DK145199B

DK145199B - Fremgangsmaade til fremstilling af et antibiotikum papulacandin dets komponenter papulacandin a,b,c,d og e eller hydrogeneringsprodukter og eller ethere eller estere deraf

Info

Publication number: DK145199B
Application number: DK108076AA
Authority: DK
Inventors: P Traxler; J Gruner; J Nueesch
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1975-03-13
Filing date: 1976-03-12
Publication date: 1982-10-04
Also published as: JPS51128494A; ES445965A1; JPS6012039B2; DK145199C; US4278665A; FR2303557A1; DE2609611A1; FR2303557B1; GB1543986A; DK108076A; NL7602642A

Description

(19) DANMARK (w) I \j£a/

^ (12) FREMUEGGELSESSKRIFT (H) U5199B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 1080/76 (51) intCl.* C 12 P 19/44 (22) Indleveringsdag 12. mar. 1976 C 07 Η 19-/00 (24) Løbedag 12. mar. 1976 (41) Aim. tilgængelig 14. sep. 1976 (44) Fremlagt 4. Okt. 1 982 (86) International ansøgning nr. -(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. - (30) Prioritet 15. mar. 1975, 5199/75, CH 5- okt. 1975, 12857/75, CH.

(71) Ansøger CIBA-GEIGY AG, 4002 Basel, CH.

(72) Opfinder Peter Traxler, CH: Johannes Gruner, CH: Jakob

Nueesch, CH.

(74) Fuldmægtig Dansk Patent Kontor ApS.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af et antibiotikum papulacandin dets komponenter papulacandin A, B, C, D og E eller hydro« generingsprodukter og/eller ethere eller estere deraf.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt antibiotikum papulacandin samt dets komponenter A, B, C, D og E eller hydrogeneringsprodukter og/eller ethere eller estere

OD

deraf, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, ΟΊ at man aerobt dyrker en papulacandin-producerende stamme af arten ^ Papularia sphaerosperma (Pers.) Hohnel i en vandig næringsopløs- -rf ning, der indeholder en carbon- og nitrogenkilde samt uorganiske salte, og herpå isolerer antibiotikumet papulacandin og om ønsket opdeler dette i dets komponenter og ligeledes om ønsket behandler en ® eller flere af disse med hydrogeneringsmidler og/eller foreste rings- eller foretheringsmidler.

145199 2

Som papulacandin-producerende stamme anvendes især stammen NRRL 8086 (A32283) .

Arten Papularia sphaerosperma (Pers.) Hohnel er tidligere betegnet som Arthrinium sphaerospermum (Corda) Ellis. Arten er indgående beskrevet af Ellis i Ellis M.B. "Dematious Hyphomycetes" 1971, side 569, under Arthrinium sphaerospermum. Den ovennævnte foretrukne stamme A 32283 er deponeret hos Northern Regional Research Lab. US-Department of Agriculture, Peoria, Illinois under nr. NRRL 8086.

Som carbonkilde skal f.eks. nævnes: assimilerbare kulhydrater, f.eks. glucose, saccharose, lactose, mannitol, stivelse, glycerol, endvidere inositol. Som nitrogenholdige næringsstoffer skal nævnes: aminosyrer, peptider og proteiner samt deres nedbrydningsprodukter, såsom pepton eller trypton, endvidere kødekstrakter, vandopløselige bestanddele af kornsorter, såsom majs og hvede, af destillationsrester fra alkoholfremstilling, af gær, bønner, især fra sojaplanten, af frø, f.eks. fra bomuldsplanten, men også ammoniumsalte og nitrater. Af andre uorganiske salte kan næringsopløsningen f.eks. indeholde chlorider, carbonater, sulfater, phosphater af alkali- eller jordalkalimetaller, af magnesium, jern, zink og mangan.

Dyrkningen sker aerobt, altså f.eks. i hvilende overfladekultur eller fortrinsvis submert under rystning eller omrøring med luft eller oxygen i rystekolber eller de kendte fermentere. Som temperatur egner sig en sådan mellem 18 og 40°C, fortrinsvis ca. 23°C. En væsentlig antifun-gisk virkning viser næringsopløsningen derved i almindelighed efter 1 1/2 til 5 dage. Fortrinsvis kultiverer man i flere trin; dvs. man fremstiller først en eller flere forkulturer i flydende næringsmedium, hvilke så overpodes til det egentlige produktionsmedium, f.eks. i forholdet 1:20. Forkulturen får man f.eks. ved, at man overpoder et mycelium, der har dannet sporer, og som er opnået ved ca. 14-dages vækst på et fast næringssubstrat, til et flydende medium og lader det vokse i 48 timer.

Isoleringen af antibiotikumet papulacandin fra kulturmediet sker efter i og for sig kendte metoder under hensyntagen til antibiotikumets kemiske, fysiske og biologiske egenskaber.

3 145199 Således kan antibiotikumet f.eks. ekstraheres fra den ufiltrerede kulturvæske med et med vand kun lidt blandbart organisk opløsningsmiddel, f.eks. ethylacetat. Denne såkaldte "whole-broth”-metode anvendes fortrinsvis, fordi antibiotikumet befinder sig såvel i myceliet som i kulturfiltratet. Antibiotikumet ansamler sig i den vandholdige organiske fase, f.eks. i ethylacetat, og denne fase skilles fra den ekstraherede kulturvæske og "slammet” (ekstraheret mycelium og faste næringsopløsningsbestanddele). Den ved ekstraktionen opnåede remanens kan underkastes en eller flere fornyede ekstraktioner med det samme eller et andet opløsningsmiddel.

