DK143250B - Vandig gel af calciumphosphat til brug som adsorphtionsmiddel for antigener samt fremgangsmaade til fremstilling heraf - Google Patents

Description

||| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT ου 11)-3250 B

(19) DANMARK

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 1876/73 (51) Int.CI.3 A 61 K 47/00 (22) Indleveringsdag 6. apr. 1973 (24) Løbedag 6. apr. 1973 (41) Aim. tilgængelig 7. okt. 1973 (44) Fremlagt 3· aug. 1981 (86) International ansøgning nr. - (86) International indleveringsdag - (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 6. apr. 1972, 72120 36, FR

(71) Ansøger INSTITUT PASTEUR, Paris 15eme, FR.

(72) Opfinder Edgar Hans Relyveld, FR.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Lehmann & Ree.

(54) Vandig gel af caleiumphosphat til brug som adsorptionsmiddel for an= tigener samt fremgangsmåde til fremstilling heraf.

Den foreliggende opfindelse angår en vandig gel af calcium-phosphat til brug som adsorptionsmiddel for antigener samt en fremgangsmåde til fremstilling heraf.

Fordelene ved adsorberede vacciner er kendte. Den koncentrerede form, hvori de kan være til stede, har den fordel, at der kun kræves ringe plads til deres opbevaring, samtidig med at det ud fra denne form er muligt på et hvilket som helst tidspunkt at fremstille OQ meget store mængder af vaccine i løbet af et meget kort tidsrum.

^ Dette forhold er særlig værdifuldt i tilfælde af epidemier eller an- C\] den overhængende nødsituation. De adsorberede præparater, der for- ^ bliver stabile i adskillige år, muliggør en væsentlig nedsat kontrol r~ af deres fortyndingsprodukter, idet de nødvendige titreringsanalyser y, gennemføres på de koncentrerede produkter. Af disse årsager har de O adsorberede vacciner været genstand for talrige undersøgelser, der ikke alle har ført til tilfredsstillende resultater. I virkeligheden har størstedelen af adsorbenter, der er blevet foreslået, den ulempe, at de udgør irritamenter, at de adsorberer antigenerne dår- 2 143250 ligt, eller at de er vanskelige at tilpasse til industriel målestok. Der er opnået visse fremskridt ved anvendelse af en calciumphosphat-gel fremstillet ved hjælp af den kendte metode ifølge Tiselius, d.v.s. en gel dannet af brushit, hvis phosphat har formen PO^HCa,21^0. Selv i denne form adsorberer gelen imidlertid ikke tilstrækkeligt med antigener i alle tilfælde af interesse, og ret ofte lader dens uskadelighed meget tilbage at ønske. I beskrivelsen til belgisk patent nr. 721.141 er der beskrevet en yderligere forbedret på calciumphosphat-gel adsorberet vaccine fremstillet ved udfældning af phosphatet i et medium indeholdende antigenet.

Fra beskrivelsen til østrigsk patent nr. 282.822 kendes en fremgangsmåde til fremstilling af vacciner af den i indledningen angivne art. Ved denne kendte fremgangsmåde hældes en vandig calcium-chloridopløsning hurtigt i en antigenholdig vandig opløsning af dina-triumphosphat, hvorved der dannes et bundfald i form af en gel. Den ved denne fremgangsmåde dannede gel indeholder calcium og phosphor i et vægtforhold, Ca/F, der normalt ligger i intervallet 1,35-1,55.

Formålet med opfindelsen er at tilvejebringe en gel, som har en mindre sedimentationshastighed og en mindst lige så stor adsorptionsevne med hensyn til vacciner, som de kendte geler.

Dette formål opnås med gelen ifølge opfindelsen, hvilken gel er ejendommelig ved, at den indeholder calcium og phosphor i et vægtforhold Ca/P, som er større end 1,55 og højest 1,90, og fortrinsvis ligger i intervallet 1,62 til 1,85.

