DK157302B - Estere af clavulansyre til anvendelse som mellemprodukter ved fremstilling af clavulansyre eller farmaceutisk tolerable salte deraf - Google Patents

Description

DK 157302 B

Den foreliggende opfindelse angâr hidtil ukendte estere af clavulansyre til anvendelse som mellemprodukter ved fremstilling af clavulansyre eller farmaceutisk tolerable salte deraf, hvilke estere er ejendonunelige ved, at de har den almene formel I 5

. CH-OH

n^W

COOR

hvor R betegner en carbonhydridgruppe med hojst 16 .carbonatomer, som eventuelt er substitueret med halogen, C^.g-alkoxy eller hydroxy, eller R betegner en gruppe med formlen 10 I 5

- CH - O - CO - A

yLX,.

hvor betegner hydrogen eller methyl, betegner methyl, tert.but-yl eller phenyl, og A^ betegner hydrogen eller methoxy, eller R betegner en carbonhydridgruppe med 1-9 carbonatomer, som er sub-15 stitueret med eventuelt til salte omdannede basiske grupper med den almene formel NR^R^, hvor R^ betegner hydrogen eller C^.g-alkyl, R^ betegner hydrogen eller C^_g-alkyl eller er knyttet til R^, sâledes at NR^R^ er en pyrrolidin-, piperidin- eller morpholinring.

Stereokemien ved carbonatomerne 5 og 2 i clavulansyren er den samme, 20 som findes hos naturligt forekommende penicilliner og cephalospo-riner, sâledes at clavulansyre kan illustreres med strukturformlen

DK 157302 B

2

CH OH

Γ /"Ν' \

CO OH

Sâledes er et mere fyldestgorende kemisk navn for clavulansyre Z-(2R,5R)-3-(/3-hydroxyethyliden)-7-oxo-4-oxa-l-azabicyclo[3,2,0]heptan-5 2-carboxylsyre.

Clavulansyres virkning som /?-lactamase-inhibitor illustreres ved, at vis se stammer af Klebsiella aerogenes A, hvis vækst ikke inhiberes ved tilstedeværelse af 125 /ig/ml ampicillin, amoxycillin, carbeni-cillin eller benzylpenicillin eller ved tilstedeværelse af 10 /ig/ml 10 clavulansyre, inhiberes ved tilstedeværelse af mindre end 12,5 /ig/ml af de ovenfor anferte penicilliner, nâr der ogsâ forekommer 5 /ig/ml clavulansyre. Lignende resultater er iagttaget for kombinationer indeholdende forskellige estere af clavulansyre. Fx inhiberes stammer af Klebsiella aerogenes A, hvis vækst ikke inhiberes af 125 /ig/ml 15 ampicillin eller af 10 /ig/ml clavulansyre-methylester, af mindre end 12,5 /ig/ml ampicillin i nærværelse af 5 /ig/ml clavulansyre-methylester. Det har ogsâ vist sig, at stammer af Staphylococcus aureus Russell, hvis vækst ikke inhiberes ved tilstedeværelse af 100 /ig/ml ampicillin eller af 5 /ig/ml clavulansyre, inhiberes ved tilste-20 deværelse af mindre end 10 /ig/ml ampicillin i nærværelse af 1 /ig/ml clavulansyre. Ved forsag pâ hunmus har det vist sig, at blod- og vævsniveauer af clavulansyre pâ betydelig mere end 5 /ig/ml let kan nâs ved subcutan administration af 100 mg/kg af natriumsaltet af clavulansyre, og at værdifulde niveauer af clavulansyre kan nâs efter 25 oral administration af 100 mg/kg af natriumsaltet af clavulansyre.

Clavulansyre og salte deraf synes at være noget nyttigere syner-gistiske midler end esteme i sig selv.

Særlig velegnede farmaceutisk tolerable salte af clavulansyre er fx natrium- , kalium-, calcium-, magnésium- , aluminium- , ammonium- og 30 substituerede ammoniumsalte sâsom trimethylammonium- , benzathin-,

DK 157302 B

3 procain- og lignende salte, soin sædvanligvis dannes med penicilliner eller cephalosporiner.

Salte af clavulansyre synes at være mere stabile end selve syren.

Særlig velegnede salte af clavulansyre er natrium- og kaliumsaltene,

5 som har de nedenstâende formler III og IV

. CH90H . CH/IH

/ 2 -_/ 2 \ \

COONa COOK

III IV

krystallinske former af sâdanne salte kan indeholde hydratvand.

10 De i nærværende beskrivelse omhandlede estere er rent teoretîsk afledt af en alkohol med den almene formel ROH, hvor R har den ovenfor anfarte betydning. Egnede grupper R er fx alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, arylalkyl eller andre lignende grupper, som, om ansket, kan være substituerede som angivet ovenfor. Gruppeme R 15 omfatter ikke mere end 16 carbonatomer, især ikke mere end 12 carbonatomer og navnlig ikke mere end 8 carbonatomer.

Gruppen R er fortrinsvis, rent teoretîsk, afledt af en alkohol ROH, som er farmaceutisk tolerabel.

Egnede estere af clavulansyre er sâdanne, som rent teoretîsk er 20 afledt af alkoholer sâsom methanol, éthanol, propanol, butanol, 2,2,2-trichlorethanol, 2,2,2-trifluorethanol, benzylalkohol, phénol og 2-dimethylaminoethanol.

Egnede substituenter, som kan omfattes af gruppen R, er fx halo-genatomer, og alkoxy-, hydroxy-, alkylamino- og dialkylaminogrupper 25 som defineret ovenfor. Sâledes kan R fx være methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, ligekædet eller forgrenet butyl, pentyl, heptyl, octyl,

DK 157302 B

4 nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, vinyl, allyl, butenyl, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclohexenyl, cyclohexadienyl, methylcyclopentyl, methylcyclohexyl, benzyl, benzhydryl, phenylethyl, naphthylmethy1, phenyl, naphthyl, propynyl, 5 tolyl, 2-chlorethyl, 2,2,2-trichlorethyl, 2,2,2-trifluorethyl, 2-methoxyethyl, 2-dimethylaminoethyl, 2-diethylaminoethyl, 2-plperidinoethyl, 2-morp_holinoethyll 3-dimethylaminopropyl, p-chlorbenzyl, p-methoxÿbenzyl, p-brombenzyl, m-chlorbenzyl, 6-methoxynaphthyl-2-methyl, p-chlorphenyl eller p-methoxyphenyl.

10 Særlig velegnede estere med formlen I er sàdanne, som har de almene formler VII og VIII

nu CH0OH

—r\/2 /2 0 \ f 5 ° X ^ /A6 " y-Uv ο

VIII

hvor A^, og A^ har den ovenfor anforte betydning.

15 Særlig gode estere af clavulansyre til anvendelse som mellemprodukter er sâdarme, som har den almene formel IX

CH0OH

nV

XCOORX

hvor R·*- betegner en carbonhydridgruppe med 1-9 carbonatomer, som 20 eventuelt er substitueret med halogen, C^_g-alkoxy, hydroxy eller eventuelt til salte omdannede basiske grupper med den almene formel NR%^, hvor betegner hydrogen eller C^_g-alkyl, og R^ betegner hydrogen eller C^.g-alkyl eller er knyttet til R^, sâledes at NR^R^ er en pyrrolidin-, piperidin- eller morpholinring.