Man kan også ekstrahere det f.eks. med filterhjælpemidler frafiltrerede mycelium eller kulturfiltrat alene. Det med vand vaskede mycelium (sammen med filterhjælpemidlet) ekstraheres fortrinsvis med et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel, f.eks. en lavalkanol med 1-4 carbonatomer, såsom methanol, ethanol, propanol·, isopropanol, endvidere dimethyIsulfoxid, formamid, dimethylformamid, methylacetamid, dioxan, tetrahydrofuran, acetone, eller med blandinger af disse opløsningsmidler med vand, især med vandholdigt methanol. Kulturfiltratet ekstraheres med et med vand ikke blandbart opløsningsmiddel, f.eks. med ethylacetat, med vand ikke blandbare alkoholer, såsom n-butanol, højere aliphatiske ketoner, f.eks. methylisopropylketon.

Til rensning af det efter afdampning af opløsningsmidlet opnåede råprodukt kan man f.eks. betjene sig af ekstraktion, fældning, fordeling mellem ikke-blandbare opløsningsmiddelfaser eller absorption, fremfor alt kromatografi. Således kan der fra råproduktet, f.eks. ethylacetat-ekstrakt af kulturvæsken, fjernes betydelige mængder ledsagestoffer ved på hinanden følgende simple rensningsprocesser, såsom ekstraktion af det tørrede eller opløste råprodukt med opløsningsmidler, i hvilke antibiotikumet er uopløseligt, f.eks. earbonhydrider, såsom petroleums-ether, cyclohexan, eller vandfrie halogenerede earbonhydrider, såsom methylenchlorid, chloroform, tetrachlormethan. Man kan også opløse råproduktet, f.eks. i methanol og skille fra ledsagestoffer ved hjælp af adsorptionsmidler, såsom aktivt kul, kiselgel, magnesiumsilicat, aluminiumoxid eller blandinger deraf eller adsorptionsharpikser, f.eks. tværbundne dextraner,såsom "Sephadex” (fra fa. Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala). F.eks. kan råproduktet renses ved gentagen søjlekromatografi under anvendelse af kiselgel, hensigtsmæssigt med ringe tilsætninger af aktivt kul. Antibiotikumet elueres fortrinsvis efter gradientmetoden med blandinger af chloroform eller tetrachlormethan og methanol, hvorved 4 145199 det procentuelle indhold af det stærkere polære opløsningsmiddel trinvis forøges. Når man kromatograferer den ved ekstraktion af kulturvæsken vundne ekstrakt på en blanding af kiselgel og f.eks. 5 vægt-% aktivt kul og med f.eks. chloroform/methanol som elueringsvæske, finder man næsten den totale mængde af det fra kulturvæsken ekstraherede papulacandin fordelt på eluaterne med methanolkoncentratio-ner på 5-20%.

Den ovennævnte fordeling mellem ikke-blandbare opløsningsmiddelfaser kan også foretages som modstrømsfordeling med et Craig-apparatur.

Som opløsningsmiddelsystem tjener f.eks. en blanding af ethylacetat, cyclohexan, methanol og vand.

Til udvinding af de enkelte ensartede komponenter af antibiotikumet papulacandin kan deres adskillelse og isolering f.eks. ske efter metoden med præparativ tyndtlagskromatografi under de for den analytiske påvisning beskrevne betingelser. Mere fordelagtig er adskillelse ved hjælp af søjlekromatografi, hvorved der som adsorptionsmiddel f.eks. anvendes kiselgel med et indhold på 1-5% aktivt kul, og elueringen fortrinsvis sker efter gradientmetoden med en blanding af chloroform og methanol. Forøgelsen af koncentrationen af det mest polære opløsningsmiddel sker hensigtsmæssigt i mindre procentuelle trin, f.eks.

5-20 methanol, eller man arbejder efter den kontinuerlige gradient-élueringsmetode. Antibiotikumkomponenterne elueres fortrinsvis ved en methanolkoncentration på 10%. Rensningsproceduren kan eventuelt gentages.

Ved tyndtlagskromatografi på silicagel (f.eks. med chloroform-methanol eller med ethylacetat-acetone-vand som elueringsmiddel) og bioautograf i med Candida albicans kan man isolere mindst fem antibiotisk aktive komponenter, hvis Rf-værdi i tyndtlagskromatogram på silicagel er angivet i tabel Is System 1 betegner chloroform-methanol (4:1}, to ganges gennemløb; system 2 betegner ethylacetat-acetone-vand (72:24:4), to ganges gennemløb.

5 U5193

Tabel I

Stof System 1 System 2

Papulacandin

Komponent A 0,35 0,41

Komponent B 0,27 0,32

Komponent C 0,24 0,28

Komponent D 0,45 0,74

Komponent E 0,47 0,51

Ca. 75% af papulacandinet består af komponent B, ca. 10% af komponent A.

Por komponenterne A og B bliver der ved rækkefortyndingsprøve med Candida albicans som forsøgsorganisme fundet minimale hæmningskoncentrationer (MIC) mellem 0,006 og 0,1 Y/ml.

Til afprøvning af antibiotikavirkningen i de enkelte isoleringstrin -såvel som i kulturmediet - egner Candida albicans sig særlig godt som forsøgsorganisme.

Papulacandin består - ifølge elementaranalyse af komponenterne A, D og E - kun af grundstofferne C, H og 0.

