DK149347B - Fremgangsmaade til fremstilling af insulinpraeparater med krystaller med 2-zn-struktur - Google Patents

Description

i 149347 o

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af insulinpræparater, der indeholder insulin-zink-krystal-ler, især sådanne af svineinsulin. Disse krystaller er skarpkantede rhomboedre med 2-Zn-struktur, og de fås ved 5 strukturtransformation ud fra rhomboedre med 4-Zn-struk-tur.

Det er kendt at krystallisere insulin i form af rhomboedre fra vandige medier under tilsætning af divalente metaller, fortrinsvis zink, og et pufferstof såsom ammoni-10 umacetat eller natriumacetat ved en pH-værdi mellem 5 og 7. I mange tilfælde tilsættes der til undgåelse af en udfældning af amorft insulin et organisk opløsningsmiddel såsom acetone. Desuden kan det være hensigtsmæssigt at påvirke krystallisationsprocessen ved tilsætning af podekrystal-15 ler. Ved tilstedeværelse af halogenider (chlorid eller iod-id), urinstof eller formamid i krystallisationsmediet dannes der, afhængigt af de nævnte stoffers koncentration, rhomboedre med forskellig krystalstruktur. Således dannes der ved en koncentration på op til 6% natriumchlorid 20 i krystallisationsmediet rhomboedre med såkaldt 2-Zn-struk-tur, og ved et højere natriumchloridindhold dannes der rhomboedre med såkaldt 4-Zn-struktur, jfr. M.J. Adams et al., Nature, 224, 491 (1969), og G. Bentley et al., Nature, 261, 166 (1976). Begge krystalformer optager yder-25 ligere zink ved stigende pH-værdi i det omgivende medium. Bruttozinkindholdet i krystallerne og zinkkoncentrationen i det omgivende medium samt krystallernes størrelse og form er bestemmende for krystallernes opløsningshastighed. Således har f.eks. krystaller af svineinsulin 30 med et zinkindhold fra 0,8 til 2,5%, beregnet på insulinvægten, i neutral opløsning en forhalet terapeutisk virkning.

Det er endvidere kendt, at krystallisation under de betingelser, der fører til rhomboedre med 2-Zn-struk-35 j

O

2 149347 tur, giver dårligt udviklede krystaller; ofte dannes der herved afrundede krystalllegemer, deformerede rhom-boedre eller tvillingeformer (US-PS 2.920.014). Under de betingelser, der fører til rhomboedre med 4-Zn-struk-5 tur, dannes der derimod godt udviklede, skarpkantede rhomboedre. Det er let at indse, at ensartet udviklede krystaller er fordelagtige i insulinpræparater til terapeutiske formål, især fordi en reproducerbar opløsningshastighed for krystallerne tilvejebringer en reproducer-10 bar tids-virkningsprofil for præparatet.

Det har vist sig, at insulinkrystaller med 4-Zn--struktur under de betingelser, der er nødvendige i insulinpræparater til terapeutiske formål, dvs. med et natrium-chloridindhold på op til 1,5%, ikke er stabile. Dette vi-15 ser sig på den måde, at krystallerne, der er suspenderet i et neutralt og til terapeutiske formål gængs medium og indeholder mindre end 1,5% zink, går delvis i opløsning efter nogen tids forløb. Såfremt krystallerne indeholder en højere zinkandel, udviser de ikke reproducerbare virk-20 ningseffekter.

Det er kendt, at man kan transformere 4-Zn-kry-staller af svineinsulin til 2-Zn-krystaller, når man sætter 4-Zn-krystallerne til et medium, der er frit for na-triumchlorid og har en pH-værdi på 6,5. Herved kommer det 25 imidlertid til så store spændinger i krystallerne, at transformationen foregår med en fuldstændig sønderdeling af den ydre krystalform, jfr. G. Bentley et al., J. Mol. Biol., 126, 871 (1978).

Det har nu overraskende vist sig, at man uden er-30 kendelig påvirkning af den ydre form kan transformere rhom-boedriske insulinkrystaller med 4-Zn-struktur, og det såvel af svineinsulin som af okseinsulin, til krystaller med 2-Zn-struktur, således at man kan anvende disse transformerede krystaller til fremstilling af stabile insulinpræ-35 parater til terapeutiske formål.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af insulinpræparater med krystaller med 2-Zn- 149347

