DE69927416T2

DE69927416T2 - Globale regulatoren von pathogenen bakteriellen genen; bakterielles selbstinduzierendes inaktivierungsprotein, die als ziele für die herstellung von krankheitsresistenzen einsetzbar sind

Info

Publication number: DE69927416T2
Application number: DE69927416T
Authority: DE
Inventors: Zhang Lian-Hui; Dong Yihu; Xu Jinling
Original assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Current assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date: 1999-07-02
Filing date: 1999-11-17
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2019-11-18
Also published as: JP2003504028A; DE69927416D1; BR9917419A; RU2236462C2; MY136784A; AU780185B2; SG91822A1; EP1192256B1; CA2378153A1; ATE305042T1; CN1230539C; HUP0202166A2; NZ516516A; NO20016397L; CN1361823A; AU1594800A; RU2002102558A; IL147334A; WO2001002578A1; HUP0202166A3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf globale Regulatoren von bakteriellen pathogenen Genen und ihre Verwendung zur Verleihung von Krankheitsresistenzen.
Eine Bibliographie wurde an das Ende der vorliegenden Beschreibung der Erfindung angehangen. Die dort aufgeführten Verweise sind hiermit alle durch diesen Hinweis eingeführt.
Die Zell-zu-Zell-Kommunikation über kleine Signalmoleküle hat nicht nur eine entscheidende Bedeutung bei mehrzelligen lebenden Organismen, wie Tieren und Pflanzen, sondern sie spielt auch eine wichtige Rolle bei der funktionalen Koordination unter Familienmitgliedern von einzelligen Organismen, wie Bakterien. Der große Fortschritt in den letzten Jahren hat deutlich gemacht, dass N-Acylhomoserinlactone, die als Autoinduktoren (Als) bekannt sind, allgemein konservierte Signalmoleküle in Gram-negativen Bakterien sind. Als wurden als erstes in Meeresbakterien, Vibrio-Arten, im Zusammenhang mit der Regulation der Biolumineszenz (Eberhard, et al., 1981; Cao und Meighen, 1989) gefunden. In den vergangenen Jahren wurden Als bei einer Vielzahl von Gramnegativen Bakterien identifiziert. Es stellte sich heraus, dass Als beteiligt sind bei der Regulation eines Bereiches von biologischen Funktionen, einschließlich des konjugalen Ti-Plasmidtransfers in Agrobacterium tumefaciens (Zhang, et al., 1993), der Induktion von Virulenzgenen in Erwinia carotovora, Pseudomonas aeruginosa, Erwinia stewartii, Xenorhabdus nematophilus, Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas solanacerum und Xanthomonas campestris (Jones, et al., 1993; Passador, et al., 1993; Pirhonen, et al., 1993; Pearson, et al., 1994; Beck von Bodman und Farrand, 1995; Barber, et al., 1997; Clough, et al., 1997; Costa und Loper, 1997; Dunphy, et al., 1997; Nasser, et al., 1998), der Regulation der Antibiotikaproduktion in Pseudomonas aureofaciens und Erwinia carotovora (Pierson, et al., 1994; Costa und Loper, 1997), der Regulation der Schwarmmotilität in Serratia liquifaciens (Eberl, et al., 1996) und der Biofilmbildung in Pseudomonas fluorescens und P. aeruginosa (Allison, et al., 1998; Davies, et al., 1998). Es sind inzwischen viele andere bakterielle Arten bekannt, die Als herstellen, wobei aber die damit zusammenhängenden biologischen Funktionen noch nicht erarbeitet wurden (Bassler, et al., 1997; Dumenyo, et al., 1998; Cha, et al., 1998).
Verschiedene bakterielle Arten können unterschiedliche Als herstellen. Alle AI-Derivate teilen sich identische Homoserinlacton-Komponenten, wobei sie sich in der Länge und in der Struktur ihrer Acylgruppen jedoch unterscheiden können. Die Schlüsselkomponente bei AI-vermittelten Genregulationssystemen sind die Proteine des LuxI- und LuxR-Typs. Es wurde jetzt bestätigt, dass das Protein des LuxI-Typs als eine Autoinduktor-Synthase dient, die Acyl-ACPs und AdoMet (S-Adenosylmethionin) als Substrate verwendet (More, et al., 1996; Schaefer, et al., 1996). Von dem Protein des LuxR-Typs wird angenommen, dass es ein Rezeptor für Als und ein AI-abhängiger Transkriptionsregulator ist, der DNA sofort stromaufwärts von dem Lux Promotor bindet (Meighen, 1994; Sitnikov, et al., 1995). Eine 20-Nukleotid invertierte Sequenzwiederholung wurde identifiziert, die 44 Nukleotide stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle des Lumineszenz-Operons zentriert ist. Diese Lux-Box genannte Sequenz ist erforderlich für die Transkriptionsaktivierung durch LuxR und ist wahrscheinlich die LuxR-Bindungsstelle (Fuqua et al., 1994). Ähnliche 18 Basenpaare lange Tra-Boxen wurden stromaufwärts bei wenigstens drei TraR-regulierten Promotoren gefunden und die Unterbrechung von diesen Elementen hebt die Transkriptionsaktivierung durch TraR auf (Fuqua und Winans, 1996a).
