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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung
zum Auftragen einer Probe auf eine Sonden-DNA oder dergleichen,
die an einen Biochip gebunden ist, zum Zweck einer DNA-Analyse oder
dergleichen.
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Hintergrund
der Erfindung
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Auf
den Gebieten der Molekularbiologie und Biochemie werden Biopolymere
wie etwa Nucleinsäuren
und Proteine aus Organismen identifiziert und fraktioniert, um nach
brauchbaren Genen zu suchen oder Krankheiten zu diagnostizieren.
Als Vorbehandlung einer solchen Identifizierung und Fraktionierung wird
häufig
eine Hybridisierungsreaktion angewandt, bei der ein Zielmolekül in einer
Probe mit einer Nucleinsäure
oder einem Protein von bekannter Sequenz hybridisiert wird. Wenn
jedoch dieses Verfahren beispielsweise zur Untersuchung einer Erbkrankheit eingesetzt
wird, ist es mühsam
und zeitaufwendig, die Krankheit zu identifizieren, da derzeit ungefähr 3.000
Erbkrankheiten bekannt sind. Das derzeit durchgeführte Human-Genom-Projekt
zielt auf die Analyse aller humaner Genome mit vermutlich einigen
hunderttausend Basen insgesamt. Es ist klar, dass dies sehr zeitaufwendig
und mühsam
ist, wenn dies vollständig
in Handarbeit durchgeführt
wird.
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Andererseits
wurden Vorrichtungen entwickelt, mit denen man die Verarbeitung
einer großen Zahl
von Proben in kurzer Zeit bewältigen
kann. Ein Beispiel für
eine solche Vorrichtung ist in "Rapid
genetic sequence analysis using a DNA probe array system": Thane Kreiner,
Affimetrix, Inc., (American Laboratory, März 1996, Seiten 39-43) beschrieben. Bei
diesem Analysator wird ein in 10 gezeigter Biochip 100 eingesetzt,
der mit mehreren Features 101 versehen ist, die in einer
Matrix auf der Oberfläche
desselben angeordnet sind. Die Features 101 sind mit verschiedenen
Arten von Sonden immobilisiert. Der Biochip 100 ist in
einem Reaktionsgefäß, genannt
Kammer, zusammen mit einer DNA-Probe so untergebracht, dass die
mit Fluoreszenz markierte DNA-Probe mit den an die Features 101 des
Biochips 100 gebundenen Sonden hybridisiert. Anschließend wird
der Biochip 100 mit Anregungslicht bestrahlt, wodurch bei
jedem Feature 101 eine Fluoreszenzintensität erfasst
wird, um das Ausmaß der
Bindung zwischen jeder Sonde und der DNA-Probe zu bestimmen. Das
Ergebnis kann als vorteilhafte Information verwendet werden.
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Im
Falle der vorstehend beschriebenen Vorrichtung ist der Biochip 100,
an den die Sonden gebunden sind, im Reaktionsgefäß untergebracht. Die DNA-Probe
oder ein anderes Reagens in einem Proben- oder Reagensbehälter wird
mittels einer peristaltischen Pumpe durch einen Schlauch in das
Reaktionsgefäß eingespritzt,
so dass der Biochip 100 teilweise in die Probe oder in
das Reagens eintaucht, die in das Reaktionsgefäß eingespritzt werden. Durch
Schütteln
des Reaktionsgefäßes wird
die DNA-Probe oder das Reagens im Reaktionsgefäß auf die gesamten Features 101 verteilt
oder aufgetragen.
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Die
vorstehend beschriebene Art des Probenauftrags auf alle sondengebundenen
Features 101 des Biochips 100 erfordert jedoch
eine große Probenmenge.
Beispielsweise muss im Falle eines Biochips mit einer Fläche von
1,28 cm × 1,28
cm (d.h. 1,64 cm2) die Kammer mit einer
Probe von 350 μl
gefüllt
werden, um eine einzige Hybridisierungsreaktion durchzuführen. Unter
Berücksichtigung
der Tatsache, dass die Probe aus einem Probenbehälter über einen Schlauch in das Reaktionsgefäß eingeführt wird,
wird die tatsächlich
erforderliche Probenmenge um ein Mehrfaches zunehmen. Zudem muss
die überschüssige Probenmenge
abgewaschen werden. Reaktionsfehler, die durch variierende Probenauftragmengen
unter den Features 101 verursacht werden, waren der Grund
für die
geringe Zuverlässigkeit des
Reaktionsgefäßes. Um
solche Fehler zu vermeiden, muss eine gleichmäßige Probenmenge auf die gesamten
Features 101 aufgetragen werden.
