DK153154B

DK153154B - Fremgangsmaade til fremstilling af 7-acylamido-cephalosporin-forbindelser

Info

Publication number: DK153154B
Application number: DK589474AA
Authority: DK
Inventors: Leonard Maurice Weinstock
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1973-11-30
Filing date: 1974-11-13
Publication date: 1988-06-20
Also published as: NL187023C; IE40122B1; FR2253022A1; ES432305A1; JPS50105687A; NO744088L; FI60210C; NL187023B; DK153154C; CH618443A5; AU7550474A; NO147839C; JPS6020393B2; NO147839B; DD115125A5; NL7414820A; DE2456528C2; FR2253022B1; HU168823B; SE432934B

Description

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af 7-acylamido-cephalosporin-forbindelser med den i kravets indledning angivne almene formel.

Opfindelsen udgør en forbedring af en acyleringsproces til fremstilling af 7-acylamido-cephalosporiner, som er genstand for U.S.A.-patentansøgning nr. 149.364.

Det er kendt at fremstille 7-acylamido-cephalosporiner med antibiotisk aktivitet ved først at fremstille den analoge 7-amino-cephalosporin og derefter acylere denne til dannelse af det ønskede produkt. Denne metode lider af den ulempe, at det er nødvendigt først at isolere og rense mellemproduktet 7-aminocephalosporin.

Man hg/r derfor forsøgt at finde andre metoder til fremstilling af 7-aminocephalosporinsyre.

Det kar for nylig vist sig, at cephalosporiner med en methoxy-substituent i stedet for hydrogenatomet i C-7-stillingen dannes af forskellige mikroorganismer. Disse cephalosporiner indeholder en aminoadipoyl-sidekæde, der fortrinsvis fjernes til dannelse af hidtil ukendte 7a-methoxy-cephalosporiner med forøget antibiotisk aktivitet.

Den foreliggende opfindelse er baseret på den erkendelse, at det er muligt at udskifte eller omlejre cephalosporinforbindelser i overensstemmelse med følgende reaktionsskemas

hvor B* og R' repræsenterer forskellige acylgrupper, idet R' er gruppen

hvori har den i kravet angivne betydning, R1 er hydrogen eller methoxy, og R" er hydrogen eller en letfra-spaltelig blokerende gruppe.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte, omsættes cephalosporin-forbin- delsen I med et acyleringsmiddel i nærværelse af en molekylesigte-katalysator af den angivne art til dannelse af 7-diacylimido-cephalosporin-forbindelsen (II), som derefter spaltes til dannelse af de ønskede 7-acylamido-cephalosporin-forbindelser (ill).

Reaktionen til fremstilling af det diacylerede produkt udføres ved intim behandling af cephalosporinforbindelsen med et acyleringsmiddel i et passende opløsningsmiddel i nærværelse af molekylsigte* Temperaturen, hvorved reaktionen finder sted, er ikke særlig kritisk, og temperaturer fra -20° C til 100° 0 er sædvanligvis tilfredsstillende, selv om det foretrækkes at udføre reaktionen ved temperaturer fra 50° C til 90° 0. Til udførelse af denne reaktion egner sig opløsningsmidler, der ikke indeholder aktivt hydrogen, såsom chloroform, acetonitril, methylenchlorid, dioxan, benzen, halogenbenzen, carbontetrachlorid og diethylether.

Acyleringsmidlet kan være et acylhalogenid, et anhydrid eller et blandet anhydrid, men sædvanligvis foretrækkes det at anvende et acylhalogenid, f.eks. et acylchlorid, som acyleringsmiddel.

Molekylsigterne, der er velegnede til dette formål, er aluminium-silikat-zeolitter. De naturligt forekommende zeolitter kan defineres som en gruppe krystallinske faste stoffer, hydratiserede aluminiumsilikater af mono- eller divalente baser, som er i stand til at miste en del eller hele indholdet af deres vand uden at ændre krystalstruktur, idet der kan absorberes andre forbindelser i stedet for det fjernede vand, og som er i stand til at undergå base-udskiftning. En syntetisk zeolit kan på den anden side fremstilles ud fra en kombination af basiske oxider (AIC^, SiC^, Na20 og KgO) i et vandigt medium til dannelse af den hydratiserede eller semi-hydratiserede krystallinske struktur. Efter varmebehandling kan zeolitterne betragtes som i det væsentlige vandfrie. Syntetiske zeolitter karakteriseres og klassificeres hovedsageligt ved røntgenstrålediffraktionsmetoder. Selv om der mangler en systematisk kemisk nomenclatur for syntetiske komplexe aluminiumsilikater, er der tradition for at tildele enhver ny syntetisk zeolit et vilkårligt bogstav eller en gruppe af bogstaver og tal. Meningen med disse vilkårlig symboler er forståelig for fagmanden.

Det har vist sig, at syntetiske zeolitter af A- og X-klasserne er særlig hensigtsmæssige til anvendelse ved den ovenfor heksrevne acyleringsproces. Porestørrelsen af zeolitterne skal ligge i et område fra 3 til 15 Å, idet en sådan porestørrelse betinger den ønskede katalytiske virkning. Zeolitterne kan være i det væsentlige vandfrie eller indeholde noget hydratiseringsvand. Vægtmængden af vand i zeolitten kan ligge mellem 0 og 30%.

I forbindelserne I, II og III er 3-stillingen substitueret med H

gruppen -CB^OCNH^· Transacyleringsreaktionen fungerer dog lige sa godt, hvis man anvender forbindelser, hvori 3-stillingen repræsenterer gruppen -CH^A1, hvor A* er hydrogen eller en alkanoyloxy-gruppe med 2-6 carbonatomer.

Acyl-substituenteme, der er repræsenteret ved B' i formlerne I, II og III, er fortrinsvis carboxylsyre-radikaler. B1 er aminodipoyl, når forbindelserne er produceret af visse microorga-nismer, såsom S. clavuligerus, S. lipmanii eller S. lactamdurans.