Die Proteine des LuxR-Typs scheinen aus zwei Modulen zusammengesetzt zu sein (Choi und Greenberg, 1991; Hanzelka und Greenberg, 1995). Ihre terminalen Carboxylregionen enthalten eine konservierte kurze Sequenz von 19 Aminosäuren, mutmaßlich ein Helix-Turn-Helix-Motiv des Sondentyps, von dem angenommen wird, dass es bei der Bindung von Targetpromotoren beteiligt ist. Ein allgemeiner Mechanismus der Aktivierung wurde vorgeschlagen, wobei die N- terminale Domäne des Proteins des LuxR-Typs negativ wirkt, um eine Interaktion zwischen seiner C-terminalen Domäne und der DNA-Zielbindungsstellen zu verhindern. Diese Hemmung kann durch die Wirkung eines Autoinduktor-Liganden aufgehoben werden. Ein starker Anhaltspunkt dafür besteht darin, dass die Deletion der N-terminalen Domäne von LuxR zu konstitutiv aktiven Allelen von LuxR führt, während größere Deletionen, die Teile der angenommenen DNA-Bindungsdomäne entfernen, die Transkriptionsaktivierung aufheben (Choi und Greenberg, 1991). Andere Mitglieder können jedoch unterschiedliche Mechanismen verwenden. Vor kurzem durchgeführte, genetische Studien belegen, dass EsaR und ExpR eher Repressoren von ihren Zielgenen als Aktivatoren darstellen. Die Expression dieser Gene, die durch EsaR und ExpR unterdrückt werden, wird durch Autoinduktoren erhöht (Beck von Bodman und Farrand 1995; Throup, et al. 1995). Es scheint, dass die Bindung von diesen Proteinen an ihren Zielorten in der Promotorregion zur Repression führt, so dass die Autoinduktor-Liganden die Bindungsaffinität reduzieren können.
Ein Anhaltspunkt dafür, dass die Autoinduktor-Bindungsstelle in der terminalen Aminodomäne des LuxR Proteins liegt, wurde vorgestellt (Hanzelka und Greenberg, 1995). LuxR Allele, die mutierte, terminale Aminoregionen besitzen, erfordern höhere Mengen von diesem Signal als der Wildtyp, was anzeigt, dass diese Region für die Ligandeninteraktion erforderlich ist (Slock, et al., 1990; Shadel, et al., 1990). Diese Region (Aminosäure 79–127) und eine Region innerhalb der DNA-Bindungsdomäne (Aminosäure 180–230) zeigen ein höheres Maß an Konservierung innerhalb von LuxR und seinen Homologen (ca. 50% Identität) als andere Teile von diesen Polypeptiden. Die vorgeschlagene Protein-Liganden-Interaktion zwischen LuxR und dem Autoinduktor wurde jedoch bisher noch nicht bewiesen. Die Analyse von merodiploiden E. coli Stämmen, die Wildtyp- und mutierte LuxR-Allele enthalten, lässt vermuten, dass LuxR als ein Homomultimer fungiert, und dass eine Region, die für die Multimerisation erforderlich ist, innerhalb der Aminosäurereste 116 und 161 liegt (Choi und Greenberg, 1992).
Gemäß einem Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein bakterielles Autoinduktor-Inaktivierungsprotein codiert, wobei das Nukleinsäuremolekül aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: a) einer Nukleinsäure mit einer Sequenz des codierenden Teils von SEQ ID Nr. 1; b) einer Nukleinsäure, die für die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 codiert, und c) einer Nukleinsäure, die mit a) oder b) hybridisiert, wobei ein positives Hybridisierungssignal nach Waschen mit 1 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C für eine Stunde beobachtet wird.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf einen Expressionsvektor, der dieses Nukleinsäuremolekül umfasst, welches für ein bakterielles Autoinduktor-Inaktivierungsprotein codiert, wobei der Expressionsvektor in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle sich vermehrt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Zelle eines Prokaryonten oder Eukaryonten, der mit dem Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert oder transfiziert ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein isoliertes Protein, das eine bakterielle Autoinduktor-Inaktivierungsaktivität besitzt, wobei das Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, die für ein bakterielles Autoinduktor-Inaktivierungsprotein zur Verwendung in der Therapie codiert, wobei diese Nukleinsäuresequenz von der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus: a) einer Nukleinsäure mit der Sequenz des codierenden Teils von SEQ ID Nr. 1; b) eine Nukleinsäure, die für die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 codiert.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Erhöhung der Krankheitsresistenz in einer Pflanze, wobei das Verfahren die Einführung einer Nukleinsäuresequenz, die für ein bakterielles Autoinduktor-Inaktivierungsprotein codiert, in eine Zelle von solch einer Pflanze in einer Weise umfasst, was dieser Zelle erlaubt, diese Nukleinsäuresequenz zu exprimieren, wobei die Nukleinsäuresequenz aus der Gruppe ausgewählt wird, die umfasst: a) eine Nukleinsäure mit der Sequenz des codierenden Teils von SEQ ID Nr. 1; b) eine Nukleinsäure, die für die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 codiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein bakterielles Autoinduktor-Inaktivierungsprotein zur Verwendung in der Therapie, was die SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Verhinderung oder zur Reduktion eines bakteriellen Schadens bei einer Pflanze, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge eines bakteriellen Autoinduktor-Inaktivierungsproteins, wobei das Protein die SEQ ID Nr. 2 umfasst, auf eine Pflanze umfasst, die solch einer Verhinderung oder Reduktion bedarf.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Zusammensetzung, die umfasst:

a) eine wirksame Menge eines bakteriellen Autoinduktor-Inaktivierungsproteins, das SEQ ID Nr. 2 umfasst; und
b) ein geeigneter Träger für die Verwendung in der Therapie oder für die Reduktion eines bakteriellen Schadens bei einer Pflanze.