Ved anvendelse af gelen ifølge opfindelsen kan der fremstilles stærkt koncentrerede og stabile vacciner, hvis injektion ikke forårsager nogen irritationer eller komplikationer. Endvidere kan den anvendes til adsorption efter at være blevet fremstillet, og det er ikke længere nødvendigt, at den fremstilles i et medium indeholdende antigenet for at bevare dens gode egenskaber.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af en gel af den beskrevne art. Denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en opløsning af calciumchlorid i vand i løbet af et tidsrum på mindre end 3 minutter og fortrinsvis på fra 2 til 30 sekunder hældes i en vandig opløsning af omrørt dinatriumphosphat, og at pH for blandingen under kontinuerlig omrøring efter afslutningen af calcium-chloridtilsætningen indstilles til en værdi meget nær 7, fortrinsvis på fra 6,8 til 7,2, og at den således opnåede gel derefter dekanteres og vaskes.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er baseret på den overraskende iagttagelse, at den meget hurtige tilsætning af calciumsalt 3 143250 fører til et calciumphosphat, der er forskelligt fra brushit og dibasiske phosphater, der dannes, når en vandig opløsning af calci-umchlorid gradvis under omrøring sættes til en opløsning af dinatriumphosphat» Det phosphat, der udgør gelen ifølge den foreliggende opfindelse, har i virkeligheden en kemisk sammensætning, der nærmer sig tricalciumphosphat (P04)2Ca3, medens de phosphater, der hidtil har været anvendt til vaccineadsorption, har en sammensætning som brushit, PO^HCa, eller nær denne sammensætning. Når blandingen gennemføres ved den forøgede hastighed, der er tale om i forbindelse med den foreliggende opfindelse, forbliver en del af phosphorionerne 1 opløsning, hvorved udfældningsproduktet bliver rigere på calcium, end teorien ville indicere, selv om mængderne af udgangsmaterialer, dinatriumphosphat og calciumchlorid er ækvimolære.

Molariteten af de opløsninger, der anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, kan hensigtsmæssigt ligge mellem 0,01 og 0,5, idet foretrukne værdier er fra 0,05 til 0,1. Indenfor disse grænser kan den vandige opløsning af calciumchlorid have en koncentration, der afviger fra dinatriumphosphatets, men dens rumfang har en sådan størrelse, at der i den endelige blanding er stort set 1 mol af den ene pr. 1 mol af den anden af reaktanterne.

Selv om varigheden af tilsætning af calciumsaltet til dina-triumphosphatet kan være op til tilnærmelsesvis 3 minutter, er det at foretrække, at den ikke overstiger 1 minut. Der opnås udmærkede resultater, når der arbejdes med sådanne rumfang, at det er muligt på en gang at hælde den vandige opløsning af CaC^ i opløsningen af dinatriumphosphat. Med mængder af størrelsesordenen 50 liter er det således muligt at gennemføre blandingen i løbet af et tidsrum på 2 til 30 sekunder.

En praktisk måde til gennemførelse af blandingen består i at anbringe opløsningen af dinatriumphosphat i en beholder eller kumme, der er forsynet med omrørerorganer, og hurtigt udtømme i denne beholder indholdet af en beholder, der indeholder det tilsvarende rumfang calciumchlorid, idet omrørerorganerne er i funktion under dette trin, og omrøringen fortsættes,efter at indføringen af CaC^ er blevet afsluttet. Særlig gunstige resultater opnås ved anvendelse af en vibrator, men omrøringen kan også gennemføres ved hjælp af andre apparater, såsom en skovlomrører eller en turboblander.

Et yderligere vigtigt karakteristisk træk ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er som nævnt indstillingen af pH for den opnåede blanding såsnart som muligt efter tilsætning af calciumchloridet.

På dette tidspunkt indstilles pH-værdien som nævnt til en værdi, der 4 143250 er lig med eller meget nær 7, især mellem 6,8 og 7,2, idet området 7 til 7,2 foretrækkes. Denne indstilling foretages ved hjælp af en opløsning af natriumcarbonat, hvis foretrukne koncentration ligger mellem 0,1 N og IN.

Som omtalt ovenfor skal indstillingen af pH-værdien følge så hurtigt som muligt efter indføring af CaCl2 i den vandige opløsning af dinatriumphosphat. I praksis er det ønskeligt, at denne indstilling finder sted mindre end 10 minutter efter fremstilling af blandingen.. For at opnå bedre resultater foretrækkes det, at indstillingen af pH-værdien sker umiddelbart, d.v.s. den skal finde sted i løbet af de 30 til 90 sekunder, der følger efter fremstilling af blandingen. De ovenfor omtalte skridt gennemføres ved temperaturer, der kan variere mellem 5° og 40°C; i praksis kan de gennemføres ved stuetemperatur.

En foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at reaktionsblandingen henstilles, indtil 80 til 90% af dets samlede rumfang er fraskilt som et overliggende lag af klar væske, der derefter fjernes, idet disse trin med henstand og fjernelsesbehandlinger fortrinsvis gentages 2 til 4 gange. Herved opnås et relativt stort udbytte af udfældningsproduktet, samt en god adsorberende evne. Henstillingen kan foregå ved almindelig temperatur eller i et køleskab og varer almindeligvis 6 til 18 timer.

Undersøgelse af den opnåede gel og af den fraskilte væske viser, at alt det oprindelige calcium findes i phosphatudf ældnings-produktet, medens en del af PO^-ionerne forbliver i opløsning i den klare væske, der ledsager gelen. Sidstnævnte karakteristiske træk er et indicium på et udfældningsprodukt, der fører til en phosphat-gel med en sammensætning, der ligger nær tricalciumphosphat, og som besidder de forbedrede egenskaber som omtalt ovenfor.

Efter fradekantering af den klare væske sættes en 0,4% til 0,9% opløsning af natriumchlorid i vand til gelen, idet opløsningens rumfang er af samme størrelsesorden eller er lig med rumfanget af den fradekanterede væske. Det hele blandes ved hjælp af en vibrator og får igen lov til at bundfælde. Det friske lag af klar overliggende væske fjernes atter og erstattes igen med en lignende opløsning af natriumchlorid. Denne behandling kan om ønsket gentages en tredie gang for at fuldende vasken af gelen.

En rensning af gelen af calciumphosphat er af stor betydning. Det har således vist sig, at de phosphorioner, der er til stede i opløsningen, hindrer adsorption af visse antigener. Ved den beskrevne fremgangsmåde forbedres adsorptionen ved fjernelse af disse ioner.

5 143250

Denne fjernelse gennemføres hensigtsmæssigt ved den ovenfor omtalte vask af gelen med en saltopløsning. Fortrinsvis gennemføres vasknin-gen ved fortynding med en vandig opløsning af NaCl fulgt af dekantering; behandlingen gentages om nødvendigt flere gange. Det anbefales især at anvende en opløsning af NaCl indeholdende fra 4 til 9 g af dette salt pr. liter; den afsluttende fortynding af vaccinen med en sådan opløsning er gunstig for vaccinens virkning.

Den således vaskede færdige gel indeholder almindeligvis en sådan mængde phosphat, at dens phosphorindhold pr. liter er fra 0,3 til 1,5 g og fortrinsvis fra 0,7 til 0,85 g. Den gennemførte totale kemiske analyse fører for gelens phosphat til en sammensætning, der ligger mellem sammensætningerne af dicalcium- og tricalciumphosphater; i praksis finder man molforhold for Ca/PO^, der varierer mellem 1,20 og 1,45 og hovedsagelig mellem 1,25 og 1,38, hvilket svarer til vægtforhold for Ca/P på fra 1,55 til 1,90 og hovedsagelig 1,62 til 1,85; vægtforholdet Ca/P for brushit, PO^CaH,21^0, er 1,29 og for (PO^^Ca^ 1,98. Den samlede sammensætning af phosphatet i gelen ifølge den foreliggende opfindelse ligger i nærheden af P04CaH(P04)2Ca3, hvori Ca/P er 1,72 (molforhold Ca/P04 = 1,33).

Den opnåede gel steriliseres i en autoklave ved 120°C i 1 time, hvorefter pH-værdien indstilles på fra 6,8 til 7,2 og fortrinsvis i området fra 7 til 7,2 for at korrigere for den formindskelse af pH til omkring 6,5, der sker under sterilisationen. Den er nu klar til at tjene som adsorbent for forskellige antigener på i og for sig kendt måde. Det er klart, at udtrykket antigen i den foreliggende beskrivelse omfatter alle arter af mikrobielle sekretionsstoffer, f.eks. anatoxinerne, såvel som hele mikroorganismer, såsom bakterier, virusarter eller andet eller visse af deres fraktioner.

