DE9017746U1 - Affinitätschromatographische Säule zur Verwendung bei der Hämodialyse - Google Patents

Affinitätschromatographische Säule zur Verwendung bei der Hämodialyse

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Description

Beschreibung
Gegenstand der Anmeldung sind Säulen für die Affinitätschromatographie, die eine spezifische Kapazität zur Bindung der im Blut von Säugetieren und Menschen vorhandenen Bindungsproteine von Hormonen und Enzymen haben.
Wachstumsfaktoren, wie z.B. Insulin-like Growth Factor (IGF, Somatomedine), Schilddrüsenhormone oder Steroidhormone sind essentielle Hormone, die im Organismuns und im Blut in einer bestimmten Menge verfügbar sein müssen. Diese Hormone können durch spezifische Bindungsproteine (BP) gebunden werden, welche die Aktivität der Hormone modulieren. Bei einem relativen Überschuß dieser Bindungsproteine kann es im Organismus zu schwerwiegenden Mangelerscheinungen an dem betreffenden Hormon kommen, da durch den Überschuß des Bindungsproteins nicht mehr genügend ungebundenes und damit für den Metabolismus verfügbares Hormon vorhanden ist, wie beispielsweise der bei der chronisch renalen Insuffizienz (CRI) bedingte Überschuß von IGFBP durch eine Akkumulation aufgrund einer eingeschränkten Clearance. Andererseits kann ein Mangel an Bindungsproteinen zu 0 Überschußreaktionen des Hormons führen.
Der genannte Überschuß an IGFBP bei der CRI ist beispielsweise pathogenetisch bedeutsam für einen Minderwuchs der davon betroffenen Kinder.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, Möglichkeiten und Mittel bereit zu stellen, die eine Herabsetzung der Serumspiegel der Bindungsproteine ermöglichen.
Neben der Möglichkeit der therapeutischen Behandlung des Hormonmangels durch Stimulation des Organismus zu höherer Produktion des Hormons oder durch Zufuhr des durch biochemische 0 oder rekombinante Methoden gewonnenen Hormons besteht eine andere Möglichkeit darin, die im Überschuß vorhandenen zugehörigen Bindungsproteine zu entfernen. Dies kann während einer Hämodialyse auf affinitätschromatographischem Wege geschehen.
5 Dieses ist beispielhaft nachfolgend an den IGF-Hormonen und den zugehörigen IGF-Bindungsproteinen (IGFBP) beschrieben, ohne daß
dieses jedoch als einschränkend auf den Umfang der Erfindung auszulegen ist.
Insbesondere bei jugendlichen Patienten in der Wachstumsphase mit chronisch renaler Insuffizienz (chronic renal failure, CRF) und vor allem auch bei Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz (end-stage renal failure, ESRF) sind die Werte der IGF-Bindungsproteine, besonders IGFBP-3 stark erhöht. Die IGF-I- und IGF-II-Spiegel sind normal. Daraus resultiert eine stark erhöhte freie IGF-Bindungskapazität. Bei Kindern mit ESRF ist die Somatomedin-Bioaktivität im Serum subnormal. Unter hohen therapeutischen Dosen von GH steigt IGF-I deutlich an, wobei der Anstieg von IGFBP-3 weniger stark ausgeprägt ist, und die Wachstumsgeschwindigkeit sich daher signifikant verbessert. Parallel dazu kommt es zu einer Normalisierung der Somatomedin-Bioaktivität im Serum (Koch et al., J. Pediatr., 115, 365-371, 1981). Daraus ergibt sich zwangsläufig, daß der relativ stärkere Anstieg von IGF-I gegenüber IGFBP-3 für das verbesserte Wachstum ursächlich von Bedeutung ist.
Die zur Entfernung der Bindungsproteine während einer 0 Hämodialyse bevorzugten chromatographischen Säulen sind Säulen zur Äffinitätschromatographie, in welcher ein Hormon oder eine zur Koppelung geeignete Teilsequenz an einem inerten Trägermaterial gegebenenfalls über einen Spacer gebunden ist, und woran das zum Hormon zugehörige Bindungsprotein während 5 einer Dialyse gekoppelt werden kann, und in welcher Säulenmaterial und Blut durch poröse Hohlfasern oder ein poröse Trennwand getrennt bleiben, und die Porengröße von Hohlfasern oder Trennwänden eine molekulare Ausschlußgrenze von 100 kDa hat.
