DK158474B - Fremgangsmaade til fremstilling af vaevsthromboplastinpraeparat og reagens indeholdende vaevsthromboplastinpraeparatet - Google Patents

Description

DK 158474 B

i

Den foreliggende opfindelse angår fremstilling af en vævs-thromboplastinpræparat (TP) af pattedyrvæv, som har en defineret faktor-VII-følsomhed og et reagens indeholdende præparatet.

Ved TP forstår man ifølge DIN 58910 en ekstrakt af pattedyr-5 væv, som i tilstedeværelse af kalciumioner forkorter størkningstiden af blodplasma flere gange.

Thromboplastiner anvendes i diagnostikken til erkendelse af størkningsforstyrrelser. Den hertil anvendte test betegnes som guick-test eller prothrombin-tid-test. Man efterligner 10 herved de ved en karbeskadigelse optrædende begivenheder, som til sidst fører til blodstørkning og lukning af karsåret, idet man til vævs-TP i nærværelse af kalcium sætter blod eller blodplasma fra den patient, der skal undersøges, og måler tiden til dannelse af en størknet masse. TP aktiverer herved 15 faktoren VII, som på sin side via faktorerne X og V bevirker dannelse af thrombin af prothrombin (faktor II). Thrombin spalter fibrinogenet til uopløseligt fibrin, som tager del i sårlukningen. Den tid, der går til dannelse af en størknet masse efter tilsætning af thromboplastin + calcium, er et mål 20 for koncentrationen henholdsvis aktiviteten af de deltagende størknings faktorer.

Quick-testen giver dermed et summarisk udsagn om koncentrations-forholdene af de deltagende størkningsenzymer (faktorer). Herved kan der ved samme quick-værdi udmærket foreligge forskel-25 lige forhold i koncentrationerne af de enkelte faktorer II, V, VII og X. Sådanne forskydninger i koncentrationsforholdene af de enkelte størkningsfaktorer kan f.eks. være forårsaget af patologiske forandringer (levercirrhose, intravaskulær størkning, vitaminmangel) eller af medikamenter, f.eks. cumarinderi-30 vater til oral antikoagulansterapi. Forskelle bliver først synlige, når samme undersøgelsesmateriale undersøges med thromboplastiner fra forskellige fabrikanter. Thromboplastinerne 2

DK 158474 B

adskiller sig i almindelighed stærkt i deres følsomhed over for de enkelte størkningsfaktorer, således at samme patientprøve kan give forskellige quick-værdier med TP fra forskellige fabrikanter.

5 Man tilstræber derfor at tilvejebringe sammenlignelighed mellem forskellige thromboplastiner. En vej hertil er standardisering med hensyn til en defineret faktorfølsomhed. Der eksisterer talrige fremgangsmåder til fremstilling af faktorfølsom TP. Medens fremstilling af faktor-II-, V- og X-følsarme 10 præparater ikke mere udgør noget problem, er der stadig vanskeligheder ved fremstilling af faktor-VII-følsom thromboplastin.

Det formodes, at en ringe faktorfølsomhed af en thromboplastin er betinget af, at præparatet stadig indeholder spor af størk-15 ningsfaktorer, som indføres via blodindholdet i det til throm boplas tinekstraktionen anvendte væv. For denne antagelse taler især en i Thrombosis Hemostasis (Stuttgart) 1939, 592-599 (1978) meddelt konstatering, ifølge hvilken der af hundehjerne med kongenital mangel på faktor VII kan fremstilles en særlig 20 faktor-VII-følsom thromboplastin.

Der er allerede beskrevet fremgangsmåder til fremstilling af specielt faktor-VII-følsomme thromboplastiner. For eksempel skal den Ønskede virkning ifølge DE-AS 2 556 493 opnås ved, at vævet ekstraheres direkte med en alkali lud. En beskadigelse 25 af thromboplastinen er derved i høj grad sandsynlig. Dette viser sig også ved, at der ved anvendelse af denne fremgangsmåde kræves et større antal hjælpestoffer til stabilisering af den fremkomne thromboplastin.

En anden fremgangsmåde beskrives i Biochem.Soc.Trans. 8, 133 30 (1980), nemlig adsorption af faktor VII på bariumsulfat. Her- 3

DK 158474B

ved bliver imidlertid efter opfindernes erfaring thrombo-plastinen vidtgående medudfældet med bariumsulfatet.

Isolering af thromboplastin fra væv af dyr med medfødt fak-tor-VII-mangel kommer ikke på tale til industriel anvendelse, 5 alene af prisgrunde og tilgængelighedsgrunde.