B’ kan dog også være en af de sædvanligt anvendte acylgrupper i cephalosporinforbindelser. B* kan være repræsenteret af den almene formel R11R10CHC0, hvor R10 repræsenterer hydrogen, halogen, amino, guanidino, phosphono hydroxy, tetrazolyl, carboxy, sulfo, eller sulfamino, og R11 repræsenterer phenyl, substitueret phenyl, en monocyclisk heterocyelisk 5- eller 6-leddet ring med et eller flere oxygen-, svovl- eller nitrogenatomer i ringen, substituerede heterocycler, phenylthio—heterocycliske eller substituerede heterocycliske thio-grupper eller cyano. Substituen-terne kan være halogen, carboxymethyl, guanidino, guanidinomethyl, carboxaminomethyl, aminomethyl, guanidino, guanidinomethyl, carb-oxaminomethyl, aminomethyl, nitro, methoxy eller methyl. Eksempler på foretrukne acylgrupper, er phenacetyl, 3-brom-phenylacetyl, p-aminomethylphenylacetyl, 4-carboxymethylphenyl-acetyl, 4-carboxamidornethylphenylaeetyl, 2-furylacetyl, 5-nitro-furylacetyl, 3-furylacetyl, 2-thienylaeetyl, 5-chlorthienylacetyl, 5-methoxythienylacetyl, a-guanidino-2-thienylacetyl, 3-thienyl-aeetyl, 4-methylthienylacetyl, 3-isothiazolylacetyl, 4-methoxyiso-thiazolylacetyl, 4-isothiazolylacetyl, 3-methylisothiazolylacetyl, 5-isothiazolylacetyl, 3-chlorisothiazolylacetyl, 3-methyl-1,2,5-oxadiazolylacetyl, 1,2,5-th.iadiazolyl-4-acetyl, 3-methyl-1,2,5-th.iadiazolyl-4-acetyl, 3-clilor-1,2,5-thiazolyl-4-acetyl, 3-methoxy-1,2,5-thiadiazolyl-4-acetyl, phenylthioacetyl, 4-pyridylthioacetyl, cyanoacetyl, "betrazolylacetyl, a-fluorphenylacetyl, D-phenylglycyl, 3-h.ydroxy-D-plienylglycyl, 2-thienylglycyl, 3-thienylglycyl, phenyl-malonyl, 3-chlorphenylmalonyl, 2-thienylmalonyl, 3-thienylmalonyl, a-phosphonophenylacetyl, α-sulfaminophenylacetyl, a-hydroxyphenyl-acetyl, α-tetrazolylphenylacetyl og a-sulfophenylacetyl.

Reaktionen I —* II, som er anskueliggjort ovenfor, er en ligevægtsreaktion. Et overskud af acyleringsmiddel anvendes for at forøge udbyttet af det ønskede slutprodukt, III. Diacylmellemproduktet, II, må forberedes til fjernelse af gruppen B' til fremstilling af slutproduktet III. Denne fraspaltning kan udføres på forskellige måder. Først kan der finde en spontan kløvning sted (i nærværelse af et molekylært overskud af acylerings-midlet) blot ved forlænget reaktionstid. For det andet kan vandet, når det er til stede i molekylærsigten, virke som spaltningsmiddel, og det færdige acylamidoprodukt udvindes i højt udbytte.

Begge disse metoder kan karakteriseres som "passive" i den forstand, at det ikke er nødvendigt at tilsætte et separat kløvningsmiddel til reaktionsblandingen.

En tredje metode til spaltning består i en tilsætning af benzyl-alkohol, en alkanol eller en alkylthiol med 1-6 carbonatomer.

Saltsyre kan også tilsættes som spaltningsmiddel som et fjerde reagens.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er illustreret mere detaljeret ved hjælp af efterfølgende reaktionsskema:

hvor R1 er hydrogen eller methoxy, Å! er carbamoyloxy eller acet-oxy, og R2 er en blokerende eller beskyttende gruppe. Gruppen COXR^ angiver en blokerende carboxygruppe eller thiocarboxy-gruppe (I er 0 eller S; R^ er en blokerende gruppe, og R’ er en acylgruppe.

Ted den nævnte proces bliver aminogruppen i cephalosporin-udgangs-forbindelsen (IX) først blokeret (R2) ved omsætning med et passende reagens til beskyttelse af 5'-amino-substituenten. Således blokeres aminogruppen ved hjælp af amino-beskyttende grupper, såsom acyl, aroyl, alkoxycarbonyl, alkylsulfonyl eller arylsulfonyl på i og for sig kendt måde. Eksempler på specifikke grupper, der egner sig til blokering af aminogruppen, er følgende: trichlorethoxy- carbonyl, tertiært butoxycarbonyl, benzoylmethoxycarbonyl, tri-methylsilyl, p-methoxybenzyloxy, 2-nitrophenylsulfenyl, 2,4-dinitro-phenylsulfenyl, chloracetyl, p-nitrophenylthio, p-nitrobenzensulfo-nyl, p-toluensulfonyl, methansulfonyl, benzoyl, p-chlorbenzoyl, p-nitrobenzoyl og toluolyl, men generelt foretrækkes det at anvende p-toluensulfonyl- eller benzoyl-derivater, som hensigtsmæssigt fremstilles ved omsætning af cephalosporinforbindelsen med p-tolu-ensulfonylchlorid eller benzoylchlorid, medens lalandingens pH-værdi lioldes basisk, dvs. mellem 9 og 10.

Det foretrækkes sædvanligvis at udføre de ovenfor "beskrevne reaktioner med en eephalosporinforbindelse, livor carboxygrupperne i aminoadipoyl-sidekæden og ved 4-stillingen ligeledes er "blokeret eller beskyttet (XI), da maksimale udbytter af den ønskede forbindelse fås med sådanne derivater. Endvidere er det ikke nødvendigt at blokere carboxygruppen i aminoadipoyl-sidekæden, da den fjernes under spaltningsreaktionen, men den blokerende eller beskyttende gruppe er fortrinsvis af en sådan art, at den let kan fjernes i 4-stillingen til dannelse af den frie syre uden åbning af β-lac-tam-gruppen, da cephalosporin-forbindelseme sædvanligvis anvendes i form af salte, såsom alkalimetalsalte eller aminsalte. Beskyttende grupper, der egner sig til dette formål, er velkendte. Eksempler på egnede derivater er estere af alkoholer, phenoler, mer-captaner og thiophenoler, hvor gruppen -COXR repræsenterer estere. I denne almene formel betyder X oxygen eller svovl, og R betyder radikale fra en alkohol eller en thiol, såsom methyl, ethyl, tertiært butyl, substitueret alkyl, såsom phthalimidornethyl, succin-imidomethyl eller phenacyl, substitueret phenacyl, f.eks. p-brom* phenacyl, β-substitueret ethyl, såsom 2,2,2-trichlorethyl, 2-methylthioethyl, 2-(p-methylphenyl)ethyl, 2-(p-methylphenyl)sulfo-nylethyl, 2-methylaminoethyl, 2-chlor-(eller brom)ethyl eller benzyl, substitueret benzyl, såsom p-nitrobenzyl, p-methoxybenzyl, 3,5-dinitrobenzyl, 2,4,6-trimethylbenzyl eller 3,5-diehlor-4-hydroxybenzyl, benzhydryl eller substitueret benzhydryl, såsom p-methoxybenzhydry1, acyloxy-alkyl, såsom acetoxymethyl eller pivaloyloxymethyl, alkoxy, såsom methoxymethyl, eller en monocyc-lisk arylgruppe, såsom phenyl eller substitueret phenyl, såsom p-nitrophenyl eller 3,5-dinitrophenyl. Det har vist sig, at den mest hensigtsmæssige gruppe til blokering af carboxygruppen er methoxy-methylgruppen, hvor X er oxygen. Disse beskyttende eller blokerende grupper for carboxysubstituenterne fremstilles let på i og for sig kendt måde.