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Die
PCT-Anmeldung mit der internationalen Veröffentlichungs-Nummer WO 98/38510
beschreibt eine optische Scheibe, typischerweise im CD-ROM- oder
DVD-Format, die durch ein optisches Lesegerät gelesen werden kann, wobei
sich die Scheibe mit einstellbarer Geschwindigkeit im Lesegerät dreht.
Durch eine Steuerungssoftware wird das Rotationsschema während der
Untersuchung bestimmt. Die Probe wird nahe am Drehpunkt aufgetragen
und durch die Zentrifugalkraft nach außen zu den verschiedenen Probenaufbereitungs-
und Analysenbereichen transportiert.
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Die
PCT-Anmeldung mit der internationalen Veröffentlichungs-Nummer WO 97/12030
beschreibt ein System zur Durchführung
gesteuerter Reaktionen mit mikroskopischen Probenmengen. Das System
umfasst einen Biochip mit vielen einzelnen Testorten und eine Durchflusszelle
mit einem Fenster zur Bereitstellung eines optischen Zugangs zur
Probe, wobei die Durchflusszelle oberhalb des Biochips angeordnet
ist und in hermetischem Kontakt damit steht. Die Fangsonden und
die Permeationsschicht werden häufig
mittels Drehbeschichtung auf die Oberfläche des Biochips aufgetragen,
indem man diesen auf die Drehachse aufsetzt, ausgenommen das Fenster
der Durchflusszelle. Die vorbehandelte Probe wird in den Probeneinlass
der Durchflusszelle gegeben und strömt in die durch den Biochip
und die Durchflusszelle gebildete Probenkammer. Zudem ist ein Auslass
der Probenkammer zu einem Abfallsammelschlauch bereitgestellt, der
gegebenenfalls unter Vakuum betrieben wird.
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Die
vorliegende Erfindung wurde im Hinblick auf die vorstehend genannten
Probleme des Standes der Technik verwirklicht und zielt auf die
Bereitstellung eines Probenauftragverfahrens und einer Probenauftragvorrichtung,
wobei eine Probe gleichmäßig über die
gesamten Features eines Biochips mit einer geringen Probenmenge
aufgetragen wird.
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Der
Begriff "Probe", wie in der vorliegenden Erfindung
verwendet, bezieht sich nicht nur auf eine Probe, die aus einem
Analyten gewonnen wird, sondern auch auf verschiedene Reagenzien.
Insbesondere umfasst der Begriff "Probe", wie hierin verwendet, eine beliebige
Flüssigkeit,
die auf die Features des Biochips aufgetragen wird, etwa eine Pufferlösung, die
eine DNA-Probe oder ein Reagens enthält, das für eine PCR (Polymerase-Kettenreaktion)
verwendet wird.
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Kurzbeschreibung
der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird das vorstehend beschriebene Ziel mittels eines Probenauftragverfahrens
nach Anspruch 1 erreicht. Die Probe, die auf im Wesentlichen den
Drehpunkt des sich drehenden Biochips aufgetropft wird, verteilt
sich aufgrund der Zentrifugalkraft in Richtung äußerer Rand des Biochips, so
dass sie gleichmäßig auf
die gesamten Features des Biochip aufgetragen wird. Um eine kleine
Probenmenge gleichmäßig über die
gesamten Features zu verteilen, muss die Oberfläche des Biochips in einem Zustand
sein, in dem die Probe problemlos verteilt werden kann. Zu diesem
Zweck wird bevorzugt eine dünne
Schicht eines Puffers (zum Beispiel Tris-HCl-Puffer) vorher auf
die Oberfläche des
Biochips aufgetragen.
