DE886053C

DE886053C - Verfahren zur Inaktivierung von Virusproteinen

Info

Publication number: DE886053C
Application number: DEB10490D
Authority: DE
Inventors: Gerhard Dr Schramm
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1941-02-26
Filing date: 1941-02-26
Publication date: 1953-08-10

Description

Verfahren zur Inaktivierung von Virusproteinen Nach den bisherigen Forschungsergebnissen stellen alle bekannten und näher untersuchten Virusarten Nucleoproteide dar, die zum Teil in kristallisierter Form erhalten wurden.
Es ist bereits bekannt, daß man aus den Nucleoproteinen durch proteolyptische Enzyme Nucleinsäure abspalten kann (vgl. z. B. Ammon-Dirscherl, »Fermente, Hormone, Vitamine« 1938, S. 410 und 411). Bei diesem Verfahren werden aber gleichzeitig mit der Abspaltung der Nucleinsäure der Eiweißkomplex und damit die immunologischen Eigenschaften zerstört.
Es wurde nun gefunden, daß man die Virusproteine unter Erhaltung ihrer immunologischen Eigenschaften inaktivieren kann derart, daß sie die pathogenenEigenschaften nicht mehr aufweisen, wenn man die Virusproteine mit nucleasehaltigen Präparaten behandelt. Für diese Abspaltung geeignete Enzyme sind besonders Nucleasen pflanzlicher oder tierischer Herkunft, wie sie z. B. aus Darmschleimhaut oder anderen tierischen oder pflanzlichen Organen in bekannter Weise gewonnen werden können. Die aus den Virusproteinen so erhältlichen nucleinsäurefreien Produkte zeigen noch das hohe Molekulargewicht der Virusproteine. Bei Verwendung chemisch einheitlicher kristallisierter Virusproteine als Ausgangsstoffe können die Spaltprodukte wiederum in chemisch einheitlicher und kristallisierter Form erhalten werden. Bei den üblichen Prüfungen auf Virusaktivität haben sich die neuen Stoffe als praktisch inaktiv erwiesen, während ihre immunologischen Eigenschaften erhalten geblieben sind. Die Verfahrensprodukte sollen pharmazeutische I Anwendung finden.
Beispiel Zu io ccm einer Viruslösung, die 254 mg Tabakmosaikvirus enthält und zur Entfernung von Phosphaten gegebenenfalls dialysiert wurde, werden 2 ccm einer Enzymlösung (vgl. unten) gegeben. Die Mischung wird einige Zeit bei 37° stehengelassen. Nach Beendigung der Spaltung wird der Versuchansatz auf 25 ccm aufgefüllt. Durch Zugabe von Trichloressigsäure wird das Spaltprodukt ausgefällt, der Niederschlag abfiltriert und mit trichloressigsäurehaltigem Wasser ausgewaschen.
Die Abspaltung der Nucleinsäure läßt sich dadurch nachweisen, daß das Protein und das eingedampfte Filtrat jedes für sich mit konzentrierter Schwefelsäure und Salpetersäure verascht und das Phosphat durch Fällung mit Ammonmolybdat gravimetrisch bestimmt wird. Nach Abzug des in der Enzymlösung enthaltenen Phosphors wurden 1,05 mg abgespaltener Phosphor gefunden, während das Spaltprodukt keinen Phosphor mehr enthielt. Ein gleichartiger Ansatz ohne Enzymzusatz ergab o,97 mg im Virusprotein gebundenen Phosphor und 0,174 mg freien Phosphor im Filtrat. Eine Analyse des Virusproteins, das nicht bei 37° aufbewahrt worden war, ergab i,oi mg gebundenen und 0,i92 mg freien Phosphor. Ohne Enzym findet also keine Spaltung statt.
Der Verlauf der Spaltung läßt sich durch Titration der bei der Spaltung frei werdenden Phosphorsäure verfolgen, wenn man die Viruslösung von vornherein mit n/5o-Natronlauge bis zum Umschlagspunkt des Phenolphthaleins neutralisiert und eine neutralisierte Enzymlösung hinzufügt. Das Ende der Spaltung kann dann durch Zurücktitrieren mit n/5o-Natronlauge leicht ermittelt werden. Die Titration ergibt, daß pro Mol abgespaltenen Phosphors etwa zwei Säureäquivalente auftreten. Die biologische Auswertung im Einzelherdtest (vgl. Holmes, Bot. Gaz. 87 [i9291, 39) auf Nicotiana glutinosa ergab eine praktisch vollständige Inaktivierung. Die serologische Prüfung zeigte, daß die serologischen Eigenschaften des nucleinsäurefreien Proteins sich nicht von denen des Virusproteins unterscheiden. Ein Kaninchen wurde durch mehrmalige Injektion von reinem Tabakmosaikvirus gegen dieses Virusprotein immunisiert. o,i ccm des gewonnenen Antiserums gaben mit 1o-5 g Tabakmosaikvirus, das in i ccm physiologischer Kochsalzlösung gelöst war, gerade noch ein Präzipitat. Mit dem nucleinsäurefreien Protein wurde die gleiche Grenzdosis beobachtet.
Die Prüfung in der Ultrazentrifuge ergab, daß das nucleinsäurefreie Spaltprotein ein einheitliches Molekulargewicht besitzt, das von dem des aktiven Virusproteins nicht merklich verschieden ist. Der durch die Abspaltung der Nucleinsäure bedingte Verlust von 5 °/o des @Molgewichtes läßt sich in der Ultrazentrifuge nicht mehr feststellen.
Die für die Spaltung benutzte Enzymlösung wurde in bekannter Weise wie folgt gewonnen: Von dem Dünndarm eines Kalbes wurden die beiden ersten Meter vom Magen weg entnommen, mit Wasser durchgespült und die Schleimhaut mit einem Spatel ausgeschabt. Der erhaltene Organbrei (5o g) wurde mit 250 ccm 87°/oigem Glycerin versetzt, die Mischung gut durchgeschüttelt, mit 2,5 ccm io°/oiger Natronlauge versetzt und 2 Tage unter öfterem Durchschütteln bei Zimmertemperatur stehengelassen. Der Extrakt wurde dann durch ein Sieb gegossen, mit 3 ccm Toluol versetzt und im Eisschrank aufbewahrt.

Claims

PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Inaktivierung von Virusproteinen unter Erhaltung der immunologischen Eigenschaften, dadurch gekennzeichnet, daß die Virusproteine mit nucleasehaltigen Fermentpräparaten behandelt werden.