DK161859B - Fremgangsmaade til stabilisering af erythrocytter ved analyse af blodgas og haemoglobin, erythrocytter fremstillet ved fremgangsmaaden, et blodgas-haemoglobinanalysekontrolprodukt indeholdende de ved fremgangsmaaden stabiliserede erythrocytter, samt et analysesaet indeholdende produktet i en ampul - Google Patents

Description

i

DK 16 185 9 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til stabilisering af erythrocytter fra pattedyr til anvendelse i en b1odgas-hæmog1obinana1ysekontro 1, erythrocytter fremstillet ved fremgangsmåden, et blodgas-hæmoglobinanalysekontrolpro-5 dukt, samt et analysesæt der omfatter mindst én ampul, der indeholder blodgas-hæmoglobinanalysekontrolproduktet.

Blodgasanalyser udføres på de fleste hospitalslaboratorier med det formål at di agnostisere og behandle anormal iteter i lunge-10 funktion og syre/baseba1ance. De tre parametre, som måles, er blod-pH, det partielle C02~tryk (Pcq2) °9 det partielle oxygentryk (Po2)‘ Desuden kan hæmoglobinanalyser også udføres. Disse analyser omfatter bestemmelse af total deoxyhæmog1obin, oxyhæmog1obin, carboxyhæmog1obin og methæmog1obin.

15

Under udførelsen af pH-, Pq2" og Pc02_ana^yserne udtages en blodprøve fra patienten og indføres i specialiseret udstyr, som indeholder elektroder, som er specifikke for de parametre, som måles. Fordi blod forringes hurtigt, og opløste gasser er 20 tilbøjelige til at forsvinde ud af opløsningen, må det analyseres hurtigt eller inden for få timer, hvis blodet er nedkølet på is.

Det er selvfølgeligt indlysende, at analyseresultaterne ikke 25 kan blive bedre end den anvendte instrumentation. Det er derfor nødvendigt at overvåge udstyret for korrekt kalibrering og funktion. Hvor en fremmed gaskilde kan anvendes til at standardisere bl odgaskontrol udstyr, er elektroderne, som anvendes i analyserne sensitive over for analysemediet. Når f.eks. oxy-30 gen i luftform anvendes som standard, opnås der en instrumentaflæsning, som er forskellig fra den, der opnås, når standarden er en væske, der indeholder opløst oxygen. Denne væske-luft-forskel er et resultat af forskelle i diffusionshastigheder for oxygen igennem det gasformige eller flydende medium, 35 hvori det findes.

For at lette behovet for matematiske korrektioner for at kompensere for denne væske-gas-forskel er det erkendt, at en væ- DK 161859 B' 2 skekontrol er at foretrække frem for en gaskontrol. Den foretrukne væske ville selvfølgelig være blod, fordi det omfatter alle de bestanddele, som analyseinstrumentet udsættes for. Blodet forringes imidlertid hurtigt og mister opløste gasser.

5 Desuden øges som følge af cellulær metabolisme PCO2' roens P02 °9 pH falder. Da der ikke er nogen kendt fremgangsmåde til at forhindre disse forandringer i at indtræde i lagret komplet blod, er det blevet afvist som en kontrol.

10 De første flydende blodgaskontroller var på pufrede, vandige opløsninger indeholdende opløste gasser. Imens man med disse opløsninger undgik væske-gas-forskelsproblemet, manglede de andre blodkompon-enter, som påvirker de fø-Vsomme eTektrodekom-ponenter i analyseudstyret.

15

Som et første trin til løsning af dette problem blev der fremstillet kontroller, som indeholdt opløseligt hæmoglobin. Disse kontroller manglede imidlertid enzymet methæmoglobinreduktase, som i blodcellen reducerer jern til Fe++-ti 1 standsformen. Som 20 følge heraf er jernet i hæmoglobin altid i et Fe+ + + -ti1 standsformen, dvs. hæmoglobin er methæmoglobin. Derfor kan disse kontroller kun anvendes til total hæmoglobinanalyse. På et senere tidspunkt er der udviklet kontroller, som i højere grad til nærmer sig rigtigt blod.

25 US-patentskrift nr. 3.859.049 angiver en fremgangsmåde til at stabilisere komplet blod og komplette blodkomponenter under anvendelse af fluorider, citrater, f1uoreddikesyre og jodeddikesyre. Sædvanligvis tilsættes natriumfluorid, natriumcitrat 30 og fluoreddikesyre eller jodeddikesyre til det komplette blod. Blandingen køles og henstår i en periode, som er tilstrækkelig til at stabilisere Pco2-' Po2- °9 pH-η iveaueren. Uheldigvis har produktet en kort 1 agerholdbarhed på omkring en måned. Et produkt med en længere 1 agerholdbarhed er fremstillet ved be-35 handling af blodkomponenterne med et aldehyd.

US-patentskri ft nr. 3.973.913 angiver en fremgangsmåde til at stabilisere røde blodlegemer ved at separere dem fra komplet

DK 161859 B

3 blod og stabilisere dem ved behandling med et aldehyd, f.eks. formaldehyd eller giutaraldehyd. Disse stabiliserede blodlegemer tilsættes til en pufret opløsning, der indeholder glucose, neomycin og chloramphenicol som bakteri c i der og salt til 5 at udgøre en isotonisk opløsning, som har en osmolalitet svarende til blod. Dette produkt har imidlertid kun en lager!eve-tid på 2 måneder, og cellerne mister hurtigt hæmoglobin, som oxideres til methæmoglobin.

10 Det der er behov for, er en forbedret stabiliseringsteknik, som vil resultere i mere stabile blodgas- og hæmoglobinanaly-sekontroller, som simulerer komplet blod.