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Somit
umfasst das Probenauftragverfahren der vorliegenden Erfindung die
Schritte: Drehen eines Biochips, umfassend mehrere Regionen (d.h. Features),
an die verschiedene Sonden gebunden sind; und Auftropfen einer Probe
auf im Wesentlichen den Drehpunkt des sich drehenden Biochips, um
so die Probe auf die mehreren Regionen aufzutragen. Der Biochip
kann eine kreisförmige,
quadratische oder irgendeine andere Form aufweisen.
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Des
Weiteren umfasst das Probenauftragverfahren der vorliegenden Erfindung
die Schritte: Befeuchten der Oberfläche des Biochips, umfassend mehrere
Regionen (d.h. Features), an die verschiedene Sonden gebunden sind,
mit einem Puffer; und Auftropfen einer Probe auf im Wesentlichen
den Drehpunkt des sich drehenden Biochips, um so die Probe auf die
mehreren Regionen aufzutragen.
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Als
Puffer können
Tris-HCl-Puffer (NaCl, Tris-HCl (pH 8,0), EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), SDS
(Natriumdodecylsulfat)) oder dergleichen eingesetzt werden. Durch
das Befeuchten der Oberfläche
des Biochips mit dem Puffer vor dem Auftragen einer Probe kann eine
winzige Probenmenge problemlos und gleichmäßig auf alle an die Sonde gebundenen
Regionen aufgetragen werden, wobei die Verflüchtigung der Probe verhindert
wird.
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Das
Probenauftragverfahren der vorliegenden Erfindung kann des Weiteren
die Schritte umfassen: Drehen eines Biochips, umfassend mehrere
Regionen (d.h. Features), an die verschiedene Sonden gebunden sind;
Auftropfen eines Puffers auf im Wesentlichen den Drehpunkt des sich
drehenden Biochips, um die Oberfläche des Biochips mit einem
Puffer zu befeuchten; und Auftropfen einer Probe auf im Wesentlichen
den Drehpunkt des sich drehenden Biochips, um so die Probe auf die
mehreren Regionen aufzutragen. Durch Auftropfen des Puffers auf
im Wesentlichen den Drehpunkt des sich drehenden Biochips kann eine äußerst dünne Pufferschicht
auf der Oberfläche
des Biochips gebildet werden. Wird eine winzige Probenmenge unter
Zentrifugationsbedingungen darauf aufgetragen, so können die
gesamten an die Sonde gebundenen Regionen mit der Probe bedeckt
werden, wobei die Verflüchtigung
der Probe verhindert wird.
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Gemäß dem Probenauftragverfahren
der vorliegenden Erfindung können
mehrere Probentropfen auf im Wesentlichen den Drehpunkt des sich
drehenden Biochips aufgetragen werden. Die mehreren winzigen Tropfen
können
gleichzeitig oder nacheinander aufgetragen werden. Um die Verflüchtigung der
Feuchtigkeit der Probe auf dem sich drehenden Biochip zu verhindern,
wird die Luftfeuchtigkeit der Atmosphäre zum Auftragen der Probe
so hoch wie möglich
gehalten, bevorzugt bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 95%
oder höher.
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Gemäß einem
Aspekt kann die Probe ein Biopolymer wie etwa eine Nucleinsäure oder
ein Protein sein, die/das selektiv mit den Sonden hybridisiert. Für den Fall,
dass die Probe eine Nucleinsäure
ist, ist es bevorzugt, die Probe und die Sonde so zu hybridisieren,
dass die Temperatur des Biochips anfänglich auf 90-100°C eingestellt
und dann nach und nach auf Raumtemperatur heruntergekühlt wird.
Die Temperatur des Biochips kann vor oder nach dem Probenauftrag
auf 90-100°C
eingestellt werden. In letzterem Fall wird die Probe bei Raumtemperatur
auf den Biochip aufgetragen und anschließend kann dessen Temperatur
erhöht
werden. Bei der Probe kann es sich beispielsweise um Humangenom-DNA handeln, wobei
die Probe in diesem Fall auf die Features des Biochips aufgetragen
wird, um eine PCR durchzuführen.
Für den
Fall, dass die Probe ein Protein ist, das selektiv mit der Sonde
hybridisiert, werden Probe und Sonde aneinander gebunden, wobei
man die Temperatur des Biochips bei 30-40°C hält.
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Eine
Probenauftragvorrichtung der vorliegenden Erfindung ist in Anspruch
7 näher
erläutert.