5

DK 1 57302 B

Egnede grupper rA er alkyl og aralkyl, soin eventuelt er substitueret med halogen, methoxy, hydroxy eller til sait omdannede NR^R^-grupper, hvor R^ betegner methyl eller ethyl, og R^ betegner methyl eller ethyl.

5 Særlig velegnede alkylgrupper R·*· er ligekædede grupper med hojst 6 carbonatomer, som eventuelt er substitueret med en methoxy-, hydroxy eller til et sait omdannet NR^R^-gruppe eller med et chlor-, brom-eller iodatom eller med en CCI3- eller CF3-gruppe.

Clavulansyreestere med formlen I kan omdannes til clavulansyre eller 10 farmaceutisk tolerable salte deraf med forskellige former for hydrolyse.

En yderligere gruppe af særlig velegnede estere ifolge opfindelsen er sâdanne værdifulde mellemprodukter, som let omdannes til clavulansyre eller et sait deraf ved kemiskeeller biologiske teknikker, som fra 15 penicillin- eller cephalosporinteknikken vides at være tilstrækkelig milde til ikke at nedbryde reaktive syre-labile y9-lactamringe.

En velegnet gruppe estere til anvendelse som mellemprodukter ved fremstilling af clavulansyre eller farmaceutisk tolerable salte deraf er en sâdan, som har den almene formel X

20

^H20H

0S~^< \ 7

fcO-O-CH-A

i8 hvor èJ betegner et hydrogenatom eller en eventuelt med chlor, brom eller methoxy substitueret phenylgruppe, og betegner en eventuelt med chlor, brom eller methoxy substitueret phenylgruppe.

DK 157302 B

6 Særlig hensigtsmæssigt er èJ et hydrogenatom eller phenyl, tolyl, chlorphenyl eller methoxyphenyl, og er phenyl, tolyl, chlorphenyl eller methoxyphenyl.

èJ er fortrinsvis et hydrogenatom, og er fortrinsvis en phenyl-5 gruppe.

Esteme med formlen X kan spaltes ved hydrogenolyse, hvorved der fâs clavulansyre eller et sait deraf.

Sâdanne reaktioner finder normalt sted i nærværelse af en overgangs-metalkatalysator under anvendelse af lave eller middelhoje hydro-10 gentryk. Reaktionen kan udfores ved hoj temperatur, stuetemperatur eller lav temperatur,. fx ved 0-100°C. Særlig velegnede reaktions-betingelser til sâdanne hydrogeneringer er at anvende hydrogentryk lidt over atmosfæretryk og en omtrentlig stuetemperatur (12-20°C).

Reaktionen kan udfores i sædvanlige oplosningsmidler sâsom lavere 15 alkanoler, fx éthanol·. Det har vist sig, at en særlig velegnet katalysator er palladium pâ kul.

Hvis hydrogeneringen udfores i nærværelse af en base, fâs et sait af clavulansyre, fx fâs natrium- eller kaliumsaltet, hvis reaktionen udfores i nærværelse af natrium- eller kaliunihydrogencarbonat.

20 Clavulansyren eller saltet deraf, som fâs ved sâdanne reaktioner, er sædvanligvis af god renhed.

Særlig hensigtsmæssige estere er benzylclavulanat, p-chlorbenzyl-clavulanat, p-methoxybenzylclavulanat, p-brombenzylclavulanat og m-chlorbenzylclavulanat.

25 Som tidligere anfort har clavulansyre og salte deraf værdifulde terapeutiske egenskaber. Der kan derfor fremstilles et farmaceutisk præparat, som indeholder clavulansyre eller et sait deraf sammen med et farmaceutisk tolerabelt bærestof.

Sâdanne præparater foreligger i en form, som er egnet til oral, to-

DK 157302 B

7 pisk eller parentéral anvendelse, og de kan anvendes til behandlingen af infektioner hos pattedyr, herunder mennesker.

Egnede præparatformer er fx tabletter, kapsler, cremer, sirupper, suspensioner, opl0sninger, rekonstituerbare pulvere og stérile for-5 mer, som er egnet til injektion eller infusion. Sàdanne præparater kan indeholde sædvanlige farmaceutisk tolérable materialer sàsom fortyndingsstoffer, bindemidler, farvestoffer, smagsstoffer, konser-veringsmidler og desintegranter i overensstemmelse med sædvanlig farmaceutisk praksis pâ den mâde, som er kendt af fagmanden til 10 formulering af antibiotika.

Injicerbare eller infunderbare præparater af clavulansyre eller salte deraf er særlig velegnede, da hoje vævsniveauer af forbindelsen af clavulansyre kan optræde efter administration ved injektion eller infusion. Et foretrukket præparat indeholder clavulansyre eller et 15 sait deraf i steril form.

Under visse betingelser kan effektiviteten af orale præparater af clavulansyre og salte deraf forbedres, hvis sâdanne præparater indeholder et pufferstof eller et enterisk overtræksmiddel, sâledes at de omhandlede forbindelser ikke har forlænget kontakt med stærkt sur 20 mavesaft. Sâdanne pufrede eller enterisk overtrukne præparater kan fremstilles i overensstemmelse med sædvanlig farmaceutisk praksis.

Clavulansyren eller salte deraf kan forekomme i præparatet som eneste terapeutiske middel eller kan forekomme sammen med andre terapeutiske midler sâsom et /3-lactam-antibiotikum. Egnede β-lactara-antibiotika 25 til anvendelse i sâdanne synergistiske præparater omfatter ikke kun sâdanne, som vides at være stærkt modtagelige for /9-lactamaser, men ogsâ sâdanne, som vides at hâve god grad af modstandsdygtighed i sig selv over for β-lactamaser. Sâdanne egnede β-lactam-antibiotika til anvendelse i disse præparater omfatter benzylpenicillin, phenoxy-30 methylpenicillin, carbenicillin, methicillin, propicillin, ampicil-lin, amoxycillin, epicillin, ticarcillin, cyclacillin, 6-aminope-nicillansyre, 7-aminocephalosporansyre, 7-aminodesacetoxycephalo-sporansyre, cephaloridin, cephalothin, cefazolin, cephalexin, cefo-xitin, cephacetril, cephamandol, cephapirin, cephradin, cephaloglycin

DK 157302 B

s og andre velkendte penicilliner og cephalosporiner eller "pro-drugs" dertil, fx hetacillin, metampicillin, acetoxymethyl-, pivaloyloxy-methyl- eller phthalidylesterne af benzylpenicîllin, ampicillin, amoxycillin eller cephaloglycin eller phenyl-, tolyl- eller indanyl-5 α-estere af carbenicillin eller ticarcillin.

Det er klart, at hvis den i præparatet værende penicillin eller ce-phalosporin Ikke er egnet til oral administration, skal præparatet tilpasses parentéral administration.

Nâr clavulansyren eller et sait deraf forekommer i et farmaceutisk 10 præparat sammen med et /8-lactam-antibiotikum, kan forholdet mellem clavulansyren eller et sait deraf og /S-lactam-antibiotiket være fx 20:1-1:12, især 10:1-1:10 og navnlig 3:1-1:3.

Den totale mængde antibakterielle midler i en hvilken som helst en-hedsdosisform vil normalt være mellem 50 og 1500 mg og vil sædvan-15 ligvis være mellem 100 og 1000 mg.

De nævnte præparater kan anvendes til behandling af infektioner i bl.a. luftvejene, urinvejene og blede væv bos mennesker.

Præparateme kan ogsâ anvendes til behandling af infektioner hos husdyr, fx til behandling a£ mastitis hos kvæg.