Die 1 zeigt den zeitlichen Verlauf der Als-Inaktivierung durch Zellextrakte von Bacillus sp. Stamm 240B1. Die Zellextrakte in 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,0), der 100 μg Gesamtprotein enthielt, wurden zu dem gleichen Puffer, der OHHL enthielt, in einer Endkonzentration von 20 μM zugesetzt. Die Reaktion wurde in 1,5 ml Eppendorf-Zentrifugenröhrchen mit einem Endvolumen von 200 Mikroliter durchgeführt und bei 28°C inkubiert. Die gleiche Konzentration von OHHL in dem Phosphatpuffer wurde als Kontrolle verwendet. Proben wurden im 10 Minuten Abstand bis zu 60 Minuten genommen und die Reaktion wurde durch Kochen für 3 Minuten gestoppt. Die Proben wurden für 5 Minuten in einer Tischzentrifuge mit Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert und dann auf ihre Als-Aktivität wie beschrieben (Zhang, 1993) getestet. Eine blaue Kolonie zeigt die Gegenwart von AI an, welches das lacZ Reportergen aktiviert, und eine weiße Kolonie zeigt die Abwesenheit von AI an. Die Reihen von links nach rechts: 1, OHHL Kontrolle ohne Proteinextrakt; 2–7, Proben nach 10, 20, 30, 40, 50, 60 Minuten Enzymreaktion.
Die 2 zeigt die Bestimmung der Molekularmasse des Als-Inaktivierungsenzyms. Ein 600 μl Aliquot der Zellextrakte wurde Centricon 30 (Amicon) zugesetzt und mit einer Geschwindigkeit von 5.000 × g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die durchgehende Fraktion (550 Mikroliter) und die zurückgehaltene Fraktion (50 Mikroliter) wurden getrennt auf ein Endvolumen von 600 Mikroliter durch Zugabe von 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,0) aufgefüllt. Für den Biotest wurden verschiedene Mengen der Proteinproben den Röhrchen, die OHHL enthielten, bis zu einer Endkonzentration von 20 μM zugesetzt. Von der Reihe 1–6 hatten die zugesetzten Proteinproben 2, 4, 6, 8, 10 und 0 μl und das Endreaktionsvolumen war 20 Mikroliter für jede Reaktion. Platte A: Durchgehende Fraktion, Platte B: zurückgehaltene Fraktion.
Die 3 zeigt die Klonierungs- und Deletionsanalyse der AI Inaktivierungsregion von Bacillus sp. Stamm 240B1. Der Cosmidklon E7-R3 enthält das 4,3 kb EcoRI Fragment, das durch Restriktionsanalyse von überlappenden Cosmidklonen identifiziert wurde. Für die Deletionsanalyse wurde das gleiche Fragment in den Klonierungsvektor pGEM-7Zf(+) für die Erzeugung des Klons E7-7 kloniert. Die Deletions-Subklone wurden durch Verdau mit Restriktionsenzym und Dnase I Behandlung von dem Klon E7-7 hergestellt. Die Lokalisierung und die Ausrichtung der Ptac Promotoren in dem Cosmid und in dem pGEM-7Zf(+) Klon sind durch Pfeile dargestellt. Die AI Inaktivierungsaktivität der Klone ist in der zweiten Reihe dargestellt: +, mit AI Inaktivierungsaktivität; -, ohne AI Inaktivierungsaktivität. Restriktionsenzyme: E, EcoRI; H, HindIII; Ev, EcoRV; st, Styl. Die Lokalisierung und die Richtung der Transkription von aiiA ORF sind mit einem offenen Pfeil dargestellt.
