DE69928821T2

DE69928821T2 - Auflösung von trans-2 (alkoxycarbonylethyl)-lactamen, nützlich bei der synthese von 1-(4-fluorophenyl)-[3(r)-3(s)-hydroxy-3-(4-fluorophenyl)propyl]-4(s)-(4-hydroxyphenyl)-2-azetidinone

Info

Publication number: DE69928821T2
Application number: DE69928821T
Authority: DE
Inventors: J. Michael HOMANN; Brian William MORGAN
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme Corp
Priority date: 1998-10-02
Filing date: 1999-10-01
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2019-10-02
Also published as: WO2000020623A1; CA2345750C; DE69928821D1; ATE312196T1; CN1330721A; ES2249917T3; AU6252599A; CN1191372C; JP2002526119A; JP3703719B2; US5919672A; HK1037684A1; EP1117823B1; CA2345750A1; EP1117823A1

Description

ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Trans-2(Alkoxycarbonylethyl)-Lactame und trans-2-(Carboxyethyl)-Lactame sind Zwischenprodukte bei der Synthese von 1-(4-Fluorphenyl)-3-(R)-[3(S)-hydroxy-3-(4-fluorphenyl)-propyl)]-4(S)-(4-hydroxyphenyl)-2-azetidinon, einem cholesterinsenkenden Mittel, das in US 5,767,115 offenbart ist.
US Patentschrift 5,618,707 offenbart die stereoselektive mikrobielle Reduktion eines Keto-Zwischenproduktes (4-(4-fluoro-benzoyl)buttersäure oder einem Phenyloxazolidinon-Konjugat davon) auf das entsprechende Hydroxy-Zwischenprodukt, welches bei der Herstellung von Azetidinon verwendet wird. Bevorzugte Mikroorganismen, die in dem Verfahren verwendet werden, sind Zygosaccharomyces bailii oder Schizosaccharomyces octosporus.
Tetrahedon letters, Band 38, Nr. 4, 1997, Seiten 643–646 offenbart das Unterziehen von jeweils zwei Klassen von 3,4-disubstituiertem β-Lactam, welches trans-3-Carboethoxy aufweist, und cis-3-Acetoxymethyl-Substituenten zu enzymatischer Hydrolyse unter Verwendung von Schweineleberesterasen (PLE) oder Schweinepankreaslipase (PPL).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung betrifft die mikrobiologische oder enzymatische hydroloytische Auflösung eines racemischen trans-2-(Alkoxycarbonylethyl)-Lactams der Formel I:
wobei R C₁-C₇-Alkyl, 2,2,2-Trifluorethyl oder Methoxyethoxyethyl und R¹ ein Wasserstoff oder eine Schutzgruppe ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Benzyl, Trimethylsilyl, t-Butyldimethylsilyl (TBDMS) und Acetyl besteht, um eine optisch angereicherte Verbindung der Formel Ib oder IIa zu erhalten:
Wenn ein Carboxylsäureester der Formel Ib erhalten wird, umfasst das Verfahren ferner die Hydrolyse der resultierenden Verbindung von Formel Ib, um eine Säure der Formel IIa zu erhalten. Die resultierende 3R,4S-Lactam-Säure ist als Zwischenprodukt bei der Herstellung von 1-(4-Fluorphenyl)-3-(R)-[3(S)-hydroxy-3-(4-fluorphenyl)-propyl)]-4(S)-(4-hydroxyphenyl)-2-azetidinon nützlich.
Die Auflösung umfasst die Verwendung von Mikroorganismen (aus Quellen in der Umwelt und Kultursammlungen erhalten, z.B. die American Type Kultursammlung (ATCC)) in einem Medium, Medium und Puffer, Medium und Lösungsmittel oder Medium und einer Mischung aus Puffer und Lösungsmittel, oder die Verwendung von Enzymen in einem Puffer, einem Lösungsmittel oder einer Mischung aus diesen, zu denen ein racemisches trans-2-(Alkocycarbonylethyl)-Lactam hinzugefügt wird, derart dass eine Verbindung, die eine Ester- oder Säuregruppe mit der gewünschten Stereochemie aufweist, gebildet, akkumuliert und isoliert werden kann. Die Auflösung ist entweder eine direkte oder subtraktive Auflösung, in Abhängigkeit von dem verwendeten Mikroorganismus oder Enzym.
