DK146263B - Fremgangsmaade til isomerisering af glucose til fructose - Google Patents

Description

(19) DANMARK (S')

(12) FREMLÆGGELSESSKRIFT <n, 146263 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Patentansøgning nr.: 3858/75 (51) InLCI.3: C12P 19/24 (22) Indleveringsdag: 27 aug 1975 (41) Aim. tilgængelig: 28 fob 1977 (44) Fremlagt: 15 aug 1983 (86) International ansøgning nr.: -(30) Prioritet:- (71) Ansøger: ‘MITSUBISHI CHEMICAL INDUSTRIES LIMITED; Tokyo, JP, ‘SEIKAGAKU KOGYO CO. LTD;

Tokyo, JP.

(72) Opfinder: Yoshtmasa ‘Fujita; JP, Akiyoshi ‘Matsumoto; JP, Hachlro ‘lehlkawa; JP, Tadashi ‘Hishlda; JP, Hideo *Kato; JP, Hiroshi *Takamisawa; JP.

(74) Fuldmægtig: Internationalt Patent-Bureau (54) Fremgangsmåde til isomerisering af glucose til fructose

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til isomerisering af glucose til fructose med immobiliseret glucoseisomerase.

Det er kendt, at glucoseisomerase er et enzym, som er i stand til at omdanne glucose til fructose og vice versa, og det anvendes ® til fremstilling af fructose ud fra glucose.

Sådan glucoseisomerase er fundet i forskellige mikroorganis-^ mer, som f.eks. bakterier, såsom sådanne tilhørende slægterne Pseudo- monas, Bacillus og Lactobacillus, actinomyceter, såsom Streptomyces ^ phaeochromogenus, Streptomyces fradie, Streptomyces roseochromogenus, O Streptomyces olivaceus, Streptomyces californicus, Streptomyces vi- naceus og Streptomyces albus samt gær.

Til praktiske formål foretrækkes det at anvende glucoseisome- 2 146263 rase isoleret fra Streptomyees i en uopløseliggjort form, som opnås enten ved at underkaste mikroorganismeceller indeholdende glucoseiso-merase en varmebehandling til opnåelse af en intracellulær fiksering eller ved at knytte glucoseisomerase isoleret fra cellerne til en bærer ved adsorption, ionbytning, dannelse af en covalent binding eller inclusion. I denne forbindelse henvises til Chemical Abstracts Vol. 69, 64824 d (1968) Tsumura et al.; USP 3.788.945; Applied Microbiology, april 1971, p. 588 - 593, G.W.Strandberg et al.; og Biotechnology and Bioengineering Vol. XIV, p. 509-513 (1972), G.W. Strand-berg et al.

Næsten al den glucoseisomerase, der findes i mikroorganismeceller, kræver metalioner, der kan være forskellige afhængigt af isome-rasens oprindelse. Det er kendt, at glucoseisomerase fra Streptomyees kræver magnesiumioner, og at aktiviteten og modstandsdygtigheden mod varme forøges under yderligere tilstedeværelse af cobaltoioner (jvf.

N. Tsumura et al. Agr. Biol. Chem. Vol. 29, 1126 (1965) og T. Takasa-ki, Agr. Biol. Chem. Vol. 30, p. 1249 (1966)).

Ved kommerciel fremstilling af fructose ud fra glucose har magnesium- og cobaltoioner været til stede i reaktionsblandingen. I-midlertid er dette ikke ønskeligt, da forskellige tungmetalioner omfattende cobaltoioner ikke er tilladte som additiver til næringsmidler i mange lande, hvorfor anvendelse af cobaltoioner ved fremstilling af fructose bør undgås.

Det har nu vist sig, at aktiviteten af immobiliseret glucoseisomerase kan opretholdes i lang tid, uden at der anvendes cobaltio-ner, når der anvendes en tilsætning af bestemte mængder vandopløseligt jernsalt sammen med magnesiumsalt til glucoseisoraerisations-blandingen.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fås der derfor en effektiv udnyttelse af imrobiliseret glucoseisomerase ved omdannelse af glucose til fructose, og fremgangsmåden er ejendommelig ved, at der er 0,005 - 5 mmol/liter 'jernioner til stede sammen med 2 - 20 mmol/ liter magnesiumioner i reaktionsblandingen.