Die 4 zeigt die Nukleotidsequenz des aiiA Gens [SEQ ID Nr. 1]. Die potentielle Ribosomenbindungssequenz und das –10 Promotorelement sind unterstrichen bzw. doppelt unterstrichen. Der codierende Abschnitt startet bei Base 1. Die wahrscheinliche Faktor-unabhängige Terminationsstelle ist durch eine dicke Unterstreichung gekennzeichnet. Die 4B zeigt die angenommene Aminosäuresequenz des aiiA Genproduktes [SEQ ID Nr. 2]. Eine kurze Peptidsequenz, die dem Konsensusmotiv der aktiven Aspartyl-Proteasenstelle ähnlich ist, ist unterstrichen.
Die 5 zeigt die beste Übereinstimmung der Aminosäuresequenz des aiiA Genproduktes (AiiA) mit dem Konsensusmotiv der aktiven Aspartyl-Proteasenstelle (Asp). Symbol: X, jede Aminosäure. Eine vertikale Linie zeigt eine perfekte Übereinstimmung an.
Die 6 zeigt den Biotest für die Als Inaktivierungsaktivitäten in Bacillus sp. Stamm 240B1, E. coli Klonen und die Als Produktionsaktivität in Stämmen von Erwinia carotovora. Reihe 1, OHHL Kontrolle; Reihe 2, Bacillus sp. Stamm 240B1; Reihe 3, E. coli DH5α; Reihe 4, E. coli DH5α (pE7-R3); Reihe 5, E. coli DH5α (pF41); Reihe 6, Erw. carotovora SCG1 (pE7R3); Reihe 7, Erw. carotovora SCG1 (pLAFR3); Reihe 8, Erw. carotovora SCG1. In dem Biotest wurde OHHL bis zu einer Endkonzentration von 20 μM den Proben von den Linien 1 bis 5 zugesetzt. Keine exogene Als wurden den Proben von den Reihen 6 bis 8 zugefügt.
Die 7 zeigt den Effekt der aiiA Genexpression in Erw. carotovora auf die Pathogenität in (A) Kartoffel; (B) Aubergine; (C) Chinakohl; (D) Karotte und (E) Sellerie. Oben: Die pflanzlichen Gewebe wurden mit Erw. carotovora SCG1 inokuliert. Unten: Die pflanzlichen Gewebe wurden inokuliert mit Erw. carotovora SCG1 (pE7-R3). Die aktiv wachsenden Bakterien wurden für 1 Minute bei 3.000 × g zentrifugiert und mit YEB Flüssigmedium auf 0D600 = 1,3 (2 × 10⁹ cfu/ml) resuspendiert, was als 10⁰ Inokulum bezeichnet wurde. Das 10⁰ Inokulum wurde 5-fach bzw. 10-fach verdünnt, um 10^–1/2 und 10^–1 Verdünnungen herzustellen. Die pflanzlichen Gewebe wurden inokuliert durch Zugabe von 4 μl Volumen des Bakterieninokulums auf frische Schnittflächen oder auf eine Verwundungsstelle, die mit einer Pipettenspifze geschaffen wurde. Die Inokulum-Konzentration von der linken zu der rechten Platte ist 10⁰, 10^–1/2 und 10^–1. Die okulierten pflanzlichen Gewebe wurden in Plastikschalen angeordnet und bei 28°C inkubiert. Die Aufnahmen wurden 48 Stunden nach der Inokulation aufgenommen.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass das SEQ ID Nr. 2 Protein einen Effekt auf die Reduktion oder Eliminierung der Aktivität von bakteriellen Autoinduktoren (Als) besitzt. Demgemäß kann das Protein und jede Nukleinsäure, die für das Protein codiert, bei einer Reihe von Situationen verwendet werden, wo es erwünscht ist, den Effekt von solchen Bakterien zu reduzieren oder zu eliminieren.
Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäuremolekül bereit, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

a) einer Nukleinsäure mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 1;
b) einer Nukleinsäure, die für die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 2 codiert; und
c) einer Nukleinsäure, die mit a) oder b) hybridisiert, wobei ein

Die Nukleinsäuresequenz kann verwendet werden, um Pflanzen eine bakterielle Resistenz zu verleihen oder für eine Therapie bei Tieren. Eine Nukleinsäure, die für ein bakterielles Autoindukter-Inaktivierungsprotein codiert, kann so in eine Zelle eingeführt werden, dass das Inaktivierungsprotein von der Pflanze oder dem Tier exprimiert wird.
Die Nukleinsäuresequenz kann verwendet werden, um Krankheitsresistenzen zu übertragen, wo die Expression der pathogenen Gene durch Autoinduktoren reguliert wird, wie bei Krankheiten, die hervorgerufen werden von Pseudomonas aeruginosa, Erwinia stewartii, Xenorhabdus nematophilus, Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas solanacerum und Xanthomonas campestris (Passador, et al., 1993; Pirhonen, et al., 1993; Pearson, et al., 1994; Beck von Bodman und Farrand, 1995; Barber, et al., 1997; Clough, et al., 1997; Costa und Loper, 1997; Dunphy, et al., 1997; Nasser, et al., 1998). Auf landwirtschaftlichem Gebiet kann die Sequenz vorzugsweise verwendet werden, um empfindlichen Pflanzen, wie Kartoffel, Aubergine, Chinakohl, Karotte und Sellerie, eine Krankheitsresistenz gegenüber Weichfäule zu vermitteln.