Antibiotikumet papulacandin B har følgende kemiske og fysiske egenskaber:

Det er et svagt surt, i pulverform hvidt stof. Det er opløseligt i alkoholer, f.eks. lavalkanoler, såsom methanol, ethanol, n-propanol, samt i ketoner, f.eks. dilavalkylketoner, såsom acetone,methyliso-butylketon, endvidere i dimethylformamid og dimethylsulfoxid; det er tungt opløseligt i ethylacetat og chlorerede carbonhydrider, såsom methylenchlorid, chloroform og tetrachlormethan (10-100 mg/liter); i vand, petroleumsether, ether, hexan er forbindelsen praktisk taget uopløselig. Smp. 193-197°C (sønderdeling).

Elementaranalyse (beregnet for C^yH^O.^).

C beregnet 62,65$, fundet 61,28$, H beregnet 7,16$, fundet 7*18$· 6 145199 [α]^° = +5.0,0 ±1° (c = 0,46 i methanol).

UV-spektrum i ethanol: W 232 - 42-000) 240 nm (e = 42.400) 268 nm (e = 44.800) 300 nm (e = 31.200).

IR-spektrum i KBr, se eksempel 3.

100 MHz - HMR-spektrum, se fig. 1.

På basis af damptryk-osmometrisk molekylvægtsbestemmelse af acetylderivatet kan molekylvægten anslås til 900-950. Antibiotikumet har ingen frie carboxyl- og ingen O-methylgrupper. I massespektrum kan der kun erkendes mindre fragmenter. En molekylion mangler, i c-NMR-spektrum kan der konstateres signaler fra 45-48 C-atomer. Sammen med resultaterne fra elementaranalysen og nedbrydningsforsøg af papulacandin kan der beregnes følgende bruttoformel: C^Hg^O-^.

Med eddikesyreanhydrid og pyridin kunne flere hydroxylgrupper, deraf 2 phenoliske, acetyleres. Om antallet af acetylgrupper kan der kun vanskeligt skønnes spektroskopisk. 1100 MHz-NMR-spektrum ses ved ca. 2 ppm signaler for flere acetylgrupper. Efter nedbrydningsforsøgene at dømme turde der være 9 acetylgrupper til stede. Molekylvægten blev bestemt osmometrisk til 1267. Por acetylderivatet fik man følgende fysisk-kemi-ske data:

Element ar analyse (beregnet for ^5^32026^ C beregnet 61,02$, fundet 60,74$, H beregnet 6,46$, fundet 6,50$.

UV-spektrum (i ethanol):

Vax 216 ^ = 23.200) 242 nm (e = 25.600) 268 nm (ε = 27.600) 295 nm (skulder).

IR-spektrum, se eksempel 6.

[a]^° = -6 -1° (c = 0,765 i chloroform).

Ved hydrogenering af papulacandin B blev der optaget 7 mol hydrogen. I 'Hi-NMR-spektrum for hydrogeneringsproduktet er alle signaler fra olefiniske protoner forsvundet. To aromatiske protoner ved 6,3 ppm er endnu syn- 7 145199 lige. IR-spektret i KBr er angivet i eksempel 7. f^djjoge^ln^KOduIctet har følgende fysisk-kemiske data:

Elementaranalyse (beregnet for C^H^gO^).

C beregnet 61,69$, fundet 60,94$, H beregnet 8,59$, fundet 8,56$, 0 beregnet 29,72$, fundet 30,10$.

Snip. 125-130°C.

UY-spektrum (i ethanol): w 270 ™ (s = 3·100)· [α]ρ^ = +7 -1° (c = 0,214 i methanol).

Antibiotikumet papulacandin komponent A har følgende kemiske og fysiske egenskaber: Det er et svagt surt, i krystallinsk form hvidt stof, der har de samme opløselighedsegenskaber som komponent B.

Smp. 171-173°C (sønderdeling).

Elementaranalyse: C fundet 61,88$ H fundet 7,34$ UV-spektrum (i ethanol): 232 nm (skulder) 242 < W = «5) 265 (emaX = 52°) IR-spektrum i KBr, se eksempel 3.

[a]^ = +30 ±1° (c = 0,419 i methanol).

Eigur 2 viser 100 MHz-NMR-spektret. Papulacandin A har ingen frie carboxyl- og O-^nethylgrupper. I massespektrum kan der kun erkendes mindre fragmenter. En molekylion mangler. Følgende bruttoformel er sandsynlig for papulacandin A: c^0-53^72-78^17-19' led eddikesyreanhydrid og pyridin kunne der acetyleres forskellige hydroxylgrupper. IR-spektret for acetylderivatet i methylenchlorid er angivet i eksempel 9. Det er vanskeligt at skønne over antallet af acetylgrupper. Formodentlig er der 9-11 ac^tylgrupper til stede. Acetylderivatet af papulacandin A har følgende fysisk-kemiske egenskaber:

Elementaranalyse: C fundet 61,91$ H fundet 7,22$ 0 fundet 30,81$.

g 145199 UV-spektrum (i ethanol) W 240 ™ (w = 270 > 262 nm (e = 330) [cc]-qU= -15 -1 (c = 0,249 i chloroform).

Ved mikrohydrogenering af papulacandin A optages 7 mol hydrogen.

Antibiotikumet papulacandin komponent D har følgende kemiske og fysiske egenskaber: Det er et svagt surt, i pulverform hvidt stof, der har lignende opløselighedsegenskaber som komponent B.

Smp. 127-130°C.

Elementar analyse 0 fundet 62,32$ H fundet .7,59$.

UV-spektrum (i ethanol)

Vax 230 ™ (W = 340) 235 nm skulder 261 nm (e = 320).

OCi 4- [α]ρ = + 7-1 (c = 0,250 i chloroform).

IR-sp.ektret i KBr er angivet i eksempel 5.

Antibiotikumet papulacandin komponent E har følgende kemiske og fysiske egenskaber: Det er et svagt surt, i pulverform hvidt stof,der har lignende opløselighedsegenskaber som komponent B.