Nedenfor forklares opfindelsen mere detailleret.

Eksempler på kilder for jernioner, som kan anvendes ved fremgangsmåden omfatter vandopløselige jernsalte, som f.eks. uorganiske jernsalte, såsom ferrosulfat, ferrisulfat, ferrochlorid, ferrichlor-id, ammoniumferrisulfat, ammoniumferrosulfat og jernnitrat, og organiske jernsalte, såsom jerntartrat og blandinger deraf. Opmærksomheden må imidlertid henledes på, at visse organiske jernsalte, som er 3 146263 vandopløselige, giver en formindsket dannelse af jernioner, hvis ba-seanionen danner kraftige coordinationsbindinger til jern, hvorved der fremkommer en såkaldt "masking effect".

Endvidere er blandt de uorganiske salte jernphosphater ubekvemme, da de har ringe opløselighed i vand og giver et uopløseligt bundfald. Ferrichlorid, ferrosulfat, jernlactater, jerncitrater og ammonium- jerncitrater , som er tilladte som additiver til næringsmidler ifølge den japanske levnedsmiddellovgivning, er eksempler på vandopløselige jernsalte, der kan anvendes ifølge opfindelsen. Som det fremgår af nedenstående eksempler, kan det vandopløselige jernsalt være enten divalent eller trivalent.

Selv om virkningsmekanismen for jernioner ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen endnu ikke er klarlagt, antages det, uden at opfindelsen dog begrænses af nogen teori, at hvis jernioner er til stede sammen med magnesiumioner i reaktionsblandingen, vil jernionerne knytte sig til enzymet til dannelse af visse komplekser, der modstår den deaktivering af enzymet, som skyldes kemiske påvirkninger og/eller indvirkning af varme. Således er det teoretisk muligt at underkaste glucoseisomerase en forbehandling med en vandig jernsaltopløsning og herved opnå den tilsigtede virkning uden tilsætning af jernsalt som følge af, at jernion er til stede nær isomerasen, men i praksis må der i sådanne tilfælde tilsættes jernsalt til reaktionsblandingen, for herved at opretholde et konstant niveau med hensyn til koncentration af jernion i reaktionsblandingen, som følge af at de jernioner, der er knyttet til glucoseisomerasen til dannelse af komplekser, vil dissocieres senere og fjernes fra reaktionsblandingen sammen med produktet, specielt ved en kontinuerlig fremgangsmåde.

Koncentrationen af jernioner i reaktionsblandingen holdes fortrinsvis fra 0,02 til 0,5 m mol/liter.

Eksempler på vandopløselige magnesiumsalte, der kan anvendes sammen med jernsaltet ved den omhandlede fremgangsmåde, omfatter magnesiumsulfat, magnesiumchlorid, magnesiumsulfit, magnesiumcarbo-nat og blandinger heraf.

Isomeriseringen af glucose til fructose ved den omhandlede fremgangsmåde er egnet til kontinuerlig fabrikation, ved hvilken en vandig glucoseopløsning kontinuerligt bringes i kontakt med immobi- 4 146263 liseret glucoseisomerase til opnåelse af fructose. Fremgangsmåden er særligt egnet til en kontinuerlig fremgangsmåde, ved hvilken en vandig glucoseopløsning ledes gennem en søjle, hvori glucoseisomerase er pakket adsorberet på en bærer, til opnåelse af omdannelse af glucose til fructose.

Bærere, som er egnede til uopløseliggørelse af glucoseisomerase omfatter: (1) en macroporøs anionbytterharpiks, hvis matrix er styren-divinylcopolymer,og hvis anionbyttergruppe er af den kvaternære ammoniumtype. Et sådant materiale er nærmere beskrevet i USA-patent-skrift nr. 4.o78.97o.