Die Sequenz kann in die pflanzlichen oder tierischen Zellen durch gut bekannte Verfahren eingeführt werden. Verfahren für die Transformation oder Transfektion von eukaryontischen Zellen mit exogenen Nukleinsäuresequenzen umfassen die Transfektion, die Projektilbeschießung, die Elektroporation oder Infektion durch Agrobacterium tumefaciens. Diese Verfahren sind Fachleuten auf dem Gebiet der Molekularbiologie und der Biotechnologie gut bekannt und müssen hier nicht weiter im Detail erläutert werden. Da pathogene bakterielle Zellen auf den interzellulären Bereich von pflanzlichen Geweben beschränkt sind, ist es vorteilhaft, das AiiA Protein in die interzellulären Räume einzubringen. Dies kann erzielt werden durch die Fusion eines Sekretionssignalpeptides mit dem AiiA Protein (Sato, et al., 1995; Firek, et al., 1993; Conrad und Fiedler, 1998; Borisjuk, et al., 1999). Alternativ kann ein Befestigungsmotiv für die pflanzliche Membran in die Peptidsequenz von AiiA eingefügt werden, um das AiiA Enzym an der äußeren Oberfläche der pflanzlichen Zellmembran zu verankern.
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Strategie für die Erzeugung von Krankheitsresistenzen bereit. Insbesondere zielt diese Strategie auf N-Acylhomoserinlacton-Autoinduktoren, welche die Expression von pathogenen Genen von vielen bakteriellen Pathogenen mit einer Schwellenkonzentration induzieren. Diese Strategie ist auf alle pflanzlichen, tierischen oder Säugetierkrankheiten anwendbar, wo die Expression von pathogenen Genen des bakteriellen Pathogens durch N-Acylhomoserinlacton-Autoinduktoren induzierbar ist.
Die vorliegende Erfindung zielt auch auf die Verwendung eines bakteriellen Autoinduktor-Inaktivierungsproteins, um direkt den bakteriellen Schaden zu behandeln oder zu verhindern. Das Protein kann zum Beispiel direkt auf Pflanzen, die solch einer Behandlung oder Verhinderung bedürfen, angewandt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Protein in Form einer Zusammensetzung angewandt, welche eine wirksame Menge des Proteins und einen geeigneten Träger umfasst. Die Zusammensetzung kann einen großen Bereich an Formen umfassen, einschließlich Lösungen, Pulver, Emulsionen, Dispersionen, Pasten, Aerosolen, etc.
Das bakterielle Autoinduktor-Inaktivierungsprotein kann auch bei der Therapie verwendet werden, zum Beispiel bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen in Tieren. Bei dieser Anwendung wird eine wirksame Menge des aktiven Wirkstoffs einem Tier, das solch einer Behandlung bedarf, verabreicht.
Für eine therapeutische Behandlung kann der aktive Wirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert werden, die zusätzlich zu der wirksamen Menge des aktiven Inhaltsstoffes pharmazeutisch akzeptable Träger, Verdünnungsmittel, Puffer, Konservierungsmittel, oberflächenaktive Mittel und ähnliches umfasst. Die Zusammensetzungen können auch einen oder mehrere andere aktive Wirkstoffe umfassen, wenn dies notwendig oder wünschenswert ist.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können sehr untershciedlich verabreicht werden, wie dies für einen Fachmann erkennbar ist. Die Verabreichung kann topisch, oral, durch Inhalation oder parenteral erfolgen.
Topische Formulierungen umfassen Salben, Lotionen, Cremes, Gels, Tropfen, Zäpfchen, Sprays, Flüssigkeiten und Pulver. Orale Formulierungen umfassen zum Beispiel Pulver, Körnchen, Suspensionen oder Lösungen in Wasser oder nicht-wässrige Medien, Kapseln oder Tabletten. Verdickungsmittel, Geschmacksstoffe, Verdünnungsmittel, Emulgatoren, Dispergierhilfsmittel oder Bindemittel können auch, wie erforderlich, verwendet werden.
Parenterale Formulierungen können sterile wässrige Lösungen umfassen, die auch Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Additive enthalten können.
Die Dosisbehandlung wird von einer Reihe von Faktoren, die leicht zu bestimmen sind, abhängen, wie die Stärke und die Reaktivität des zu behandelnden Zustandes.
Aspekte der Erfindung werden nun anhand der nicht limitierenden Beispiele erläutert werden.