Den beskyttende eephalosporinforbindelse omsættes derefter med et acyleringsmiddel i nærværelse af den ovenfor beskrevne molekylær- sigte, til dannelse af imidet eller det diacylerede produkt (XII). Acyleringsmidlet kan være et syrehalogenid (chlorid eller t>romid) eller et funktionelt ækvivalent deraf, såsom et syreanhydrid, et mercaptid eller et blandet syreandhydrid med andre carboxylsyrer, en aktiveret ester af carboxylsyren, såsom p-nitrophenyl-esteren.

De benyttede acyleringsmidler er sådanne, som er afledt af carboxylsyrer indeholdende gruppen:

hvor R^'har den i kravet definerede betydning.

Acyleringsmidlet anvendes i et molekylært overskud i forhold til cephalosporin-forbindelsen, fortrinsvis 2-6 gange så meget acyle-ringsmiddel som cephalosporin.

Som molekylsigte kan anvendes forskellige i og for sig kendte mo-lekylsigter. Fortrinsvis benyttes en syntetisk zeolit med regelmæssig krystalstruktur og ensartet porestørrelse. De mest almindeligt benyttede sigter af typen 3A, 4A, 5A og 13X er alle anvendelige til fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Disse sigter har følgende egenskaber:

Sigterne forekommer i det væsentlige i vandfri form; de kan anvendes i denne form eller dehydratiseres yderligere, til 0 i + 2 io vand, ved opvarmning til høje temperaturer (ca. 500° C eller derover) før anvendelsen; eller de kan anvendes med et indhold af op til 30 io hydratiseringsvand (vægtprocent). De hydratiserede sigter fremstilles hensigtsmæssigt ved henstand i en fugtig atmos- fære eller Yed opslemning i Tand med efterfølgende indstilling af det ønskede fugtighedsindhold til vakuumtørring eller tørring ved stuetemperatur eller forhøjet temperatur.

Denne tørring vil sædvanligvis tage 2-5 timer, men disse tidsgrænser er ikke kritiske. Fugtighedsindholdet kan måles efter Karl Fischer, der er en almindeligt anerkendt teknik, eller på anden kendt måde.

Omdannelsen af den beskyttede cephalosporin-forbindelse (XI) til imidet af det diacylerede produkt (XII) udføres hensigtsmæssigt ved intim blanding af cephalosporin-forbindelsen med acylemngsmid-let i et passende opløsningsmiddel i nærværelse af den valgte molekylsigte. Temperaturen ved denne reaktion er ikke kritisk, og sædvanligvis er temperaturer fra -20° C til 100 C tilfredsstillende. ha reaktionen er temperaturafhængig og forløber hurtigere ved høje temperaturer, foretrækkes det at udføre reaktionen ved temperaturer mellem 50° C 90° C. Som reaktionsmedium ved denne reaktion anvendes et opløsningsmiddelr der ikke indeholder aktivt hydrogen, såsom chloroform, acetonitril, methylenchlorid, dioxan, benzen, halogenbenzen, carbontetrachlorid, 1,2-dichlorethan eller diethylether. Det er vigtigt at holde opslemningen i bevægelse ved omrøring eller rystning under reaktionen.

hen nødvendige mængde sigter til reaktionen kan variere til afpasning efter driftsbetingelserne, het foretrækkes sædvanligvis at anvende tilnærmelsesvis lige vægtmængder udgangsmateriale og sigter, men det er muligt at anvende et vægtforhold mellem udgangsforbindelsen og sigterne på 1 - 0,5-2.

Som ovenfor nævnt kan den oprindelige acylgruppe fraspaltes pa mange forskellige måder. En simpel "ældning" af reaktionsblandingen er i nogle tilfælde tilstrækkelig, f.eks. når sigterne indeholder 10 - 30 % vand, i et tidsrum mellem 30 minutter og 30 timer. En alkanol, alkylthiol eller benzylalkohol kan tilsættes efter en kortere ældningsperiode. Alkanolen eller alkylthiolen kan have 1-6 carbonatomer, og eksempler herpå er methanol, ethanol, isopropanol og t-butanol. Saltsyre kan også tilsættes for at fremkalde en spaltning. Under acyleringsreaktionen forekommer nogen spontan spaltning af aminoadipoylgruppen som følge af reaktionens ligevægtskarakter, i afhængighed af de "betingelser, hvorunder acyleringen finder sted. En forlænget opvarmning af reak-tionshlandingen resulterer i en fraspaltning af aminoadipoylgruppen og dannelse af den ønskede 7-acylerede cephalosporinforbindelse, især hvis sigterne indeholder ca. 10 fy vand.

Ejerneisen af den "beskyttende eller blokerende gruppe ved carb-oxyfunktionen udføres på i og for sig kendt måde. Således kan methoxymethylgruppen for eksempel fjernes ved anvendelse af saltsyre ved 0-10° C; trichlorethoxycarbonylgruppen fjernes ved omsætning, med zink og eddikesyre; og t-butoxycarbonyl- og benzhy-drylgrupperne fjernes ved omsætning med trifluoreddikesyre. Indre fraspaltninger udføres lige så let.

fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal i det efterfølgende illustreres nærmere ved hjælp af nogle eksempler.

EKSEMPEL _1 3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-7P-thienylacetamido-3-cephem-4-_________________________________-___-__________

Trin A: 7p-(D-5-tosylamino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoylo:xy·- methyl-7-methoxy~3-oephem-4-car"boxyls.yre_

Mono-natriumsaltet af 7P-(D-5-amino-5-carboxyvaleramido)-3“Carb-amoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carboxylsyre (45,0 ml, 49,5 mg/ml vandig opløsning) blandes med acetone (450 ml) og vand (450 ml). Blandingens pH-værdi indstilles på 9,5 - 9,6 med 50 fyo natriumhydroxidopløsning, og 19 g tosylchlorid i 100 ml acetone tilsættes i portioner. pH-værdien opretholdes på 9,5 - 9,6 ved hyppig tilsætning af natriumhydroxidopløsning. Efter 15-20 minutter bliver pH-værdien stabil, og sulfonyleringsreaktionen fortsættes i alt i 1 time. Opløsningens temperatur holdes ved 20-23° 0 under hele reaktionsperioden.