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Die
Probenauftragvorrichtung der vorliegenden Erfindung umfasst: ein
Biochip-Trägerelement zum
Tragen eines Biochips, der mehrere Regionen (d.h. Features) umfasst,
die an verschiedene Sonden gebunden sind; einen Antrieb zum Drehen
des Biochip-Trägerelements;
ein Puffereinspritzelement zum Auftropfen eines Puffers auf im Wesentlichen
den Drehpunkt des Biochips; und ein Probeneinspritzelement zum Auftropfen
einer Probe auf im Wesentlichen den Drehpunkt des Biochips. Durch
Befeuchtung der Oberfläche
des Biochips mit dem Puffer vor dem Auftragen der Probe kann eine
winzige Probenmenge problemlos und gleichmäßig auf die gesamten an die
Sonde gebundenen Regionen aufgetragen werden.
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Eine
Probenauftragvorrichtung kann versehen sein mit: einem Luftbefeuchter,
um die Atmosphäre
der Umgebung um den Biochip bei einer hohen Luftfeuchtigkeit zu
halten, um so das Austrocknen der auf die Oberfläche des sich drehenden Biochips aufgetragenen
Probe zu verhindern; und einer Temperatursteuerung zur Steuerung
der Temperatur des Biochips. Zudem kann das Probeneinspritzelement verwendet
werden, um mehrere Probentropfen auf im Wesentlichen den Drehpunkt
des Biochips aufzutragen. Die optimale Drehge schwindigkeit des Biochips
sollte in Übereinstimmung
mit der Viskosität und
der Menge der aufgetragenen Probe passend eingestellt werden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine winzige Probenmenge auf einen sich drehenden
Biochip so aufgetragen, dass diese aufgrund der durch die Drehung
verursachten Zentrifugalkraft gleichmäßig über die gesamten Features des
Biochips verteilt wird. Dadurch kann selbst mit einer kleinen Probenmenge
ungleichmäßiges Auftragen
verhindert werden, so dass Probenmenge eingespart und die Genauigkeit
der Analyse verbessert wird. Für
den Fall, dass der Biochip eine Scheibe mit einem Durchmesser von
zum Beispiel 2 cm ist, beträgt
die Probenmenge, die für
gleichmäßiges Auftragen über die
gesamten Features des Biochips benötigt wird, weniger als 50-100 μl.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
eine schematische Querschnittansicht, die ein Beispiel einer Probenauftragvorrichtung gemäß der vorliegenden
Erfindung zeigt;
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2 ist
ein Grundriss einer Drehplatte, die einen Biochip trägt;
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3 ist
ein Grundriss einer Drehplatte, die einen vierseitigen Biochip trägt;
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4 ist
eine schematische Ansicht zur Beschreibung des Lageverhältnisses
zwischen dem Drehkopf und dem auf der Drehplatte befestigten Biochip;
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5 ist
eine Querschnittansicht, die ein Beispiel einer Probendüse zeigt,
die im Drehkopf bereitgestellt ist;
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6 ist
eine schematische Ansicht zur Erläuterung der Positionen der
Probentropfen, die auf den Biochip aufgetragen sind;
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7 ist
eine schematische Querschnittansicht zur Beschreibung eines anderen
Beispiels einer Probendüse;
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8 ist
eine schematische Querschnittansicht, die ein anderes Beispiel einer
Probenauftragvorrichtung zeigt;
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die 9A und 9B sind
Abbildungen zur Erläuterung
der Anwendung der vorliegenden Erfindung auf einen anderen Typ Biochip,
der eine Öffnung
in seiner Mitte aufweist; und
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10 ist
eine schematische Ansicht zur Erläuterung eines herkömmlichen
Biochips.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Nachstehend
wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen mit Bezug auf
die begleitenden Zeichnungen ausführlicher beschrieben.
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1 ist
eine schematische Querschnittansicht, die eine beispielhafte Probenauftragvorrichtung 1 gemäß der vorliegenden
Erfindung zeigt. Die Probenauftragvorrichtung 1 umfasst
einen Körper 10, der
mit einem aufklappbaren Deckel 11 versehen ist, einen Mechanismus
zum Drehen eines Biochips 12 im Körper 10, einen Drehkopf 20 zum
Auftropfen eines Puffers oder einer Probe auf den Drehpunkt des sich
drehenden Biochips 12, einen Luftbefeuchter 25 zur
Aufrechterhaltung einer Atmosphäre
mit hoher Luftfeuchtigkeit innerhalb des Körpers 10 und dergleichen.