0 Vorzugsweise findet eine derartige Säule Anwendung zur Bindung von IGFBP. Es kann daher IGF-I oder IGF-II als Kopplungsprotein verwendet werden. IGF-II sollte jedoch bevorzugt zur Anwendung kommen, da es eine wesentlich höhere Affinität zu den verschiedenen IFGBP's hat. Zur Kopplung kann sowohl aus Serum 5 isoliertes Material wie auch rekombinant gewonnenes verwendet werden. Auch synthetische oder durch Rekombination hergestellte Teilsequenzen der Bindungsstelle können zur Anwendung kommen.
Zur besseren Zugänglichkeit des gekoppelten Hormons können dia in der Affinitätschromatographie üblichen Spacer verwendet werden wie z.B. -NH(CH2)nCOOH oder -NH(CH2JnNH2, in denen &eegr; eine ganze Zahl von 1 bis 15 bedeutet. Für die Kopplung der IGF's sind carbodiimid-aktivierte Spacer der allgemeinen Formel
- (NH) - (CH,).-C-O-C=NH
Il I1 0 NR"1-
bevorzugt, worin R1 ein Alkylrest von 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet.
Als inertes Trägermaterial kommen in der erfindungsgemäßen Trennsäule bekannte chromatographische Trägermaterialien in Frage wie beispielsweise unvernetzte oder vernetzte Agarose-GeIe, Controlled-Pore Glass (CPG), Cellulose-Derivate, Polyacrylamide, Dextran-Derivate, Chitin oder Elastin. Vorzugsweise wird für die erfindungsgemäßen Säulen Sepharose (mit Bromcyan aktivierte Agarose) verwendet.
Die chromatograpischen Säulen sind größenordnungsmäßig so ausgelegt, daß sie 1 bis 100 ml Trägermaterial aufnehmen 0 können, bevorzugt 10 ml, an welches 0,1 bis 10 mg des Kopplungsproteins pro ml Trägermaterial gebunden ist, vorzugsweise 0,5 mg/ml.
Die Trennung von Säulenmaterial und Blut, dessen zelluläre Bestandteile bei direkter Chromatographie zu einem Verstopfen 5 der Chromatographie-Säule führen würden, erfolgt vorzugsweise dadurch, daß das Blut durch poröse Hohlfasern, welche vom Säulenmaterial umgeben sind, gepumpt wird. Die Poren haben zweckmäßigerweise eine Ausschlußgrenze von 50 bis 500 kDa, bevorzugt 100 kDa. Hierbei bleiben auch die rheologischen 0 Eigenschaften des Blutes erhalten und bei einer mehrstündigen Dialyse treten Bindungsproteine in ausreichender Menge durch die Poren in das Trägermaterial über. Das poröse Trennmedium kann aber auch anders angeordnet sein. Beispielsweise ist auch die Verwendung parallel angeordneter Membranen möglich, deren Zwischenräume abwechselnd mit Trägermaterial gefüllt sind bzw. vom Blut durchflossen werden, sowie sämtliche Ausführungsformen von Chromatographiesäulen, in denen Blut durch poröse Membranen
großflächig vom Säulenmaterial getrennt ist.
Zur Veranschaulichung derartiger Chromatographiesaulen sind beispielhaft die Abbildungen 1, 2 und 3 zu betrachten. In Abbildung 1 wird eine Säule (1) im Längsschnitt gezeigt, Abbildungen 2 und 3 zeigen derartige Säulen im Querschnitt in der Ebene der Plasma-Austrittsfilter (2), Fig. 2 zeigt dabei eine schematische Darstellung einer Hohlfaser-Säule, Fig. 3 ein Beispiel für eine Säule mit porösen Trennplatten. In Fig. 1 bis 3 bedeutet (1) die chromatographische Säule bzw. deren äußerer Mantel, der aus den üblichen Materialien, wie Glas, Edelstahl oder Kunststoff hergestellt sein kann; in diesem Mantel befinden sich Hohlfasern oder Platten (3) aus einem porösen Material wie Glas oder Kunststoff mit einer zuvor beschriebenen Ausschlußgrenze der Porengröße, welche in einer Kunststoffdichtung (4), beispielsweise aus Epoxyharz, vergossen und im Mantel (1) zu Reinigungszwecken herausnehmbar befestigt sind. Der Zwischenraum zwischen Säulenmantel (1) und Hohlfasern (3) ist mit dem affinitatschromatographischen Material (5) beschickt. Während der Hämodialyse wird über die Zuleitung (6) 0 des Verschlusses (7) des Säulenkopfes Blut durch die Hohlfasern bzw. die Zwischenräume zwischen den porösen Trennwänden (3) gepumpt, wobei das Blutplasma über die Poren der Fasern bzw. Trennwände (3) mit dem Säulenmaterial in Kontakt treten kann und die Bindungsproteine festgehalten werden. Das Plasma tritt über das Auslaßfilter (2), beispielsweise ein Teflonnetz, in den Verschluß des Säulenbodens (8) aus und wird am Auslaß (9) mit dem Restblut wieder vereinigt. Die Verschlüsse (7) und (8) der Säulen bestehen aus Kunststoff, z.B. Polysulfon, oder Edelstahl und können durch Verschrauben, Bajonettverschlüsse etc. am Säulenmantel (1) befestigt sein und werden durch übliche Dichtungen (10) aus Teflon, Gummi etc. abgedichtet.