Dernæst afkøles opløsningen på isbad, og pH-værdien sænkes til 7 ved tilsætning af 1:1 saltsyre (iskold). Opløsningen ekstraheres under anvendelse af ethylacetat. Ethylacetatlaget vaskes tilbage med 100 ml 5 fy natriumchloridopløsning. Det organiske lag bort- kastes, og de vandige lag sammen med 500 ml ethylacetat genindstilles på 2,5, og lagene adskilles. Det vandige lag ekstraheres yderligere med 3 x 500 ml ethylacetat. Ethylacetatlaget vaskes tiltage med 100 ml mættet natriumchloridopløsning. Ekstrakterne tørres med natriumsulfat, og opløsningen inddampes til et lille rumfang. (Temperatur 50° C).

Den koncentrerede opløsning opløses derefter i 200 ml isopropanol, opvarmes til 40-45° 0, og 5,8 ml eddikesyre og 21,6 ml dioyclo- hexylalmin tilsættes.

Denne opslemning afkøles langsomt ved henstand og ældes i 18 timer ved stuetemperatur. Produktet filtreres, vaskes med 100 ml iso propanol og tørres i 18 timer ved stuetemperatur under kraftigt vakuum.

Produktet, 7p-(D-5-tosylamino-5“carboxyvaleramido)-3-earbamoyloxy-methyl-7-methoxy-3-cephem-4-carboxylsyre, dicyclohexylamin-salt, fås i et udbytte på 44,5 g; UV: (pH=7,0 puffer)

Imax. 2620 E # 94,7 Ækvivalentvægt (HCIO^-titrering) 481,5 (teoretisk 481,5)

Analyse beregnet for 1S2: 0 58,60 - H 7,74 - N 8,72

Pundet * G 58,29 -H 7,29 -N 8,73.

Trin B* Dimethoxymethyl-ester af 7p-(D-5-tosylamino-5-earboxy- —-* valeramido)-3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-oephem-4- carboxylsvre --------

Tosylsaltet fra trin A, 20 g, indføres i en 3-halset kolbe. Me-thylenchlorid (200 ml) tilsættes, og opslemningen afkøles til 0 0 på isbad under nitrogen. Chlormethylmethylether (4,1 ml) i 30 ml methylenchlorid sættes til reaktionsblandingen i løbet af 90 minutter under god omrøring og isafkøling. Efter tilsætning i 1 time indføres en opløsning af collidin (1,58 ml) i 5 ml methylenchlorid.

Efter tilsætningen omrøres blandingen i yderligere 2 timer, den filtreres, og filterkagen vaskes med tørt methylenchlorid. Efter ekstraktion med vandig phosphorsyre, natriumchlorid, natnumbicar-bonat og natriumchloridopløsninger vaskes filterkagen tilbage med methylenchlorid. Det organiske lag tørres, filtreres, inddampes til et lille rumfang og krystalliseres. Produktet er dimethoxymethyl-esteren af 7P-(D-5-tosylamino-5--carboxy-valeramido)-3-carbamoyloxy-methyl-7-methoxy-3-cephem-4-carboxylsyre, 9»6 g (udbytte 85,5 1°). Både ultraviolet og tyndtlagskromatografi viser kun en enkelt komponent i produktet.

grin Π; 3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-7P-thienylacetamido-3-ceT>hem-4--carbox.yls.vre_

Til en opslemning af 6,9 g tosylmethoxymethylester fra trin B og 7,5 g af type 4A pulveriseret molekylsigte (600 mesh, hydratiseret til 17$ + 2$ vand) i 85 ml 1,2-dichlorethan sattes 5 ml destilleret 2- thienylacetylchlorid. Opslemningen opvarmes under omrøring ved 65° 0 i .16 timer under en nitrogenatmosfære.

Reaktionen styres ved anvendelse af tyndtlagskromatografi. Efter den angivne tid består hovedkomponenten i reaktionsblandingen af det ønskede mellemprodukt. Methanol (0,8 ml) tilsættes derefter, og opslemningen ældes i yderligere 2 timer. På dette punkt er 4-methoxymethylesteren af det ønskede produkt hovedforbindelsen i opslemningen.

Esteren hydrolyseres ved afkøling af opløsningen til ca. 25° C, filtreres og vaskes med kold methanol, filtratet og vaskevæskerne forenes og afkøles til 0° C. En opløsning ved 0° 0 af 20,8 ml koncentreret saltsyre og 23,6 ml methanol tilsættes, og opløsningen opvarmes til 15° C og omrøres ved denne temperatur i 2 timer og 40 minutter. På dette tidspunkt foretages en tyndtlagskromatografisk analyse. Blandingens pH-værdi indstilles ved først om fornødent at indføre gasformigt ethylenoxid til indstilling af pH-værdien på 2 - 2,5, hvorefter pH-værdien hæves til 5-6 ved tilsætning af fast natriumhydroxid. Blandingen filtreres, og dichlorethanlaget fraskilles. Det kolde vandige lag indeholder natriumsaltet af produktet. Dette lag renses ved kolonnekromatografi, idet der anvendes en IRA-68 harpiks på nitratform, medens elueringsmidlet er 0,02 M phosphatpuffer, pH = 7,0. Det endelige udbytte af produktet er 1,74 g, der udviser en enkelt plet ved tyndtlagskromatografi. Rotationsvinkelen er 192° C. Produktets identitet bekræftes ved NMR og ved kemisk analyse. Produktet er den ønskede 3- carbamoyloxymethyl-7-methoxy-7p-thienylacetamido-3-cephem-4- carboxylsyre, smp.: 165-167° C.

Udgangsmaterialet, natriumsaltet af 7P-(D-5-amino-5-earboxyvaler- amido) -3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-eephem-4-carboxylsyre, der anYendes i ovennævnte eksempel, fremstilles på følgende måde:

Præparation af mononatriumsalt af 7β-(D-5-amino-5-carboxy-valeramido) -3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4- __________________________________________________________

Modificeret fermentationsproces:

Ir in 1-: Skråkulturer

En lyophiliseret rørkultur af Streptomyces lactamdurans (NRB.Ii 3802) åbnedes aseptisk, og organismen overførtes til et medium med følgende sammensætning:

Medium Kl: 1 io Blackstrap-melasse 1 io National Brewer's gær 2,5 i Difco agar pH=7,0 Resten vand

Kulturerne dyrkes i 7 dage ved 28° C. Ved opbevaring i kulden bliver kulturerne stabile i mere end 13 uger.

Trin 2: Podetrin: lotrinss.ystem Eørste nodemateriale: Det første podemateriale podes direkte fra en kultur i trin 1 til 40 ml primær tørret gær N.E., pH = 7,0 (stammende fra the Xeast Product Corporation) i en 250 ml luftet konisk kolbe. Kolberne blev derefter rystet ved 220 omdrejninger^ pr. minut i et roterende rysteapparat med et slag på 50 mm ved 28 C i 2-3 dage.

Anden podning: Et 2,5 i podningsmateriale fra første podetrin blev sat til en kolbe indeholdende et 2 i Eleischmann S-150 gær-autolysat, pH = 7,0. Væksten på dette trin er typisk let, og dyrkningen, der udførtes som angivet i trin 1, blev ikke udstrakt udover 48 timer.