O

3 -struktur; og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at rhomboedrisk krystalliseret insulin, fortrinsvis fra svin, med 4-Zn-struktur holdes i et vandigt medium, der indeholder mindre end 6 g natriumchlorid pr. 100 ml, og hvis pH--værdi er indstillet på 4,5 til 6,0 og holdes stabil ved 5 tilsætning af en puffer, i så lang tid ved en temperatur mellem stuetemperatur og 45°C, at der er dannet rhom-boedre med 2-Zn-struktur, og at der i en prøve ikke længere kan konstateres nogen krystaller med 4-Zn-struktur, 1Q hvorpå den således opnåede krystalsuspension fortyndes med en fortyndingsopløsning, der indeholder et fysiologisk tåleligt stof til indstilling af isotonien, et konserveringsmiddel, og så meget zink, at krystallerne i neutral suspension har et zinkindhold på fra 0,9 til 2,5%, idet sus-1g pensionen eventuelt blandes med en hurtigtvirkende neutral opløsning af insulin eller insulinderivater eller med en forhalet virkende, neutral suspension af amorft insulin eller insulinderivater.

De transformerede krystaller har skarpe kanter og 20 hjørner samt glatte flader. De udviser den samme transparens som de oprindelige 4-Zn-krystaller. En sammenligning af krystallernes røntgenspektre før og efter transformationen viser, at strukturen har ændret sig, hvilket kan erkendes gennem ændringen af bøjningsvinklen. Ufor-25 andret er derimod ordningsgraden i krystallerne, hvilket kan erkendes gennem peakenes i røntgenspektret optrædende forhold mellem højde og bredde, i de ved transformation opnåede 2-Zn-krystaller.

Til fremstilling ifølge opfindelsen af en suspension 30 af insulinkrystaller med 2-Zn-struktur til terapeutiske formål går man ud fra krystalliseret insulin med 4-Zn--strukturen, som fordelagtigt er blevet krystalliseret under sterile betingelser på i og for sig kendt måde. Til gennemførelse af strukturtransformationen af krystallerne 35 erstattes det omgivende medium med en vandig opløsning, der indeholder mindre end 6% (vægt/rumfang) natriumchlorid, fortrinsvis 0,5-2% (dvs. 0,5-2 g pr. 100 ml) og et salt til pufring af pH-værdien, fortrinsvis natriumacetat.

4

O

149347

Opløsningen indstilles på en pH-værdi nær ved det iso-elektriske punkt for insulin, dvs. mellem en pH-værdi på 4,5 og 6,0, fortrinsvis mellem 5,0 og 5,8. Strukturtransformationen foregår ved stuetemperatur eller ved en 5 forhøjet temperatur op til 45°C, fortrinsvis 37°C. Det er fordelagtigt, men ikke nødvendigt, at holde suspensionen i bevægelse under omlejringsreaktionen, f.eks. ved omrøring eller omrystning. Strukturtransformationen af krystallerne kan let konstateres, idet man udtager en 10 prøve og f.eks. ved røntgenstrukturanalyse, undersøger, om der endnu befinder sig krystaller med den oprindelige 4-Zn-struktur i suspensionen. Dette er i reglen tilfældet i nogle timer til nogle dage, alt efter reaktionsbetingelserne. Transformationens hastighed falder med stigende pH-15 -værdi og med stigende koncentration af natriumchlorid i mediet. Med stigende temperatur tiltager transformationshastigheden.

Aromatiske stoffer, således som de udgøres af de almindeligt anvendte konserveringsmidler, hæmmer trans-20 formationen. Således hindrer f.eks. en tilsætning af 0,1% methylparaben transformationen af krystaller af svi-neinsulin. Disse stoffer må derfor udelukkes ved omlejringsreaktionen ifølge opfindelsen. Efter afslutning af omdannelsen fortyndes krystalsuspensionen med en fortyn-25 dingsopløsning således, at der fås en suspension med 40, 80, eller 100 I.E. pr. ml insulinkrystaller. Fortyndingsopløsningen indeholder til indstilling af isotonien et fysiologisk foreneligt stof, f.eks. natriumchlorid, til pufring af pH-værdien med fordel et puffersalt, f.eks.

30 natriumacetat, og et konserveringsmiddel, f.eks. methylparaben. Opløsningen indstilles fortrinsvis med natriumhydroxidopløsning på en sådan pH-værdi, at der efter fortynding i krystalsuspensionen fås en pH-værdi i området fra 6 til 8, fortrinsvis en pH-værdi fra 6,7 til 35 7,5. Desuden er det nødvendigt til fortyndingsopløsnin gen at sætte så meget zink, at insulinkrystallerne i den neutrale suspension udviser et zinkindhold på 0,9-2,5%.

5 149347

O

Den således fremkomne suspension af stabile insulinkrystaller med 2-Zn-struktur kan om ønsket blandes med en hurtigtvirkende, neutral opløsning af insulin eller insulinderivater, eller med en forhalet virkende, 5 neutral suspension af amorft insulin eller insulinderivater, idet komponentforholdets stabilitet kun afhænger af blandingens zinkindhold.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere i det følgende eksempel.