Det skal bemærkes, at med de udfældede phosphater er det muligt at bringe gelen til at adsorbere en eller flere forskellige antigener, selv når denne gel allerede forud har adsorberet et andet antigen. På basis af gelen ifølge opfindelsen kan der således også fremstilles blandede vacciner ved tilsætning af en calciumphosphat-gel, der har adsorberet et nærmere bestemt antigen til en opløsning indeholdende et eller flere andre antigener.

Ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan en eller flere arter af antigener være til stede i udfældningsmediet, specielt i udgangsopløsningen af dinatriumphosphat; der opnås således direkte en gel indeholdende adsorberede antigener. Efter fra-skillelse af moderlud og vask, er denne gel i stand til yderligere at adsorbere andre antigener; det er således muligt at opnå blande 6 143250 de adsorberede vacciner ved successive behandlinger, hvoraf den første er en adsorption in situ under udfældningen, og den anden er en adsorption på allerede dannet gel.

Den foreliggende opfindelse vil blive belyst nærmere i de efterfølgende ikke-begrænsende eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling af adsorberede poliomyelitisvacciner.

Til 50 1 af en 0,07 M opløsning af dinatriumphosphat, der omrøres kontinuerligt ved hjælp af en vibrator, sættes 50 1 af en 0,07 M opløsning af calciumchlorid i løbet af 28 sekunder; blandingens pH indstilles på 7,1 med en opløsning af normal natriumcarbonat efterfulgt af tilsætningen af CaC^. De 100 1 calciumphosphatgel, der således er opnået, får lov til at henstå indtil dekantering af 85 1 af væsken; den klare overliggende væske fraskilles ved hjælp af hævertvirkning og erstattes med 85 1 af en vandig opløsning af NaCl indeholdende 4 g/1. Der gennemføres derefter en anden vask ved dekantering af saltopløsningen og en yderligere tilsætning af 85 1 af 4 g NaCl pr. 1 vand. De 100 1 opslæmning, der opnås, steriliseres ved 120°C, hvorefter dens pH indstilles på 7; produktet får lov til at henstå, og derefter fradekanteres 85 1 af den overliggende væske.

Til de 15 1 gel, der er til rest i bunden ar beholderen, sættes 100 1 af en vandig opløsning af poliomyelitisvaccine; blandingen omrøres i 30 minutter ved hjælp af en vibrator. De 115 liter produkt får derefter lov til at henstå indtil dekantering af 100 1 af klar overliggende væske; sidstnævnte fraskilles, idet der efterlades 15 1 af en opslæmning af calciumphosphatgel med adsorberet poliomyelitisvaccine.

Til det sidstnævnte rumfang sættes en yderligere portion af 100 1 vaccine som i første omgang. Efter vibrering i 40 minutter gennemføres en yderligere dekantering af 100 liter væske.

Til 15 1 af opslæmningen af phosphatgel belastet med antigener af poliomyelitis, der er til rest efter dekantering, sættes en tredie portion på 100 1 af den samme poliomyelitisvaccine som tidligere omtalt. Efter yderligere vibrering i 45 minutter får produktet lov til at henstå, og der fradekanteres 100 liter overliggende væske, idet der efterlades 15 1 af en gelopslæmning.

Denne, der er et resultat af tre på hinanden følgende adsorptioner af vaccine, udgør et produkt med en stor koncentration af denne. Det skal bemærkes, at under forløbet af de ovenfor nævnte 7 1432 5 0 dekanteringer var den overliggende væske altid inaktiv, hvilket viser, at vaccinen bar blevet fuldstændig adsorberet.

Til de 15 1 af den endelig opnåede opslæmning sattes en opløsning på 85 1 af 4 g/1 NaCl indeholdende 25 milliontedele hyamin. Blandingen omrøres igen ved hjælp af en vibrator; efter henstand fradekanteres 85 1 væske; til de 15 1 endelig opnået gel sættes 85 1 af en 4 g/1 NaCl opløsning indeholdende 25 milliontedele hyamin.

Den resulterende vaccine er tre gange så koncentreret som den oprindelige vaccine og er fri for bestanddele fra dyrkningsmediet.