Der Biochip 12 ist auf einer Drehplatte 14 mit
mehreren Befestigungsstiften 15 befestigt, die tangential
zum Umfang des Biochips 12 angeordnet sind. Die Drehplatte 14 wird
durch einen Motor 13 in Drehung versetzt. Die Drehplatte 14 ist
auch mit einer Temperatursteuerung 16 versehen, etwa einer
Heizung, die sowohl die Temperatur der Drehplatte 14 als
auch die Temperatur des Biochips 12 steuert, die eine vorbestimmte
Temperatur haben sollen. Der Luftbefeuchter 25 kann ein
Ultraschall-Luftbefeuchter oder derglei chen sein, der Dampf abgibt,
um eine relative Luftfeuchtigkeit innerhalb des Körpers 10 von 95%
oder höher
beizubehalten.
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2 ist
ein Grundriss der den Biochip 12 tragenden Drehplatte 14.
Der Biochip 12 weist mehrere Features auf, die an die Sonden
auf der Oberfläche
desselben gebunden sind, und ist auf der Drehplatte 14 mit
den Stiften 15a bis 15c tangential zum Umfang
des Biochips 12 befestigt. Obwohl es sich bei den hierin
beschriebenen Elementen zur Befestigung des Biochips 12 um
Stifte handelt, können
auch ein Klemmfutter, Vakuumadsorption, ein Befestigungszahn oder
irgendeine Art von Element verwendet werden, solange das Drehen
des Biochips 12 zusammen mit der Drehplatte 14 möglich ist,
wobei der Drehpunkt feststehend bleibt. Zwar ist des Weiteren der
in 2 gezeigte Biochip 12 kreisförmig, doch
ist der Biochip nicht darauf beschränkt. 3 ist ein Grundriss
einer Drehplatte 14a, die einen vierseitigen Biochip 12a trägt. Der
vierseitige Biochip 12a ist mit den Befestigungsstiften 18a bis 18h oder
dergleichen an der Drehplatte 14a befestigt.
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Betrachtet
man wiederum 1, so ist der Drehkopf 20 drehbar
am Deckel 11 des Körpers 10 angebracht
und mit einer Pufferdüse 31 und
einer Probendüse 32 zum
Auftropfen eines Puffers beziehungsweise einer Probe auf den Drehpunkt
oder in die Nähe
desselben versehen. Der Puffer wird aus einem Pufferbehälter 21 durch
einen Schlauch 23 mittels einer Pumpe 22 zur Pufferdüse 31 geführt.
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4 ist
eine schematische Ansicht zur Beschreibung des Lageverhältnisses
zwischen dem Drehkopf 20 und dem auf der Platte 14 befestigten Biochip 12.
Durch Drehen des Drehkopfes 20 bezüglich der Rotationsachse B
können
die Pufferdüse 31 und
die Probendüse 32 oberhalb
des Drehpunkts A der Drehplatte 14 selektiv in Position
gebracht werden. Der Drehkopf 20 wird bevorzugt durch einen
Antrieb, z.B. einem Motor, angetrieben, um die Düsen 31 und 32 oberhalb
des Drehpunkts A in Position zu bringen. Alternativ kann der Drehkopf 20 von
Hand gedreht werden, wobei in diesem Fall die Kerben 33 und 34 am äußeren Randteil
des Drehkopfes 20 so angebracht sind, dass ein beweglicher
Vorsprung 35, der durch den Deckel 11 elastisch
getragen wird (1), in die Kerben 33 und 34 einrastet,
wodurch die Stellung des Drehkopfes 20 gesteuert und gesichert
wird.
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5 ist
eine Querschnittansicht, die ein Beispiel einer Probendüse 32 zeigt,
die durch den Drehkopf 20 gehalten wird. Die Probendüse umfasst eine
Probeneinspritzöffnung 36 mit
einem relativ großen Öffnungsdurchmesser
und einen Düsenteil 37 mit
einem engen Öffnungsdurchmesser,
der mit der Probeneinspritzöffnung 36 verbunden
ist. Eine Heizung 38 ist bereitgestellt, die Kontakt zu
einem Teil des Düsenteils 37 hat.