10

Eksempel 1 A 1. Fremstilling af en suspension af krystaller med 4-Zn-struktur._

Krystallinsk insulin fra svin (450.000 I.E.), der 15 indeholder 0,5 vægtprocent zink, opløses i 400 ml 0,03 N saltsyre. Til opløsningen sættes der 15 ml af en 1%'s zinkchloridopløsning i 0,03 N saltsyre, og der suppleres op med 0,03 N saltsyre til 500 ml. Opløsningen sterilfiltreres og blandes med 500 ml af en ligeledes sterilfiltreret 20 opløsning af 70 g natriumchlorid, 14 g natriumacetat-tri-hydrat og 10 ml 1 N natriumhydroxidopløsning i vand. Blandingen indstilles på en pH-værdi på 5,4-5,5 og omrøres i 48 timer ved stuetemperatur, hvorved insulinet krystalliserer i rhomboedre med 4-Zn-struktur.

25 A 2. Strukturtransformation af 4-Zn-krystaller til 2-Zn-krystaller._

Fra 1 liter krystalsuspension, der er fremstillet ifølge Al., bortpumpes der efter afsætning af krystaller-30 ne fra den klare ovenstående væske 888 ml under sterile betingelser, og der erstattes med 1013 ml af en sterilfiltreret vandig opløsning, der indeholder 50 mg zinkchlorid og 1,125 g natriumchlorid og er indstillet på en pH-værdi på 5,4-5,5 med 1 N saltsyre. Krystalsuspensionen omrøres 35 derpå i 7 dage ved stuetemperatur og derefter i 5 dage ved 37°C. Røntgenspektret viser derpå en fuldstændig omdannelse af 4-Zn- til 2-Zn-strukturen.

6

O

149347 A 3. Fremstilling af en neutralkrystalsuspension med 40 I.E. pr. ml,____

Til 1,125 ml af den ifølge Al. og A 2. fremstillede krystalsuspension sættes der 10,125 liter af en ste-5 rilfiltreret opløsning, der indeholder 81 g natriumchlo-rid, 14,175 g natriumacetat-trihydrat, og 0,8-1,1 g zink-chlorid, 11,250 g methylparaben og så meget 1 N natriumhydroxidopløsning, at der i blandingen indstiller sig en pH-værdi i området fra 6,9 til 7,4.

10

Eksempel 2

Fremstilling af et tofasepræparat ud fra 70% krystaller af svineinsulin og 30% amorft des-Bl-phenylala-nin-insulin fra svin.

15 Til 1,125 liter af den ifølge Al. og A 2. (ek sempel 1) fremstillede krystalsuspension sættes der 14,946 liter af en steril suspension, der indeholder 192.900 I.E. amorft des-Bl-phenylalanin-insulin fra svin, 119,6 g natriumchlorid, 20,9 g natriumacetat-trihydrat,

20 2,362 g zinkchlorid, 16,07 g methylparaben og så meget 1 N

natriumhydroxidopløsning, at der i blandingen indstiller sig en pH-værdi i området fra 7,2 til 7,5.

Eksempel 3 25 Fremstilling af et tofasepræparat ud fra 75% kry staller af svineinsulin, 12,5% opløst svineinsulin og 25% opløst des-Bl-phenylalanin-insulin fra svin.

Til 1,125 liter af den ifølge Al. og A 2. (eksempel 1) fremstillede krystalsuspension sættes der 30 13,875 liter af en steril opløsning, der indeholder 150.000 I.E. des-Bl-phenylalanin-insulin fra svin, 111,04 g natriumchlorid, 19,43 g natriumacetat-trihydrat, 292 mg zinkchlorid, 15,00 g methylparaben og så meget 1 N natriumhydroxidopløsning, at der i blandingen indstiller 35 sig en pH-værdi på 6,8-7,0.

U9347 7 o

Eksempel 4

Fremstilling af et tofasepræparat ud fra 75% krystaller af svineinsulin, 12,5% opløst svineinsulin og 12,5% opløst des-Bl-phenylalanin-insulin fra svin.

5 Til 1,125 liter af den ifølge Al. og A 2. (ek sempel 1) fremstillede krystalsuspension sættes der 13,875 liter af en steril opløsning, der indeholder 75.000 I.E. insulin fra svin og 75.000 I.E. des-Bl-phenylalanin- insulin fra svin, 111,04 g natriumchlorid, 19,43 g 10 natriumacetat-trihydrat, 354 mg zinkchlorid, 15,00 g methylparaben samt så meget 1 N natriumhydroxidopløsning, at der i blandingen indstiller sig en pH-værdi på 6,8--7,0.