Elementar analyse C fundet 64,71$ H fundet 8,43$.

UV-spektrum (i ethanol).

\nax 230 m (W " 270) 237 nm (skulder) 267 = 300) 292 nm (skulder).

IR-spektret i methylenchlorid er angivet i eksempel 5. Strukturbestemmelse for papulacandin B

Ved alkalisk hydrolyse af papulacandin B i 0,5 N methanolisk kaliumhydroxidopløsning kan der isoleres 3 brudstykker.

9 145199

Formelskema 1 Alkalisk hydrolyse af papulacandin B

Papulacandin B

0,5 N KOH

CH30H/H20 2 timer/RT

^ CH OH CH OH

: 2 4 |6 13 ioL-α P-, νννγχ/ν'γχ o.

1 3 5 CH3 CHj N_/ \|_/ 0H L· la: R = H: ClgH2803 3 lb: R = CH3 M+306 la) 6-Hydroxy-7,13-dimethylpentadeca· · 1,3,7,9-tetra-en-carboocylsyre v

1 3 5 OH

2a: R=H: C7nH.,.0„ — 10 14 3 2b: R=CH3 7-Hydroxy-nona-l,3,5-trien-carboxylsyre.

lb) 6-Hydroxy-7,13-dimethyl-pentadeca-l,3,7,9-tetra-en-carboxyl-syre-methylester.

Forbindelsen blev opnået ved ekstraktion af reaktionsopløsningen med ethylacetat ved pH 7,5 og påfølgende forestering med diazo-methan.

145199 ίο

Strukturen af denne 4 gange umættede C-16-fedtsyre blev fastlagt på følgende måde (se formelskema 2):

Formelskema 2; Nedbrydning af 6-hydroxy-7,13-dimethyl-pentadeca-1,3,7,9-tetra-en-carboxylsyre-roethylester__ OAc /™3 CiI3 _5 1H32°4 + M : 348

Pt02/C2H50H

un V

CH300C (CHz) 5fΤ'[CH2) 5fCH2CH3 I I OAe CH- lb ch3 ch3 ch3 j

Pt02/C2H50H - C H O C21H40°4 C19H30°3 \ + . X M : 356

M : 306 X A

\ (CH CO„) O/Pyr 1) 03/CH2Cl2/ X 3 2 2 -70°C Ψ CH OOC(CH ) CH-CH(CH.).CHCH.CH.

3 Z b|| 2 5| 2 3 2) H202/CH3C00H/HC1 0H CH3 CH3

3) CH-N/AO

Z Z 7 (CH3C00)2 + CH300CCH2CH2CHCH2CH3 C19H38°3 CH3 M+: 314 8 9_ lx 145199

Acetylering af methylesteren lb gav monoacetat 5 med massen 348. 13-Stillingen for methylgruppen fremgik af tolkning af 4^C-HMR-8pektret for 5. Hytoogeneringspraiuktet 6 af 5 viste ved MS en molekylion ved m/e 356 ..Hydrogenering af methylesteren lb gav på den anden side 7-hydroxy-8,14-dimethyl-palmitinsyre-methylester 7, hvis molekylion i MS blev fundet ved m/e 314. Dens monoacetat var atter identisk med den ovenfor beskrevne forbindelse 6. Den postulerede struktur af den aliphatiske gruppe blev så bevist ved en ozon-nedbrydning af methylesteren lb. Derved kunne der fra reaktionsblandingen gaskromatografisk påvises oxalsyre—Simethylester 8 og 4-methylcapronsyre-methylester 9 ved sammenligning med autentisk materiale.

2) 7-Hydroxy-nona-l,3,5-trien-carboxylsyremethylester.

Forbindelsen blev opnået ved ekstraktion af reaktionsopløsningen med ethylacetat ved pH 2,5 og påfølgende forestering med diazomethan. Ved hjælp af UV-, IR- og massespektrum (MS,med høj opløsning) og MR-spektroskopi (med dobbeltresonansforsøg) af methylesteren kunne den ovenfor postulerede struktur opstilles.

Strukturen af denne 3 gange umættede fedtsyre blev bekræftet ved oxidation af methylesteren med CrO^ (Jones-reagens) til den tilsvarende keton 4: 1) Cr03 H2S04 CH^OOC Λ Λ Λ n Λ Acetone CH-,000 A A Λ Λ 3 - 3 °H q , 2b 4 C11H16°3 M+ : 196 C11H14°3 M+ : 194 I MS før ketonen er der en molekylion til stede ved m/e 194. I HMR-spektret er protonen i 7-stil'ling forsvundet, 3) Sukkerdel C]_9H26°13

Dette brudstykke blev opnået af den resterendereaktionsopløsning efter neutralisation til pH 7,5 ved kromatografi på Sephadex-LH-20.

Tolkning af MS, af 100 MHz- og 360 MHz-MR-spektr.ene og af ^C-HMR-spektret med off-resonans-dekobling af acetatet 10a (se formelskema 3) taler for den foreslåede struktur.

12 145199

Formelskema 3: Nedbrydning af sukkerbrudstykket kf v„ _/ir or or y===/

OR

- R = H C19H26°13 JOa: R = C0CH3 M+ : 840 10b: R = COCD M+ : 367 j CHJ.

2 2

CH^OH/6 30'min. / 0°C

V

ch2cr ch2or OR CR i ' OCR +

Jb R « H 3 J2: R;- COCH : « 784

O

ru np 1,5 N HC1 / abs. CH OH

RO 2 48 timer/RT

, J~n 6timer/50 C .