Wenn ein Stromimpuls zur Heizung 38 geleitet wird und eine
Probe in der Probendüse 32 vorhanden
ist, wird die Temperatur der Heizung 38 erhöht und eine
Blase in der Probe am Düsenteil 37 erzeugt.
Durch die Blase wird ein Probentropfen aus der Spitze der Düse 32 in
Richtung Drehpunkt A des Biochips 12 gedrückt. Die
Menge des Probentropfens, der aus der Spitze der Düse 32 austritt,
kann mittels des zur Heizung 38 geleiteten Stroms gesteuert
werden. Leitet man zudem mehrere Stromimpulse zur Heizung 38,
so können
mehrere Probentropfen nacheinander auf den Drehpunkt A des Biochips 12 aufgetragen
werden. Alternativ lässt sich
der gleiche Effekt erzielen, indem der Düsenteil 37 mit einem
piezoelektrischen Element an Stelle der Heizung 38 versehen
wird.
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Nachstehend
wird die Art des Auftragens der Probe auf die Features des Biochips 12 beschrieben. Zuerst
wird der Deckel 11 des in 1 gezeigten Körpers 10 geöffnet, so
dass der Biochip 12 zwischen die Stifte 15a bis 15c (2)
eingeführt
werden kann. Nach Schließen
des Deckels 11 wird die Pufferdüse 31 oberhalb des
Drehpunkts A des Biochips 12 durch Drehen des Drehkopfes 20 ausgerichtet,
wobei der Motor 13 läuft,
um den Puffer auf den sich drehenden Biochip 12 aufzubringen.
Aufgrund der Zentrifugalkraft wird eine ausreichende Puffermenge
auf dem Drehpunkt des Biochips 12 in Richtung des äußeren Rands
des Biochips 12 verteilt, um die gesamte Oberfläche des
Biochips 12 zu befeuchten, wobei die überschüssige Puffermenge durch die Zentrifugalkraft herausgeblasen
und am Boden des Körpers 10 aufgefangen
wird. Auf diese Weise wird die Oberfläche des Biochips 12 gleichmäßig mit
einer dünnen
Pufferschicht bedeckt.
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Danach
wird durch Drehen des Drehkopfes 20 die Probendüse 32 über dem
Drehpunkt A des Biochips 12 ausgerichtet. Mit einer Mikropipette
oder dergleichen wird die Probe in die Probeneinspritzöffnung 36 der
in 5 gezeigten Probendüse 32 eingespritzt.
Der Düsenteil 37 mit
der engen Öffnung bleibt
aufgrund der Kapillarwirkung mit Probe gefüllt. In diesem Zustand wird
ein Stromimpuls zur Heizung 38 geleitet, so dass ein Probentropfen
die Spitze des Düsenteils 37 in
Richtung Drehpunkt A des Biochips 12 verlässt. Der
auf die befeuchtete Oberfläche
des Biochips 12 aufgetropfte Probentropfen verteilt sich in
Richtung äußerer Rand
des Biochips 12, um aufgrund der Zentrifugalkraft, die
durch den sich drehenden Biochip 12 erzeugt wird, die gesamten
Features zu bedecken.
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Wenn
die Menge eines aus der Probendüse 32 austretenden
Probentropfens sehr klein ist und sich die Auftrageposition vom
Drehpunkt A des Biochip 12 weg verschiebt, kann die Probe
nicht gleichmäßig auf
die gesamten Features aufgetragen werden. In diesem Fall werden
mehrere Probentropfen nacheinander auf den Drehpunkt des sich mit
hoher Geschwindigkeit drehenden Biochips 12 aufgetragen,
so dass die Probe auf die gesamten Features über die Oberfläche des
Biochips 12 aufgetragen werden kann. Wie schematisch in 6 gezeigt,
wird die zeitliche Abfolge der zur Heizung 38 geleiteten Stromimpulse
in Verbindung mit der Drehstellung des Biochip 12 bevorzugt
so eingestellt, dass die Positionen der nacheinander aufgetropften
Proben 40a bis 40d gleichmäßig bezüglich des Drehpunkts A verteilt sind.