(2) et cyanogenhalogenidderivat af tværbundet agar i partikelform.

Sidstnævnte materiale fremstilles ved at behandle agar med et tværbindingsmiddel, såsom epichlorhydrin under alkaliske betingelser til indførelse af tværbindinger, efterfulgt af opvarmning til høj temperatur og vaskning med varmt vand til fjernelse af materialer opløselige i varmt vand, og påfølgende behandling af den tværbundne agar med en vandig opløsning af cyanogenhalogenid, såsom cyanogenbromid under alkaliske betingelser.

Det har vist sig, at ved udførelse af fremgangsmåden bevares aktiviteten af isomerase imraobiliseret på denne måde i lang tid, og isomerisationsreaktionen af glucose til fructose er derfor tilfredsstillende til anvendelse på kommerciel basis.

En vandig glucoseopløsning kan bekvemt underkastes en kontinuerlig behandling ifølge opfindelsen ved en pH-værdi andragende fra 5,5 til 9, en koncentration på 20-70 vægt% og en temperatur på 40-80°C, og en sådan opløsning ledes gennem en kolonne som beskrevet med en specifik volumetrisk fødehastighed på 0,1-20 pr. time.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af nedenstående eksempler.

c 146263 5

Eksempel 1

Glucoseisomerase blev ekstraheret ved en konventionel ultralydbehandling ud fra "Glucose Isomerase NAGASE", som bestod af celler af en stamme hørende til Streptomyces phaeochromogenes, intracellulært fikseret ved varmebehandling og tilgængelig fra "Nagase Sangyo Kabu-shiki Kaisha, Osaka, Japan".

Aktivitetstiteren, der defineres nedenfor, af en sådan ekstrakt var 200 enheder/ml.

Derpå blev fremstillet en uopløselig glucoseisomerase ved at blande 75 ml af en sådan ekstrakt med 15 ml af en våd macroporøs kraftigt basisk anionbytterharpiks ("Diaion PHA" fra Mitsubishi Chemical Industries, Limited, hvis matrix var styren-divinylbenzen-copo-lymer, og hvis ionbyttergruppe var en kvaternær ammoniumgruppe) ved stuetemperatur i 6 timer til opnåelse af adsorption af isomerasen på anionbytterharpiksen. Adsorptionsgraden blev målt til mere end 99%.

Den uopløseliggjorte glucoseisomerase, der var fremstillet på denne måde, blev pakket i en med kappe forsynet kolonne med en indre diameter på 8 mm.

En 3 molær vandig glucoseopløsning indeholdende 5 m Mol magnesiumsulfat og 1 m mol ferrosulfat (de anførte koncentrationer er ionkoncentrationer) blev ledt gennem en sådan kolonne, der blev holdt ved en temperatur på 67°C til opnåelse af kontinuerlig isomerisation, medens der blev ført varmt vand gennem kappen.

Graden af aktivitetsbevarelse, som defineret nedenfor, efter 10 og 20 dages forløb, er anført i tabel 1.

Eksempler 2-6

Der blev gået frem på lignende måde som i eksempel 1 med den afvigelse, at der i stedet for ferrosulfat blev anvendt forskellige metalsalte ved de i tabel 1 anførte koncentrationer. Graden af aktivitetsbevarelse for glucoseisomerasen efter 10 og 20 dages forløb er også angivet i tabel 1, hvoraf det fremgår, at der opnås bedre resultater ved tilsætning af jernsalte end andre salte, idet der opnås en forlænget isomeraseaktivitet.

6 146263

Tabel 1

Eksempel Forbindelse Ionkoncentration Grad af aktivitets- nr. (m mol/liter) bevarelse (%) 10 dage 20 dage 1 Ferrochlorid 1,0 70 45 2 Ferrichlorid 0,5 62 37 3 Jerntartrat 1,0 68 40 4 — 33 11 5 Cobaltochlorid 1,0 55 25 6 Calciumchlorid 1,0 30 13

Eksempler 7-13 I disse eksempler blev der gået frem som i eksempel 1, idet dog isomerisationerne blev udført ved en temperatur på 72°C under anvendelse af ferrisulfat i forskellige koncentrationer som anført i tabel 2.