20 Penicillinen eller cephalosporinen i de nævnte synergistiske præparater vil normalt forekomme i op til eller næsten den mængde, som sædvanligvis anvendes, nar den pâgældende penicillin eller cepha-losporin er det eneste terapeutiske middel, som anvendes til behandling af infektionen.

25 Særlig foretrukne præparater indeholder 150-1000 mg amoxycillin, ampicillin eller et "pro-drug" dertil og 50-500 mg clavulansyre eller et sait deraf, især 200-500 mg amoxycillin, ampicillin, eller et "prodrug" dertil og 50-250 mg clavulansyre eller et sait deraf.

De stoffer, som forekommer i sâdanne præparater kan, om nodvendigt, 30 hydratiseres. Vægten af de i sâdanne præparater tilstedeværende an-

DK 157302 B

9 tibiotika udtrykkes pâ basis af det antibiotikum, som teoretisk er tilgængeligt 1 kompositionen, og ikke pâ basis af vægten af "pro-drug".

Estere af clavulansyre kan fremstilles ved, at clavulansyre eller et 5 sait deraf omdannes til en ester af clavulansyre pâ sædvanlig mâde.

Fremstilling af clavulansyre eller et sait deraf, som kan anvendes ved fremstilling af esterne ifelge opfindelsen, er beskrevet i dansk patent nr, 141.254.

Den urene form af clavulansyre eller et sait deraf, som anvendes som 10 udgangsmateriale til fremstilling af estere I, kan være i form af et fast stof eller en oplosning, som sædvanligvis ogsâ vil indeholde betydelige mængder organiske eller uorganiske urenheder.

Clavulansyren eller et sait deraf kan omdannes til en ester ved es-terificeringsreaktioner, som nedenfor beskrives. Den foretrukne me-15 tode til fremstilling af den onskede ester af clavulansyre er om- sætning af et sait af clavulansyre med et esterificeringsmiddel, fx et reaktivt halogenid eller en sulfonatester. Sâdanne reaktioner udfores hyppigt i et organisk oplosningsmiddel med hej dielektri-citetskonstant, fx dimethylformamid, dimethylformamid/acetone, di-20 methylsulfoxid, N-methylacetamid eller hexamethylphosphoramid.

Om onsket kan saltet af clavulansyre oploses i oplosningsmidler pâ sædvanlig mâde, eller det kan bindes til et polymerbærestof. Egnede bærestoffer til anvendelse ved denne fremgangsmâde er stærke base-anionbytterharpikser, især sâdanne, som har en makroretikulær natur, 25 som tillader anvendelsen af ikke-vandige oplosningsmiddelsystemer.

Det har vist sig, at "Amberlyst A26" er anvendelig til dette formâl. Clavulansyresaltet kan adsorberes pâ harpiksen fra kulturfiltratet, og harpiksen kan derefter suspenderes i dimethylformamid indeholdende natriumiodid, eller det kan elueres som en sojle med en oplosning af 30 natriumiodid i dimethylformamid eller i en blanding af dimethylformamid og acetone.

DK 157302 B

10 Nâr den urene ester er dannet, renses den normalt chromatografisk.

Ved sâdaime fremgangsmâder oploses esteren normale i et organisk oplesningsmiddel sâsom ethylacetat, methylenchlorid, chloroform eller cyclohexan. Den faste fase, som anvendes ved den chromatografiske 5 procès, er normalt et inert materiale sâsom silicagel eller chroma-tografisk lignende materialer.

De fraktioner, som fbrlader sojlen, kan undersoges for tilstedevæ-relse af clavulansyre ved at gore brug af dens synergistiske egen-skaber. Aktive fraktioner sammenhældes normalt, og det organiske 10 oplosningsmiddel afdampes under reduceret tryk.

Den ester, som fâs ved denne fremgangsmâde, er sædvanligvis af ac-ceptabel renhed, men materialet kan, om onsket, genchromatograferes.

Egnede metoder til esterdannelse omfatter

a) omsætning af et sait af clavulansyre med en forbindelse med den 15 almene formel Q - R, hvor Q betegner en let udskiftelig gruppe, og R

har den ovenfor anforte betydning; b) omsætning af clavulansyre med diazoalkan, og c) omsætning af clavulansyre med en alkohol ROH i nærværelse af et kondensationsfremmende middel sâsom carbodiimid.

20 Egnede salte af clavulansyre, som kan omsættes med forbindelser R-Q, er fx alkalimetalsalte sâsom natrium- eller kaliumsalte eller andre sædvanlige salte, fx solvsaltet.

Egnede grupper Q omfatter sâdanne atomer eller grupper, som vides at være udskiftelige med carboxylatanioner, og omfatter chlor-, brom- og 25 iodatomer, sulfonsyreestere sâsom OSO2CH3- eller OSO2C6H4CH3-grupper, aktive estergrupper sâsom 0C0H- eller OCOCF3-grupper og andre sædvanlige grupper, som kan udskiftes med nucleofile grupper.

Den ovenfor anforte reaktion udfores normalt i et organisk oplos-ningsmiddel med relativt hoj dielektricitetskonstant sâsom dimethyl-30 formamid, acetone, dioxan eller tetrahydrofuran og ved ikke-ekstreme temperaturer, fx mellem -5 og +100°C, sædvanligvis mellem +5 og +30°C, fx ved stuetemperatur.

U

DK 1 b 7302 B

Omsætningen af clavulansyre med en diazoforbindelse er en mild fremgangsmâde til fremstilling af alkyl- eller aralkylestere eller lignende estere. Diazoteringsreaktionen kan udfores under sædvanlige reaktionsbetingelser, fx ved ikke-ekstreme temperaturer og i et 5 sædvanligt oplesningsmiddel. Sâdanne reaktioner udfores normalt ved en temperatur mellem -5 og +100°C, især mellem +5 og +30°C, fx ved stuetemperatur. Egnede oplesningsmidler til denne reaktion omfatter lavere alkanoler sâsom methanol og éthanol og oplosningsmidler sâsom tetrahydrofuran eller dioxan. Ethanol har vist sig at være et særligt 10 anvendeligt oplesningsmiddel ved denne omsætning.

Omsætningen mellem clavulansyre og en alkohol i nærværelse af et kondensationsfremmende middel finder normalt sted i et inert organisk oplosningsmiddel med relativt hej dielektricitetskonstant, fx ace-tonitril. Reaktionen udfores sædvanligvis ved stuetemperatur eller 15 sænket temperatur, fx ved en temperatur mellem -10 og +22°C, især mellem -5 og +18°C, fx i starten ved 0°C og derefter under gradvis opvarmning til ca. 15°C. Det anvendte kondensationsfremmende middel er normalt et middel, som fjerner vand fra reaktionsblandingen. Egnede midler er fx carbodiimider, carbodiimidazoler eller ækvivalente 20 reagenser. Dicyclohexylcarbodiimid har vist sig at være et særlig velegnet kondensationsfremmende middel til anvendelse ved denne fremgangsmâde. For at undertrykke clavulansyrens indre kondensation udfores denne omsætning normalt i nærværelse af et betydeligt over-skud af alkoholen.

25 Estere af clavulansyre og deres anvendelse som mellemprodukter be- lyses nærmere ved nedenstâende eksempler 1-11, fremstilling af nogle estere belyses nærmere ved eksempel 12-18, og nogle ved anvendelse af estere med formlen I som mellemprodukt fremstillede syrers og saltes antibakterielle/synergistiske virkning beskrives i eksempel 19-21.