Werden derartige Säulen bei der Hämodialyse eingesetzt, dann wird nach Beendigung der Dialyse die Säule mit einem sauren Puffer von pH 1 bis 5, bevorzugt pH 3, gespült. Dadurch 5 dissoziieren die Bindungsproteine ab und können durch eine anschließende Proteinreinigung weiter aufgearbeitet werden. Die vor der erneuten Verwendung der Säule erforderliche Desinfektion erfolgt nach den üblichen Methoden, bevorzugt durch Alkohol, vorzugsweise 70%igem Ethanol. Die Aufbewahrung
des Säulenmaterials bis zum nächsten Dialyse-?;ir>satz erfolgt zweckmäßigerweise in 20%igem Ethanol. Vor der erneuten Verwendung wird die Säule mit physiologischer Kochsalzlösung gespült und sie kann daher mehrmahls (bis zu 100 mal) wieder verwendet werden.
Da bei der beschriebenen Verwendung der Chromatographiesäule die Bindungsproteine in hoher Reinheit isoliert werden können, ist auf diese Weise ist die Gewinnung von Bindungsproteinen, vor allem humanen IGFBP's, auf eine wirtschaftlich günstige Weise möglich.
Diese Bindungsproteine können vielfache Anwendung finden. So können sie verwendet werden zur Herstellung von immunologischen Testmaterialien zur Diagnose und zum Monitoring der Therapie von Erkrankungen, beispielsweise IGFBP-3 als Material für RIA, IRMA oder ELISA. Auch zur Herstellung von Arzneimitteln können sie Anwendung finden, wie z.B der IGF/IGFBP-Komplex für die Wundheilung, während der Postagressionsphase nach schweren chirurgischen Eingriffen oder Polytraumen oder zur Therapie des Laron'sehen Zwergwuchses oder anderen Bindungsprotein-0 Mangelerkrankungen oder Erkrankungen bei denen Bindungsproteine bzw. die zugehörigen Hormone eine Rolle spielen.
Die folgende Ausführungsvorschriften sollen beispielhaft die Herstellung des Trägermaterials und die Gewinnung von Bindungsproteinen mittels des Anmeldegegenstands näher erläutern.
Trägermaterial:
4 g aktivierte CH-Sepharose 4B (Pharmacia) auf Glasfritte werden in 20 ml eiskalter 1 mM HCl für 15 Minuten gequollen und mit 200 ml eiskalter 1 mM HCl gewaschen und trocken gesaugt. 0 Die Gelsuspension wird 2 Stunden bei Raumtemperatur mit einer Suspension von 10 mg IGF-II in 18 ml Kopplungspuffer (0,1 M NaHCO3, pH 8,0, 0,5 M NaCl) durch Rotation gemischt. Nach der Sedimentation des Gels wird der Überstand abpipettiert. Danach werden 2 0 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) zugegeben und die Suspension nach weiteren 2 Stunden Rühren auf einer Glasfritte im Wechsel mit je 200 ml 0,05 M Na-Acetatpuffer (pH 4,0), 0,5 M NaCl und 0,05 MTris-HCl-Puffer (pH 8,0) und 0,5 M NaCl-Lösung
in insgesamt 3 Zyklen gewaschen. Anschließend wird aas GsI zunächst mit 0,1 M Glycin-HCl-Puffer (pH 2,5) gewaschen und danach mit PBS/Azid, bestehend aus 0,05 M Na-Phosphat-Puffer (pH 7,4), 0,1 M NaCl, 0,003 M NaN3. Das Trägergel wird dann in 50 ml PBS/Azid suspendiert und läßt sich bei 4°C lagern. Die Bestimmung der Menge gekoppeltes IGF-II erfolgt durch Messung von IGF-II durch RIA im Überstand des Kopplungsgemischs und der Waschlösungen und anschließende Bilanzierung. Die Ausbeute beträgt normalerweise 90%.
Bindunqsproteine:
Nach einer Hämodialyse werden die Bindungsproteine mit einer mit konzentriertem Ammoniak auf pH 3.0 eingestellten 0,1 M Essigsäurelösung ausgewaschen.
Anschließend wird die Chromatographiesäule mit 100 ml PBS, ml Wasser und 300 ml Ethanol/Wasser (70:30, V/V) desinfiziert.
Die Reinigung der ausgewaschenen Bindungsproteine erfolgt zweckmäßigerweise durch HPLC. Zum Beispiel wird eine mit Pro RPC 5/10 (Pharmacia) gepackte Säule mit dem Eluat aus der Affinitätschromatographie-Säule durch wiederholte Injektion 0 beladen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, das Eluat zunächst zu lyophilisieren und anschließend nach Lösung in 5ml 0,1% Trifluoressigsäure-Lösung (TFA) auf die Säule zu laden. Die Elution erfolgt in beiden Fällen mit einem Gradienten von 0,1% TFA in Wasser nach 60% einer Lösung von 0,1% TFA in Acetonitril bei einer Flußgeschwindigkeit von 1 ml/min. Die Reinfraktion des Bindungsproteins wird anschließend zum Endprodukt lyophilisiert.