Dette opnås ved hjælp af en fremgangsmåde til stabilisering af 15 erythrocytter fra pattedyr til anvendelse i en blodgas-hæmo- g1obinana1ysekontrol, som er ejendommelig ved, at den omfatter : (a) suspension af disse erythrocytter i et pufret fikser ings-20 medium bestående af en vandig opløsning af en pufferkomponent, hvilket medium har en pH på omkring 7,3 til omkring 11,3, (b) at bringe erythrocytterne i kontakt med en gas, hvilken gas er oxygen' eller carbonmonoxid, i tilstedeværelse af et 25 proteintværbindende middel i form af en imidoester ved en temperatur på omkring 20 ° C til omkring 30°C i en reaktionstid på omkring 15 minutter til omkring 60 minutter, og (c) genindvinding af de stabiliserede erythrocytter.

30

Med betegnelsen "hæmoglobinanalyse" menes i forbindelse med patentbeskrivelsen og kravene de hæmoglobinanalyser, som måler totalhæmoglobin, procent oxyhæmog1obin, procent carboxyhæmo-globin og procent methæmog1 obin. Andre parametre, såsom volu-35 men% O2 og CO2, kan udregnes fra de observerede værdier.

Dimethy1 ad i pimi dat er angivet som et tværbindende middel for erythrocytmembraner, se Niehaus, W.G, et al. "Cross-Linking of

DK 161859 B

4

Erythrocyte Membranes With Dimethyl Adipi mi date", Biochem. Biophys. Acta 196: 170-175 (1970).

I andre studier er dimethyladipimidat (DMA) angivet som et 5 middel, der forhindrer dannelse af seglform hos røde blodlegemer: se "Dimethyl Ad ipimi date:- A New- Antisickling Agent:-,

Lubin, B.H., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72 (1): 43-46 (1975) og "Antisickling Nature of Dimethyl Adipimidate", Waterman, M.R. et al. Biochem. Biophys. Res. Comm., 63 (3): 580-10 587 (1975).

For nylig har DMS’s tværbindende effekt vist sig at hæmme enzymaktivitet; se "The Effect of Crosslinking Reagents on Red-Cell Shape", Mentzer, W.C. og Lubin, B.H., Seminars in Hemato-15 logy 16: 115-127 (1979). Desuden er det bevist, at DMA påvirker iontilbageholdelsen i erythrocytter. Krinsky, N.I., et al. "Retention of K+ Gradients in Imidoester Crosslinked Erythrocyte Membranes", Arch. Biochem. Biophys., 160: 350-352 (1974).

20 Der er ikke hidtil angivet nogen anvendelse af DMA til tværbinding af ery thracy tmembran-er til- b 1 odgasko-ntro 1 ler .

Det har overraskende vist sig, at et blodgas-hæmoglobinanaly-sekontrolprodukt kan fremstilles ved at stabilisere røde blod-25 legemer' med di met hyl ad'fp i mi dat (DMA) og suspendere de stabiliserede blodlegemer i et pufret medium, som kan indeholde et protein til at simulere effekten af plasmaprotein til blodgas-målinger. Den foretrukne plasmaprotein er bovinserumalbumin.

30 Ved adskilt at behandle røde blodlegemer med oxygen eller car-bonmonoxid i den DMA-tværbindende fase kan kontrol produkter fremstilles til anvendelse ved hæmoglobinbestemmelser. Den pufrede røde blodlegemesuspension pakkes i ampuller og lagres nedkølet. Den foretrukne puffer er N-(tris-hydroxymethyl)me-35 thylr2amino-ethansu1 fonsyre (TES) eller N-2-hydroxymethy1pipe- razin-N-2-ethanosulfonsyre (HEPES).

DK 161859B

5

Den foreliggende opfindelse angår et kontro1 produkt, som kan anvendes til både blodgas og hæmoglobinbestemmelser, hvilket produkt er ejendommeligt ved det i krav 6's kendtegnende del anførte. Opfindelsen angår således et kontrolprodukt, som om-5 fatter stabiliserede erythrocytter suspenderet i et pufret medium. Under udførelsen af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan erythrocytter fra ethvert pattedyr anven des. Imidlertid er de foretrukne erythrocytter humane erythro-cytter.

10

Kontrollen eller kontrol produktet ifølge opfindelsen kan fremstilles med adskilte niveauer af hver af de eksperimentelt bestemte parametre, dvs. pH, Pc>2' PCO2' hæmoglobinkoncen tration (THb), procent oxyhæmoglobin (02Hb), procent carboxy-16 hæmoglobin (COHb) og procent methæmoglobin (MetHb). Enhver af disse parametre kan således udvælges til at simulere klinisk acidosis, normal tilstand og alkalosis på enten en metabolisk eller en respiratorisk basis. De parameterområder, til hvilke der kan fremstilles en kontrol, er: 20 25 30 35

DK 161859 B

6

Foretrukket Mest foretrukket Parameter Område område område_ pH 6,6 til 8,0 6,8 til 7,8 7,0 til 7,7

Pn mmHg 20 til 200 30-180 40-150 5 U2

Pco mmHg 10 til 150 15-75 15-65 THb, g/dl 3 til 150 5-21 9-17 %02Hb,% 0 til 100 50-100 60-98 % COHb,% 0 til 100 0-50 0-35 10 %MetHb,% 0 til 30 0-10 <3

Typiske parameterkoncentrationsområder er pH, omkring 6,8 til omkring 8,0; total hæmoglobin, omkring 3 til omkring 24 g/dl; oxyhæmoglobin, omkring 6 0-100%;. carboxyhæmoglobin, omkring 15 0-35% og methæmoglobin, mindre end 3%. Disse områder er valgt, fordi de er tilnærmet de områder, hvori disse parametre optræder fysiologisk.

Erythrocyter fra friskt udtaget blod såvel som erythrocyter 20 fra ældet blod, dvs. blod, som er op til 11 uger gammelt, kan anvendes. En større stabilitet kan opnås ved anvendelse af ældede blodlegemer. Fortrinsvis ældes blodlegemerne mindst 6 uger; og mest foretrukket mindst 10 uger.

25 Ved fremstilling af kontrollen ifølge den foreliggende opfindelse stabiliseres- erythrocyter ved reaktion med DMA, og de suspenderes i et pufret medium. Fire kriterier afgør valget af pufferen, som er egnet til anvendelse ved udøvelsen af opfindelsen: 30 1. Den må have tilstrækkelig pufferkapacitet i pH-området af interesse.