30 Metoder til pâvisning af antibakteriel og synergistisk virkning er beskrevet i dansk patentskrift nr. 141.254.

Fremstilling af clavulansyre-natriumsait.

Eksempel 1.

12

DK 157302 B

ÎHOH . yCü0OE

rfy=/2 - r-rw 2

<T N 0^~NV

\ ° \ COOCH«CcHc COONa 2 6 5 5 281 mg i det væsentlige rent benzylclavulanat i 25 ml éthanol indeholdende 82 mg natriumhydrogencarbonat hydrogeneres over 90 mg 10%'s palladium/kul i 25 minutter ved stuetemperatur og under atmosfæretryk. Katalysatoren frafiltreres og vaskes med vand og éthanol, og de samlede filtrater inddampes under reduceret tryk ved 10 stuetemperatur. Det som remanens vundne halvfaste stof tritureres med acetone, filtreras og vaskes med ether, hvorved der fâs 135 mg natr iumclavulanat.

Eksempel 2.

Hydrolyse af clavulansyre-méthyléster til dannelse af clavulansyre.

15 2,17 mg clavulansyreester oploses i 0,1 ml methanol og behandles med 0,208 ml 0,G482N natriumhydroxidoplosning. Efter 1 time ved stuetemperatur indeholder reaktionsblandingen adskillige produkter. Tyndtlagschromatografisk analyse viser, at en af de overvejende kom-ponenter har en Rf-værdi, som er identisk ved værdien for natri-20 traisaltet af clavulansyre; farvereaktioner og biologisk undersagelse er i overensstemmelse med dette stof, som er natriumsaltet af clavulansyre.

Langsom omdannelse af esteren til clavulansyre ses, nâr 1 mg/ml af forbindelsen inkuberes ved 37°C i 0,05M phosphatpuffer ved pH-værdi 13

DK 15 7302 B

7. Reaktionen felges af papirchromatografi (bioautografisk System).

Under anvendelse af butanol/ethanol/vandsystemet til at folge reaktionen over en période pâ 2 timer, aftager methylesterzonen ved en Rf-værdi pâ 0,79 i storrelse, medens zonen for clavulansyre ved Rf-5 værdi 0,12 stiger.

Eksempel 3.

Fremstilling af clavulansyre.

100 mg benzylclavulanat i 5 ml éthanol hydrogeneres over 30 mg 10%'s palladium/kul i 45 minutter ved stuetemperatur og atmosfæretryk. Ka-10 talysatoren frafiltreres og vaskes med éthanol, og de samlede fil- trater inddampes i vakuum, hvorved der fâs 58 mg clavulansyre i form af en ustabil, viskos olie.

NMR-spektrum (C5D5N): 3,05 (d, 1, J = 18 Hz), 3,60 (dd, 1, - 18

Hz, J2 = 2,5 Hz), 4,75 (d, 2, J = 7,5 Hz), 5,58 (t, 1, J - 7,5 Hz), 15 5,66 (S, 1), 6,0 8 (d, 1, J - 2,5 Hz).

Eksempel 4.

Fremstilling af natriumclavulanat.

840 mg benzylclavulanat i 30 ml éthanol og 5 ml vand hydrogeneres over 267 mg 10%'s palladium/kul og 244 mg natriumhydrogencarbonat i 20 25 minutter ved stuetemperatur og atmosfæretryk. Katalysatoren frafiltreres og vaskes med vand og éthanol, og de samlede filtrater inddampes i vakuum. Produktet omkrystalliseres af en vand-acetone-blanding i form af 565 mikronâle. Ved omkrystallisation af vand-acetone fâs nâle, som efter terring over P2®5 *· vakuum i 24 timer 25 viser nedenstâende analyse: C 41,01, 40,86; H 3,77, 3,64; N 5,68, 5,51.

IR-spektrum (KBr-skive): 1785, 1700 og 1620 cnT^-.

DK 157302 B

14 NMR-spektrum (D20>: 3,06, (d, 1, J — 18,5 Hz), 3,57 (dd, 1, J - 18,5 Hz, J2 « 2,5 Hz), 4,15 (d, 2, J = 8 Hz), 5,3 (HOD), 4,9 (m), 5,71 (d, 1, J = 2,5 Hz).

Eksempel 5.

5 Fremstilling af lithiumsalt af clavulansyre.

En opl0sning af 0,84 g benzylclavulanat i 30 ml éthanol blandes med en oplasning af lithiumhydrogencarbonat (fremstillet som nedenfor beskrevet) i 5 ml vand. Denne oplasning hydrogeneres over 0,27 g 10%'s palladium/kul i 25 minutter ved stuetemperatur (~20°C), hvor-10 efter der ifelge tyndtlagschromatografi (Si02-ethylacetat:KMn04- spray) ikke kan pâvises udgangsmateriale. Katalysatoren frafiltreres og vaskes med 5 ml vand og 5 ml éthanol, og de samlede filtrater inddamoes trader- reduceret. tryk. Den krystallinske remanens tritureres med 25 ml acetone, og det faste stof frafiltreres, vaskes med 10 ml 15 acetone og terres over P2Û5, hvorved der fis 0,41 g produkt.

Produktet optages i 3 ml vand, og der tilsættes langsomt acetone, indtil krystallisation begynder. Efter afkeling i 20 minutter til 2 - 3°C kan der ved filtrering fâs et krystaludbytte, som vaskes med. en lille mængde acetone og terres i vakuum (80 mg). Filtratet 20 fortyndes med et lige sâ stort rumfang acetone og afkeles igen, hvorved der fâs yderligere 80 mg udbytte.

Analyse: ferste udbytte = 84,3% rent lithiumclavulanat andet udbytte = 85,1% rent lithiumclavulanat.

(Lithiumhydrogencarbonatoplesningen fremstilles ved at suspendere 25 14 g lithiumcarbonat i 480 ml vand ved 5 - 10eC og lede en konstant strem af carbondioxidgas gennem suspensionen i 8 timer, hvorefter der er darmet en klar oplasning. Oplasningens volumen fyldes op til 500,0 ml med vand, der er mættet med C02. Denne oplesning indeholder der-efter 5,15 vægt/volumenprocent LiHCOj).

Fremstilling af kaliumsalt af clavulansyre.

Eksempel 6.

15

DK 157302 B

En oplosning af 2,89 g benzylclavulanat (med god renhed) i 100 ml éthanol og 17 ml vand hydrogeneres ved stuetemperatur og atmos-5 færetryk over 0,92 g 10%'s palladiseret kul (Engelhard 4505) 1 nærværelse af 1,0 g fint formalet kaliumhydrogencarbonat. Efter 30 minutters forlob viser tyndtlagschromatografi kun spor af tilba-geværende benzylester.

Katalysatoren fjernes ved filtrering og vaskes med 10 ml vand og 10 10 ml éthanol. De samlede filtrater og vaskevæsker (som er neutrale, ~ pH-værdi 7) inddampes under reduceret tryk ved stuetemperatur, hvorved der fâs en lysegul sirup. Denne oploses i 17 ml vand og fortyndes med 450 ml acetone. Den uklare blanding filtreres gennem kiselgur, og filtratet fortyndes til 1,0 liter med acetone. Forbin-15 delsen krystalliserer, og efter 30 minutter ved stuetemperatur iso-leres den ved filtrering, vaskes med 50 ml acetone og terres i va-kuum, hvorved der fâs 0,75 g af det enskede kaliumclavulanat i form af et farvelost krystallinsk fast stof, som er 98,5% rent kaliumclavulanat -anhydrat (indeholdende ca. 0,2 - 0,3% vand).