V OR \ \i ^)-vwv OCH^ \f

OR CH^OR

13a: R = H : α-D-forci /w- ^V^GCH

13b: R = H : B-D-fbrm \ ---s~ - R° OR 1- \ „ m OCH \v H5

Ik: R= C0CH3: α-D-for* Jgs R . Hs H+; 328 \.

— R = C0CH3: 16; R = -C0CH3: M+: 496 o/\^NN/CCM' οΛ-ζΤ ' im} il_ : H+ 194 13 145199 I MS for acetatet 10a findes en molekylion ved m/e 840. Acetylering med deutero-eddikesyreanhydrid gav 10b, hvis molekylion i MS blev fundes ved m/e 867. Dermed er nærværelsen af 9 acetylgrupper bevist.

Methanolyse af 3 gav ingen tilfredsstillende resultater. Fremfor alt kunne det aromatiske brudstykke ikke isoleres. Derfor blev 3 med diazo-methan overført til dimethylderivatet 11, der ved acetylering gav et hepta-acetat 12 med M+ ved m/e 784. Methanolyse af 11 gav så 3 brudstykker, nemlig methyl-a-D-galacto-pyranosid 13a, lidt methyl-B-D-galacto-pyranosid 13b, hvis tetraacetater 14a og 14b var identiske med autentisk materiale, og forbindelse 15, der i MS gav en molekylion ved m/e 328 (høj opløsning: O-j^E^qOq). Acetylering af 15 gav tetraacetatet 16 med M+ ved m/e 496. Endelig gav periodatspaltning af 15 med periodsyre forbindelse 17, der i MS viste en molekylion ved m/e 194. Ifølge tolkning af 360-MHz-SIMR-spektret for 10a er galactoseresten sammenknyttet β-glycosidisk med den resterende del af molekylet.

Hvis man adderer bruttoformlerne for de 3 fundne brudstykker under den antagelse, at de to fedtsyrer er sammenknyttet esteragtigt med sukker-brudstykket, kommer man til følgende bruttoformel for papulacandin B: ^47H64^17» molekylvægt 900. Den stemmer overens med resultaterne af e 1 em en t aranaly s en.

14 145199 -μ 3 σ> G Η Ό

μ G

tji 0 ø U G 0 0 4-) tn

co G

0 Ή

G

•P +> 0 · >ι -G H G G >ι X G X G Λ O g M g G Ό 6 0 >i G .G co μ I 0 G G G 0 O >i M 4-) W Al +> 3 +> +> -000¾

0 -OG

m -o ø ø ø -μ m n > m s æ " Λ S I * v I Λν-° _ww\

1 Y

^ /\ « -L

• 0 S3 Q 1—O μ

O <D

}j cm μ 3 æ g μ

s U-W I

G ν' i c

Li I CO 0 4J o ^ c g co T S S 1 tP /\ ^ ” s §,/v§ ° ? 5 “-J§_ ~υ\/\/ν/\/\^ΛνΛν/\ § 7v7 ό ύ

S u sT aT

15 145199

Struktur af papulacandin A

Ifølge spektroskopiske sammenligninger mellem papulacandin A og papulacandin B og præliminære hydrolyseforsøg indeholder komponent A ligeledes 6-hydroxy-7,13-dimethyl-pentadeca-l,3,7,9-tetraen-carboxyl-syre og det samme sukkerbrudstykke og adskiller sig formodentlig i den anden fedtsyre ved 1 ekstra methyl- og 3-4 ekstra methylengrupper.

På baggrund af yderligere analytiske undersøgelser, især 360 MHz NMR 13 og C NMR-spektret og massespektroskopi tillægges papulacandin B følgende strukturformel: VL4" VH3 \-CH_ HO-/8" 7"\

O HO X

x”vwJv" \ 7

0=C 3 OH

ho 6' 3' OH 4 6fH2

OH

På tilsvarende måde tillægges papulacandin A, C og D følgende formler: 16 145199

Papulacandin A

\14" /"CH3

X

Λ,-ch

H0-/8" J

7VS

0 \ i*1"' 8'" / ’ o'\WA \ Q’^X8 13

I 0=C 3 S“0H

H0 fi·· 1 g ϋ ch o Y 2/ /ίο u

4 ^ \ 1' / 5 J OH

3' OH 4 6L

7*2

OH

Sumformel: C4?H66016, molekylvægt: 896 Papulacandin C

\14" X-ch3

\-CH

HO-/8" 7"\

0 V

Hr" > 7 o- \8 13

I 3 OH

H9 6*' H0

4* ^^K2'\ , / 5 / OH

HcXJ^T^\iX-o--—/—Γ^ο 3 · I 4 6*

J OH CH

1 Δ OH

Sumformel: C47Hg4017, molekylvægt: 900.

17 145199

Papulacandin D

,/14" >CH3 >-CH HO^/8" 3 7 > 13 ,^μΟ> / - 2 / [10 11

OH

4 6ch9 I 2

OH

Sumformel: C3iH42°10' molekylvæ9t: 574.

Strukturen af papulacandin E er endnu ikke klarlagt.