Mikroorganismen, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus den folgenden Gattungen besteht, haben sich als nützlich in der direkten Auflösung erwiesen: Aspergil lus, Bacillus, Candida, Cunninghamella, Debaryomyces, Mycobacterium, Paecilomyces, Penicillium, Rhodobacter, Streptomyces und Trichothecium. Die folgenden Arten der obigen Gattungen werden bevorzugt: Aspergillus alliaceus, niger, niveus, und terreus; Bacillus sphaericus; Candida parapsilosis und rugosa; Cunninghamella homothallica; Debaryomyces hansenii; Mycobacterium fortuitum; Paecilomyces marquandii; Penicillium implicatum; Rhodobacter sphaeroides; Streptomyces spectabilis und Trichothecium roseum.
Mikroorganismen, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus den folgenden Gattungen besteht, haben sich bei der subtraktiven Auflösung als nützlich erwiesen: Comamonas, Curvularia, Mucor, Nocardia und Rhodococcus. Die folgenden Arten der obigen Gattungen werden bevorzugt: Comamonas testosteroni; Curvularia brachyspora und geniculata; Mucor cicinelloides und racemosus; Nocardia corallina und Rhodococcus erythropolis, rhodochrous und species.
Im Handel erhältliche Enzyme, die für die Verwendung in der Auflösung dieser Erfindung geeignet sind, enthalten Amano Lipase D (Rhizopus delemar); Amano Lipase FAP-15 (Rhizopus javanicus); Amano Lipase MAP-10 (Mucor javanicus); Amano Lipase N (Rhizopus niveus); Interspex Bakterielle Esterase/Lipase BE1-gestützt (Pseudomonas mandocino); Nagase Lipase A-10 (Rhizopus japonicus); Novo SP 525 (Candida antarctica, Typ B); Toyobo Lipoprotein Lipase LPL-701 und LPL-311, Typ A (Pseudomonas sp.); Seikagaki Lipase (Rhizopus delemar); Kinzi & Payne Lipase WT (Rhizopus sp.); Svedas Lipase (Rhizopus oryzae); Sawa Lipase A-10 (Rhizopus japonicus); Sawa LPL-701 und LIP 301 (Pseudomonas sp.); Boehrigner-Mannheim Chirazyme^TM L2 (Candida antarctica lipase, Typ B); Boehringer-Mannheim Chirazyme^TM L4 und L6 (Pseudomonas sp.); Interspex Lipase/Esterase ICS-16-FL1 Fungal (Rhizopus oryzae); Fluka Lipase (Aspergilius niger); Toyobo LIP-300/301 und LIP-321 (Pseudomonas sp.); Toyobo Lipoprotein Lipase LPL 311 Typ A (Pseudomonas sp.); Novo Lipozyme IM-60 (Mucor miehei); und Sigma Lipase Typ XI (Rhizopus arrhizus).
Bevorzugte Enzyme sind Hydrolasen von Pseudomonas sp. (Toyobo LPL 311 Typ A, Toyobo LIP-301/LIP 300, Toyobo LPL 701, Boehringer-Mannheim Chirazyme^TM L6).
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die direkte Auflösung von trans-1-(4-Fluorphenyl)-3-(alkoxycarbonylethyl)]-4(S)-(4-hydroxyphenyl)-2-azetidinon, welches das Hinzufügen der Verbindung zu einem Mikroorganismus in einem Medium, Medium und Puffer, Medium und Lösungsmittel, oder Medium und einer Mischung aus Puffer und Lösungsmittel, besonders wenn der Mikroorganismus Aspergillus terreus oder alliaceus, oder Candida parapsilosis ist, Inkubieren der resultierenden Mischung und Isolieren einer Verbindung mit der Formel IIa umfasst:
wobei R¹ wie oben definiert ist.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung auch die subtraktive Auflösung von trans-1-(4-Fluorphenyl)-3-(alkoxycarbonylethyl)]-4(S)-(4-hydroxyphenyl)-2-azetidinon, welches das Hinzufügen der Mischung zu einem Mikroorganismus in einem Medium, Medium und Puffer, Medium und Lösungsmittel, oder Medium und einer Mischung aus Puffer und Lösungsmittel, besonders wenn der Mikroorganismus Rhodococcus rhodochrous oder Rhodococcus species ist, oder zu einem Enzym in einem Lösungsmittel, Puffer oder einer Mischung aus diesen, besonders wenn das Enzym eine Hydrolase von Pseudomonas sp. ist, Inkubieren der resultierenden Mischung und Isolieren einer Verbindung der Formel Ib umfasst:
wobei R und R¹ wie oben definiert sind. Die Verbindung von Formel Ib wird dann hydrolysiert, um die Carboxylsäureestergruppe, R, zu entfernen, um eine Verbindung der Formel IIa zu erhalten.