20 Eksempel 7.

Trimethylammoniumclavulanat.

En trimethylammoniumhydrogencarbonatoplosning fremstilles ved at oplese 5 g trimethylamin i 50 ml iskoldt vand og lede CO2 gennem oplosningen i en hurtig strem, indtil pH-værdien i oplesningen er ca.

25 8,5. Denne oplesning analyseres ved titrering med 1,0M saltsyre under anvendelse af sereened methylorange som indikator og viser sig at være 0,4M.

Til en oplesning af 2,89 g benzylclavulanat i 100 ml éthanol sættes 0,9 g 10%'s palladiseret kul og 25 ml 0,4M trimethylammonium-30 hydrogencarbonat. Blandingen hydrogeneres i 30 minutter ved stue-

DK 157302 B

16 temperatur og atmosfæretryk; tyndtlagschromatografi viser, at der ikke er udgangsmateriale tilbage. Katalysatoren fjernes ved filtre-ring og vaskes med 30 ml éthanol og 10 ml vand. Filtratet inddampes i vakuum, hvorved der fâs en brun olie. Olîen tritureres med 50 ml 5 acetone, hvorefter den krystalliserer. Krystallerne isoleres ved filtrering, vaskes med 10 ml acetone og 10 ml ether og terres i vakuum, hvorved der fâs 0,84 g lysebrunt trimethylammoniumclavulanat.

Analyse (ved hejtryksvæskechromatografi) viser 68,7% som fri syre; 89,1% som trimethylammoniumclavulanat.

10 IR-Spektrum (KBr): υ = 3320 (bred, med skarp snids), 1775, 1690 og 1590 - 1620 cm-1 (bred).

Intet deoxy synligt i NMR-Spektret.

Eksempel 8.

Fremstilling af aluminiumclavulanat.- 15 En oplesning af 2,89 g benzylclavulanat og 0,68 g aluminiumiso- propoxid i 150 ml tort, gendestilleret tetrahydrofuran hydrogeneres over 0,86 g 10%'s palladiseret kul i 40 minutter (tyndtlagschromatografi viser intet ureageret benzylclavulanat efter dette tidsrum). Katalysatoren frafiltreres og vaskes med 20 ml tetra-20 hydrofuran, og filtratet inddampes til terhed i vakuum. Den faste remanens tritureres med 100 ml acetone, og det resulterende faste stof frafiltreres og terres i exsiccator over phosphorpentoxid. Aluminiumsaltet fâs pâ denne mâde i form af 0,3 g hvidt fast stof.

Analyse ved hejtryksvæskechromatografi viser 48% clavulanat; 25 aluminiumindholdet ifelge EDTA-titrering er 5,76%; Karl Fischer-bestemmelse viser 5,4% H2O.

IR-Spektrum (KBr): umax = 1790, 1695 og 1615 cm"·1-.

Eksempel 9.

17

DK 157302 B

Magnes iumclavulanat.

En oplesning af 4,34 g benzylclavulanat og 1,61 g magnesiumacetat-tetrahydrat i 100 ml éthanol hydrogeneres over 1,45 g 10%'s pal-5 ladiseret kul, indtil der ikke yderligere optages hydrogen (ca. 20 minutter). Pâ dette tidspunkt viser tyndtlagschromatografi intet ikke-omsat benzylclavulanat. Katalysatoren fjernes ved filtrering og vaskes med 30 ml éthanol og 10 ml vand. Filtratet inddampes i vakuum, hvorved der fâs 5,2 g lysegul gummi indeholdende noget oplosnings-10 middel. Denne tritureres med 50 ml acetone, og det resulterende faste stof frafiltreres, vaskes med 5 ml acetone og lufttarres, hvorved der fâs 2,4 g farvelest fast stof. Hejtryksvæskechromato-graf i-undersoge1se viser 75% rent magnesiumsalt.

Eksempel 10.

15 Fremstilling af ammoniumclavulanat.

4,34 g benzylclavulanat i 50 ml éthanol behandles med 1,155 g ammoniumacetat (1 ækvivalent) i 50 ml éthanol og hydrogeneres over 1,4 g 10%'s palladium/kul i 10 minutter. Katalysatoren frafiltreres, og oplosningsmidlet fjernes i vakuum, hvorved der fâs et halvfast 20 stof. Remanensen oplases i 5 ml vand og behandles med 75 ml acetone.

Den overstàende væske dekanteres fra den oprindeligt dannede olie og ÿ stilles til side, hvorved der fâs 0,348 g nâle. Hojtryksvæskechroma-tografi-undersogelse viser, at ammoniumclavulanatindholdet er 97,4%.

Karl Fischer-analyse viser 0,44% vand.

25 IR-Spektrum (KBr): rmax = 1785, 1700 og 1595 .cm-^.

Fremstilling af krystallinsk kaliumclavulanat.

Eksempel 11.

18

DK 157302 B

En opiosning af 2,89 g benzylclavulanat i 100 ml éthanol indeholdende 1,0 g kaliumhydrogencarbonat hydrogeneres over 0,93 g 10%'s palla-5 dïum/kul i 25 minutter ved stuetemperatur og atmosfæretryk. Pâ dette tidspunkt viser tyndtlagschromatografi intet ikke-reduceret benzylclavulanat. Katalysatoren fjernes ved filtrering og vaskes med 10 ml éthanol og derefter med 150 ml vand. Filtratet inddampes til et halvfast stof under reduceret tryk pâ rotationsfordamper. Til denne 10 remanens sættes 800 ml acetone. Efter omroring fâs krystaller. Det krystallinske produkt frafiltreres, vaskes med 20 ml ether og terres i vakuum, hvorved der fâs 1,75 g krystallinsk kaliumclavulanat.

Analyse (ved hejtryksvæskechromatografi): 89,1 vægt/vægtprocent i form af kaliumclavulanat.

15 NMR- og IR-Spektrer: I det væsentlige de samme som for tidligere fremstillet rent krystallinsk kaliumclavulanat). (NMR-Spektret viser forekomst af <3% deoxy, <0,5% acetone).

Eksempel 12.

Fremstilling af en ester af clavulansyre (methylester).

20

^ ,CH OH . CH20H

_/ ΕΗ8Χ , Γ~^ /~BS/ \ 0 v COONa ' cooch3 19,8 mg af natriumsaltet af clavulansyre opleses i 0,5 ml tert dimethylformarnid og behandles med 0,25 ml methyliodid. Efter henstand ved stuetemperatur i 1 1/2 time under vandfrie betingelser fjernes

DK 157302 B

19 oplosningsmidlerne i vakuum. Remanensen renses ved P.L.C. pâ silicagel (Kieselgel 60F254, markedsfort af E.Merck, Darmstadt,

Vesttyskland) og eluering med ethylacetat, hvorved der fâs clavu-lansyre-methylester i form af en farvelos olie (Rf-vardi 0,38; rod 5 farve med triphenyltetrazoliumchloridspray), og olien har neden-stâende egenskaber:

Analyse:

Beregnet for CgH^NOg: C 50,70 H 5,20 N 6,57 Fundet: C 50,49 H 5,43 N 6,29.

10 UV-spektrum (methanol: Amax: ingen absorption >215 nm; IR-spektrum: umax (film): 3300 - 3600 (bredt), 1800, 1750, 1695 cm'-*-.