Estere af papulacandin eller dets komponenter er f.eks. sådanne, i hvilke de alkoholiske hydroxylgrupper er foresteret med carboxylsyrer eller thiocarboxylsyrer med 1-20 carbonatomer. Sådanne syrer er fremfor alt eventuelt substituerede lavalkansyrer med 1-6 carbonatomer, såsom myresyre, eddikesyre, propionsyre, pivalin-syre, endvidere eventuelt substituerede mono- eller bicycliske aromatiske eller araliphatiske syrer, såsom benzoesyre, thiobenzoe-syre, naphthalensyre, phenyllavalkansyrer, såsom phenyleddikesyre, phenylpropionsyre, substituenter i syrerne er f.eks. halogen, såsom fluor, chlor, brom, iod, trifluormethyl, nitro, frie, fores ter ede eller foretherede hydroxylgrupper, f.eks. lavalkanoyl-oxy, såsom acetoxy, lavalkoxy, såsom methoxy, lavalkylmercapto, såsom methylmercapto, frie eller funktionelt omdannede carboxyl-grupper, f.eks. lavalkoxycarbonyl, såsom methoxycarbonyl, carbamoyl, cyan, eventuelt substituerede aminogrupper, f.eks. mono- eller di-lavalkylerede eller N-acylerede aminogrupper, f.eks. methyl-amino, dimethylamino, lavalkanoylamino, f.eks. acetylamino.

18 145199

Ethere er især forbindelser, i hvilke en eller begge phenoliske hydroxy Igrupper er foretheret med alkoholer, i første række lavalkanoler, fremfor alt methanol.

Antibiotikumet papulacandin og dets derivater har ved siden af deres antifungiske virkning på trådsvampe (hyphomyceter), såsom Trichoderma mentagrophytes, fremfor alt en særdeles god specifik virkning mod forskellige arter af gæragtige svampe, såsom Candida albicans, Torulopsis dattila, Torulopsis famata og Hansenula anomale. Således andrager f.eks. ved in vitro-prøvning ved gradient-plade-stregprøven (W. Szibalski, Science 116, 46 [1952]) den minimale hæmningskoncentration overfor ca. 20 forskellige klinisk forekommende stammer af Candida albicans 0,006 til 0,1 Y/ml. Papulacandin udmærker sig ved meget ringe toksicitet i sammenligning med kendte antifungisk virkende antibiotika. Det omhandlede antibiotikum og dets derivater kan derfor anvendes til bekaanpelse af infektioner, der fremkaldes af de nævnte svampe, især Candida albicans, eller som desinfektionsmidler.

Antibiotikumet papulacandin og dets derivater kan som nævnt anvendes som lægemidler, f.eks. i form af farmaceutiske præparater. Disse indeholder de nævnte forbindelser i blanding med et til topisk, enteral eller parenteral anvendelse egnet farmaceutisk organisk eller uorganisk bæremateriale. Til dette formål kommer sådanne stoffer i betragtning, der ikke reagerer med de omhandlede forbindelser, såsom gelatine, lactose, stivelse, magnesiumstearat, planteolier, benzylalkoholer, eller andre kendte lægemiddelbærere. De farmaceutiske præparater kan f.eks. •foreligge som tabletter, dragåes, pulvere, suppositorier eller i flydende form som opløsninger, suspensioner, emulsioner, cremer eller salver. Eventuelt er de steriliserede og/eller indeholder hjælpestoffer, såsom konserveringsmidler, stabiliserings-, befugtnings- eller emulgeringsmidler. De kan også indeholde andre terapeutisk værdifulde stoffer.

Opfindelsen beskrives nærmere i de efterfølgende eksempler.

På tegningen viser:

Pig. 1: ^H-ME-spektrum i methanol med tungt hydrogen CD^OD for papulacandin B.

Pig. 2: ^fflP-spektrum i CD^OD for papulacandin A.

19 '**'**

Eksempel 1.

Et godt bevokset skråagarrør af Papularia sphaerosperma A 32283 opslæm-mes med 5 ml 0,2 M phosphatpuffer med pH 7. 3 Erlenmeyerkolber med 1 chikane (indbugtning, "baffle") hver med 100 ml næringsopløsning, der pr. liter ledningsvand indeholder 20 g sojabønnemel og 20 g mannitol, og hvis pH før sterilisationen er indstillet med 1 N natriumoxidopløs-ning på 8,5, podes hver med 5 ml af Papularia-suspensionen og inkuberes i 48 timer på en roterende rystemaskine med 250 opm ved 23°C. 25 ml af den således vundne kultur podes i hver af 6 2-liter-Erlenmeyer-kolber med 4 chikaner og 500 ml af ovennævnte næringsopløsning. Kolberne inkuberes derpå ved 23°C på en roterende rystemaskine med 120 opm i 48 timer.

1.5 liter af kulturen fra 2-liter-kolbeme overføres til en 50-liter-fermenter, der indeholder 30 liter af ovennævnte næringsopløsning, og inkuberes i 48 timer ved 23°C. Derpå overføres 15 liter af kulturen til en fermenter med 300 liter af ovennævnte næringsopløsning. Denne fermenter har et totalvolumen på 500 liter og har en 6-bladet turbine-omrører og 4 chikaner (skvulpeplader "baffles"). Dyrkningsbetingelserne i fermenteren er: Tryk 1 ato, omrørehastighed 450 opm, temperatur 23°C, luftgenn emgang 1 liter v/v/min. Betingelserne svarer til en i sulfitopløsning målt oxygenabsorptionsrate på 200 mm Og/l/h. Den optimale dannelse af antibiotikumet A 32283 sker efter ca. 60 timers inkubation. Kulturopløsningen har så en pH-værdi på 6,7- Den har en aktivitet på 10-12 mm hæmningszone ved agardiffusionsprøve med Candida albicans under anvendelse af Whatmann A discs 0 6 mm.

Eksempel 2.

600 liter af den ifølge eksempel 1 opnåede kulturopløsning filtreres under tilsætning af 2$ filterhjælpemiddel "Decalite" (diatoméjord).