Det er derfor den foreliggende opfindelses opgave at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af thromboplastin med tilstrækkelig og definerbar følsomhed over for størkningsfaktor VII, hvilken fremgangsmåde ikke har ulemperne ved de 10 kendte fremgangsmåder, og som gør det muligt at tilfredsstille det allerede beskrevne behov.

Denne opgave løses ifølge opfindelsen ved en fremgangsmåde til fremstilling af et vævsthromboplastinpræparat, som er ufølsomt over for størkningsfaktor VII, ved fremstilling af 15 acetonetørpulver fra pattedyrvæv og ekstraktion af pulveret med saltopløsning, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man udfører ekstraktionen med en saltopløsning, som indeholder 1-20 mmol pr. liter Ca-ioner og eventuelt et overfladeaktivt middel/ og eventuelt tørrer ekstrakten.

20 Fortrinsvis anvender man ifølge opfindelsen en saltopløsning til ekstraktionen, der indeholder 5-15 mmol pr. liter cal= ciumioner. Som calciumsalt egner sig hertil principielt ethvert tilstrækkeligt vandopløseligt calciumsalt. Fortrinsvis anvender man dog et calciumsalt af en vandopløselig car= 25 bonsyre, især myresyre eller eddikesyre.

Fremstillingen af acetonetørpulveret af pattedyrvæv sker på kendte måder. De er f.eks. beskrevet i "Human Blood Coagulation, Hemostasis and Thrombosis" (R.Biggs red., Blackwell Scientific Publications, Oxford 1976, side 663). Ved at gå 30 ud fra sådanne acetonetørrede vævspræparater kan ekstraktionen 4

DK 158474 B

ifølge opfindelsen af thromboplastinen ske. Det er dog hensigtsmæssigt før den egentlige ekstraktion af thromboplastinen at indskyde et forudgående vasketrin, der tjener til fraskil-lelse af stadig i vævet indeholdte uønskede forureninger, 5 f.eks. hæmoglobin. Når man anvender det forud indskudte vasketrin, sker dette fortrinsvis ved hjælp af stødpudeopløsning med en pH-værdi på ca. 6,5 - ca. 8. Eksempelvis kan denne vask ske med 0,1 mol pr. liter natriumacetatstødpude med pH 7,0 og udvinding af den thromboplastinholdige vævsremanens 10 ved fysiske metoder, såsom centrifugering. Andre vaskevæsker er dog også egnede. Et sådant forud indskudt vasketrin fører ganske vist til et vist udbyttetab ved udvaskning af thromboplastin.

Den egentlige ekstraktion med en calciumionholdig saltopløs-15 ning kan ske med en ren calciumsaltopløsning eller med en opløsning af et andet salt, hvortil der er sat den nødvendige mængde calciumioner. For eksempel kan ekstraktionen ske med fysiologisk kogsaltopløsning, hvortil der er sat de anførte mængder calciumioner i form af tilsvarende calciumsalte. Der 20 kan dog også anvendes andre koncentrationer og andre salte.

En stødpudetilsætning er ikke nødvendig til ekstraktionsopløsningen, hvis der anvendes f.eks. neutrale salte. Men hvis pH-værdien af den anvendte saltopløsning ligger uden for området på ca. 5,5 - 9, tilsættes hensigtsmæssigt en stødpude, 25 der sikrer en tilnærmelsesvis neutral pH-værdi.

En anden eventuelt tilstedeværende bestanddel af den ifølge opfindelsen anvendte ekstraktionsopløsning er et overfladeaktivt middel. Det overfladeaktive middel muliggør en forhøjelse af udbyttet, men er ikke nødvendigt for at opnå faktor-30 Vll-følsomheden. Egnede er både kationaktive, anionaktive og ikke-ioniske overfladeaktive midler. Et typisk eksempel på egnede kationiske detergenter er cetyl-trimethylammonium= 5

DK 158474B

bromid, et typisk eksempel på anioniske overfladeaktive midler er forbindelserne af galdesyregruppen og deres salte som f.eks. cholsyre, desoxycholsyre etc. Et eksempel på egnede ikke-ioniske overfladeaktive midler er polyethylenoxidetherne 5 og -esterne med hydrofobe alkyl-, aryl- og aralkyIrester.

Den i hvert enkelt tilfælde egnede mængde af overfladeaktivt middel kan konstateres ved simple forudgående forsøg. Forså-vidt det drejer sig om anioniske overfladeaktive midler, skal man drage omsorg for, at opløselighedsgrænsen for det dannede 10 calciumsalt ikke overskrides. Fortrinsvis tilsætter man 0,01 -0,5 vægt% overfladeaktivt middel til ekstraktionsopløsningen, men også mindre og større mængder kan anvendes.