Tilnærmet forste ordens NMR-spektrum (CDCI3): 2,49 (bred S, 1, udskiftet med D2O), 3,05 (d, 1, J = 17,5 Hz), 3,54 (dd, 1, J = 17,5 Hz,, J2 = 2,5 Hz), 3,84 15 (S,3) 4,24 (d, 2, J = 7 Hz), 4,93 (dt, 1, J = 7 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,07 (d, 1, J » 1,5 Hz), 5,72 (d, 1, J = 2,5 Hz).

Molekylvægt (massespektrum): 213,0635.

Beregnet for C9H1JNO5: 213,0637.

20 Tyndtlagschromatografi pâ methylesteren viser en enkelt zone i hver af de nedenstàende oplosningsmiddelsystemer: butanol/ethanol/vand i volumen/volumen-forholdet 4:1:5, topfase Rf-vardi 0,75; isoprop-anol/vand i volumen/volumen-forholdet 7:3, Rf-vardi 0,95; ethyl-acetat/ethylalkohol i volumen/volumen-forholdet 8:2, Rf-vardi 0,87.

25 Disse zoner bestemmes ved bioautografi under anvendelse af

Klebsiella aerogenes med tilsat benzylpenicillin (synergismesystem).

Fremstilling af en ester af clavulansyre (benzylester).

20

DK 157302 B

Eksempel 13.

CH-OH

z ch2oh I-Κ°Υ^Β

J—n—L * ___I

<f COONa / TOOCH0-Ph 5 Ur ent 3 - (/5-hydroxyethyl idin) - 7 - oxo - 4 - oxa -1 - azab icyc lo [ 3,2,0 ] hep tan-2-carboxylsyre-natriumsalt (antages at være ca. 55 mg rent stof) i 0,64 ml tort dimethylformamid behandles med 0,18 ml benzylbromid. Oplos-ningen holdes ved stuetemperatur (ca. 17 - 18°C) i 3 timer under vandfrie betingelser. Reaktionsblandingen fraktioneres pà silicagel 10 og elueres med ethylacetat, hvorved der fâs 63 mg af en i det væ-sentlige ren form af benzylesteren af 3-(/î-hydroxyethylxdin)-7-oxo- 4-oxa-l-azabicyclo[3,2,0]heptan-2-carboxylsyre i form af en farvelos olie.

IR-spektrum (film): 1800, 1745 og 1695 cm"^·; 15 NMR-spektrum (CDCI3): 2,25 (s, 1, udskiftelig med D2O), 3,05 (d, 1, J = 17 Hz), 3,51 (dd, 1, J - 17 Hz, J2 = 2,5 Hz), 4,24 (d, 2, J = 7,5 Hz), 4,92 (dt, 1, J = 7,5 Hz, J2 - 1,5 Hz), 5,15 (d, 1, J = 1,5 Hz), 5,24 (s, 2), 5,71 (d, 1, J = 2,5 Hz), 7,45 S (s, 5).

Eksempel 14.

20 Fremstilling af benzylesteren af clavulansyre ud fra râekstrakter af kulturfiltratet fra Streptomyces clavuligerus.

1. Dyrkning af Streptomyces clavuligerus.

DK 157302 B

21

En "Yeatex"/glucose-stam-agarskrâkultur anvendes til at pode en "yeatex"/glucose-agarskrâkultur i en Roux-flaske ved fremstilling af en mycelium/sporesuspension i sterilt vand. Roux-flaskens's skrâ-kultur inkuberes ved 26°C i 10 dage. Til denne skrâkultur sættes 100 5 ml sterilt vand, og en myceliesuspension fremstilles. Denne anvendes til at pode 50 liter dampsteriliseret kimmedium œed nedenstâende sammensætning i ledningsvand: "Oxoid" maltekstrakt 1 vægt/volumenprocent "Oxoid" bakteriologisk pepton 1 vægt/volumenprocent 10 Glycerol 1 vægt/volumenprocent 10% "Pluronic L81" antiskum- middel i sojabonneolie 0,05 vægt/volumenprocent.

"Pluronic" markedsfores af Jacobs and Van den Berg UK Ltd., 231 The Vale, London, W3, og indeholder en polypropylen-polyethylen blok-15 polymer, og soj abonneolie markedsfores af British Oil and Cake Mills Ltd., Stoneferry Road, Hull, Storbritannien).

Mediet er i en 90 liters rustfri stâlfermenteringsbeholder med prelplader og omrores af en 12,5 cm vingeskîverotor ved 240 omdrejninger/minut. Der ledes steril luft ind med en hastighed pâ 50 20 liter/minut, og tanken inkuberes ved 26°C.

Efter 72 timers forlob anvendes kimfermentet til at pode 150 liter af samme medium under anvendelse af en 5 volumen/volumenprocents tilsætning ved en steril overforsel. Dette pxoduktionstrinsmedium er i en 30 liters rustfri stâlfermenteringsbeholder, helt forsynet med 25 prelplader, og omrort af en 21,6 cm's vingeskîverotor med 210 omdrejninger/minut. Steril luft indblæses i en mængde pâ 150 liter/ minut. Fermenteringen bibeholdes ved 26°C. Der tilsættes, nâr det er nodvendigt, antiskummiddel i 10 ml's portioner (10% "Pluronic L81" i sojabonneolie). Med regelmæssige mellemrum udtages prover til 30 bestemmelse af ^-lactamase-irihibering. Det fermenterende stof hostes mellem 4. og 5. dag pâ det optimale niveau for β-lactamase-inhiberende virkning, og resultaterne er anfort i tabel II.

Tabel II.

22

DK 1 57302 B

β-Lactamase-inhiberende virkning i prover af kulturfiltrat udtaget fra en 300-liters fermenteringsbeholder med Streptomyces clavuligerus.

5 Fermenteringstid % irihibering ved ^-lactamase-inhiberings (dage) forsog i en endelig fortynding pâ 1/2500 1,0 12 1.5 20 10 2,0 31 2.5 36 3.0 50 3.5 54 4.0 51 15 4,5 56 5.0 55.

2) 20 liter kulturfiltrat freinstillet som beskrevet ovenfor inddampes 20 under vakuum til 5 liter under anvendelse af en "opstigende film"- inddamper. Koncentratet frysetorres under anvendelse af en "Edwards E.F.6" skalfryseterrer fremstillet af Edwards High Vacuum Ltd. 300 g af det sâledes fremstillede faste stof indeholder 3 g natrium-clavulansyre som bestemt ved enzymirihiberingsforsoget. Det faste stof 25 suspenderes i 900 ml tort dimethylformamid, og der tilsættes 150 ml benzylbromid. Blandingen omrores i 2 timer ved stuetemperatur og fortyndes derefter med 1 liter ethylacetat. Reaktionsblandingen filtreres, og filtratet inddampes til mindst muligt rumfang. Den olieagtige remanens ekstraheres med yderligere 1 liter ethylacetat, 30 og ekstrakten filtreres. Filtratet koncentreres igen, og den re-sulterende olieagtige remanens hældes pâ en 7,62 cm x 35,56 cm silicagelsojle ("Biogel Biosil A" 100 mesh) i cyclohexan. Sojlen elueres med cyclohexan til fjernelse af benzylbromid, og oplos-ningsmidlet ændres derefter til ethylacetat, og der opsamles 35 fraktioner pâ 20 ml. Fraktionerne undersoges for tilstedeværelse af benzylesteren af clavulansyre ved at sætte dem pletvis pâ glasbârne