560 liter kulturfiltrat indstilles med natriumhydroxidopløsning på pH

8.6 og ekstraheres på en kontinuerlig ekstraktor to gange med ethyl-acetat i forholdet 2:1. Det inaktive vandige raffinat bortkastes. 600 liter ethylacetatfase koncentreres i vakuum. Der fås et koncentrat på 45 liter.

91 kg mycelium fra ovennævnte filtrering røres op 1 x med 200 liter og 1 x med 100 liter methanol, og der filtreres hver gang. Det inaktive mycelium bortkastes. 300 liter methanolekstrakt koncentreres i 20 145199 vakuum. Der fås en vandig mycelium-ekstrakt på 33 liter, der indstilles med HaOH på pH.8,4 og ekstraheres 2 x liver gang med 66 liter ethylacetat. Det inaktive vandige raffinat bortkastes.

120 liter mycelium-ethylacetatekstrakt forenes med ovennævnte 45 liter kulturf iltrat-ethylac etat ekstrakt og koncentreres i vakuum. Der fås 1,85 liter ethylaeetatekstrakt-koncentrat,til hvilket der sættes 2 liter 85$' s methanol, og som ekstraheres 3 x hver gang med 2 liter petroleumsether. De inaktive petroleumsetherfaser bortkastes, og methan-olfasen inddampes i vakuum til tørhed. Der fås 51 g mørkebrun, sejtflydende remanens, der opløses i 200 ml 85$'s methanol og ekstraheres 2x hver gang med 300 ml heptan. De inaktive heptanfaser bortkastes. Methanolfasen inddampes og tørres i højvakuum. Der fås 41,8 g ekstraktremanens.

Eksempel 3.

Af den ifølge eksempel 2 opnåede ekstrakt-remanens kromatograferes 18 g på en søjle (0 5,4 cm, h = 140 cm), der består af en (95:5 vægt: vægt)-blanding af 1000 g silicagel (Merck komstørrelse 0,05-0,2 mm) og 50 g aktivt kul Horit®. Blandingen af silicagel-aktivt kul blev forud opslammet 3 gange med methanol og derpå 3 gange med chloroform og filtreret. De 12,3 g ekstrakt-remanens opløses i 50 ml methanol, blandes med 50 g silicagel, og blandingen inddampes til tørhed. Den tørrede pulverformige remanens sættes til søjlen. Elueringen sker i fraktioner hver på 1 liter med chloroform-methanolblandinger under trinvis forøgelse af koncentrationen af methanol. Man begynder med et methanolindhold på 4$ og hører op med 50$ methanol. Gennemløbs-hastigheden andrager 500 ml/time. Fraktionerne inddampes i vakuum, og remanensen tørres i højvakuum. Fraktionerne forenes så på basis af tyndtlagskromatografisk og bioautografisk prøvning. Fraktionerne 1-16 (elueret med 1-4$ methanol) er kun svagt aktive og bortkastes. Fraktionerne 17-23 (elueret med 4-7$ methanol) indeholder papulacandin D og E (yderligere rensning se eksempel 5). Fraktionerne 24-27 (elueret med 7$ methanol) indeholder papulacandin A. Fraktion 28 (elueret med 10$ methanol) indeholder en blanding af papulacandin A og B. Fraktionerne 29-31 (elueret med 10$ methanol) indeholder papulacandin B. Fraktionerne 32 og 36 (elueret med 10-20$ methanol) indeholder foruden papulacandin B også papulacandin C med mindre Rf-værdi. De resterende fraktioner (elueret med 20-50$ methanol) indeholder yderligere aktive stoffer i små mængder.

21 145199

Til isolering af papulacandin B fældes remanensen af fraktionerne 29-31 (1,86 g) af acetone/ether. Der fås 1,5 g rent papulacandin B som et farveløst pulver med smp. 193-197°C (sønderdeling). Til isolering af rent papulacandin A krystalliseres remanensen fra fraktionerne 24-27 (1,5 g) af acetone/ether. Der fås 1,2 g rent papulacandin A som et farveløst pulver med smp. 171-173°C.

Panulacandin B

Elementaranalyse giver følgende værdier: C = 60,45$; H = 6,99$; 0 = 32,62$. Antibiotikumet viser i IR-spektrum i kaliumbromid bånd ved 3450, 2975, 2925, 2875, 1690, 1640 (skulder), 1615, 1465, 1380, 1345, 1300, 1260, 1180, 1150, 1070, 1035, 1005, 970, 865 og 845 om"1. I UV-spektrum i ethanol er følgende maksima til stede: 232 nm (e = 42.000), 240 nm (ε = 42.400), 268 nm (e = 44.800), 300 nm (e = 31.200) Den optiske drejning andrager = +50 ±1° (c = 0,458 i methanol).

Bruttoformlen lyder C^H^O^.

1H-NMR-spektret i CD^OD er vist i fig. 1. I tyndtlagskromatogram på silicagel (kiselfærdigplader ^254 fra fa* Merck) i systemet chloroform-methanol (4:l) er Rf-værdien =0,4 ved tre ganges gennemløb. Påvisning med UV, iod eller koncentreret svovlsyre og opvarmning. Ved mikrohydrogenering forbruges 7 ækvivalenter hydrogen.