Ekstraktionen kan udføres ved normal eller ved forhøjet temperatur. Ved forhøjet temperatur kan udbyttet forøges, men en 15 overgrænse på ca. 45°C skal ikke overskrides for at undgå en beskadigelse af den ekstraherede thromboplastin.

Der haves en faktor-VII-følsomhed, når der ved udførelse af quick-testen med en faktor-VII-mangelplasma findes en væsentligt længere størkningstid end ved udførelse af samme test 20 under anvendelse af normalplasma. Ved faktor-VII-mangelplasma forstås en plasma, der stammer fra personer med kongenital faktor-VII-defekt.

Den ifølge opfindelsen opnåede virkning kan f.eks. vises ved,at man først vasker efter kendte fremgangsmåder fremstillet 25 acetonetørpulver med acetatstødpude pH 7,0 og derpå ekstrahe-rer med 0,85% kogsaltopløsning, som indeholder 0,05% natrium= desoxycholat. Den udvundne TP viser ved quick-testen en høj thromboplastisk aktivitet, f.eks. over for normalplasma en størkningstid på ca. 11 sekunder. Hvis man i stedet for normal-30 plasma anvender en faktor-VII-mangelplasma, finder man f.eks. en størkningstid på 18 - 20 sekunder. Den med dette calciumfrie ekstraktionsmiddel ekstraherede thromboplastin har derfor 6

DK 158474B

kun en ringe faktor-VII-følsomhed.

Hvis man imidlertid ekstraherer acetonetørvævet med en tilsvarende opløsning, der desuden indeholder 10 mmol pr. liter calciumioner, viser væsken over thromboplastinen efter centri-5 fugering ved quick-testen med normalplasma en størkningstid på ca. 12 sekunder, men med faktor-VII-mangelplasma derimod en størkningstid på 40 - 60 sekunder. Ifølge opfindelsen får man således en væsentligt højere følsomhed over for en faktor-VI I -mangelti Is tand end ved anvendelse af en kendt fremgangsraå-10 de med ekstraktion uden calciumtilsætning.

Karakteristisk bliver størkningstiden for normalplasma med den ifølge opfindelsen fremstillede thromboplastin herved noget forlænget i sammenligning med et præparat, der er ekstraheret uden calciumioner. Dette er dog uden betydning på bag-15 grund af det høje udbytte af følsomhed over for faktor VII. Hvis man f.eks. udtrykker faktorfølsomheden af en thromboplastin som forholdet mellem størkningstiden af en mangelplasma og størkningstiden af en normalplasma, udviser en efter det foregående eksempel uden calcium ekstraheret thromboplastin 20 et forhold på ca. 1,6 og en ifølge opfindelsen udvundet thromboplastin derimod et forhold på 4,0.

En thromboplastin med forbedret faktor-VII-følsomhed kan ganske vist også fås, når den nedre grænse på 1 mmol pr. liter underskrides, men de fremkomne følsomhedsværdier ligger da tydeligt 25 lavere og er ikke ensartede fra parti til parti.

Opfindelsen angår endvidere et reagens til kontrol af blodstørkningsevne med et indhold af thromboplastin og calciumsalt, som er ejendommeligt ved, at det indeholder et efter den foran beskrevne fremgangsmåde i nærværelse af calciumioner fremstil-30 let vævsthromboplastinpræparat. Fortrinsvis udviser et sådant præparat en helt defineret faktor-VII-følsomhed. Dette kan opnås ved, at man til præparatet også sætter et thromboplastin- 7

DK 158474B

præparat, der er ufølsomt over for faktor VII. Ved passende valg af mængderne af faktor-VII-følsamt og faktor-VII-ufølsomt TP kan der indstilles enhver ønsket faktor-VII-følsomhed.

Dette kan særlig enkelt opnås ved, at man underkaster remanen-5 sen fra ekstraktionen ifølge opfindelsen af acetonetørvævet endnu en yderligere ekstraktion uden calciumiontilsætning.

Herved får man en faktor-VII-ufølsom thromboplastinfraktion.

Ved blanding af forskellige mængder af de to fraktioner kan der derved fremstilles TP-partier i stor målestok, som udviser 10 en defineret og reproducerbar faktor-VII-følsomhed. Herved opnås et betydeligt fremskridt med hensyn til standardisering og konstans af de enkelte partier.

En særlig fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ligger i dens enkelhed og i mangel på betingelser, der kunne fremkal-15 de en beskadigelse af thromboplastinen.

De følgende eksempler belyser nærmere opfindelsen.

EKSEMPEL 1.

a) Til 10 g acetonetørpulver fra kaninhjerne sættes 10 g Supercel, og der inkuberes med 400 ml 0,1 mol natriumacetat- 20 stødpude, pH 7,0, i 30 minutter ved 37°C i vandbad. Der efter centrifugeres i 15 minutter ved 2500 g. Bundfaldet suspenderes i 400 ml 0,85% natriumchloridopløsning, der indeholder 0,05% natriumdesoxycholat, og omrøres i 30 minutter ved 30°C i vandbad. Derefter centrifugeres i 10 25 minutter ved 2500 g. Den overstående væske indeholder faktor-VII-ufølsom thromboplastin. Bundfaldet kasseres.

b) Ekstrakten af thromboplastinen sker under samme betingelser som i eksempel la), men med en tilsætning af 7,5 mmol pr. liter Ca-formiat. Man får en faktor-VII-følsom thrombopla- 30 stin.

8

DK 158474B

EKSEMPEL 2.

Der udføres en quick-test med de ifølge eksempel la) og b) fremstillede thromboplastinekstrakter. Da der til reaktionen kræves calcium, må den i fravær af calciumioner fremkomne thromboplastinekstrakt fra eksempel la) bagefter tilføres 5 calciumformiat indtil 7,5 mmol pr. liter. Som normalplasma tjener en af 10 sunde donorer udvundet citratplasma, således som den anvendes ifølge DIN 58910, til fremstilling af referencekurver til quick-testen. Som faktor-VII-mangelplasma tjener en i handelen værende kongenital faktor-VII-mangelplas-10 ma fra firmaet DADE.

Til 0,1 ml plasma sættes 0,2 ml af den til 37°C forvarmede thromboplastinsuspension, og man måler tiden indtil begyndende størkning under anvendelse af et koagulometer ifølge Schnitt-ger & GroS (Fa. Amelung, Lemgo, BRD). Man finder, at den iføl-15 ge eksempel la) ekstraherede test-thromboplastinsuspension med normalplasma størkner efter 10,0 sekund og med faktor-VII-mangelplasma efter 16,1 sekund (forhold 1,6).

Den under calciumtilsætning ifølge eksempel lb) ekstraherede thromboplastinsuspension giver med normalplasma 12,3 sekund 20 og med faktor-VII-mangelplasma 45 sekunder størkningstid (forhold 3,7).

EKSEMPEL 3.

Thromboplastinekstrakt fremstillet ifølge eksempel la) og b) bliver efter supplering med calciumindholdet i den calciumfrie 25 ekstrakt til 7,5 mmol pr. liter blandet i forskellige forhold, og størkningstiden måles som i eksempel 2 for normalplasma og faktor-VII-mangelplasma. Resultaterne er vist i tabel 1.

De bekræfter, at der ifølge opfindelsen kan fremstilles blandinger med defineret faktor-VII-følsomhed.

Claims (7)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et vævsthromboplastin-præparat, som er følsomt over for størkningsfaktor VII, ved fremstilling af acetonetørpulver af pattedyrvæv og ekstrak-25 tion af pulveret med saltopløsning, kendetegnet ved, at man udfører ekstraktionen med en saltopløsning, der indeholder 1-20 mmol pr. liter Ca-ioner og eventuelt et overfladeaktivt middel og eventuelt tørrer ekstrakten. 30 DK 158474B 10

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man anvender en saltopløsning, der indeholder 5 - 15 mmol pr. liter calciumioner.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendeteg net ved, at man anvender et calciumsalt af en vandopløselig carbonsyre.

4. Fremgangsmåde ifølge de foregående krav, kendeteg- 10 net ved, at man vasker acetonetørpulveret før ekstraktio nen med en stødpudeopløsning med pH 6,5 - 8.

5. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, kendetegnet ved, at man sætter 0,01 - 5% overfladeaktivt 15 middel til ekstraktionsopløsningen.

6. Reagens til kontrol af blodstørkningsevne med et indhold af thromboplastin og calciumsalt, kendetegnet ved, at det indeholder et efter fremgangsmåderne ifølge krav 1 - 20. fremstillet vævsthromboplastinpræparat.

7. Reagens ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det desuden indeholder et thromboplastinpræparat, der er uføl- 25 somt over for faktor VII, i en sådan .mængde, at der foreligger en forudbestemt faktor-VII-følsomhed. 30 1