DK 157302 B

23 silicageltyndtlagschromatografiplader (Merck precoated silicagel 60 F 254) og pàsprojtning af 2,3,5-triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) sprayreagens. Fraktioner, som viser intense rade pletter med dette reagens, undersoges yderligere ved tyndtlagschromatografi pâ si-5 licagelplader under anvendelse af chlorof orm-ethylacetat i forholdet 8:2 som oplosningsmiddel og ved at sprejte de fremkaldte plader med TTC-spray. Benzylesteren af clavulansyre lober med en Rf-værdi pâ 0,31 ved 22°C. Fraktioner indeholdende denne ester sammenhældes og koncentreres til 15 ml, og denne oplosning chromatograferes yder-10 ligere pâ en 3,81 cm x 40,64 cm silicagelsojle (Merck silicagel H, type 60) med chloroform/ethylacetat 8:2 som oplosningsmiddel. Der opsamles fraktioner pâ 15 ml, og de undersoges for benzylester pâ den ovenfor beskrevne mâde. De fraktioner, som indeholder esteren, koncentreres til 8 ml og renses endelig ved sojlechromatografi pâ en 15 2,54 cm x 40,64 cm silicagelsojle (Merck silicagel H, type 60) med ethylacetat/cyclohexan i forholdet 8:2 som oplosningsmiddel. Udvalgte fraktioner sammenhældes og inddampes under vakuum, hvorved der fâs 160 mg af den rene benzylester i form af en olie.

Eksempel 15.

20 Fremstilling af clavulansyre-benzylester..

150 liter kulturfiltrat med pH-værdi 7,0 indeholder 16,2 g clavulansyre (natriumsalt) ifelge enzyminhiberingsforsog. Dette filtrat omrares med 5 kg "Amberlyst A.26"-anionbytterharpiks i Cl'-form (Rohm & Hass Company, Philadelphia, U.S.A) il time ved stuetemperatur.

25 Harpiksen filtreres derefter, og filtratet underseges igen, hvorved det ses, at 6,4 g clavulansyre er fjerneït. Harpiksen vaskes med 20 liter deioniseret vand efterfulgt af 20 liter acetone og 10 liter dimethylformamid. Efter genfiltrering suspenderes harpiksen i 2,3 liter dimethylformamid/0,2M natriumiodid.. Til dette sættes 200 ml 30 benzylbromid, og suspensionen omrores grundigt. Efter henstand ved stuetemperatur i 16 timer tilsættes 2 liter ethylacetat, hvorefter harpiksen filtreres, og yderligere ethylacetatvaskevæsker fra harpiksen sammenhældes med filtratet. Ekstrakten inddampes til et lille rumfang og chromatograferes pâ en 7,62 cm x 45,72 cm sili-

DK 157302 B

24 cagelsojle (Merck silicagel H type 60) med ethylacetat/ cyclohexan i forholdet 8:2 som oplesningsmiddel. Fraktioner indeholdende benz-ylclavulanat udvælges ved pletprover pâ silicageltyndtlagschro-matografiplader og pâsprcj tning med TTC-reagens som beskrevet i 5 eksempel 24. De udvalgte fraktioner inddampes til 20 ml og chro- matograferes derefter pâ en 3,81 cm x 45,72 cm silicagelsojle (Merck silicagel H type 60) med chloroform/ethylacetat i forholdet 8:2 som oplosningsmiddel. Udvalgte fraktioner sammehhældes og inddampes, hvorved der fâs 440 mg af en farveles olie, som ifolge NMR-spek-10 troskopi er 90% benzylclavulanat.

Eksempel 16.

Fremstilling af methylclavulanat.

130 mg clavulansyre i 10 ml éthanol behandles med en overskydende mængde diazomethan i ether. Efter 2 minutter ved stuetemperatur vises 15 reaktionen ved hjælp af tyndtlagschromatografi at være fuldstændig. Oplosningen inddampes i vakuum, og remanensen renses ved chroma-tografi pâ silicagel og elueres med ethylacetat. Fraktioneme indeholdende methylclavulanat sammenhældes og inddampes, hvorved der fâs 104 mg af en klar olie.

20 Eksempel 17.

Fremstilling af methylclavulanat.

200 mg clavulansyre i 5 ml acetonitril afkeles og omreres ved 0°C.

0,5 ml methanol og derefter 206 mg dicyclohexylcarbodiimid tilsættes, og reaktionsblandingen omrores ved stuetemperatur natten over.

25 Suspensionen filtreres, og filtratet inddampes i vakuum, hvorved der fâs rât methylclavulanat. Râproduktet renses ved chromatografi pâ silicagel bg elueres med ethylacetat, hvorved der fâs 140 mg af en klar olie.

Eksempel 18.

Fremstilling af phenylclavulanat.

25

DK 157302 B

100 mg clavulansyre i 5 ml acetonitril afkeles og omrores ved 0°C.

Til oplesningen sættes 0,94 g phénol og 100 mg dicyclohexylcar-5 bodiimid, og reaktionsblandingen omrores ved stuetemperatur natten over. Suspensionen filtreres, og filtratet inddampes. Remanensen fraktioneres pâ silicagel og elueres med ethylacetat-hexan i forhol-det 1:1, hvorved der fâs 70 mg phenylclavulanat.

IR-spektrum (film): 1800, 1770 og 1690 cm" 10 NMR-spektrum (CDC13): 2,18 (bred s, 1), 3,06 (dd, 1, J = 17 Hz, J2 = 0,9 Hz), 3,54 (dd, 1, Ji = 17 Hz, J2 = 2,6 Hz), 4,29 ( d, 2, J = 7,5 Hz), 5,1 (dt, 1, = 7,5 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,29 (d, 1, J - 1,5 Hz), 5,76 (dd, 1, = 2,6 Hz, J2 = 0,9 Hz), 7,35 δ (m, 5).

Molvægt (massespektrometri) = 275,0777, îhvilket svarer til Cj.4Hj.3NO5 15 (beregnet 275,0794).

Eksempel 19.

Antibakterielt spektrum for clavulansyre-natriumsalt.

Den antibakterielle virkning af clavulansyre-natriumsalt mod en række bakterier bestemmes under anvendelse af mikrotitermetoden. Serie-20 fortyndinger af clavulansyre-natriumsaltet i "Oxoid"-sensitivi-tetsforsogsvæske i en mikrotiter plastbakke podes med en dyrk-ningskultur, der har stâet natten over, af hver organisme, sàledes at den endelige fortynding af inokulet er <0,5 x 10"^. Kulturerne inku-beres natten over, og punkterne med bakterievækst bestemmes næste 25 morgen ved at observere kulturens uklarhed. Resultaterne, udtrykt som tilnærmelsesvise MIC-værdier (minimum ihhiberingskoncentration /ig/ml) er anfert i nedenstâende tabel I, som viser, at forbindelsen har bredspektret antibakteriel virkning.

Tabel I.

26

DK 157302 B

Antibakterielt spektrum for clavulansyre-natriumsalt.

Bakteriestammer Minimum irihiberings- koncentration /ig/ml 5 _

Staphylococcus aureus (Oxford H) 7,5

Staphylococcus aureus (Russell) 7,5

Bacillus subtilis 62

Streptococcus faecalis >500 10 Streptococcus pyogenes CN 10 125

Escherichia coli NCTG 10418 31

Klebsiella aerogenes 31 - 62

Klebsiella oxytocum 62

Enterobacter aerogenes T 624 31 15 Enterobacter cloacae 62

Acinetobacter anitratus 125

Providentia stuartii 125

Serratia marcescens 125

Proteus mirabilis C977 62 20 Proteus vulgaris W090 31

Salmonella typhimurium 31

Shigella sonnei 62

Pseudomonas aeruginosa A 500 25 Eksempel 20.

Eksempler pâ β-lactamase-inhibering med clavulansyre-natriumsalt.

Clavulansyre inhiberer progressivt og irreversibelt /J-lactamasen hos Escherichia coli. Den tidligere i "Beskrivelse 1" beskrevne metode viser, at de andre, i tabel II viste j9-lactamaser, ogsâ inhiberes af 30 clavulansyre.

Inhibering af /3-lactamaser med clavulansyre.

27

DK 157302 B

Tabel II.

Kilde til /î-lactamase Tilnærmelsesvis Iejg- -værdi i forhold 5 til Escherichia coli JT 4 - 1

Staphylococcus aureus (Russell) 1,0

Escherichia coli JT4 1,0 10 Escherichia coli Bll 2,0

Klebsiella aerogenes A 0,6

Pseudomonas aeruginosa 1822 (R faktor) 5,0

Pseudomonas dalgleish 0,1 15 Med penicillin G som substrat er Igg-værdien for clavulansyre- natriumsaltet imod ^-lactamasen for Staphylococcus aureus (Russell) ca. 0,06 pg/ml.

Eksempel 21.

Antibakteriel synergisme mellem ampicillin og clavulansyre-20 natriumsalt.

Den minimale inhiberingskoncentration (MIC-værdi) for ampicillin, clavulansyre-natriumsalt og ampicillin 1 tilstedeværelse af 1 /zg/ml clavulansyre-natriumsalt bestemmes for en række β-lactamase-produ-cerende bakterier. Organismerne podes i "Oxoid" sentivitetstests-25 dyrkningsvæske anbragt i smâ skakter i en plastbakke og indeholdende forskellige koncentrationsgradienter af ampicillin, clavulansyre-natriumsalt eller ampicillin plus 1 pg/ml clavulansyre-natriumsalt (mikrotitermetode). Den endelige fortynding af inokulet i dyrk-

O

ningsvæsken, dyrket natten over, er 0,5 x 10. Bakken inkuberes ved

DK 157302 B

28 37 °C natten over, og næste morgen bestemmes endepunkteme for bakterievæksten. MIG-værdierne i /ig/ml er anfert i tabel V, hvoraf det fremgâr, at synergisten ved den lave koncentration pâ 1 jtg/ml pâ afgorende mâde forbedrer den antibakterielle virkning af ampicillin 5 mod visse grampositive og gramnegative bakterier. Mekanismen i denne synergisme antages at bestâ i inhibering af ampicillin-nedbrydende β-lactamase-enzymer, men eksistensen af andre mekanismer kan ikke ude-lukkes.

Der fâs lignende resultater som dem, som vises i tabel III, nâr 10 ampicillin erstattes med amoxycillin eller med phthalidylesteren af ampicillin.

Tabel III.

Antibakteriel synergisme mellem ampicillin og clavulansyre-natriumsalt 15 Bakteriestamme Minimal inhiberingskoncentration /tg/ml

Clavulansyre- Ampicillin Ampicillin i natriumsalt tilstedeværelse af 1 /zg/ml 20 clavulansyre- natriumsalt

Escherichia coli NCTC 10481 31 1,8 <0,4 25 Escherichia coli B 11 62 >500 125

Klebsiella aerogenes A 31 125 <0,4

Klebsiella sp 62 31 125 <0,4

Enterobacter cloacae 62 250 62

Serratia marcescens 125 >500 62 30 Staphylococcus aureus (Russell) 15 500 <0,4

Staphylococcus aureus 62 250 7,5 (en methicillinresistent stamme) 35 Antibakteriel synergisme mellem cephaloridin og clavulansyre-natriumsalt.

DK 157302 B

29

Den minimale inhiberingskoncentration af cephaloridin, clavulansyre-natriumsalt og cephaloridin i nærværelse af 5 μg/ml clavulansyre-natriumsalt bestemmes pâ den ovenfor beskrevne mâde. Resultaterne er anfart i tabel IV og viser, at der kan opnâs synergisme mellem 5 clavulansyre-natriumsalt og cephaloridin, især for den /9-lactamase-producerende stamme af Staphylococcus aureus (Russell).

Tabel IV.

Antibakteriel synergisme mellem cephaloridin og clavulansyre-natriumsalt.

10 Bakteriestamme Minimal inhiberingskoncentration μg/ml

Clavulansyre- Cephaloridin Cephaloridin i natriumsalt nærværelse af 5

Mg/ml 15 clavulansyre- natriumsalt

Proteus mirabilis 889 >500* 62 7,5 20 Staphylococcus aureus (Russell) 15 3,1 <0,03+

Staphylococcus aureus (en methicillinresi- 62 15 3,7 stent stamme) 25 _ * "Tailing point" + Samme værdi opnâet, nâr synergisten tilsættes med 1 ^g/ml i stedet for 5 ^g/ml.

Antibakteriel synergisme mellem clavulansyre-natriumsalt og 30 forskellige penicilliner.

De i tabel V viste resultater er opnâet med den ovenfor beskrevne metode.

Claims (5)

15 PATENTKRAV

1. Estere af clavulansyre til anvendelse som mellemprodukter ved fremstilling af clavulansyre eller farmaceutisk tolerable salte deraf, kendetegnet ved, at de har den almene formel I 20 CH20H /λ COOR hvor R betegner en carbonhydridgruppe med hejst 16 carbonatomer, som eventuelt er substitueret med halogen, G^.g-alkoxy eller hydroxy, eller R betegner en gruppe med formlen DK 157302 B A4 ! 5 - CH - O - CO - A {"XX hvor betegner hydrogen eller methyl,, betegner methyl, tert.butyl eller phenyl, og A® betegner hydrogen eller methoxy, eller 5 R betegner en carbonhydridgruppe med 1-9 carbonatomer, som er substitueret med eventuelt tll salte omdannede basiske grupper med den almene formel NR^rX hvor R^ betegner hydrogen eller C^.g-alkyl, R^ betegner hydrogen eller C^.g-alkyl eller er knyttet til R^, sâledes at NR^R^ er en pyrrolidin-, piperidin- eller morpholinring.

2. Estere ifolge krav 1, kendetegnet ved, at de har den almene formel IX CH-OH l / ix 0 ncoor hvor R^- betegner en carbonhydridgruppe med 1-9 carbonatomer, som 15 eventuelt er substitueret med halogen, C^_g-alkoxy, hydroxy eller eventuelt til salte omdannede basiske grupper med den almene formel NR^rX hvor R^ betegner hydrogen eller C^.g-alkyl, og R^ betegner hydrogen eller C^.g-alkyl eller er knyttet til R^ sâledes, at NR^R^ er en pyrrolidin-, piperidin- eller morpholinring. 1

3. Estere ifolge krav 1, kendetegnet ved, at de har den almene formel X DK 157302 B -CH„OH fQ-" CO-O-CH-A À8 hvor iJ betegner et hydrogenatom eller en eventuelt med chlor, brom eller methoxy substitueret phenylgruppe, og betegner en eventuelt 5 med chlor, brom eller methoxy substitueret phenylgruppe.

4. Ester ifolge krav 3, kendetegnet ved, at den er benzylclavulanat.

5. Ester ifolge krav 3, kendetegnet ved, at den er p-chlorbenzylclavulanat, p-10 methoxybenzylclavulanat, p-brombenzylclavulanat eller m-chlorbenz-ylclavulanat.