Trin 3: Produktionsmedium

Produktionsmediet indeholder pr. liter destilleret vand 30 g destil lationsrest, 7,5 g primær tør gær N.F. og 0,25% v/v af et emulgeret (Mobilpar-S)antiskummemiddel på petroleumbasis. Mediet indstilles på en pH-værdi på 7,0 med en lille mængde koncentreret natriumhydroxidopløsning, overføres i koniske kolber og autoklaveres i 15-20 minutter ved 121° C, Efter afkøling indførtes i mediet 2,5 f> podemateriale, dannet i ovennævnte trin 2. Dyrknings ti den kan variere mellem 50 og 100 timer, men der anvendes fortrinsvis 72 timer. Rumfanget af mediet i hver kolbe kan variere mellem 30 og 50 ml, og den foretrukne mængde er 40 ml. Mængden af podemateriale kan variere mellem 1 og 5 #, men i praksis anvendes sædvanligvis 2,5 frin 4· Afprøvning

Efter at gæringen var afsluttet, fjernedes cellerne ved centrifugering, og væsken fortyndedes »ed phosphatpuffer, pH = 7,0. Koncentrationen af 7p-(D-5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxy-methyl-7-methoxy-3-cephem-4-oarboxylsyre i gæringsvæsken blev bestemt ved den standardiserede biologiske skive-prøvemetode. Prøveorganismen var Vibrio percolans (ATCC 8461). Eilterpapirskiver blev neddykket i den fortyndede væske og anbragt på overfladen af agar-holdige Petri-skåle, som dyrkedes med prøveorganismen Vibrio percolans (ATCC 8461). ligeledes anbragtes på disse Petri-skåle skiver, som forud var dyppet i standardopløsninger indeholdende kendte koncentrationer af 7p-(D-5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carboxylsyre. Skiverne blev dyrket i 18 timer ved 28° C, og diametrene for zoneinhibering blev målt. Koncentrationen af produktet og gæringsvæsken beregnes ved interpolation ud fra standard-kurver over forholdet mellem zonediameteren og kendte koncentrationer af standardopløsninger af produktet. Ved denne metode blev det beregnet, at Streptomyces lac-tamdurans NRR1-3802 producerer 78,6 pg/ml 7P-(D-5-amino-5-carb-oxyvaleramido)-3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carboxyl-syre ved den modificerede fermentationsproces.

Irin 5? Isolation

Den filtrerede væske indstilles på pH = 7,0 med fortyndet saltsyre, og 2900 ml heraf føres gennem en kolonne indeholdende en stærkt basisk anionbytterharpiks (100 g) med en styren-divinyl-benzen-matrice (Dowex 1 x 2 ehlorid-cyclus-harpiks) ved 10 ml/ minut. Det forbrugte opløsningsmiddel opsamles i 500 ml fraktioner.

Harpikskolonnen vaskes med vand og elueres med 3 i° ammoniumchlorid i 90 io methanol. Eluatet opsamles i 100 ml fraktioner. Aktiviteten af fraktionen måles, de mest aktive fraktioner forenes, pH-værdien indstilles på 7,2 - 8,0 med fortyndet natriumhydroxid, og der adsorberes på en stærk basisk anionbytterharpiks (100 g) med en styren-divinylbenzen-matrix (Dov/ex 1x2 chlorid-cyclus-harpiks) ved 14 ml/minut. Kolonnen vaskes med vand og elueres med 5 $ vandig natriumchlorid. Koncentratet fortyndes til 500 ml, indstilles fra pH = 8,8 til pH = 2,0 med fortyndet saltsyre og adsorberes på 25 ml stærkt sur kationbytterharpiks af sulfonattypen med en styrendi vinylbenzen-matrix (Dowex 50 x 2 hydrogen-cyclus-harpiks) ved 2,5 ml/minut. Kolonnen vaskes med 25 ml vand, elueres derefter med 2 $ pyridin, indtil pH~værdien af afløbet fra kolonnen steg til 7,0 (54 ml). Det således dannede eluat indstilles på pH = 8,0 med fortyndet natriumhydroxid og inddampes under vakuum til fjernelse af pyridinet og dannelse af mononatriumsalt af 7β-(ϋ-5- amino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem- 4-carboxylsyre.

Elementæranalyse for C-j g^^N^SO^Na:

Beregnet: 0 41>0 - H 4,5 - N 12,0 - S 6,8

Eundet : C 39>31- H 4»76 - N 11,16 - S 6,46.

EKSEMPEL 2 3-carbamoylo2ymethyl-7-methoxy-7p“phenylacetamido-3"-cephem-4~carb- oxylsyre________________________________________________________

Trin A: Limethoxymethylester af 7β-[(D-5-tosylamino-5-oarboxy- valeryl)phenylacetamido]-3-carbamoyloxyme.thyl-7-methoxy- 3-cenhem-4-carboxvlsvre......

En opløsning af dimethoxymethylesteren af 7p-(L-5-tosylamino-5- carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carb- oxylsyre (9,3 g, 10 mmol), type 12A pulveriseret molekylsigte (hydratiseret til 20 fo + 2 <fo vand) (10,8 g) og phenylacetylchlorid (5,3 ml, 40 τητηηΐ) i 50 ml acetonitril opvarmes til 40° C i 20 timer. Efter denne periode afkøles blandingen til stuetemperatur og filtreres. Eiltratet inddampes til tørhed og udrives med hexan. Uop- løselig remanens indeholdende dimethoxymethylesteren af 7β—[(D—5— tosylamino-5-carboxyvaleryl)i>henylacetylamino]-3-carbamoyloxymethyl- 7-methoxy-3-cephem-4-carbo:xylsyre anvendes uden rensning i næste trin.

Trin B: 3-carbamoylo:Kymethyl-7-methoxy-7P-phenylacetamido-3- cephem-4-carboxylsyre______

Det urene produkt fra trin A opløses i 50 ml 1,2-dichlorethan.

1,0 ml methanol tilsættes, og opløsningen omrøres i 1 time. Meth-oxymethylesteren hydrolyseres ved tilsætning ved 0° C af en opløsning af 20 ml koncentreret saltsyre i 25 ml methanol og omrøring ved 15° C i 3 timer. Produktet isoleres og renses ved samme generelle procedure som angivet i eksempel 1. Derved fås 3-carbamoyl- oxymethyl—7-meth.oxy—7P-phenylacetamido-3-cephem-4--car'boxylsyre, smp.: 159-161° C, og UV- og SMR-spektrer svarende til den angivne struktur.