2. Den må være karakteriseret ved en pH/temperatur-koeffi-3 5 cient, som i tilstrækkelig høj grad svarer til den i friskt, komplet blod.

DK 161859 B

7 3. Den må være anvendelig i en koncentration, som er tilstrækkelig til at sikre pH-stabilitet og samtidig muliggør tilstrækkelig følsomhed ved påvisning af fejlkilder i pH-må-lingssystemerne.

5 4. Den må ikke påvirke erythrocyterne på uhensigtsmæssig måde.

Ved betegnelsen "pufferforbindelse" forstås i forbindelse med patentbeskrivelsen og kravene en forbindelse, som opfylder de angivne kriterier.

10

Illustrative eksempler på puffere anvendelige ^ for anvendelse under udøvelsen af den foreliggende opfindelse er N-(tris-hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsyre (TES) og N-2-hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsyre (HEPES). Pufferen anvendes i koncentrationer på omkring 0,01 til omkring 0,10 M; fortrinsvis omkring 0,025 til omkring 0,09 M; mere foretrukket omkring 0,035 til omkring 0,08 M; mest foretrukket omkring 0,05 til omkring 0,07 M.

Den korrekte anvendelse af et pH-meter og blodgasudstyr kræver god kontrol med temperaturen, ved hvilken målingerne foretages.

Med henblik på at simulere udførelsen heraf med komplet blod 25 i det termostaterede system er det ønskeligt at have en kontrol, som har en pH/temperatur-koefficient, som svarer til den i komplet blod (-0,015 pH enheder/°C). Derfor er pH/temperatur-koefficienten i referencekontrollen ifølge den foreliggende 30 opfindelse fortrinsvis mindst -0,015 pH-enheder/°C.

En kontrol, som anvender HEPES som puffer i en koncentration på omkring 0,05 til omkring 0,07 M, har en pH/temperatur-ko-efficient på -0,015 pH/°C.

35

DK 161859 B

8

Under fremstillingen af kontrollen ifølge den foreliggende opfindelse suspenderes de stabiliserede erythrocyter i et flydende pufret medium, som kan være en pufferopløsning i deioniseret vand. Imidlertid kan målingerne i blodgasbestemmel- ser påvirkes af plasmaproteiner som følge af belægning på 5 elektroderne. Denne effekt kan simuleres ved i det flydende pufrede suspensionsmedium at inkorporere et protein, som ikke (1) danner bundfald, (2) forårsager fibrinklumper eller (.3) forårsager agglutination af erythrocyterne. Endvidere må proteinet ikke være forurenet med rester af enzymer, som kunne 10 påvirke stabiliteten af kontrollen.

Proteinkoncentrationen i human plasma er omkring 4,0-6,0% vægt/volumen. En egnet standard kan fremstilles ved anvendelse af en proteinkoncentration på omkring 0,4 til 8,0% vægt/volumen. Under 0,4% ses der ikke nogen betydende belægningseffekt, hvorimod der over 8,0% vægt/volumen er en belægningseffekt, som er større end den, der normalt forekommer ved en human blodprøve. Den proteinkoncentration, som anvendes ved frem-stillingen af kontrollerne ifølge den foreliggende opfindelse, er fortrinsvis omkring 2% til omkring 7% vægt/volumen; mere foretrukket omkring 3% til omkring 6,5% vægt/volumen; mest foretrukket 4,0-6,0% vægt/volumen. Ethvert inert vandopløseligt protein kan anvendes som proteinkilde til kontrollerne ifølge.

2g opfindelsen. Med betegnelsen "inert" menes, når den anvendes om sådanne proteiner, at proteinerne ikke vil nedbryde erythrocyter eller på anden måde forårsage en forringelse heraf.

Enzymer er således generelt ikke en egnet kilde for sådanne proteiner.

30

Mens serumalbuminer fra pattedyr generelt er egnede kilder for protein til kontrollerne ifølge opfindelsen, er det foretrukne serumalbumin humanserumalbumin og bovinserumalbumin. Bovinserumalbumin er mest foretrukket, fordi det er let til-2g gængeligt i en oprenset form til en rimelig pris. Alternativt kan gelatine anvendes som protein.

DK 161859 B

9

Det vil fremgå for fagfolk, at enhver af de tidligere kendte blodgaskontroller kan forbedres og gøres mere tilsvarende komplet blod ved at gøre brug af det begreb at inkorporere albumin fra pattedyr i disse flydende kontroller i overensstemmelse med, hvad her er angivet.

5

Blodgaskontrollen må indeholde passende koncentrationer af C>2 og CC>2 for at standardisere analyseudstyret med hensyn til disse gasser. De ønskede P0 - og PCQ -niveauer opnås ved 2Q at lægge en gasblanding over det pufrede flydende medium.

Gassen lægge fortrinsvis over den flydende kontrol ifølge den foreliggende opfindelse umiddelbart før forseglingen af den flydende suspension i ampuller eller andre egnede beholdere.

15 Afhængig af pH og temperaturen i opløsningen kan carbondioxiden findes i form af enten en opløst gas eller hydreret, f.eks. som kulsyre sammen med bicarbonat- og carbonatanioner.

Fordi det totale gastryk i den forseglede kontrol må holdes 20 inden for visse praktiske grænser, er det nødvendigt at tilsætte bicarbonation, fortrinsvis i form af natriumbicarbonat for at sikre et tilstrækkeligt P_n -niveau. Den forseglede uj2 kontrol udgør' et lukket system med hensyn til den totale mængde tilgængeligt CC^. På grund af dette udgør pH og PCQ en lige-25 2 vægt imellem mængden af CO^ i gasblandingen, som ligger over blodlegemesuspensionen, koncentrationen af bicarbonat- eller carbonatanion, som tilsættes den pufrede opløsning og bidraget

fra ikke-carbonat-afledede protoner og hydroxylioner til pH

i den pufrede opløsning.