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7 ist
eine schematische Querschnittansicht zur Beschreibung eines anderen
Beispiels einer Probendüse 30.
Um diese Probendüse 30 aufzunehmen,
ist ein Drehkopf 51 mit einer spitz zulaufenden Öffnung 52 versehen,
die einen Durchmesser aufweist, der zum Boden hin abnimmt. Die Probendüse 30 wird unter
Verwendung einer Mikropipette 42 oder eines Zylinders gebildet.
Die Mikropipette 42, die eine Probe in ihrer Spitze trägt, wird
in die spitz zulaufende Öffnung 52 des
Drehkopfes 51 so eingeführt,
dass die Spitze der Mikropipette 42 darin fixiert werden kann,
wobei sie durch die innere Wandung gestützt wird, die von der spitz
zulaufenden Öffnung 52 gebildet
wird. Durch Zusammendrücken
des oberen Teils 43 der fixierten Probendüse 30 wird
ein Probentropfen auf den Drehpunkt A des sich drehenden Biochips 12 aufgetragen.
Eine winzige Probenmenge, aufgetragen aus der Mikropipette 42 auf
den Drehpunkt A des Biochips 12, verteilt sich aufgrund
der Zentrifugalkraft in Richtung äußerer Rand des Biochips 12 und
bedeckt die gesamten Features.
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8 ist
eine schematische Querschnittansicht, die ein anderes Beispiel einer
Probenauftragvorrichtung 50 zeigt, die einen anderen Kopfteil
zum Einspritzen eines Puffer- und eines Probentropfens aus der in 1 gezeigten
Probenauftragvorrichtung 1 aufweist. In 8 stehen
die gleichen Bezugsziffern für
die gleichen Komponenten wie in 1, wobei
die Details weggelassen sind. Der Deckel 11 des Körpers 10 ist
mit einem Einspritzkopf 51 versehen, der eine spitz zulaufende Öffnung 52 oberhalb
der Drehachse des Motors 13 aufweist.
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Wie
vorstehend mit Bezug auf 7 beschrieben, wird die Spitze
der Mikropipette 42 in die die Düse aufnehmende Öffnung 52 eingeführt. Die Mikropipette 42 in
der die Düse
aufnehmenden Öffnung 52 befindet
sich unmittelbar oberhalb des Drehpunkts des Biochips 12.
Wird eine ausreichende Puffermenge aus der Mikropipette 42 auf
den Drehpunkt des sich drehenden Biochips 12 aufgetropft,
so verteilt sich diese in Richtung äußerer Rand des Biochips 12,
um die gesamte Oberfläche
des Biochips 12 zu bedecken. Danach wird die Probe unter
Verwendung der Mikropipette 42 auf die gleiche Weise aufgetragen.
Die auf den Drehpunkt des sich drehenden Biochips 12 aufgetragene
Probe verteilt sich ebenso in Richtung äußerer Rand des Biochips 12, um
die gesamten Features aufgrund der durch die Drehung verursachten
Zentrifugalkraft zu bedecken.
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Bei
den 9A und 9B handelt
es sich um Abbildungen zur Erläuterung
der Anwendung der vorliegenden Erfindung auf einen anderen Typ des Biochips 61,
der eine Öffnung 62 in
seinem Zentrum aufweist. Was die Zuführung einer Probe über die
gesamten Features angeht, so ist der Biochip 61 in den Probenauftragvorrichtungen 1 und 50 von
sich aus nicht wirksam.
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Wie
in 9A gezeigt, wird ein Zusatzelement 63 in
die Öffnung 62 des
Biochips 61 eingeführt. Das
Zusatzelement 63 umfasst den Steckteil 64, der in
die Öffnung 62 passt,
sowie den Plattenteil 65, der die obere Fläche des
Biochips 61 teilweise bedeckt. Der Plattenteil 65 weist
einen etwas größeren Durchmesser
als die Öffnung 62 auf
und ist aus Glas, Polycarbonat oder dergleichen zusammengesetzt.
Wie in 9B gezeigt, weist der Biochip 61 mit
dem Zusatzelement 63 eine abgeflachte obere Fläche von
im Wesentlichen gleicher Höhe
auf. Infolgedessen kann der Biochip 61 mit dem Zusatzelement 63 beispielsweise
an der in 1 gezeigten Probenauftragvorrichtung 1 der
vorliegenden Erfindung befestigt werden, um die Probe wie vorstehend
beschrieben auf die gesamten Features aufzutragen.
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Durch
eine Temperatursteuerung 16 (1) kann
die Temperatur des Biochips 61 entsprechend einem vorprogrammierten
Temperaturzyklus gesteuert werden. Beispielsweise kann der Biochip 61 vor oder
nach dem Probenauftrag auf den Biochip 61 auf eine relativ
hohe Temperatur erhitzt und anschließend zum Annealing nach und
nach heruntergekühlt werden.
Eine solche Temperatursteuerung ermöglicht Hybridisierung und PCR
unter optimalen Bedingungen.
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Nachstehend
wird ein Beispiel für
die Durchführung
einer PCR unter Nutzung einer Temperatursteuerung der Probenauftragvorrichtung
der vorliegenden Erfindung beschrieben. Durch die PCR lässt sich
ein DNA-Fragment in etwa 3 Stunden etwa 106-fach
amplifizieren.
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Eine
PCR-Lösung
wird hergestellt, die beispielsweise in 100 μl die Zusammensetzung 5 μl Matrizen-DNA
(200 μl/ml),
10 μl Pufferlösung (500
mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 25 mM MgCl2,
0,2% Gelatine), 16 μl
dNTP-Mischung (jeweils 1,2 mM), 5 μl zweier Primer-Typen (2 μM), 58 μl destilliertes Wasser
und 1 μl
Taq-Polymerase aufweist.
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Diese
PCR-Lösung
wird vor der Initiierung der Reaktion auf einen Biochip der erfindungsgemäßen Probenauftragvorrichtung
aufgetropft und aufgetragen. Alternativ wird ein Behälter, der
die PCR-Lösung
enthält,
vor der Initiierung der Reaktion auf eine Drehplatte 14 aufgesetzt.
In diesem Fall besteht der Behälter
aus einem hitzebeständigen
Material, und die Größe desselben
ist so festgelegt, dass er auf die Drehplatte 14 aufgesetzt
werden und die PCR-Lösung
aufnehmen kann. Ansonsten kann der Behälter von beliebiger Art sein.
Die Vorrichtung ist bevorzugt mit einem Deckel versehen, der verhindert,
dass sich die PCR-Lösung verflüchtigt.
Für den
Fall, dass es keinen Deckel gibt, kann die Oberfläche der
PCR-Lösung
mit einem Mineralöl
oder mit flüssigem
Paraffin bedeckt werden. Alternativ kann eine PCR-Scheibe mit einem
Kranzring zur Verhinderung des Verschüttens der Lösung hergestellt und an der
Drehplatte 14 befestigt werden, um so die PCR durchzuführen.
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Die
PCR wird wie nachstehend programmiert durchgeführt. Zuerst wird die Matrizen-DNA
zur Trennung in eine Einzelstrang-DNA 3 Minuten lang bei
93°C gehalten,
die anschließend
umgesetzt wird unter 20 bis 30 Zyklen mit: 1 min 93°C; 1,5 min
55°C; und
1,5 min 7°C.
Diese Temperaturen und Zeiten variieren in Abhängigkeit der eingesetzten Matrizen-DNA;
doch in den meisten Fällen
findet die Umsetzung unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen
statt. Am Ende der obigen Zyklen wird die DNA weitere 10 Min lang
bei 72°C
umgesetzt und danach zur Beendigung der Reaktion auf 4°C abgekühlt.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine kleine Probemenge wirksam eingesetzt, um die
gesamten Features des Biochips gleichmäßig zu bedecken.
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Verschiedene
andere Abwandlungen werden dem Fachmann klar sein und können von
diesem leicht vorgenommen werden, ohne vom Umfang und Geist die ser
Erfindung abzuweichen. Dementsprechend ist nicht beabsichtigt, den
Umfang der beigefügten
Ansprüche
auf die hier dargelegte Beschreibung zu beschränken, sondern die Ansprüche breit auszulegen.
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Sämtliche
Publikationen, darunter die hierin zitierten Patente und Patentanmeldungen,
seien hiermit in ihrer Gesamtheit durch Zitat erwähnt.