GENAUE BESCHREIBUNG
Die hydrolytische Auflösung der vorliegenden Erfindung ist im folgenden Reaktionsschema zusammengefasst:
Dieses Schema zeigt ein Verfahren zur Durchführung einer direkten Hydrolyse unter Verwendung eines Mikroorganismus oder Enzyms, bei dem racemischer Lactam-Ester I hydrolisiert wird, um enantiomerisch angereicherte Säure (3R,4S)-IIa zu erhalten, die leicht vom unreagierten Carboxylsäureester (3S,4R)-Ia getrennt werden kann. Als Alternative liefert eine subtraktive Auflösung von racemischem Lactam-Ester I Säure IIb und enantiomerisch angereichertes Carboxylsäureester (3R,4S)-Ib, welches anschließend hydrolisiert wird, um (3R,4S)-IIa zu erzeugen. Das enantiomerisch angereicherte (3R,4S)-IIa wird anschließend dazu verwendet, um 1-(4-Fluorphenyl)-3-(R)-[3(S)-Hydroxy-3-(4-Fluorphenyl)Propyl)]-4(S)-(4-Hydroxyphenyl)-2-Azetidinon unter Verwendung von Vorgehensweisen, die auf dem Stand der Technik bekannt sind, zu synthetisieren, z.B., indem man die Säure aus Formel IIa in das entsprechende Säurechlorid umwandelt, das Säurechlorid mit einem 4-Fluorphenyl-Derivat reagiert und das Keton auf den Alkohol reduziert, wie das Verfahren H der 5,767,115 beschrieben.
Die hydrolytische Auflösung wird durchgeführt, indem ein racemisches trans-2-(Alkoxycarbonylethyl)-Lactam I einem Mikroorganismen enthaltenden Medium, Medium und Puffer, Medium und Lösungsmittel, oder Medium und einer Mischung aus Puffer und Lösungsmittel, oder einem Enzym enthaltenden Lösungsmittel, Puffer oder einer Mischung aus diesen hinzugefügt wird. Die Bioumwandlung kann bei Temperaturen in einem Bereich von zwischen ungefähr 20 °C bis ungefähr 40 °C durchgeführt werden; die mikrobielle Reaktion wird vorzugsweise bei Raumtemperatur bis 30 °C durchgeführt, und die enzymatische Reaktion wird vorzugsweise bei Raumtemperatur bis 37 °C durchgeführt. Der anfängliche pH-Wert der Reaktion wird abgestimmt, um in einem Bereich von zwischen ungefähr pH 5,0 bis ungefähr 9,0, vorzugsweise pH 7,0 zu sein. Die anfängliche Konzentration von racemischem trans-Lactam-Ester I in der mikrobiellen Reaktion kann von zwischen ungefähr 0,5 g/l bis ungefähr 5 g/l variieren und beträgt vorzugsweise 0,5 g/l. Die Dauer der mikrobiellen Hydrolyse kann von ungefähr 18 bis ungefähr 96 Stunden variieren und beträgt vorzugsweise 48 Stunden. Die anfängliche Konzentration von trans-Lactam-Ester I in der enzymvermittelten Reaktion kann von zwischen ungefähr 5 mg/ml bis ungefähr 200 mg/ml variieren und beträgt vorzugsweise 25 mg/ml. Die Dauer der enzymatischen Hydrolyse kann von ungefähr 24 bis ungefähr 192 Stunden variieren.
Dem Fachmann sind geeignete Fermentationsmedien, Puffer und Lösungsmittel bekannt. Fermentationsmedien enthalten typischerweise eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle oder Mischungen daraus, unter Verwendung solcher Inhaltsstoffe wie Hefeextrakt, Nährbrühe, Dextrose (Cerelose), weißem Kartoffeldextrin, Sojamehl, Pepton und andere im Stand der Technik bekannte Bestandteile. Typische Puffer sind Phosphatpuffer (z.B. 0,1 M bei pH 7), MES (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure], Bis-Tris (Bis[2-hydroxyethyl]iminotris[hydroxymethyl]-methan), PIPES (1,4-Piperazin-diethansulfonsäure), HEPES (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]), TRIS (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) und MOPS (3-[N-Morpholino]propansulfonsäure)-Puffer (z.B. 0,1 M bei pH 7). Typische Lösungsmittel sind Acetonitril, Aceton, Ethylether, Isopropanol, t-Butanol, Isoamylalkohol, p-Dioxan, Isopropylether, Dimethylsulfoxid, t-Butylmethylether (TBME), Toluol, Tetrahydrofuran und CH₂Cl₂. Vorzugsweise werden die mikrobiellen Auflösungen in einem Fermentationsmedium durchgeführt, und die enzymatischen Auflösungen werden vorzugsweise in einem Puffer mit einem Cosolvens durchgeführt; ein bevorzugtes Cosolvens für enzymatische Auflösungen ist TBME.