Det område for bicarbonationer, som anvendes i fremstillingen af kontrollen ifølge den foreliggende opfindelse, er omkring 0,005 til omkring 0,2 M for at sikre at P^q ligger inden 35 for det ønskede område. Den tilsatte bicarbonation er fortrinsvis i koncentrationsområdet på omkring 0,01 til omkring 0,12 M. Samtidig er koncentrationsområdet for C02 i gasblandingen omkring 2 til omkring 15% volumen/volumen; fortrinsvis omkring

...... DK 161859B

10 5 til 10% volumen/volumen for at bevare et passende P i 2 den forseglede kontrol.

Pn påvirkes af koncentrationen af oxygen i gasblandingen, 5 °1 opløseligheden af oxygen i den pufrede opløsning og den reducerede hæmoglobins evne til at binde frit oxygen. Et egnet oxygenkoncentrationsområde, som er nyttig i fremstillingen af kontrollen ifølge opfindelsen er omkring 2 til omkring 30% volumen/volumen; fortrinsvis omkring 7 til omkring 20% volumen/volumen. En egnet sammensætning af gasblandingen, som lægges f.eks. i toprummet over den pufrede væskeblanding af referencestandard ifølge opfindelsen er omkring 2-30% volumen/volumen oxygen og omkring 2 til omkring 15% volumen/vo-25 .lumen carbondioxid, hvor balancen er nitrogen eller en anden inert gas.

Ikke stabiliserede erythrocyter i suspension vil miste hæmoglobin ved hæmolysis til det flydende suspensionsmedium. Efter-20 som dette cellefrie hæmoglobin ikke længere er forbundet med enzymet methæmoglobinreduktase, som det er i cellen, oxiderer det hurtigt til methæmoglobin. Bortset fra den uhensigtsmæssige kosmetiske effekt, som er forbundet med hæmolyse, resulterer oxidationen af hæmoglobin til methæmoglobin i instabilitet 25 af hæmoglobinparametrene. For at løse dette problem kan der anvendes stabilisatorer. Det foretrukne tværbindingsmiddel til at stabilisere erythrocyter ved udøvelsen af opfindelsen er dimethyladipimidat (DMA). Hydrochlorider af DMA, f.eks. dimethyladipimidatdihydrochlorid er også egnede.

30

Reaktionsbetingelser for reaktionen af DMA med aminer i vandige opløsninger er velkendte. DMA hydrolyserer ved lavt pH. Derfor er et stort overskud af DMA nødvendig for at udgøre tilstrækkeligt med DMA til at reagere med aminogrupperne. Ydermere er 35 de fleste aminogrupper protoneret ved lav pH. Dette gør dem mindre reaktive end de ikke-protonerede aminogrupper.

DK 161859 B

11

Ved høj pH undertrykkes hydrolyse. Generelt gælder, at jo højere pH er, jo mindre koncentration af DMA er nødvendigt for at imidere proteinet, og jo hurtigere sker imiderings-reaktionen, og jo færre sidereaktioner er der med DMA, f.eks.

5 hydrolyse.

Imidlertid gælder, at jo højere reaktions-pH, jo større sandsynlighed er der for at ødelægge erythrocyterne. Der må derfor rammes en balance imellem at anvende en høj pH for gunstige 10 reaktionsbetingelser og begrænsning af pH-niveauet for at undgå beskadigelse af erythrocyter.

Graden af imidering af erythrocyter er en funktion af pH, reaktionstid og temperatur. Hvis imideringen ikke får lov 15 at forløbe tilstrækkeligt langt, vil erythrocyterne ikke stabi liseres og vil miste hæmoglobin ved hæmolyse. På den anden side, hvis imideringen får lov at løbe for langt, vil erythrocyterne hærdes unødigt. For at udføre hæmoglobinanalysen må der ske en cellelysis i analyseudstyret. Imidering må derfor 20 kontrolleres for at undgå både dannelsen af skrøbelige celler, som er tilbøjelige til at hæmolysere og hærdede celler, som ikke kan lysere.

Denne imideringsbalance kontrolleres ved at fastsætte imide-25 ringsreaktionsbetingelserne som følger: 1 2 DMA-koncentrationen bevares ved omkring 0,77 til omkring 8,00 g/1, fortrinsvis omkring 0,85 til omkring 4,0 g/1, f.eks. 0,9 g/1.

30 2 pH i imideringsopløsningen holdes på omkring 7,3 til 11,3, fortrinsvis omkring 8 til omkring 10, mere foretrukket omkring 8,5 til omkring 10, mest foretrukket omkring 8,5 til omkring 9,5, f.eks. omkring 9,2. pH-kontrollen opnås 35 bedst ved anvendelse af uorganiske baser, såsom natrium- bicarbonat eller natriumcarbonat. Aminpuffere må undgås, idet de vil reagere med DMA'et.

DK 161859 B

12 3. Reaktionstiden kan variere fra 15 til 60 minutter, fortrinsvis omkring 18 til omkring 40 minutter, mere foretrukket omkring 20 til omkring 30 minutter, f.eks. omkring 25 minutter.

5 4. Imideringsreaktionen udføres ved en temperatur på omkring 20 til omkring 30°C, fortrinsvis omkring 22 til omkring 28°C, mere foretrukket ved omkring 24 til 26°C, f.eks. omkring 25°C.

10

Ved disse betingelser vil antallet af erythrocyter, som effek- 4 tivt kan behandles, variere fra omkring 1 x 10 til omkring 7 1x10 per mikroliter. Dvs., at der vil anvendes et erythrocyt- „ 4 , 7 tal pa omkring 1 x 10 til omkring 1 x 10 per mikroliter . 5 5 15 og fortrinsvis omkring 5,8 x 10 til omkring 6,2 x 10 per mikroliter.

Processen til stabilisering af erythrocyter i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse kan opsummeres som følger: 2 0 1. Erythrocyter, som er tilvejebragt fra humant blod, der ikke er frisk, vaskes i fysiologisk saltvand, centrifugeres og resuspenderes i en fikseringspuffer med 0,1 M natriumcarbo-nat og natriumbicarbonat indeholdende natriumchlorid.

25 -- · 2. Erythrocyttallet justeres ved tilsætning eller fjernelse af fikseringspuffer om nødvendigt.

3. DMA tilsættes, og reaktionen får lov at forløbe under om- 30 røring.

4. Imens reaktionen udføres, gennembobles cellesuspensionen enten med rent oxygen eller rent carbonmonoxid. Resultatet heraf er, at lade den intracellulære hæmoglobin med den 35 egnede gas således, at efterfølgende reaktion af hæmoglobinen med DMA fikserer hæmoglobinen i den oxygen-eller carbon-

DK 161859 B

13 monoxidbærende konformation, hvorved gassen "låses" inde i hæmoglobinen og øger stabiliteten af C^Hb- og COHb- parametrene.

5. Stabiliserede celler centrifugeres for at fjerne fikserings-5 reagenserne og resuspenderes i et HEPES-bicarbonat-saltvand-puffer ved en pH på 7,13 for at sænke pH.

6. Cellepopulationer af typen 02Hb og COHb kombineres på grundlag af volumen for at opnå det ønskede kontrolniveau.

10 7. De kombinerede celler centrifugeres for at fjerne HEPES-bicarbonat-saltvandpufferen.

8. De centrifugerede celler resuspenderes i en endelig pufferopløsning i et volumen, således at mål-THb opnås ved en pH i det fysiologiske område.

Stabiliteten af pH, P og P_ afhænger af, at erythrocyterne u2 cu2 20 forhindres i at respirere. På grund af dette blev den proteinbaserede puffer formuleret til ikke at indeholde nogen nævneværdig koncentration af næringsstoffer, og erythrocyterne udvælges således, at de er så gamle som muligt for at lade dem bringe sig selv i underskud på intracellulære nærings-25 stoffer. Imidlertid kan cellerne, når de således er i underskud, ikke effektivt reducere methæmoglobin, der dannes i cellerne ved spontan oxidation af hæmoglobin, tilbage til hæmoglobin.

30 Skønt det meste hæmoglobin ved udøvelsen af opfindelsen er stabiliseret i oxy- eller carboxyformen, når de stabiliserede erythrocyter fremstilles, vil noget af dette hæmoglobin med tiden miste sit gas på trods af DMA-behandling, og den resulterende hæmoglobin kan oxideres til methæmoglobin. Denne oxi-35 deringsproces kan hæmmes ved tilsætning af anti-oxidanter eller substanser, som selv fortrinsvis oxideres, hvorved kontrolsystemet stabiliseres.

14

DK 1618 5 9 B

De egnede anti-oxidantforbindelser til brug ved udøvelsen af opfindelsen er karakteriserede ved den kendsgerning, at de undergår spontan oxidation ved en langsom hastighed, har et oxidationspotential, som er højt nok til at give en umiddelbar reduktion i et biologisk system og har acceptable lugt-5

egenskaber. Illustrative, ikke-begrænsende eksempler på disse anti-oxidanter er dithioerythritol (DTE) og ditriothreitol (DTT), som er den optiske isomer af DTE. Anti-oxidanten anven-• des ved omkring 0,001 M til omkring 0,006 M baseret på det totale suspensionsmedium, fortrinsvis ved omkring 0,002 M

10 til omkring 0,005 M, mere foretrukket ved omkring 0,003 M til 0,005 M.

Et vedvarende problem ved fremstilling af kontroller, som har en lang lagerlevetid, er mikrobiel kontaminering. En kombination af neomycin og chloramphenicol beskytter effektivt materialet imod bakterier men ikke imod svampevækst. Tilsætningen af dinatriumethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) til baktericiderne resulterer i en anti-svampeaktivitet.

20

Neomycinsulfatet anvendes ved omkring 0,10 til omkring 0,12 g/1, fortrinsvis omkring 0,11 g/1, og chloramphenicolen anvendes ved omkring 0,10 til omkring 0,72 g/-l, fortrinsvis ved omkring 0,15 til omkring 0,66 g/1, mere foretrukket ved omkring 0,3 til omkring 0,4 g/1, f.eks. omkring 0,33 g/1.

2 5

Typiske angivne områder for den pufrede proteinopløsning, som anvendes i blodgaskontrollen ifølge opfindelsen, er: 30 Ingrediens Mængde til 1 liter '

Bovinserumalbumin 40 - 60 g HEPES, puffer 11,92 - 16,68 g

Natriumbicarbonat 0,84 - 0)0,08 g

Natriumchlorid 1,00 - 3,00 g 35 Dithioerythritol 0,07 - 0,77 g

Neomycinsulfat 0,10 - 0,12 g

Chloramphenicol 0,32 - 0,34 g

DK 161859 B

15

Ingrediens Mængde til 1 liter

Dinatriumethylendiamin- tetraeddikesyre 0,37 - 3,72 g

Deioniseret vand ad 1 liter 5

Skønt det foretrækkes at inkludere serumalbumin i sammensætningen således, at kontrollen vil ligne komplet blod så meget som muligt, kan serumalbuminen undlades, hvis det er ønskeligt at fremstille en mindre kostbar kontrol.

For at sikre lagerholdbarhed af blodgas-hæmoglobinanalyse- kontrollen ifølge opfindelsen har suspensionsmediet for erythro- cyterne fortrinsvis en osmolalitet overvejende svarende til den i komplet humant blod, dvs. omkring 280 til 350 mOsm/kg, fortrinsvis 320 mOsm/kg - 5 mOsm/kg. Osmolaliteten i opløsnin-15 gen indstilles ved tilsætning af natriumchlorid til suspensionsmediet for kontrollen.

Imens den hidtige beskrivelse har angivet DMA, som det foretrukne proteintværbindende middel, vil det være indlysende 20 fra denne beskrivelse, at enhver egnet imidoester kan anvendes som krydsbindende middel, f.eks. dimethylsuberimidat.

Det er selvfølgeligt nødvendigt at pakke kontrollerne for lagring, fragt og anvendelse. Skønt der i denne beskrivelse vil blive refereret til "ampuller", er det klart for fagfolk ud fra denne beskrivelse, at ethvert væskeuigennemtrængeligt materiale, som kan forsegles til at være gastæt, vil være anvendeligt. F.eks. er en glasflaske med en gummiskillevæg, som er forseglet således, at den er lufttæt, en egnet beholder.

3 0 o

Gummiskillevæggen bør være udført således, at den let kan fjernes ved brug til analyse. Betegnelsen "ampul" anvendes i beskrivelsen og kravene i sin normale betydning, men omfatter enhver egnet beholder til kontrollen således, som det er beskrevet, af omfattende lukkede flasker, folieposer, osv.

3 5

DK 161859 B

16 Når kontrollen er fyldt på ampuller, må der være noget rum tilbage, hvori gasblandingen kan introduceres, som vil udgøre P - og P -parametrene. Mens forholdet mellem det tomme υ2 topvolumen og væskesuspensionsvolumenet ikke er kritisk, bør 5 forhold imellem topvolumenet og væskevolumenet større end 2 undgås, fordi det tilgængelige overfladeareal inde i ampullen vil være så stort, at det ikke muliggør tilstrækkelig blanding af kontrollen og desuden er uhåndterlig ved anvendelse. Ligeledes kan forholdet være nul, hvis cellesuspensionen på forhånd 1° er bragt i ligevægt med gasblandingen før forsegling af ampullen. Det foretrækkes imidlertid, at forholdet af gas i forhold til væskevolumen er mindst 0,75. Ampullen vil således i den foretrukne udførelsesform blive fyldt med tilstrækkelig væske, sådan at gasvolurnenet i forhold til væskevolurnenet vil være omkring 0,75 til omkring 2, mere foretrukket omkring 0,9 til omkring 1,5, f.eks. 1,0.

Efter at den ønskede mængde cellesuspension er fyldt på ampullen blæses en oxygen/carbondioxid/inert gasblanding med den hen-20 sigtsmæssige sammensætning ind i ampullen for at erstatte den luft, som allerede findes i det øverste rum. Gassen bør lægges over væskesuspensionen således, at det undgås, at suspensionen skummer. Der gives tilstrækkelig tid til at fjerne al den omgivende luft, og ampullen forsegles ved det omgivende 25 tryk.

Ved udøvelsen af denne opfindelse under fikseringsprocessen er antallet af røde blodlegemer den vigtige parameter, idet det udgør grundlaget for bestemmelse af den støkiometriske 30 mængde tværbindende middel, som er nødvendig.

Ved fremstilling af kontrollerne ifølge opfindelsen er den afgørende parameter imidlertid ikke antallet af celler, men· det totale indhold af hæmoglobin i cellerne udtrykt i g per 35 . .

deciliter.

DK 161859B

17 Hæmoglobinindholdet i cellerne kan bestemmes ved enhver metode, som er kendt af fagfolk. F.eks. kan en suspension af røde blodlegemer, hvor antallet blodlegemer er kendt, bringes til at reagere med et cyanid i en opløsning bestående af et oxiderende middel og et middel, som forårsager cellelysis. Cyanid-5 derivatet af heemoglobinen har en kendt ekstinktionskoefficient. Således kan det totale hæmoglobinindhold i prøven bestemmes ved anvendelse af et laboratoriespektrofotometer.

Fordelene ved denne opfindelse vil fremgå tydeligere ved gennem- 10 gang af de følgende eksempler. Alle de beskrevne procedurer udføres asceptisk under sterile betingelser.

Eksempel I 15

Adskillelse af erythrocyter fra komplet blod

En enhed gammelt komplet blod blev vasket i tre vasketrin ved anvendelse af en IBM model 2991-1 centrifuge med en 0,9% saltopløsning. Ca. en liter vaskeopløsning blev anvendt i hvert trin. Det brungule lag blev fjernet, og vaskede røde blodlegemer suspenderet i saltopløsning.

Eksempel II 25

Fiksering af sterile blodlegemer

Ved fremstillingen af oxyhæmoglobin og carboxyhæmoglobinceller ifølge opfindelsen blev en fikseringspuffer med en pH på 9,2 3Q fremstillet som følger:

Tabel I

Ingredienser Mængde til 5 liter

Natriumcarbonat 7,22 g

Natriumbicarbonat 1,48 g 35 Deioniseret vand q.s .

Natriumchlorid q,s

DK 161859B

18

Ved fremstilling af fikseringspufferen blev pH indstillet ved anvendelse af 0,1 M-opløsninger af natriumcarbonat og natriumbicarbonat, hvor carbonatet anvendes for at øge pH, og bicarbonatet anvendes for at sænke pH med henblik på at sætte pH-værdien til 9,2 - 0,5. Natriumchlorid blev tilsat 5 for at justere osmolaliteten i opløsningen til 320 mOsm/kg - 5 mOsm/kg. Ca. 5 g/1 natriumchlorid er nødvendig.

A. Oxyhæmoglobinceller 10

Vaskede røde blodlegemer (RBC) fra en enhed komplet blod fremstillet som beskrevet i eksempel I blev suspenderet i fikse- 5 + ringspufferen, og celletallet indstillet til 6,0 x 10 - 5 0,2 x 10 RBC/μΙ. Ca. 3 liter fikseringspuffer var nødvendig. Fast dimethyladipimidatdihydrochlorid blev tilsat indtil koncentrationen af DMA-HC1 var 0,9 g/1. Oxygengas blev umiddelbart boblet igennem suspensionen under konstant omrøring. Omrøring og gasning ved 25°C blev fortsat i en inkubationsperiode på 25 minutter. Efter inkubationsperioden blev cellerne centri-^ fugeret og vasket i en puffer. Vaskepuffersammensætningen var som følger:

Tabel II

Ingrediens Mængde til 2 liter HEPES 28,56 g.

Natriumbicarbonat 3,38 g

Deioniseret vand q.s.

pH i vaskepufferen blev indstillet til 7,15 - 0,4 med 5 Ν' 3 0

NaOH, og osmolaliteten blev indstillet til 320 mOsm/kg - 5 mOsm/kg med NaCl (ca. 6 g/1). Vaskeopløsningen blev filtreret igennem et sterilt 0,22 μιη Milliporefilter. De vaskede celer blev samlet i en opsamlingsflaske.

35 19

DK 161 859 B

B. Carboxyhæmoqlobinceller

Den procedure, som blev anvendt til fremstilling af oxyhæmo- globinceller, blev gentaget, hvor oxygen erstattes med carbon- monoxid for at fremstille carboxyhæmoglobinceller.

5

Eksempel III

Fremstilling af blodgas-hæmoglobinanalysekontroller 10 Tre blodgas-hæmoglobinanalysekontroller blev fremstillet på tre niveauer med henblik på en tilnærmelse til fysiologiske blodforhold: niveau 1 - acidosis; niveau 2 - normal, og niveau 3 - alkalosis. Til niveau 2 blev der kun anvendt celler indeholdende oxyhæmoglobin, hvorimod der til niveau 1 og 3 blev anvendt en blanding af oxyhæmoglobin- og carboxyhæmoglobinceller. Sammensætningen af suspensionsmediet til hvert niveau er vist i tabel III.

Tabel III

20 -

Ingrediens Mængde til 1 liter

Niveau 1 Niveau 2 Niveau 3 Bovinserumalbumin 60 g 60 g 60 g 25 HEPES-puffer 14,28 g 14,28 g 14,28 g

Dithioerythritol 0,154 g 0,154 g 0,154 g

Neomycinsulfat 0,110 g 0,110 g 0,110 g

Chloramphenicol 0,330 g 0,330 g 0,330 g EDTA 2,23 g 2,23 g 2,23 g

Natriumbicarbonat 0,845 g 2,895 g 9,10 g

Deioniseret vand q.s. q.s. q.s.

Natriumchlorid q.s. q.s. q.s.

pH 7,15-04 7,4-04 7.65-04 35 Til hvert niveau blev pH indstillet med 5 N NaOH. Osmolaliteten i blandingerne blev indstillet til 320 mOsm/kg - 5 mOsm/kg med ca. 2 g/1 natriumchlorid.

DK 161859 B

20

Kontroller blev fremstillet i 1000 ampuller til afprøvning.

Hver ampul på 3 ml blev fyldt med 1,7 ml materiale. Ved fremstilling af ampullerne blev blandingerne vist i tabel IV anvendt .

5

Tabel IV

Fremstilling af blodgaskontrolampul

Ingrediens I II III

1 3 3 3

Suspens ionsmediurn 2,91 3,41 3,5 1

Oxyhæmoglobinceller^ 958 ml^ 1,7 1 1303 ml^ 2

Carboxyhæmoglobinceller 217 ml - 1050 ml

Gasblanding %C>2 - %c°2' balance 20-5 12-5 7-10

Prn mm Hg 20 - 7 35-7 60-7 15 ^υ2 P mm Hg 140 - 10 100 - 10 50 - 10 °2

Total- hæmoglobin (g/dl) 9 - 1 13-1 17-1 % oxyhæmoglobin 83-3 96-2 63-3 + + % carboxyhæmoglobin 15-2 <5 32-3 % methæmoglobin <3 <3 <3 1. Suspensionsmedium som beskrevet i tabel III.

2. Fremstillet som beskrevet i eksempel II A og B.

3. Omtrentlige værdier.

25 4. Blandet af suspensioner af celler i vaskeopløsning (tabel II). Der udvælges en mængde carboxyhæmoglobin indeholdende celler, og der tilsættes en hensigtsmæssig mængde oxyhæmo-globinholdige celler.

30 De tre kontrolniveauer tager sigte på at dække et kontrolområde, over hvilket analyseudstyret er kalibreret, dvs. totalhæmoglobin på 6-20% vægt/volumen. Et normalt totalhæmoglobin-niveau er på omkring 12%, hvorimod et lavt område (niveau 1) er 8-9%, og et højt område (niveau 3) er omkring 18-19%.

3 5

DK 161859 B

21 3 ml ampullerne blev fyldt med 1,7 ml suspension. Forud for forsegling af ampullerne blev de gennemstrømmet med den passende gasblanding for at fjerne al atmosfærisk luft. Gassenbblev lagt over væsken uden at tillade skumning af væsken.

5

Blodgas-hæmoglobinanalysekontrollerne viste sig at have en stabilitet på omkring 155 til 430 dage, når de lagredes ved 4°C. Til sammenligning har formaldehyd-stabiliserede erythro-cyter fremstillet som beskrevet i US-patentskrift nr. 3.973.913 og modificeret beskrevet nedenfor en stabilitet på mindre 10 end 60 dage. Proceduren ifølge '913 patentet blev modificeret som følger: (1) der blev ikke tilsat natriumcarbonat for at justere Ppn -niveauer, efter at cellerne var fikseret, (2) den endelige puffer var 0,75 ml HEPES 0,075 M NaCl, pH 7,4, 15 og (3) der var ikke nogen slutindstilling af pH før påfyldning på ampuller. Et kommercielt tilgængeligt produkt, fremstillet med formaldehyd-fikserede erythrocyter, viste sig at have en lagerlevetid på omkring 60 dage.

20 Eksempel IV

Sammenligning af proteintværbindende midler

Sammenlignende studier blev udført på kontroller fremstillet 25 med celler, der var tværbundne med formaldehyd, natriumtetra-thionat, diamid, diethyloxidiformiat og dimethylsuberimidat. Formaldehyd var et effektivt fikseringsmiddel, men gav ikke den grad af stabilitet, som blev opnået med DMA. Imens dimethyl-suberimidat var et effektivt tværbindende middel, var der 30 en større variation fra dag til dag og fra ampul til ampul, end der blev fundet med celler, der var fikseret med DMA.

Diamid- og natriumtetrathionatfikseringsprocedurer blev udført i overensstemmelse med beskrivelsen af Haest, C.W.M., et al., 35 "Intra and Intermolecular Cross-Linking of Membrane Proteins In Intact Erythrocytes and Ghosts by SH-Oxidizing Agents",

DK 161859B

22

Biochem. Biophys. Act. 469, 226-230 (1977), med undtagelsen af visse modifikationer. Inkubationsperioden blev forlænget til 3 timer, og vask af røde blodlegemer blev gjort ved, at et Haemonetics 15M cellevasksystern erstattede den batchvise vaskeproces.

Erythrocyter, der var fikseret med diamid eller natriumtetra-thionat var ekstremt ustabile og lyserede fuldstændigt efter 3 uger ved 4°C eller 25°C. Fortsat lagring af lyserede celler ved 25°C resulterede i geldannelse i opløsningen efter 2 måneder. Ved fremstilling af celler, der var stabiliseret med diethyloxydiformiat erstattedes saltvandssuspensionsmediet med 0,1 M natriumchlorid-0,5 M trispuffer med et pH på 9,0.

Fire tiendele af en ml diethyloxydiformiat blev tilsat til en 125 ml cellesuspension, og blandingen blev omrørt i 2 timer ved 25°C.

Kontroller, som blev fremstillet ved diethyloxydiformiat var også utilfredsstillende. Pn var stabilt i mindst 5 måneder, u2 ^ 0 20 når suspensionen blev lagret ved 4 C, men dag-til-dag og ampul- til-ampul-variationen i PCQ var uacceptabel.

2

Eksempel V

25 Methæmoglobinstabiliserende midler

Tilsætningen af nystatin, mælkesyre, cholesterol, natrium-fumarat og xylitol forbedrede ikke den egentlige tidsstabilitet af hæmoglobin frem for kontroller, der indeholdt dithio-30 erythritol. Resultaterne er vist i tabel V.

35

Tabel V

DK 161859 B

23

Methæmoqlobin-stabilisering Stabilisator Initial^ ^ ^ 175 dage^ ^ ^ % MetHb 1. Nystatin 0,1 4,0 5 2. Xylitol 0,2 4,8 3. Fumarat 0,3 5,8 4. Cholesterol 1,4 3,4 5. Laetat 0,3 3,1 6. Kontrol 0,4 5,9 7. Dithioerythritol 0,3 2,5^ (1) værdier er middelværdier af tre bestemmelser (2) værdier opnået efter 196 dage

Det vil være klart for fagfolk, som er bekendt med denne be-15 skrivelse, at produkterne ifølge opfindelsen bedst er egnede til at distribueres som sæt. Sættet indeholder fortrinsvis mindst en ampul for hvert kontrolniveau (acidosis, normal og alkalosis). De fysiologiske pH-områder for hvert niveau 4.

er: acidosis - 7,0 til 7,3, normal - 7,4 -- 0,1, alkalosis -20 + 7,6 - 0,1.

Med betegnelserne "stabiliserede oxyhæmoglobinholdige erythro- cyter" og "stabiliserede carboxyhæmoglobinholdige erythrocyter" menes erythrocyter, som er blevet stabiliseret ved hjælp af 25 fremgangsmåden ifølge denne opfindelse, hvor gassen, hvormed erythrocyterne er forbundet under stabiliseringen er hhv. oxygen og carbonmonoxid. Det er klart, at der, når der i patentbeskrivelsen og kravene refereres til hæmoglobin, oxyhæmoglobin og carboxyhæmoglobin, da refereres til sådanne, som er indeholdt i erythrocyten, med mindre andet er angivet.

35

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til stabilisering af erythrocytter fra patte-5 dyr til anvendelse i en blodgas-hæmoglobinanalysekontrol, kendetegnet ved, at den omfatter: (a) suspension af disse erythrocytter i et pufret fiskeringsmedium bestående af en vandig opløsning af en pufferkomponent, 10 hvilket medium har en pH på omring 7,3 til omkring 11,3, (b) at bringe erythrocytterne i kontakt med en gas, hvilken gas er oxygen eller carbonmonoxid, i tilstedeværelse af et proteintværbindende middel i form af en imidoester ved en tem- 15 peratur på omkring 20°C til omkring 30°C i en reaktionstid på omkring 15 minutter til omkring 60 minutter, og (c) genindvinding af de stabiliserede erythrocytter.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at erythrocytten er en human erythrocyt.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, k e n de tegnet ved, at imidoesteren er dimethyladipimidat eller dimethylsuberimidat. 2 5

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at gassen er oxygen.

5. En stabiliseret erythrocyt, kendetegnet ved at 30 være fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 1.

6. Et b1odgas-hæmog1obinanalysekontrol produkt, kendetegnet ved, at det omfatter: 35 (a) et pufret suspensionsmedium omfattende en vandig opløs ning af en pufferkomponent, hvilket medium har en pH på omkring 6,8 til omkring 8,0, DK 161859 B (b) stabiliserende erythrocytter fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 1, hvilke erythrocytter er til stede i suspen-sionsmedi et i en mængde, således at suspensionsmediet har en total hæmoglobinkoncentration på omkring 3 til omkring 24 5 g/dl, hvilken hæmoglobin omfatter omkring 60 til 100% oxyhæmo-globin og omkring 0 til 35% (vægt/vægt) carboxyhæmog1obin.

7. Produkt ifølge krav 6, kendetegnet ved, at suspensionsmediet indeholder dithioerythritol ved en koncentra- 10 tion på omkring 0,07 til omkring 0,77 g per liter suspensions-medi um.

8. Produkt ifølge krav 6, kendetegnet ved, at ery-throcytterne er valgt fra gruppen bestående af: oxyhæmog1obin- 15 holdige erythrocytter , carboxyhæmog1obinho1dige erythrocytter og blandinger heraf.

9. Produkt ifølge krav 6, kendetegnet ved, at atmosfæren i ampullen omfatter oxygen, carbondioxid og en inert 20 gas, og hvor oxygenet har et partialtryk på omkring 2666 til 53320 Pa (20 til 400 mm Hg), og carbondioxidet har et partialtryk på omkring 1333 til 9997,5 Pa (10 til omkring 75 mm Hg).

10. Analysesæt, kendetegnet ved,, at det består af mindst en ampul med produktet ifølge krav 6, 7 eller 8. 30 35