Beispiel 1
Das bakterielle Isolat 240B1 wurde aus einer Bodensuspension isoliert auf Basis seiner Funktion zur Inaktivierung von N-β-Oxo-hexanoyl-L-homoserinlacton (OHHL) und N-β-Oxooctanoyl-L-homoserinlacton (OOHL) und N-β-Oxodecanoyl-L-homoserinlacton (ODHL) (Zhang, et al., 1993). Soweit nichts anderes angegeben ist, wurde OHHL für den Routinebiotest verwendet. Erwinia carotovora Stamm SCG1 wurde aus einem Chinakohlblatt isoliert, das Symptome von Weichfäule zeigte. Es wurde bestätigt, dass der Stamm SCG1 Als produziert und die Weichfäulekrankheit in der Kartoffel und im Chinakohl hervorruft. Der Escherichia coli Stamm DH5α wurde als Wirt für die DNA-Klonierung und – Subklonierung verwendet. Agrobacterium tumefaciens Stamm NT1 (traR; tra::lacZ749) wurde als Indikator im Bioassay für die AI Aktivität (Piper, et al., 1993) verwendet. Der E. coli Stamm wurde in Luria-Bertani (LB) Medium bei 37°C kultiviert und die anderen Stämme wurden kultiviert in LB (Miller, 1972) oder im YEB-Medium (pro Liter: Caseinhydrolysat 10 g, Hefeextrakt 5 g, NaCl 10 g, Sucrose 5 g, MgSO₄ × 7H₂O 0,5 g, Agar 15 g, pH 7,2) bei 28°C. Das Minimalsalzmedium mit Mannit und (NH₄)₂SO₄ als Kohlenstoff- und Stickstoffquellen wurde für den Biotest von OHHL verwendet (Petit und Tempe, 1978). Geeignete Antibiotika wurden gemäß den folgenden Konzentrationen zugesetzt: Ampicillin, 100 μg/ml; Tetracyclin, 20 μg/ml und Kanamycin, 50 μg/ml.
Biotest der Als Aktivität
Die qualitativen und quantitativen Biotest-Verfahren für die Bestimmung der Als Aktivität wurden zuvor beschrieben (Zhang, 1993). Für die Bestimmung der Als Produktionsfähigkeit von Wildtyp-Erwinia-Stämmen und von genetisch modifizierten Erwinia-Stämmen wurde das gleiche Biotestverfahren verwendet mit der Ausnahme, dass kein OHHL der bakteriellen Kultur zugesetzt wurde.
Klonierung und Sequenzierung des AiiA Gens
Genomische DNA von 240B1 wurde teilweise mit EcoRI geschnitten. Die DNA-Fragmente wurden ligiert an der dephosphorylierten EcoRI Stelle des Cosmidvektors pLAFR3 (Staskawicz, et al., 1987). Die ligierte DNA wurde verpackt mit Gigapack III XL Packaging Extract (Stratagene) und in E. coli DH5α transfiziert. Die Cosmidklone mit der OHHL Inaktivierungsaktivität wurden unter Verwendung des oben beschriebenen Biotestverfahrens identifiziert. Die Subklonierung in dem Sequenzierungsvektor pGEM-7Zf(+) wurde mit Routinetechniken durchgeführt (Sambrock, et al., 1989). Die Deletionsanalyse wurde durchgeführt unter Verwendung der Dnasel-Methode, wie dies beschrieben ist von Lin, et al. (1985). Die Sequenzierung wurde an beiden Strängen vorgenommen unter Verwendung von ABI PRISM^TMdRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Applied Biosystems). Die Nukleinsäure-Sequenzdaten und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden analysiert mit einem DNASTAR^TM Sequenzanalysesoftwarepaket (DNASTAR Inc.) und die Datenbankrecherchen wurden durchgeführt unter Verwendung des Suchalgorithmus BLASTA (Altschul, et al., 1990).
Genetische Modifikation des Erwinia Stammes SCG1
Das E7-R3 Plasmid, welches das aiiA Gen in dem Cosmidvektor pLARFR3 trägt, wurde in dem Erwinia-Stamm SCG1 durch Drei-Eltern-Paarung mit dem Helferstamm RK2013 transferiert (Ditta, et al., 1980). Die Transkonjuganten wurden auf den Platten, die Minimalmedium mit Tetracyclin enthielten, selektiert und mittels PCR mit Primer, die spezifisch für das aiiA Gen waren, bestätigt.
Virulenztests
Die Virulenz von Wildtyp Erw. carolovora Stamm SCG1 und des aiiA Gentransformanten SCG1 (E7-R3) wurden durch Inokulation geprüft. Vier μl einer frühen stationären bakteriellen Suspension (enthaltend ca. 2 × 10⁹ Zellen/ml) oder verdünnte Bakterien wurden auf die Schnittflächen oder die Verwundungsstellen von pflanzlichen Geweben gegeben. Die inokulierten pflanzlichen Gewebe wurden in einer Petrischale bei 28°C über Nacht inkubiert. Die Stärke der Weichfäule wurde 48 Stunden nach Inkubation bestimmt.
Ergebnisse
Screening von Bakterien, die Als inaktivieren
Bakterielle Isolate aus pflanzlichen und Bodenproben wurden hinsichtlich der enzymatischen Aktivierung von Als überprüft. Ein bakterielles Isolat 240B1, das eine starke Fähigkeit zur Eliminierung der Als Aktivität zeigte, wurde für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. Der Gesamtproteinextrakt aus dem Isolat 240B1 eliminierte die Als Aktivität während einer einstündigen Inkubation (1) vollständig und die Kapazität des Proteinextraktes zur Inaktivierung von Als wurde durch eine Behandlung mit der Proteinase K für 1 Stunde oder durch Kochen für 5 Minuten zerstört. Diese Beobachtungen zeigen die enzymatische Inaktivierung von Als durch das bakterielle Isolat 240B1. Das Isolat wurde taxonomisch charakterisiert als Bacillus sp. aufgrund der folgenden Eigenschaften: Gram-positiv, stabförmig, Katalase positiv, fakultativ anaerob, 16 rRNA Sequenz mit Homologie zu der von anderen Bacillus-Bakterien (Daten nicht gezeigt).
Die Molekularmasse des Enzyms für die Als Inaktivierung scheint größer als 30 kDa zu sein. Seine Aktivität ging verloren nach Passage des Proteinextraktes durch Centricon 30 (Amicon), wobei die Aktivität in der resuspendierten Fraktion, die Centricon 30 (2) nicht passierte, wieder gewonnen wurde.
Klonierung und Lokalisierung der Als Inaktivierungsregion
Um das Gen zu identifizieren, das für die Als Inaktivierung codierte, wurde eine Cosmidbibliothek mit der genomischen DNA von Listera sp. Stamm 240B1 hergestellt. Zwölfhundert Klone wurden hinsichtlich der Als Inaktivierungsaktivität getestet. Drei Klone mit Als Inaktivierungsfunktion wurden identifiziert. Die Restriktionsanalyse zeigte, dass die drei Klone ein gemeinsames Band von 4,3 kb aufwiesen, das durch EcoRI Verdau erzeugt wurde. Der Biotest mit dem Subklon E7-7, der dieses 4,3 kb EcoRI Fragment enthielt, bestätigte, dass dieses Fragment für die Als Inaktivierungsfunktion (3) codierte. Um die Minimalgröße und den Ort des Als Inaktivierungsgens (aiiA) zu identifizieren, wurden eine Reihe von Deletionsklonen durch Deletion von beiden Enden an diesem 4,3 kb Fragment mit dem DNasel Verfahren (Lin, et al., 1985) erzeugt. Die Resultate zeigten an, dass das aiiA Gen in einem 1,2 kb Fragment im Klon F41 (3) enthalten war.
Das AiiA Gen codiert für ein neues Protein
Das 1,2 kb DNA Insert in dem Klon F41 wurde von beiden Strängen aus vollständig sequenziert. Die Nukleotidsequenz von aiiA und die angenommene Aminosäuresequenz sind in der 4 gezeigt. Die komplette Sequenz des DNA Inserts enthält 1.222 Basenpaare und es gibt dort vier potentielle offene Leseraster (ORF), die an den Nukleotidpositionen 1, 42, 156 bzw. 228 (4) beginnen. Die Deletionsanalyse zeigte, dass nur der längste ORF für die Als Inaktivierungsfunktion codiert, da der Klon R34, in dem die 48 bp Promotorregion und die Nukleotide von 1 bis 13 in dem längsten ORF deletiert waren, die AI Inaktivierungsfunktion vollständig verlor, obwohl das verbliebene DNA Insert unter der Kontrolle eines funktionalen Ptac Promotor angeordnet war (3). Dies wurde bestätigt durch Fusion des längsten ORF mit dem Glutathion S-Transferasegen in dem gleichen ORF und durch Testung der AI Inaktivierungsaktivität des gereinigten Fusionsproteins (Daten nicht gezeigt). Dieser ORF enthielt 750 bp Nukleotide und codierte für ein Protein mit 250 Aminosäuren mit einer angenommenen Molekularmasse von 28.036 Daltons und mit einem isoelektrischem Punkt von 4,7 aufgrund von 19 stark basischen und 39 stark sauren Aminosäureresten. Dem wahrscheinlichen Initiationscodon ist mit einem Abstand von 7 Basenpaaren eine potentielle Ribosomenbindungssequenz (AAGGTGG) vorangestellt, die komplementär zu dem 3' Ende von E. coli 16S rRNA ist. Die beste Sequenzübereinstimmung (TATTGT) zu dem Konsensus –10 Promotorelement (TATAAT) liegt bei 35 Basenpaaren stromaufwärts des Initiationscodons. Eine TCTT Box nach einer T-reichen Region, die der potentiellen Faktor-unabhängigen Terminationsstelle ähnelt, wurde stromabwärts von dem Terminationscodon gefunden (Brendel, 1986). Der Gesamt GC-Gehalt des aiiA Gens beträgt 37% und der GC-Gehalt in der dritten Position des Codons ist 27,2%.