Claims (7)

Affinitatschromatoaraphisehe Säule zur Verwendung bei der Hämodialyse Schutzansprüche
1. Säule zur Affinitätschromatographie zur Entfernung von
Bindungsproteinen und Enzymen während der Hämodialyse, dadurch gekennzeichnet, daß das Komplement des betreffenden, im Blut in pathogenem Überschuß vorhandenen Proteins, an einen inerten Träger (5) gekoppelt ist und welcher für das Blutplasma unter Ausschluß der Blutzellen über poröse Trennmedien (3) zugänglich ist, wodurch eine Kopplung der pathogenen Überschußproteine und deren Eliminierung aus dem Plasma erfolgt.
2. Chromatographische Säule gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das inerte Trägermaterial Sepharose ist.
3. Chromatographische Säule gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß an den Träger IGF-II zur Bindung von IGFBP-3 gekoppelt ist.
4. Säule gemäß der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplung über einen Spacer erfolgt.
5. Säule gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein
0 Spacer der allgemeinen Formel
-(NH)-(CH2)6-C-O-C=NH O NR1
in welcher R1 einen Alkylrest von 1 bis 10 C-Atomen bedeutet, zur Kopplung verwendet wird.
6. Chromatographische Säule gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennmedien (3) poröse Hohlfasern sind.
7. Chromatographische Säule gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Poren der Hohlfasern (3) eine 0 Ausschlußgrenze von 50 - 500 kDa haben.
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DE9017746U Expired - Lifetime DE9017746U1 (de) 1990-08-23 1990-08-23 Affinitätschromatographische Säule zur Verwendung bei der Hämodialyse

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19543240A1 (de) * 1995-11-20 1997-05-22 Abion Ohg Einwegauftragsvorrichtung sowie Kit

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