Med hensyn til indholdet af calciumphosphat svarer det i 100 1 færdigt produkt til 0,897 g/1 elementarphosphor og 1,5 g/1 calcium. Vægtforholdet Ca/P er således 1,68 (atomforhold 1,292) i den færdige gel, medens der fra begyndelsen er blevet anvendt 1 mol CaCl2 pr. 1 mol P04HNa2, d.v.s. et vægtforhold Ca/P på 1,29 (atomforhold = 1); medens i virkeligheden alt Ca var blevet udfældet, forblev en del af phosphorionerne i opløsning i den fjernede overliggende væske; der blev aktuelt fundet 0,31 g P pr. liter klar væske fra den første dekantering.

Eksempel 2

Fremstilling af en rabiesvaccine.

Behandlingerne svarer til de, der er omtalt i eksempel 1, men poliomyelitisvaccinen erstattes med en opslæmning af rabiesviriis opnået ved dyrkning på fårehjerne. Først fremstilles en homogen opslæmning af hjerne indeholdende viruset ved findeling eller ved hjælp af en hvilken som helst anden metode. Efter den sidste dekantering af den overliggende væske erstattes denne med en opløsning af 9 g/1 natriumchlorid.

Lignende præparater opnås ved dyrkning af viruset på hjernen af små mus eller ved cellekultur.

Eksempel 3

Fremstilling af en blandet vaccine.

Først fremstilles en opslemning af calciumphosphat in situ i en opløsning indeholdende difteria- og tetanusvacciner. De 100 1 opslæmning, der således opnås, får lov til at henstå, indtil 4/5 af væsken kan dekanteres, hvorefter den klare overliggende væske fjernes. Til den resterende opløsning af gel sættes 100 1 polio-myelitisvaccineopløsning, og det hele omrøres i 30 minutter ved hjælp af en vibrator. Efter henstand med henblik på dekantering fraskilles den overliggende væske påny. Derefter tilsættes et yderligere rumfang på 100 1 af opløsningen af poliomyelitisvaccine, 143250 8 og der omrøres påny i i time, og der dekanteres således, at der til slut ikke haves mere produkt end 20 1 (denne behandling kan gentages flere gange), hvilket derefter tilføres 80 1 af en 4 g/1 NaCl indeholdende 25 milliontedele hyamin.

Eksempel 4

Fremstilling af en blandet vaccine.

Idet fremgangsmåden i eksempel 1 følges, fremstilles der 25 1 difteriavaccine adsorberet på calciumphosphat, fire gange koncentreret, 25 1 tetanusvaccine af den samme type og koncentration og 25 1 lignende polionyelitisvaccine. De tre rumfang på 25 1 blandes, og 25 1 calciumphosphatgel, der er opnået som i eksempel 1, sættes til blandingen. Resultatet er en sammensat difteria-tetanus-poliomyeli-tisvaccine adsorberet på calciumphosphatgel.

Ved en anden lignende fremgangsmåde erstattes de 25 1 phos-phatgel med 25 1 kighostevaccine adsorberet på calciumphosphat, fire gange koncentreret; der fås således en vaccine med fire bestanddele.

Eksempel 5

Blanding med en lyophiliseret vaccine.

Ved denne fremstilling anvendes 50 1 gelopslæmning med adsorberet difteria og tetanusvacciner fremstillet ifølge et af de forudgående eksempler til opløsning af en lyophiliseret vaccine. Sidstnævnte består af 50.000 doser lyophiliseret mild mæslingevaccine.

Efter opløsning af den lyophiliserede vaccine er blandingen klar til at blive injiceret.

Eksempel 6

Forbedring af en kighostevaccine.

Kighostevacciner indeholder hyppigt, selv efter vask, smittekim, der er stærkt giftige stoffer, der adsorberes dårligt, og som efter injektion i organismen kan forårsage sekundære reaktioner.

Disse stærkt giftige stoffer kan desuden sekreteres af smittekim , under ældning af vaccinen. For at undgå disse ulemper vaskes calciumphosphatgel en med adsorberet kighostevaccine på følgende måde.

100 ml opslæmning af den adsorberede vaccine henstilles i et køleskab i 48 timer. Al den klare overliggende væske fjernes og erstattes med en saltopløsning af 9 g NaCl pr. 1 indeholdende en passende dosis antiseptisk middel. Den gullige overliggende væske, der er blevet fjernet, indeholdt giftige stoffer; dens erstatning med saltopløsning har gjort vaccinen langt mere sikker og passiv.

Ved en anden lignende fremgangsmåde blev den oprindelige opslæmning henstillet i køleskabet i 5 uger; først derefter blev den 9 143250 ovenfor omtalte behandling gennemført. På denne måde fjernede behandlingen ikke alene de giftige stoffer, der til at begynde med var til stede, men også de,som de adsorberede mikrober havde udskilt under de 5 ugers ældning.

Eksempel 7

Fire fremstillinger af difteriavaccine blev gennemført under betingelser, der svarer til de, der er omtalt i eksempel 1, idet poliomyelitisvaccineopløsningen erstattes med en opløsning af difte-riaanatoxin. I hvert tilfælde anvendes 1 liter dinatriumphosphatop-løsning med en koncentration på 0,07 til 0,0735 M indeholdende ana-toxinet og 1 liter 0,07 til 0,0735 M CaC^ opløsning. Sidstnævnte hældes i førstnævnte under omrøring i løbet af et tidsrum, der varierer for hver af fremstillingerne A til D.

A 10 sekunder B 10 minutter C 20 minutter D 30 minutter.

Efter udfældning af calciumphosphatet bestemmes pH-værdien for den vandige opslæmning, og denne indstilles på den samme værdi på 6,85 i hvert af de fire tilfælde ved tilsætning af N NaOH.

Resultaterne af bestemmelserne af dekanteringshastigheden og de forskellige analyser, der er gennemført i forbindelse med opslæmningerne A til D er anført nedenfor.

pH-indstilling af calciumphosphatopslæmninger.

Tabel I.

Fremstilling pH ved afslutning ml N NaOH, der er nødvendig af udfældning pr. liter opslæmning for at _indstille pH-værdien på 6,85 A 5,7 14,8 B 6,5 1,2 C 6,0 7,0 D 6,05 5,2

Det fremgår heraf, at den opslæmning, der er opnået ved en overordentlig hurtig udfældning (A), har det laveste pH.

Dekantering.

Efter indstilling af pH-værdien bestemmes hastigheden for dekantering bestemt på 50 ml af hver af opslæmningerne A til D, der igen er omrørt. Disse bestemmelser blev gennemført ved 20°C i målerør med en højde på 125 mm (2,5 mm pr. ml rumfang). Følgende højder af klar dekanteret væske blev konstateret efter de intervaller, der er anført 10 143250

Tabel II.

Tidsrum Højde i mm for dekanteret væske som funktion af tiden __A_B_0_C _ 5 minutter 2,5 48 48 57 10 minutter 3,8 82 83 89 20 minutter '6,3 92 91 95 1 time 15 min. 21,2 100 95 105 17 timer 85,0 105 105 109

Det fremgår af disse målinger, at sedimentationshastigheden for opslæmningen (A) ifølge den foreliggende opfindelse er meget langsommere end for opslæmningerne (B, G, D), der er fremstillet på kendt måde, d.v.s. ved gradvis tilsætning af CaClg til en opløsning af dinatriumphosphat. Dekantering af opslæmningen A er stort set 20 gange langsommere end for opslæmningerne B, C eller D i de første 10 minutter.

Andre forsøg har ført til den iagttagelse, at ifølge den foreliggende opfindelse har gelerne af calciurrphosphat forbedrede adsorberende egenskaber, når deres vandige opslæmninger stort set er 0,035 molær (ca. 1,4 g/Ca/liter og 1,08 g P/liter) dekanterer fra 1 til 20 mm, og fortrinsvis fra 2 til 10 mm, i løbet af de første 10 minutter ved 20°C. Vacciner, der særlig let adsorberes, og som er lette at injicere opnås med opslæmninger af type A, der ikke dekanterer mere end 6 mm i løbet af 10 minutter.

Sedimentationshastighederne for gelen A i tabel II har praktisk taget ikke ændret sig efter en eller to vaskninger med dekantering af denne gel med en opløsning af 4 g NaCl pr. liter vand.

Adsorptionsevne.

Efter at have adsorberet difteriaanatoxin under den ovenfor omtalte fremstilling titrerer hver af opslæmningerne af gelerne A, B, C og D 120 flokkulationsenheder (Uf) pr. ml. Efter deres sedimentation bestemmes deres aktivitet ved hjælp af flokkulationsmetoden ifølge Ramon på den dekanterede væske, der giver følgende resultater: A 0 B 50 Uf/ml C 5 Uf/ml D 7,5 Uf/ml

Det ses således, at phosphaterne B, C og D efterlader ikke-adsorberet anatoxin (fra 5 bil 50 Uf/ml), medens gelen ifølge den foreliggende opfindelse adsorberer det fuldstændigt.

11 U3250 På den anden side bevirker vask af gelen A ved dekantering med en vandig opløsning af 4 g NaCl pr. liter ikke forekomst af anatoxinet i saltopløsningen, hverken efter en eller to vaskninger.

Indholdene af Ca og P i gelerne bestemmes.

Analyser af opslæmningerne A til D som helhed, af de dekanterede væsker og af selve gelerne har tilvejebragt de resultater, der er anført i nedenstående tabel III. I denne tabel er indholdet af Ca og P udtrykt i g/1; det vil nærmere bestemt sige på den ene side for den omrørte hele opslæmning, der er opnået efter udfældning og efter indstilling af pH på 6,85, og på den anden side for den klare væske, der er fraskilt det udfældede phosphat ved dekantering, og til slut for en opslæmning, der er ført tilbage til dets begyndelsesrumfang ved erstatning af den dekanterede væske med destilleret vand. Ca/P-forholdene i tabel III er vægtforhold.

Tabel III.

A_B_C_D

Tidsrum for CaCl^-tilsæt- 10 sek. 10 min. 20 min. 30 min. ning under udfældning

Ca/P-forhold for anvendte 1,32 1,28 1,28 1,34 reagenser

Fuldstændig begyndelsesopslæmning Ca 1,409 1,468 1,428 1,438 P 1,070 1,150 1,120 1,070

Dekanteret væske Ca 0,026 0,068 0,040 0,046 P 0,315 0,117 0,197 0,172

Gel adskilt fra dens væske og genopslæm- Ca 1,383 1,400 1,388 1,392 met i vand p 0,755 1,033 0,923 0,898

Ca/P 1,83 1,35 1,51 1,55

Disse resultater viser, at den meget hurtige udfældning (A) fører til et væskeformigt medium, der indeholder mindre af Ca og mange flere phosphorioner end det er tilfældet med væskerne fra de konventionelle udfældninger (B, C, D), og på den anden side er det udfældede phosphat meget rigere på calcium, d.v.s. et Ca/P-forhold på 1,83 mod 1,35 til 1,55. Selv om sammensætningen af phosphat D nærmer sig den nederste grænse (Ca/P = 1,55) for phosphatet ifølge den foreliggende opfindelse afviger det ikke desto mindre i høj grad fra dette med hensyn til dets fysisk-kemiske forhold; af ovenstående fremgår det, at dets dekantering på 10 minutter er 89 mm, d.v.s.

23,5 gange så meget som for gelen A, hvilket skyldes en kornformet 12 143250 struktur, der er ugunstig med hensyn til parenteral indgivelse. Det fremgår også, at adsorptionsevnen for phosphatet D er dårlig.

Når gelen af phosphat A har været underkastet to gange vask med b g/1 NaCl på den måde, der er omtalt i begyndelsen af eksempel 1, og dens opslæmning er ført tilbage til det oprindelige rumfang, findes der ikke mere end 0,06 g P/liter i dens klare væske; indholdet af Ca heri er 0,03 g/1. Den således formindskede koncentration af phosphorioner er ikke længere en ulempe, da det udfældede phosphat har stort set den samme sammensætning som forud for vaskningerne; i virkeligheden blev der fundet et vægtforhold for Ca/P på 1,81 mod 1,83 forud for vaskningerne, I sammensætningen vil Ca/P = 1,8 svare til PO^CaH,2(P0|j)gCa^·

Selv om phosphatkoncentrationen i vaccinerne kan variere indenfor vide grænser»er det almindeligvis faktisk således, at der er 1 til 2gCa og 0,56 til 1,43 g P pr. liter. Imidlertid, og dette er en fordel ved den foreliggende opfindelse, kan vaccinen bevares i form af et stabilt koncentrat, der består af en phosphatgel med henholdsvis ca.

5 til 20 g Ca og ca. 2,8 til 14,3 g P pr. liter.