EKSEMPEL 3 3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-7β-(2-furylacetamido)-3-cephem-4-__carboxylsyre___________________________________________________

Dimethoxymethylesteren af 7P-(D-5-tosylamino-5-carboxyvaleramido)- 3- carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carboxylsyre omsættes med 2-furylacetylchlorid i nærværelse af 12 g hydratiseret type 4A molekylsigte (hydratiseret til 15 1° + 2$ vand), efterfulgt af den netop beskrevne procedure. Sidekæden og den esterblokerende gruppe fjernes også ved den beskrevne procedure. Det dannede produkt er 3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-7β-(2-furylacetamido)-3-cephem- 4- carboxylsyre, smp.: 156-161° C, UV (pH = 7,0 puffer)'\max. 265 pm. &7200 og med IR og NMR svarende til strukturen.

På samme måde fremstilles produktet 3-carbamoyloxymethyl-7-meth-oxy-7P-thiophenoxyacetamido-3-cephem-4-carboxylsyre, idet der anvendes phenylthioacetylchlorid i stedet for 2—furylacetylchlorid. Produktet har et smeltepunkt på 119-123° C, UV (pH =7,0 puffer), Xmax. 247 um. £10400 og et MR-spektrum svarende til strukturen.

EKSEMPEL· 4 3-ace ΐοχγηθΐ^2ΐ-7β-£2-ΐ1ιΐθηγΐ8θθΪ8,ω.ϊάο2-3-οθ£^θΜ.--4-θΒΓ^ο^ΐ82Γθ grin Αϊ 7β-(ΐ>-5-ΐΐϊο1ι1θΓθΐ]αοχ7οαΓΐ3οη3?·1αΐ]ΐίηο-5-οαΓΐ3θΧ3Γνα1βΓΒΐΕΐάο)- 5-acet.ylmethyl-3-ee-phem-4-earboxyls.yre lil en opløsning af 7β-(D-5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-acetoxy-methyl-3-cephem-4-carboxylsyre (2,5 g, 0,53 mol) i acetone (13 ml) og vandigt 10 $ dikaliumhydrogenphosphat (40 ml) dryppes trichlor-ethoxycarbonylchlorid (3,35 g, 0,159 mol). Under tilsætningen holdes opløsningens pH-yærdi på 8,5 - 9,0 ved gradvis tilsætning af en 17 $6 vandig opløsning af natriumhydroxid. Efter 30 minutter vaskes blandingen med ethylacetat, og det vandige lag gøres surt til pH = 2,5 med koncentreret saltsyre. Eet udfældede produkt ekstraheres i ethylacetat, opløsningen tørres over natriumsulfat, filtreres, og opløsningsmidlet afdampes, hvorved fås 2,7 g 7β-(Ε- 5-trichlorethoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-acetylmethyl- 3-cephem-4-carboxylsyre.

Trin Bs Dihenzhydrylester af 7-(D-5-trichlorethoxycarbonylamino-5-carboxyvaleramido)-3-acetoxymethyl-3-cephem-4-carboxyl-syre _

Til en opløsning af 7£-(D-5-trichlorethoxyearbonylamino-5-carboxy-valeramido)-3-aeetylmethyl-3-cephem-4-carboxylsyre i ethylacetat (30 ml) sættes diphenyldiazomethan (2,0 g) i ether (25 ml). Blandingen omrøres i 18 timer, og opløsningsmidlet afdampes til dannelse af 4,0 g urent produkt. Det urene produkt renses ved chromato-grafi på silica-gel under anvendelse af chloroform som eluerings-middel, hvorved fås 2,3 g i det væsentlige ren dihenzhydrylester af 7-(D-5-trichlorethoxycarhonylamino-5-carhoxyvaleramido)-3-acet-oxymethyl-3-cephem-4-oarboxylsyre.

NMR:- (Opløsningsmiddel - CDCl^) δ = 2,0 (methyl, s), 4,9 (10-H2, quartet), 3,2 (2-H2, quartet), 4,95 (6-H, d), 5,92 (7-H), 7,0 (benzhydrylprotoner, 2 s).

Trin C: Dihenzhydrylester af 7-[(D-5-trichlorethoxycarbonylamino- 5- c arb oxyvalery1)- 2-t.hi enylac e ty lamina] - 3-ac e t oxymethy 1-3-cenhem-4-carhoxvlsyre__

En blanding af dibenzhydrylesteren af 7β-(Ε-5-^ίο1ι1ο^ΐ!ιοχ^Λο- nylamino-5-carboxyvaleramido)-3-acetoxymethyl-3-cephem-4-carboxyl- syre (2,0 g, 0,02 mol), 11,0 g type 5A molekylsigte (hydratiseret til 23 io + 2 fo, ?.-thienylacetylchlorid (1,31 g, 0,0815 mol) og methylenchlorid (6 ml) opvarmes til 40 - 45° C på oliebad under en nitrogenatmosfære i 20 timer. Reaktionsblandingen hældes i hexan (100 ml) og filtreres. Ved afdampning af opløsningsmidlet fås dibenzhydrylesteren af 7-[(M-trichlorethoxycarbonylamino-5-carbo:nyvaleryl)-2-thienylacetylamino]-3-acetoxymethyl-3-cephem-4-carboxylsyre.

Trin D: Benzhydrylester af 3-acetoxymethyl-7-(2-thienylacetamido)- 5-cephem-4-carboxylsyre_______

Dibenzhydrylesteren af 7-[(D-S-trichlorethoxycarbonylamino-S- carboxyvalerylM-thienylacetylaminoJ^-acetoxymethyl^-cephem^- carboxylsyre opløses i ethylacetat (10 ml) og sættes til en blanding af 90 io vandig eddikesyre (10 ml) og zinkstøv (1,0 g). Blandingen omrøres i 2 timer ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen filtreres til fjernelse af zink. Reaktionsblandingen vaskes i rækkefølge med to portioner vand, en kold natriumbicarbonatopløsning og derefter med mættet natriumchloridopløsning (15,0 ml). Ethyl-acetatopløsningen tørres over natriumsulfat, filtreres, og opløsningen inddampes til dannelse af 1,9 g urent produkt, som kromato-graferes over silicagel under anvendelse af en blanding af chloroform og ethylacetat (50:1) som elueringsmiddel til dannelse af 0,380 g produkt, der efter omkrystallisation af ethylacetat har et smeltepunkt på 141,5 - 143° 0.

UV: (CH^OH) \max. 263. £7580.

Elementær analyse for C29H26N2°6S2:

Beregnet: C 61,91 - H4,6£> - N4,98

Bundet : C 62,14 - H~4,84 “ N 4,91.

Trin E: 3-(acetoxymethyl)-7-(2-thienylacetamido)-3-cephem-4- carboxylsyre_____

En kold opløsning af benzhydrylester af 3-acetoxymethyl-7-(2-thienylacetamido)-3-cephem-4-carboxylsyre (100 mg) i anisol (1,0 ml) og trifluoreddikesyre (0,5 ml) omrøres ved 0° C i 35 minutter. Carbontetrachlorid (50 ml) tilsættes, og reaktionsblandingen inddampes til tørhed. Remanensen udrives med hexan.