Papulacandin A

Elementaranalyse giver følgende værdier: C = 62,98$; H = 7,45$; 0 = 29,09$. Antibiotikumet viser i IR-spektrum i kaliumbromid bånd ved 3450, 2950, 2870, 1690, 1630, 1610, 1465, 1410, 1380, 1340, 1300, 1265, 1155, 1075, 1035, 1010, 975, 860 og 845 cm"1. I UV-spektrum i ethanol er der følgende maksima til stede: x^^ (e ^): 232 nm (skulder), 242 nm (e = 425) og 265 nm (e = 520). 1H-RMR-spektret i 20 CD^OD er vist på fig. 2. Forbindelsen viser en optisk drejning [a]^ = +3l -1° (c = 0,451 i methanol). I tyndtlagskromatogram på silicagel (kiselgelfærdigplader ^254 ^ra ^a· KerCk) i systemet chloroform-methanol (4:l) er Rf-værdien = 0,50 ved tre ganges gennemløb. Påvisning med UV, iod eller koncentreret svovlsyre og opvarmning. Ved mikrohydrogienering forbruges 6-7 ækvivalenter hydrogen.Den omtrentlige bruttoformel lyder C50-53H72-78°17-19' 145199 22

Eksempel 4.

Af de ifølge eksempel 3 opnåede fraktioner 67-70, der indeholder papulacandin B, kromatograferes 2,1 g på en søjle (0 = 4 cm, h = 50 cm), fyldt medaSephade3#-EH-20 (5,5 liter). Sephadex-LH-20 (alkyleret tværbundet dextran) blev forud kvældet i 4 timer i methanol. De 2,1 g papulacandin B opløses i 5 ml methanol og sættes til søjlen. Eluerin-gen sker med methanol i fraktioner på 22 ml. Hastigheden andrager 90 ml/time. Fraktionerne befries i vakuum for opløsningsmiddel, og remanensen tørres i højvakuum. Eluateme af fraktionerne 1-15 (120 mg) er kun svagt aktive og bortkastes. Fraktionerne 16-27 indeholder 1,9 g rent papulacandin B, der fældes af acetone/ether. Egenskaberne fremgår af eksempel 3.

Eksempel 5.

De ifølge eksempel 4 opnåede fraktioner 17-23 (1,5 g), der i små mængder indeholder papulacandin D og E, opløses i acetone. Efter længere tids henstand ved 0°C udkrystalliserer et inaktivt stof. Moderluden indeholder beriget papulacandin D og E. Ved præparativ tykt-lagskromatografi på kiselplader (100 x 20 cm, 1 mm lagtykkelse) i systemet ethylaeetat-acetone-vand (72:24:4) kan de to komponenter skilles fra hinanden. Papulacandin D og E fældes af acetone/ether/ hexan som farveløse stoffer.

Papulacandin D

.iR-spektrum viser bl.a. bånd ved 3500, 2950, 2870, 1705, 1675, 1640, 1620, 1465, 1385, 1350, 1300, 1260, 1205, 1150, 1070, 1035, 1005, 975 cm-·*·. Andre fysisk-kemiske egenskaber, se beskrivelsens almene del.

Papulacandin E

IR-spektrum viser bl.a. følgende bånd: 3500, 2950, 2870, 1710, 1640 (skulder), 1615, 1465, 1385, 1350, 1300, 1240, II85 (skulder), 1150, IO7O, 1040, 1010, 975 cm Andre fysisk-kemiske egenskaber, se beskrivelsens almene del.

„ 145199 23

Eksempel 6

Papulacandin B, fremstillet som i eksempel 3 eller 4, acetyleres som følger: 250 mg papulacandin B henstilles med 2 ml pyridin og 2 ml eddikesyreanhydrid i 3 timer ved stuetemperatur. Derpå inddampes reaktionsblandingen i vakuum og kromatograferes på 30 g kiselgel med chloroform, der indeholder 1% methanol. Der fås 300 mg farveløst, amorft acetat, der fældes to gange af ether og hexan. I IR-spektrum i methylenchlorid for acetylderivatet er der følgende bånd til stede: 2970, 2870, 1755, 1645, 1620, 1425, 1375, 1225, 1195, 1125, 1080, 1050, 1015, 970 og 890 cm"1. UV-spektret i ethanol har maksima ved 216 nm (ε = 23.200)» 242 nm (ε = 25.600) 268 nm (ε=27.600) og 295 nm (skulder). Elementaranalyse giver: C = 60,74%, H = 6,51%. Osmometrisk findes en molekylvægt på 1250.

Eksempel 7

Papulacandin B fremstillet som i eksempel 3 eller 4 hydrogeneres som følger: Til 50 mg platinoxid, der er forhydrogeneret i 15 ml ethanol i et hydrogeneringsapparatur, sætter man 250 mg papulacandin B. Der optages 44 ml hydrogen, hvad der svarer til 6,8 ækvivalenter. Efter filtrering og inddampning af filtratet fås 243 mg farveløs remanens, der kromatograferes på 50 g kiselgel med chloroform, der indeholder 8% methanol. Der fås 106 mg rent hydrogenerings-produkt.

IR-spektrum (i KBr) viser bånd ved: 3500, 2950, 2860, 1720, 1610, 1465, 1385, 1250, 1185, 1150, 1095, 1070, 1030, 1005, 980 cm"1. I 1H-NMR-spektrum er signalerne fra de olefiniske protoner i komponent B forsvundet.

Andre fysisk-kemiske egenskaber, se beskrivelsens almene del.

Eksempel 8

Antibiotikumet papulacandin B fremstillet som i eksempel 3 eller 4 methyleres som følger: 200 mg af komponent B, opløst i 2 ml methanol, henstilles ved 0°C i 30-45 minutter med en opløsning af diazomethan i ether. Efter inddampning fås 210 mg remanens. Methyletherderiva-tet fås ved præparativ tyndtlagskromatografi på silicagel-tyktlags-plader i systemet chloroform-methanol (5:1). Der fås 106 mg farveløs, amorf papulacandin B-monomethylether, der fældes af acetone/ ether/hexan. I IR—spektrum (i KBr) er der følgende bånd til stede: