 128.40d, sorangicin A: 134.15d, 133.61d, 133.OOd, 132.78d, 128.34d, 10 sorangicin B: 134.27d, 133.53d, 133.03d, 132.70d, 128.40d, b) sorangiosid A: 37.06t, 35.38t, 34.37t, 33.61t, sorangiosid B: 37.01t, 35.41t, 33.85t, 33.64t, sorangicin A: 37.12t, 35.45t, 33.97t, 33.35t, 15 sorangicin B: 37.13t, 35.40t, 33.49t, 33.49t, c) 72.13d, 71.72d, d) glucosyl-signal: C-l' 02' 03' 04? 05* C-6' sorangiosid A: 102.81d, 75.19d, 78.13d, 71.64d, 77.83d, 62.80t 20 sorangiosid B: 102.62d, 75.27d, 78.21d, 71.6ld, 77.73d, 62.83t

Eksempel 2 Tørstofampuller eller hætteglas indeholdende 0,5 g sorangicin A som aktivt stof kan fremstilles på følgende 25 måde:

Sammensætning: (pr. 1 ampul eller hætteglas)

Aktivt stof 0,5 g Mannitol 0,05 g

En steril vandig opløsning bestående af aktivt stof og 30 mannitol fyldes under aseptiske betingelser i 5 ml ampuller eller 5 ml hætteglas, hvorpå disse lukkes og afprøves.

Claims

1. Makrocycliske forbindelser, kendetegnet ved, at de har formlen ,/<X i /\J \ i(7 /!V!’/^X/'n-/COOH i* ? ,1 il

25. R·23 J-l *5 t*· m/ V jS Aa/" 18 hvor Ri er hydrogen eller hydroxy, og R2 er hydroxy eller j8-glucopyranosyloxy, og hvor C-22-atomet har S-konfigura-tionen, når Ri er hydroxy, samt solvater og salte af disse forbindelser.

2. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Ri er hydroxy, og R2 er hydroxy (sorangicin A), og C-22-atomet har S-konfigurationen.

3. Forbindelse ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den foreligger i form af ethylacetatsolvatet.

4. Forbindelser ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Ri er hydrogen, R2 er hydroxy (sorangicin B), Ri er hydroxy og R2 er β-glucopyranosyloxy (sorangiosid A C-22:S), eller Ri er hydrogen og R2 er β-glucopyranosyloxy (sorangiosid B).

5. Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelser med formlen I, solvater eller salte deraf ifølge krav 1, DK 162390B f kendetegnet ved, at man dyrker stammen So ce 12 (NCIB 12134) af arten Sorangium cellulosum eller en af denne stamme afledet mutant, der har væsentlig samme egenskaber 5 i en kultur, der indeholder C- og N-kilder og essentielle uorganiske salte, ved ca. 20 til ca. 40PC og en pH-værdi på ca. 4,0 til ca. 8,0 under aerobe betingelser, og isolerer de fremstillede forbindelser med formlen I eventuelt som solvater, og om ønsket omdanner en frem-10 stillet forbindelse til et salt og/eller om nødvendigt omdanner et fremstillet salt til den frie forbindelse eller om ønsket til et andet salt.

6. Mikroorganisme til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 5, kendetegnet ved at det er stammen So ce 12 (NCIB 15 12134) af arten Sorangium cellulosum, som producerer en forbindelse med formlen I.

7. Farmaceutiske præparater, kendetegnet ved, at de indeholder en forbindelse med formlen I, et solvat eller -et farmaceutisk anvendeligt salt deraf ifølge krav 1.

8. Forbindelser med formlen I, solvater eller farma ceutisk anvendelige salte deraf ifølge krav 1 til anvendelse ved plantebeskyttelse.

9. Anvendelse af en forbindelse med formlen I, et solvat eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf ifølge 25 krav 1 til fremstilling af et farmaceutisk præparat.

10. Anvendelse af en forbindelse med formlen I, et solvat eller et farmaceutisk anvendeligt salt deraf ifølge krav 1 til fremstilling af et antibakterielt præparat ifølge krav 7.

11. Anvendelse af en forbindelse med formlen I, et solvat eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf ifølge DK 162390 B krav 1 til fremstilling af et antiviralt præparat ifølge krav 7.

12. Anvendelse af en forbindelse med formlen I, et 5 solvat eller et salt deraf ifølge krav 1 til fremstilling af et plantebeskyttelsesmiddel.