Hexanet fjernes ved dekantering, og remanensen opløses i 10 ml etliylacetat, inddampes til 1 ml, og der tilsættes dieth.yleth.er til dannelse af et bundfald. Dette bundfald omkrystalliseres af en blanding af diethylether og ethylacetat til dannelse af 0,025 g 5-(ac etoxymethyl)-7-(2-thienylacetamido)-3-cephem-4-carboxylsyre, smp.: 164° C. Smeltepunktet ved blanding med en autentisk prøve var 163° C.

EKSEMPEL 5

Natrium-7-(2-thienylacetamido)-7-methoxy-3-carbamoyloxymethy1-3- cephem-4-carboxylat___________________________________________

Irin A: 7p-(D-5-benzoylamino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxy- - methyl-7-methoxy-3-cenhem-4-carboxylsyre, dinatriumsalt_

Til 500 ml af en vandig opløsning indeholdende 48,5 mmol mono- natrium-7p-(D-5-amino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxymethyl-7“ methoxy-3-cephem-4-carboxylat sættes så meget 50 $ natriumhydroxid, at pH-værdien bliver 9*5. Til denne opløsning sættes 15 ml (128 mmol) benzoylchlorid under kraftig omrøring. pH-værdien opretholdes ved 9,5 i 30 minutter under tilsætning af natriumhydroxid, hvis det er nødvendigt.

Opløsningens pH-værdi indstilles derefter på 4,0 med koncentreret saltsyre, og der vaskes to gange med ethylacetat.

Den vandige fraktion afkøles til 0° C, og 200 ml isopropanol og 300 ml ethylacetat tilsættes under omrøring. Opløsningens pH-værdi indstilles på 2,0 med saltsyre. Den organiske fraktion bortkastes, og den vandige fraktion genekstraheres tre gange med ethylacetat.

De forenede ekstrakter vaskes med natriumchloridopløsning, tørres med natriumsulfat og inddampes i vakuum, hvorved fas 43,0 g af en mørk olie.

Denne olie opløses i 200 ml ethanol, og en opløsning af 30 g 2— ethylhexansyre-natriumsalt tilsættes. Opslemningen afkøles til 0° C, filtreres, vaskes med ethanol og tørres i vakuum, hvorved fås 28,8 g [102$] dinatrium-7P-(D-5-benzoylamino-5"Carboxyvalera-mido)-3-carbamoyloxymeth.yl-7-methoxy-3-cephem-4-carboxylat, som var 67 56 rent ved kromatografi i sammenligning med en ren standard.

Trin B: Dimethoxymethylester af 7P-(!-57benzoylaminQ-5-carboxy- - valeramido) -3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3--eephem-4- carboxvlsyre________

Til en opslemning af 20 g dinatrium-7P-(B-5-benzoylamino-5-carb-oxyvaleramido)-3_carbamoyloxymethyl—17-methoxy-3””Cephem-4-carboxy-lat i 200 ml acetonitril ved 0° C sættes dråbevis 16 ml 6 M chlorine thylmethy le ther i løbet af 9© minutter. Efter en tilsætningstid på en time tilsættes 6 ml S-collidin. Opslemningen omrøres i yderligere to timer ved 0° C. Blandingen fortyndes derefter med 500 ml methylenchlorid og vaskes to gange med fortyndet phosphor syre, en gang med fortyndet natriumbicarbonatopløsning og en gang med 5 °Jo natriumchlorid. De vandige fraktioner vaskes tilbage med 50 ml methylenchlorid. Den organiske fase tørres over natriumsulfat og inddampes i vakuum til ca. 10Θ ml.

Opløsningen føres gennem 200 ml silica-gel G, vaskes med 200 ml methylenchlorid, elueres derefter med 800 ml ethylacetat. Ethyl-acetateluateme inddampes i vakuum, hvorved fås 18,5 g af en SU1 olie.

Det urene stof omkrystalliseres af 50 ml ethylacetat til dannelse af 10,0 g [67 io\ dimethoxymethylester af 7P-(D-5-benzoylamino-5- carboxyvaleramido)—3-carbamoyloxymethyl—7-methoxy—3-cephem—4-carb— oxylsyre.

Trin 0: Natrium-7-(2-thienylacetamido)-7-methoxy-3-carbamoyloxy- methyl-3-cephem-4-cafboxylat

En opslemning af 192 mg (0,3 mmol) dimethoxymethylester. af 7β-(p_5_ftenzoylamino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxymethy1-7-methoxy-3-cephem-4-carboxylsyre, 225 mg pulveriseret linde-type 4A molekylærsigte med 10 fo + 2 fo vand, 0,3 ml 2-thienylacetylchlo-rid og 4 ml dichlorethan koges under kraftig omrøring:! 4 timer. Blandingen afkøles til 65° C, og 10 ml 0,05 M t-butano.l i dichlorethan tilsættes i løbet af to timer, hvorefter der opvarmes i yderligere en time ved 65° C. Reaktionsblandingen'afkøles til 0 C, filtreres og vaskes med 5 hlL methanol, filtratet afkøles til 0° 0 under omrøring, hvorefter der tilsættes 1,4 ml af en 1ί1

saltsyre:methanol, og den dannede blanding omrøres ved ca. 15° C

1 3 timer. Blandingen hældes i 10 ml vand indeholdende 1,6 g natriumbicarbonat . Ben organiske fase bortkastes. Be vandige fraktioner indeholdt et 65 f udbytte af produktet, natrium-7-(2-thienylacetamido )-7-methoxy-3-carbamoyloxymethyl-3-cephem-4-carboxylat .

Irin_B: På analog måde anvendes p-chlorbenzoylchlorid, p-nitro- benzoylchlorid eller toluoylchlorid i trin A. Slutudbyttet af det ønskede produkt, natrium-7-(2-thienylacetamido)-7-methoxy-3-carba-moyloxymethyl-3-cephem-4-carboxylat, er i hvert tilfælde henholdsvis 70 fo, 68 fo og 72 fo.

EKSEMPEL 6

Natrium-7-(2-thienylacetamido)-7-methoxy-3-carbamoyloxymethyl-3-__c ephem-4~carboxy;lat___________________________________________

En blanding af 2,76 g (4 mmol) dimethoxymethylester af 7β-(Β-5-tosylamino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-carboxylat, 3 g tør Linde—type 4A molekylærsigte med mindre end 2 fo vand, 2 ml thienylacetylchlorid (16 mmol) i 34 ml di-chlorethan omrøres under tilbagesvaling i 5 timer. Berefter tilsættes 0,38 ml (4 mmol) t-butanol, og omrøringen fortsættes i 2 timer. Efter dette tidsrum indføres yderligere 0,095 ml (1 mmol) t-butanol, og reaktionsblandingen omrøres under tilbagesvaling i yderligere en halv time. Reaktionsblandingen afkøles til 0-5 C i et bad af is-vand. Molekylsigterne fjernes ved filtrering på sugefilter og vaskes derefter med 40 ml iskoldt methanol. Filtratet og vaskevæskerne kombineres og afkøles til 0° C. En iskold opløsning af 8,3 ml koncentreret saltsyre og 9,5 ml methanol tilsættes, og opløsningen opvarmes til 15° C og omrøres ved 15 C i 2 timer og 40 minutter. Efter at hydrolysen er afsluttet, afbrydes reaktionen ved tilsætning af en suspension af 22 g natriumbicarbonat i 120 ml vand ved 0-5° C. Opløsningen bestående af to faser omrøres i 10 minutter. Bet dannede bundfald af et tungt salt fra-filtreres og vaskes med en lille mængde 5 f° natriumchloridopløsning indeholdende 0,5 f natriumbicarbonat. Bichlorethanlaget fraskilles og ekstraheres med 2 x 20 ml af en opløsning af 0,5 f natrium-hydrogencarbonat plus 5 f° natriumchlorid. Be vandige fraktioner forenes og vaskes med 20 ml dichlorethan. Bicarbonatopløsningen viste sig ved væskechromatografi at indeholde 73 $ natrium-7-(2-thienylacetamido)-7-methoxy-3-carbamoyloxymethyl-3-cephem-4-carb-oxylat og 2,1 96 uforandret udgangsmateriale.

EKSEMPLER 7-20

Natrium-7-(2-thienylacetamido)-7a-methoxy-3-carbamoyloxymethyl-3-__cephem-4-carho^lat____________________________________________

Den i eksempel 6 angivne procedure gentages med 4 mmol (2,8 g) dimethoxymethylester af 7p-(D-5-tosylamino-5-carboxyvaleramido)-3-carbamoyloxymethyl-7a-methoxy-3-cephem-4-car-boxylat > idet der omsættes med de i efterfølgende tabel angivne mængder reagens og under de der angivne reaktionsbetingelser. I hvert tilfælde er den totale reaktionstid ca. 16 timer. De anvendte molekylsigter er i hvert tilfælde af Linde-typen 4A, som opvarmes til 700° C før reaktionen, idet de udviste et vægttab på ca. 3 $ ved tørring. Sigterne er beregnet til at være i hovedsagen vandfrie eller at have mindre end 2 ji vandindhold efter vægt. Reaktionstemperaturen er i hvert tilfælde 67° 0.

a) lid mellem portionsvis tilsætning af imid-spaltende reagenser*

Id) Tilsætning efter 3 timers spaltning med isopropanol, idet reaktionen fortsattes i yderligere 16 timer før den endelige imid-spaltning.

c) Yderligere en mængde på 1,5 g sigte tilsattes efter afslutningen af transacyleringsperioden og forud for tilsætningen af alkohol.

d) Transacyleringsperioden var 1,5 timer.

e) Endnu en mængde på 1 g sigte blev tilsat efter afslutning af transacyleringen.

EKSEMPIER 21-25

Samme generelle procedure som anvendt i eksempler 6-20 anvendes med den ændring, at reaktionstemperaturen er som angivet i efterfølgende tabel. Reaktionsblandingen består af 4 mmol (2,8 g) af dimetlioxymetliylesteren af 7P-(D-5-tosylamino-5-car'boxyvaler- amido)-3-carlDamoyloxymet]iyl-7a-methoxy-5~cep]iem-4-car‘boxylat, 3 g tørret Linde-type 4A sigter (mindre end 2 $ vand efter vægt) og 16 mmol tMenylacetylchlorid i 34 ml dichlorethan.

Slutproduktet er i alle tilfælde natrium-7-(2-thienylacetamido)- 7a-methoxy-3-carbamoyloxymethyl-3-cephem-4-carboxylat.

EKSEMPEL 26 7-(2-thienylacetamido)-7-methoxy-3-carbamoyloxymethyl-3-cephem-4-_______________________________________________________________

Et gram natrium-7P-(L-5-amino-5-carboxyvaleramido)-3--carbamoyloxy- methyl-7-methoxy-3-cephem-4--carboxylat indføres i en reaktionsbeholder indeholdende 20 ml diclilorethan. Hertil sættes 1 g af en Linde-molekylsigte type 4A i pulverform med 15 1<> vand og 8 mmol (1 ml) thienylacetylchlorid. Opslemningen opvarmes under tilbage-svaling i 8 timer. Efter filtrering vaskes molekylsigten med methanol. Methanolvaskevæsken fra sigterne analyseres og indeholder et udbytte på 25 1<> af det ønskede produkt, 7-thienylaeetamido- 7a-methoxy-3-carbamoyloxymethyl-3-cephem-4-carboxylsyre, bestemt ved tyndtlagschromatografi og væskechromatografi. Lichlorethan-laget af reaktionsblandingen ekstraheres med 5 1° natriumhydro-gencarbonat og viser sig ved tyndtlagschromatografi og væskechro-matografi at indeholde yderligere 5 $ af det ønskede produkt. Tyndtlagschromatografi af det organiske lag på dette tidspunkt viser tilstedeværelsen af de blandede anhydrider. Efter fjernelse af opløsningsmidlet ved inddampning hydrolyseres det blandede anhydrid i 50 acetone-vand (50 ml) i nærværelse af 10 molprocent pyridin. Yed tyndtlagschromatografi og væskechromatografi vises dannelsen af yderligere 13 $> af slutproduktet som fri syre. Let totale udbytte er 156 mg af syren, 23 i° udbytte.

Claims

Patentkrav : Fremgangsmåde til fremstilling af 7-acylamido-cephalosporin-forbindelser med den almene formel:

hvor R1 er hydrogen eller methoxy; A’ er carbamoyloxy eller alkanoyloxy med 2-6 carbonatomer, R3 er phenyl, 2-thienyl, 3-thiehyl, 2-furyl eller 3-furyl, og M er hydrogen eller et alkali-metal^.— kendetegnet ved, at en forbindelse med formlen

hvor B er blokeret aminoadipoyl eller en acylgruppe, der er forskellig fra den ønskede substituent i slutproduktet, og R" er en konventionel blokerende gruppe, omsættes med et acylerings-middel indeholdende gruppen R3CH2C0-, hvor R3 har den ovenfor angivne betydning, i nærværelse af en naturlig eller syntetisk zeolit med porestørrelse fra 3 til 15 Å, hvorefter B-substituen-ten og den blokerende gruppe R" fraspaltes til dannelse af slutproduktet, idet en eventuelt dannet fri syre om ønsket overføres i et tilsvarende alkalimetalsalt.