Graden af aktivitetsbevarelse efter 7 og 13 dages forløb er også angivet i tabel 2.

De laveste værdier for aktivitetsformindskelsen iagttages ved en koncentration i området fra 0,02 til 0,5 m mol/liter jernion.

Tabel 2

Eksempel Koncentration af Grad af aktivitets- nr. jernion m mol/liter) bevarelse (%) 7 dage 13 dage I 7 0 13 5 i 8 0,02 40 22 9 0,05 52 35 10 0,1 62 49 I 11 0,25 50 33 12 0,5 38 11 13 3,0 26 9

Eksempler 14-16

Den anvendte glucoseisomerase var ekstraheret fra et kulturmedium med inkuberet Streptomyces albus YT nr. 5, der er deponeret hos "The Fermentation Research Institute", Japan (deponeringsnummer: η 146263 FERM P-463). Isomerasen blev uopløseliggjort efter fremgangsmåden ifølge eksempel 1 og blev anvendt til kontinuerlige isomerisationer som i eksemplerne 1, 4 og 5. Graden af aktivitetsbevarelse efter henholdsvis 7 og 13 dage er anført i tabel 3.

Tabel 3

Eksempel Forbindelse Ionkoncentration Grad af aktivitets- nr. (m mol/liter) bevarelse (%) 7 dage 13 dage 14 Ferrosulfat 1,0 75 60 15 -- — 40 25 16 Cobaltochlorid 1,0 62 49

Eksempler 17-19

Fremstilling af tværbundne agarpartikler.

1 liter 4% agarpartikler, "Sepharose 4B" fra Pharmacia Fine Chemicals, Sverige, blev omhyggeligt blandet med 1 liter vandig natriumhydroxidopløsning (1 mol/liter) ved stuetemperatur. 30 ml epi-chlorhydrin blev sat til ovenstående blanding, medens denne blev holdt ved 60°C på et vandbad og omhyggeligt rystet i 2 timer, hvorved der indtrådte en tværbindingsreaktion.

Derpå blev reaktionsmassen opvarmet i en autoklav til en temperatur på 120°C under et tryk på 2 atmosfærer i 2 timer. Den varme masse blev vasket med vand på 90°C til fjernelse af det i varmt vand opløselige materiale og henstillet til afkøling til opnåelse af tværbundne agarpartikler.

Aktivering af tværbundne agarpartikler.

De tværbundne agarpartikler blev underkastet en vakuumfiltrering til fjernelse af overskydende vand og blev afkølet til 4°C. Til en blanding af 50 g af de således opnåede partikler og 80 ml af en 2%'s vandig cyanogenbromidopløsning blev dråbevis sat en 2 N vandig natriumhydroxidopløsning i en sådan mængde, at opløsningen blev holdt ved en pH-værdi på 11 + 0,5, hvorved den tværbundne agar blev aktiveret.

Efter at alkaliabsorptionen var ophørt (hvilket gav sig udslag i forøgelse af pH-værdien), blev alkalitilsætningen standset og reaktionsmassen underkastet en vakuumfiltrering og vasket med vand til 1Λ 8 2 6 3 δ opnåelse af aktiverede og tværbundne agarpartikler.

Uopløseliggørelse af glucoseisomerase.

En blanding af 50 g af de således opnåede aktiverede partikler og glucoseisomeraseekstrakten fra eksempel 1 med en aktivitetstiter på 25000 enheder blev holdt ved en temperatur på 4°C i 18 timer til opnåelse af adsorption af isomerasen på partiklerne under opnåelse af uopløseliggjort glucoseisomerase i partikelform.

Isomerisationsreaktion.

Den ovennævnte uopløseliggjorte glucoseisomerase med en aktivi-tetstiter på 4000enheder, blev pakket i en med kappe forsynet kolonne (indre diameter 1,5 cm, længde 12 cm), hvorigennem en vandig glucose-opløsning med en koncentration på 3 mol/liter og indeholdende forskellige metalioner anført i tabel 4 blev ledt i nedadgående retning i en mængde på 8,5 ml pr. time ved en temperatur på 67°C til opnåelse af kontinuerlig isomerisering.

I tabel 4 er anført arten og koncentrationen af metalioner, der førtes til glucoseopløsningen og variationen i mængden af fructose, der dannes i de anførte tidsrum.

146263 9

O HO

I 00 OO LD O

g LO Ί* 'Φ

(0 HH

+) ID O LD

d) r- oo m H

tø in >» "tf

Η H

h —— (U O O "tf -p —.. ID oo m o m <D m "tf "tf Q) S H__H__ H ~” ~ +J +) in ro o d) \ in <n in o β Οι m "tf in

qa -* H

ni — —--- T3 o m o Φ 'tf σ> m "tf d) t n in "tf m

ra ø H H

0 Ό +J o ni o

O H ro o o CD

3 ifl io "tf ID

}-) -Μ Η H

m d----- tu o o o tu cm o m ’tf

10 φ ID "tf H

&i.p H HH

g H ---__

ft) -®l O O O

g IH Η H O O

ID in ID

_____ H__Η H

"f d o

rH *H

d) -P —.

A Hl·) os H o)

Eh -P -P

d η

d) H

o \ h in d h >· *· o o in o m o t n 0 g H ""

H

cd

•P

<D

5 ip + + cd M + + + + + d) + + + + 4- -P d t n a) t n Q) t n u o g fe g Pn g

j< H

H

d) a 6 · ΦΗ t" oo cn

tO d Η Η H

X

M il 10 146263

Graden af aktivitetsbevarelse og aktivitetstiteren, der angives i ovenstående beskrivelse og i kravene, måles som følger.

Grad af aktivitetsbevarelse.

En vandig substratopløsning indeholdende glucose, magnesiumsulfat, cobaltochlorid og phosphatstødpude (pH =7,2) i en koncentration på henholdsvis 0,1 mol/liter, 0,05 mol/liter, 0,001 mol/liter og 0,05 mol/liter fremstilles. En forudbestemt mængde, sædvanligvis mellem 1 og 10 ml, uopløseliggjort glucoseisomerase, der ikke tidligere har været anvendt til isomerisering,sættes til 100 ml af substratopløsningen, og der foretages isomerisation ved en temperatur på 70°C i 60 minutter under forsigtig omrøring. En tilsvarende isomerisering udføres med en uopløseliggjort isomerase som forud har været anvendt et bestemt antal dage.

Derpå fraskilles isomerasen ved filtrering, og mængden af fructose i filtratet bestemmes ved cystein-carbazol-metoden.

Mængden af fructose, der dannes pr. ml af den uopløseliggjor-te glucoseisomerase, beregnes, værdierne, der opnås, betegnes "A" for den ikke tidligere anvendte isomerase og "A,,r for den tidligere benyttede. Derpå beregnes graden af aktivitetsbevarelsen ud fra følgende ligning: 1 x 100 (%)

Aktivitetstiter af glucoseisomeraseekstrakt.

En blanding af vandige opløsninger af 0,2 ml 1 m D-glueose, 0,2 ml 0,05 m MgS04,7H20 og 0,2 ml 0,5 m phosphatstødpude (pH = 7,2) sættes til 0,2 ml glucoseisomeraseekstrakt, og opløsningen fortyndes med vand til ialt 2 ml. Den resulterende fortyndede opløsning holdes ved en temperatur på 70°C i 60 minutter til opnåelse af isomerisation, og reaktionen standses ved tilsætning af 2 ml af en 0,5 m vandig perchlorsyreopløsning. Derpå bestemmes mængden af dannet fructose ved cystein-carbazol-metoden. Den "enhed", der er anvendt i forbindelse med angivelse af aktivitetstiteren ovenfor, er defineret som mængden af dannet fructose (mg) mængden af isomeraseekstrakt (ml) .