Am Ende der Hydrolyse können optisch angereicherte Säuren oder Ester unter Verwendung organischer Lösungsmittel, wie zum Beispiel Ethylacetat (EtOAc), TBME, CH₂Cl₂ und dergleichen extrahiert werden. Es können auch Harzadsorption, Chromatographie und andere im Stand der Technik bekannte physikalische Verfahren für die Isolierung optisch angereicherter Säuren oder Ester verwendet werden.
Der Carboxylsäureester aus Formel Ib kann zu der entsprechenden Säure der Formel IIa hydrolisiert werden, indem man Verfahren anwendet, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, zum Beispiel durch die Behandlung mit einer geeigneten Base, z.B. LiOH, wie in US 5,767,115 beschrieben.
Die untenstehenden Beispiele stellen die Auswertung von Mikroorganismen und Enzymen bei der Hydrolyse dieser Erfindung und die Herstellung von Milligramm-Mengen von Verbindungen der Formel IIa und Ib dar.
Beispiel 1
Das allgemeine Verfahren zur Identifizierung der mikrobiellen Hydrolyse von racemischem trans-lactammethylester I zur Verwendung für die Herstellung von Säure IIa ist unten beschrieben.
Samenkulturen von Hefe, Fadenpilzen und Bakterien wurden in 125 ml oder 300 ml Flaschen, die jeweils 25 ml oder 50 ml YPD (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 2 % Dextrose; pH 5,5), SIM6 (3,5 % Sojamehl, 5 % weißes Kartoffeldextrin, 0,5 % Cerelose, 2 mg/l Cobaltchlorid, 0,5 % Calciumcarbonat; pH 6,0) und NYC (0,8 % Nährbrühe, 2 % Hefeextrakt, 2 % Cerelose; pH 7)-Medien enthielten, 72 Stunden lang bei 30 °C mit Umrühren (175–250 rpm) gezüchtet, vor der Inokulierung (4 % v/v) in Flaschenfermentationen (25 ml YPD/125 ml Flasche für Hefe und Fadenpilze oder 25 ml NYC/125 ml Flasche für Bakterien), die bei 30 °C mit Umrühren (250 rpm) inkubiert wurden. Bei allen Fermentationen wurde der Medien-pH-Wert vor der Inokulierung abgestimmt, wurde jedoch während der Kulturausbreitung und Substrathydrolyse nicht überprüft. Eine mikrobielle Auflösung wurde initiiert, indem 0,5 g/l des in Ethanol (25 mg/ml) aufgelösten racemischen trans-lactammethylesters I den Kulturen direkt nach 24 Stunden Wachstum hinzugefügt wurden. Proben von Nährbrühe wurden mit TBME nach 24–72 Stunden der Inkubation mit Substrat extrahiert und wurden durch Umkehrphasen-HPLC analysiert. Bevorzugte Kulturen, die eine selektive Hydrolyse demonstrieren, die Säure IIa erzeugen, sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Beispiel 2
Milligramm-Mengen der Säure IIa, welche von der mikrobiellen Hydrolyse von benzylgeschütztem racemischen trans-lactammethylester I abgeleitet wurde, wurden wie unten beschrieben hergestellt.
Eine mikrobielle Auflösung von Methylester I (0,5 g/l) wurde durchgeführt, um Säure IIa herzustellen, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung mehrerer Flaschenfermentationen unter Einsatz von Aspergillus terreus Stamm ATCC # 24839. Nach 48 Stunden Inkubation wurden Nährbrühen jeder der Kulturen gesammelt, bevor sie zentrifugiert wurden, um die Zellen von der Nährbrühe zu trennen. Zellkörner wurden in flüssigem Stickstoff unter Verwendung eines Mörsers und eines Stößels vor den drei folgenden Extraktionen mit TBME (1–2 Volumen/Nassgewicht) pulverisiert. Nährbrühe wurde separat mit TBME extrahiert. Die TBME-Extrakte enthielten beide die (3R,4S)-Säure und den (3S,4R)-Ester, jeweils in > 99 % Enantiomerenüberschuss. Wasserfreies MgSO₄ wurde zu den TBME-Extrakten hinzugefügt, um Restwasser zu entfernen, die Extrakte wurden gefiltert und das Filtrat durch Verdampfung konzentriert. Die Extraktkonzentrate wurden einem Reinigungsprozess durch vorbereitende Dünnschichtchromatografie unter Einsatz mehrerer 10–20 GF-Siliciumplatten (20 cm × 20 cm × 1000 Mikrometer) unterzogen und mit einer Lösung aus EtO-Ac:Hexan (50:50) entwickelt. Material, das mit dem erwünschten Produkt mitwanderte, wurde von jeder der Siliciumplatten abgekratzt, konzentriert und von dem Silicium mit TBME eluiert. Das Eluat wurde verdampft, um die (3R,4S)-Säure IIa zu erhalten: 170 mg, 17 % Ertrag; 86 % Enantiomerenüberschuss; [α] 25 / D = –13,0° (c = 0,123 Ethanol).
Beispiel 3
Das allgemeine Verfahren zur Identifizierung der mikrobiellen Auflösung von benzylgeschütztem racemischem trans-lactammethylester I zur Verwendung bei der Herstellung von Ester Ib ist unten beschrieben. Samenkulturen von Hefe, Fadenpilzen und Bakterien wurden in 125 ml oder 300 ml Flaschen gezüchtet, die jeweils 25 ml oder 50 ml YPD (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 2 % Dextrin, pH 5,5), SIM6 (3,5 % Sojamehl, 5 % weiße Kartoffeldextrose, 0,5 % Cerelose, 2 mg/l Cobaltchlorid, 0,5 % Calciumcarbonat; pH 6,0) und NYC (0,8 % Nährbrühe, 2 Hefeextrakt, 2 % Cerelose, pH 7,0)-Medien enthielten, 72 Stunden lang bei 30 °C mit Umrühren (175–250 rpm) vor der Inokulierung (4 % v/v) in Flaschenfermentationen (25 ml YPD/125 ml Flasche für Hefe und Fadenpilze oder 25 ml NYC/125 ml Flasche für Bakterien), welche bei 30 °C mit Umrühren (250 rpm) inkubiert wurden. Bei allen Fermentationen wurde der mittlere pH-Wert vor der Inokuliertung abgestimmt, wurde jedoch während der Kulturausbreitung und Substrathydrolyse nicht überwacht. Die mikrobielle Auflösung wurde initiiert, indem 0,5 g/l in Ethanol (25 mg/ml) aufgelöstes racemisches trans-lactammethylester I direkt zu den Kulturen nach 24-stündigem Wachstum hinzugefügt wurden. Proben der Nährbrühe, die nach 24–72 Stunden Inkubation mit dem Substrat mit TBME extrahiert wurden, wurden durch Umkehrphasen-HPLC analysiert. Kulturen, die optisch angereichterten Ester Ib lieferten, sind in Tabelle II zusammengefasst.
Tabelle 2:
Beispiel 4
Milligramm-Mengen an Methylester Ib, der von der Hydrolyse benzylgeschützten racemischen trans-lactammethylesters I (0,5 g/l) abgeleitet wurde, wurden wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt, unter Verwendung mehrerer Flaschenfermentationen unter Einsatz von Rhodococcus species ATCC # 19071. Nach 48 Stunden Inkubation wurden Nährbrühen jeder der Flaschen gesammelt, bevor sie zentrifugiert wurden, um die Zellen von der Fermentationsbrühe zu trennen. Zellkörner wurden durch Ultraschallbehandlung auseinandergesprengt vor drei aufeinanderfolgenden Extraktionen mit TBME (1–2 Volumen/Nassgewicht). Fermentationsbrühe wurde separat mit TBME extrahiert. Wasserfreies MgSO₄ wurde den TBME-Extrakten hinzugefügt, um Restwasser zu entfernen, die Extrakte wurden gefiltert und das Filtrat durch Verdampfung konzentriert. Das Extraktkonzentrat wurde einem Reinigungsprozess durch vorbereitende Dünnschichtchromatografie unter Einsatz mehrerer GF-Siliciumplatten (20 cm × 20 cm × 1000 Mikrometer) unterzogen und mit einer Lösung aus EtOAc:Hexan (50:50) entwickelt. Material, das mit dem erwünschten Produkt mitwanderte, wurde von jeder der Siliciumplatten abgekratzt, konzentriert und von dem Silicium mit TBME eluiert. Das Eluat wurde verdampft, um den (3R,4S)- Ester Ib zu erhalten: 360 mg, 36 % Ertrag; > 99 % Enantiomerenüberschuss; [α] 25 / D = –7,5° (c = 0,133 Ethanol).
Beispiel 5
Das allgemeine Verfahren zur Identifizierung der enzymatischen Auflösung von benzylgeschützten racemischen trans-Lactammethyl- oder -trifluorethylestern I zur Verwendung bei der Erzeugung optisch angereicherter Säure und Ester ist unten beschrieben.
Enzymselektionsreaktionen wurden unter Verwendung eines Zwei-Phasen-Systems von 0,6 ml TBME mit 1,0 ml von 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) durchgeführt. Es wurden Enzyme, typischerweise 50 bis 200 mg oder 100 bis 200 μl, der Suspension hinzugefügt, gefolgt von 14,4 mg Methylester. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur verrührt (350 rpm). Einige Abweichungen von diesen Reaktionsbedingungen wurden wie in Tabelle 3 angezeigt ausgewertet. Es wurde Material durch das Trennen der Phasen durch Zentrifugieren erhalten und das Produkt und das unreagierte Ausgangsmaterial wurden durch chirale HPLC analysiert. Enzyme, die selektive Hydrolyse von racemischem trans-lactammethylester I mit einem Ertrag von Säure IIb zeigten, sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3.

*Bedingungen: Ester (50 mg), Enzym (50 mg), TBME/Phosphatpuffer (pH 7) (1 ml:1 ml), 300 rpm, RT.
#Bedingungen: Ester (19 mg), Enzym (1 mg), Tetrahydrofuran/0,5 M MOPS Puffer pH 7,0 (0,2/1,0 ml)

Eine ähnliche Vorgehensweise wurde unter Verwendung von benzylgeschütztem racemischem trans-Lactamtrifluorethylester I durchgeführt. Enzymreaktionen wurden unter Verwendung eines Zwei-Phasen-Systems von 1,0 ml TBME mit 1,0 ml von 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) durchgeführt. Ungefähr 50 mg Enzym und 50 mg Ester wurden zu der Suspension hinzugefügt und mit Umrühren (300 rpm) bei Raumtemperatur bis zu 186 Stunden lang vermischt. Material wurde durch Trennen der Phasen durch Zentrifugieren erhalten, und das Produkt und das Ausgangsmaterial wurden durch chirale HPLC analysiert. Enzyme, die selektive Hydrolyse von racemischem trans-Lactamtrifluorethylester I mit einem Ertrag von Säure IIb und Ester Ib zeigten, sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Tabelle 4
Beispiel 6
Milligramm-Mengen an Ester Ib, welcher von der enzymatischen Auflösung von benzylgeschütztem racemischem trans-lactammethylester abgeleitet wurde, wurden wie unten beschrieben hergestellt.
Toyobo LPL-311 (Typ A) (Pseudomonas sp.) (202 mg) wurde in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7) (8 ml) bei Raumtemperatur aufgelöst. Eine Lösung von racemischem Methylester (199,5 mg, 0,46 mmol) in TBME (8 ml) wurde hinzugefügt. Die Zwei-Phasen-Mischung wurde 187 Stunden lang bei 37 °C bei 250 rpm geschüttelt. Die Reaktionsmischung wurde mit 0,5 M H₂SO₄ (1 ml) angesäuert, mit Wasser (15 ml) verdünnt und in zwei Zentrifugenröhren gegeben. EtOAc (20 ml) wurde zu jeder Röhre hinzugefügt und die Röhren geschüttelt, dann bei 3000 rpm 0,5 Stunden lang zentrifugiert. Die organische Schicht wurde entfernt und die Extraktion/Zentrifugation zweimal wiederholt. Die kombinierten organischen Extrakte wurden verdampft und das rohe Produkt wurde auf eine Siliciumgelsäule (Selecto 32-63-Gitter; 20 g) gegeben und mit 30 % (300 ml) und 50 % (400 ml) EtOAc/Heptan eluiert, mit einer Sammlung von Fraktionen von ~20 ml. Die Fraktionen 4 bis 6 wurden kombiniert und verdampft, um den (3R,4S)-Methylester zu liefern: 89 mg, 44,6 %, 95,1 % Enantiomerenüberschuss; [α] 25 / D = –14,15°
(c = 0,89, Ethanol) Fraktionen 11 bis 19 stellten die (3S,4R)-Säure bereit: 39 mg, 20,2 %; 84,5 % Enantiomerenüberschuss; [α] 25 / D = +14,87°
(c = 0,39, Ethanol).
Beispiel 7
Milligramm-Mengen der Säure IIa, die von der enzymatischen Auflösung von benzylgeschütztem racemischem trans-Lactamtrifluormethylester abgeleitet wurde, gefolgt von der Hydrolyse des Trifluormethylesters, wurden wie unten beschrieben hergestellt.
Schritt 1:
Toyobo LPL-311 (Typ A) (Pseudomonas sp.) (365 mg) wurde in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7) (16 ml) bei Raumtemperatur aufgelöst. Es wurde eine Lösung von racemischem Trifluormethylester (428 mg, 0,85 mmol) in TBME (16 ml) hinzugefügt. Die Zwei-Phasen-Mischung wurde bei 37 °C bei 250 rpm 7,75 Stunden lang geschüttelt, dann in einem Kühlschrank über Nacht aufbewahrt. Die Reaktionsmischung wurde mit 0,5 M H₂SO₄ (1 ml) angesäuert, mit Wasser verdünnt (50 ml) und in vier Zentrifugenröhren gegeben. Es wurde EtOAc (15 ml) zu jeder Röhre hinzugefügt und die Röhren geschüttelt, dann bei 3000 rpm 0,5 Stunden lang zentrifugiert. Die organische Schicht wurde entfernt und die Extraktion/Zentrifugation zweimal wiederholt. Die kombinierten organischen Extrakte wurden verdampft und das rohe Produkt wurde auf eine Siliciumgelsäule (Selecto 32-63-Gitter; 35 g) gegeben und mit 30 % (450 ml) und 50 % (600 ml) EtOAC/Heptan eluiert, mit Sammlung von Fraktionen von ~20 ml. Fraktionen 5 bis 7 wurden kombiniert und verdampft, um den (3R,4S)-Trifluorethylester zu liefern: 191 mg, 44,6 %; 99,0 % Enantiomerenüberschuss; [α] 25 / D = –9,31° (c = 1,88, Ethanol). Die Fraktionen 18 bis 36 stellten die (3S,4R)-Säure bereit: 100 mg, 27,9 %; 88,3 % Enantiomerenüberschuss; [α] 25 / D = +15,96° (c = 0,99 Ethanol).
Schritt 2:
(3R,4S)-Trifluorethylester (181 mg, 0,36 mmol) (99,0 % ee) wurde in THF (4 ml) aufgelöst und in einem Eisbad auf 0° gekühlt. Eine Lösung von LiOH (52,5 mg, 1,25 mmol) wurde hinzugefügt und die Mischung bei 0 °C 3,25 Stunden lang verrührt, wobei zu dieser Zeit HPLC vollständige Hydrolyse anzeigte. Die Reaktionsmischung wurde mit 0,5 M H₂SO₄ (12 ml) angesäuert und mit EtOAc (2 × 15 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden mit gesättigter NaCl-Lösung (10 ml) gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), gefiltert und verdampft: 146 mg, 96,4 %; 98,2 % Enantiomerenüberschuss.
Eine Probe des rohen Produkts wurde durch vorbereitende TLC (Analtech Uniplate Siliciumgel GF; 20 × 20 cm; 1000 μm) gereinigt, Eluieren mit 50 % EtOAc/Heptan: [α] 25 / D = –16,52° (c = 0,66, Ethanol).

Claims

Verfahren zur mikrobiologischen oder enzymatischen hydrolytischen Auflösung eines racemischen trans-2-(Alkoxycarbonylethyl)-Lactams der Formel I
wobei R C₁-C₇-Alkyl, 2,2,2-Trifluorethyl oder Methoxyethoxyethyl und R¹ ein Wasserstoff oder eine Schutzgruppe ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Benzyl, Trimethylsilyl, t-Butyldimethylsilyl und Acetyl besteht, Schritte umfassend bei denen man: ein racemisches Lactam I zu Mikroorganismen in ein Medium, Medium und Puffer, Medium und Lösungsmittel, oder Medium und einer Mischung aus Puffer und Lösungsmittel oder zu Enzymen in Puffer, Lösungsmittel oder einer Mischung daraus gibt, um eine optisch angereicherte Verbindung der Formel Ib oder IIa zu erhalten
wobei R und R¹ wie oben definiert sind; und ein Carboxylsäureester der Formel Ib hydrolysiert, um eine Verbindung der Formel IIa zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Mikroorganismen zur Auflösung eines racemischen trans-Lactam 1 verwendet werden, um eine optisch angereicherte Säure IIa zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem R ein Methyl ist.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der Mikroorganismus von der Gattung ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Aspergillus, Bacillus, Candida, Cunninghamella, Debaryomyces, Mycobacterium, Paecilomyces, Penicillium, Rhobobacter, Streptomyces und Trichothecium besteht.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Mikroorganismus von der Art ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Aspergillus alliaceus, niger, niveus und terreus, Bacillus sphaericus, Candida parapsilosis und rugosa; Cunninghamella homothallica; Debaryomyces hansenii; Mycobacterium fortuitum; Paecilomyces marquandii; Penicillium implicatum; Rhodobacter sphaeroides; Streptomyces spectabilis; und Trichothecium roseum besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Mikroorganismen für die Auflösung eines racemischen trans-Lactam I verwendet werden, um optisch angereicherten Carboxylsäureester Ib zu erhalten, gefolgt von einer Hydrolyse, um optisch angereicherte Säure IIa zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem R Methyl und R¹ Benzyl ist.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der Mikroorganismus von der Gattung ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Comamonas, Curvularia, Mucor, Nocardia und Rhodocuccus besteht.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Mikroorganismus von der Art ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Comamonas testosteroni; Curvularia brachyspora und geniculata; Mucor circinelloides und racemosus; Nocardia corallina und Rhodocuccus erythropolis, rhodochrous und species besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Enzyme für die Auflösung von Benzyl geschütztem racemischen trans-Lactam I verwendet werden, um optisch angereicherten Carboxylsäureester Ib zu erhalten, gefolgt von einer Hydrolyse, um optisch angereicherte Säure IIa zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem R Methyl oder Trifluorethyl und R¹ Benzyl ist.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Enzym aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer Hydrolase von Rhizopus delemar, Rhizopus javanicus, Mucor javanicus, Rhizopus niveus, Pseudomonas mandocino, Rhizopus japonicus, Candida antarctica, Pseudomonas sp., Rhizopus sp., Rhizopus oryzae, Aspergillus niger, Mucor miehei und Rhizopus arrhizus besteht.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das Enzym aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer Hydrolase von Pseudomonas species besteht.
Verfahren zur hydrolytischen Auflösung eines racemischen trans-2-(Alkoxycarbonylethyl)-Lactams der Formel I
wobei R C₁-C₇-Alkyl, 2,2,2-Trifluorethyl oder Methoxyethoxyethyl und R¹ Wasserstoff oder eine Schutzgruppe ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Benzyl, Trimethylsilyl, t-Butyldimethylsilyl und Acetyl besteht, Schritte umfassend bei denen man: ein racemisches Lactam I zu einem Mikrorganismus von der Gattung, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Aspergillus, Bacillus, Candida, Cun ninghamella, Debaryomyces, Mycobacterium, Paecilomyces, Penicillium, Rhobobacter, Streptomyces und Trichothecium besteht, in ein Medium, Medium und Lösungsmittel, Medium und Puffer, oder Medium und eine Mischung aus Puffer und Lösungsmittel, gibt, um eine optisch angereicherte Verbindung der Formel
zu erhalten, wobei R¹ wie oben definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem der Mikroorganismus Aspergillus alliaceus oder terreus oder Candida parapsilosis ist.
Verfahren zur hydrolytischen Auflösung eines racemischen trans-2-(Alkoxycarbonylethyl)-Lactams der Formel I
wobei R ein C₁-C₇-Alkyl, 2,2,2-Trifluorethyl oder Methoxyethoxyethyl und R¹ ein Wasserstoff oder eine Schutzgruppe ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Benzyl, Trimethylsilyl, t-Butyldimethylsilyl und Acetyl besteht, Schritte umfassend bei denen man: ein racemisches Lactam I zu einem Mikrorganismus von der Gattung, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Comamonas, Curvularia, Mucor, Nocardia und Rhodococcus besteht in ein Medium, Medium und Lösungsmittel, Medium und Puffer, oder Medium und eine Mischung aus Puffer und Lösungsmittel, gibt, um eine optisch angereicherte Verbindung der Formel Ib zu erhalten
wobei R und R¹ wie oben definiert sind; und den Carboxylsäureester der Formel Ib hydrolysiert, um eine Verbindung der Formel IIa zu erhalten
wobei R¹ wie oben definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem der Mikroorganismus Rhodococcus rhodochrous oder species ist.
Verfahren zur hydrolytischen Auflösung eines racemischen trans-2-(Alkoxycarbonylethyl)-Lactams der Formel I
wobei R ein C₁-C₇-Alkyl, 2,2,2-Trifluorethyl oder Methoxyethoxyethyl und R¹ ein Wasserstoff oder eine Schutzgruppe ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Benzyl, Trimethylsilyl, t-Butyldimethylsilyl und Acetyl besteht, Schritte umfassend bei denen man: ein racemisches Lactam I zu einem Enzym, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer Hydrolase von Pseudomonas species besteht, in Puffer, Lösungsmittel oder eine Mischung davon gibt, um eine optisch angereicherte Verbindung der Formel Ib zu erhalten
wobei R und R¹ wie oben definiert sind; und den Carboxylsäureester der Formel Ib hydrolysiert, um eine Verbindung der Formel IIa zu erhalten
wobei R¹ wie oben definiert ist.