Datenbankenuntersuchungen zeigten, dass das aiiA Gen keine signifikante Ähnlichkeit zu bekannten Sequenzen in den wichtigen Datenbanken (GenBank, European Molecular Biology Laboratory, Protein Information Resource und Swiss-Prot) gemäß FASTA und BLAST Analyse auf Nukleotid- oder Peptidsequenzniveau zeigt, was vermuten lässt, dass AiiA ein neues Protein ist. Die Konsensusprotein-Motivsuche unter Verwendung von Genetics Computer Group (Madison, WI) MOTIF Programm zeigte, dass eine kurze Peptidsequenz, „ILVDTGMPESAV" an der Position 47 bis 58 in AiiA, ähnlich aber nicht identisch zu dem Signaturmuster der aktiven Aspartylproteasestelle ist (Rawlings und Barrett, 1995) (5).
Expression des aiiA Gens in Erwinia carotovora reduziert die Als Freisetzung und vermindert die Virulenz
Der Cosmidklon E7-R3 wurde in Erwinia carotovora Stamm SCG1 durch Drei-Eltern-Paarung transferiert. Der pLARF3 Vektor wurde sicher in Erwinia carotovora ohne Selektionsdruck erhalten. Der Biotest zeigte, dass Als, das durch Erwinia carotovora (E7-R3) freigesetzt wurde, signifikant reduziert war (6, Spur 6), während die alleinige Gegenwart des Cosmidvektors pLAFR3 in Erwinia carotovora die Als Produktion nicht berührte (6, Spur 7). Die Daten lassen vermuten, dass das meiste Als, welches durch Erwinia carotovora Stamm SCG1 hergestellt wurde, durch das aiiA Genprodukt inaktiviert wurde.
Erwinia carotovora SCG1 (E7-R3), welches AiiA Protein exprimierte, ergab keine oder führte zu nur geringen Weichfäule-Krankheitssymptomen in der Kartoffel, Aubergine, Chinakohl, Karotte und Sellerie, während der Elternstamm ernsthafte Symptome hervorrief (7A, B, C, D, E). Um experimentelle Fehler aufgrund von genetischen Variationen zu verhindern, wurden vier Kolonien des Erwinia carotovora Stammes SCG1 und seine aiiA Gentransformanten zufällig ausgewählt, um die Als Produktion und die Virulenz auf der Kartoffel zu testen. In beiden Experimenten wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. Der Erwinia carotovora Stamm SCG1 (pLAFR3), der nur den Cosmidvektor enthielt, zeigte das gleiche Maß an Krankheitsstärke wie sein Elternstamm Erwinia carotovora Stamm SCG1 (7F).
Diskussion
Das bakterielle Isolat 240B1, das als Bacillus sp. identifiziert wurde, produziert ein Enzym, welches effektiv die drei getesteten Als inaktivieren kann, das heißt, N-β-Oxo-hexanoyl-L-homoserinlacton, N-β-Oxo-octanoyl-L-homoserinlacton und N-β-Oxo-decanoyl-L-homoserinlacton. Das Gen (aiiA), das für das AI Inaktivierungsenzym codiert, wurde kloniert und vollständig sequenziert. Die Expression des aiiA Gens in transformierten E. coli und in dem pathogenen Bakterium Erwinia carolovora verleiht die Fähigkeit zur AI Inaktivierung und reduziert signifikant die Freisetzung von Als aus Erwinia carolovora. Nach unserer Kenntnis ist es das erste identifizierte Protein, welches zur enzymatischen Inaktivierung von N-Acylhomoserinlactonen in der Lage ist, welche Autoinduktoren für eine globale Genregulation bei einer Reihe von bakteriellen Arten darstellen.
AiiA ist ein neues Protein. Es gibt keine signifikante Homologie zu bekannten Proteinen in den wichtigsten Datenbanken. Es zeigt Ähnlichkeiten mit dem Konsensusmuster der aktiven Aspartylproteasestelle (Rawlings und Barret, 1995). Aspartylproteasen, auch bekannt als saure Proteasen, sind in Wirbeltieren, Pilzen, Pflanzen, Retroviren und einigen pflanzlichen Viren weit verbreitet. Die Aspartylproteasen von den meisten Retroviren und einigen pflanzlichen Viren sind Homodimere. Die Molekularmasse des AiiA Proteins beträgt etwa 28 kDa, wobei aber ein Molekularsieb mit einer Trenngröße von 30 kDa nicht passiert wird, was die Möglichkeit anzeigt, dass das AiiA Protein als ein Homodimer oder Homomultimer unter den natürlichen Bedingungen existiert. Es gibt jedoch auch die Möglichkeit, dass das AiiA Monomer eine irreguläre, dreidimensionale Struktur hat, die dazu führt, dass das Molekularsieb nicht passiert wird. Aspartylproteasen sind Endopeptidasen und hydrolysieren die Amidverbindungen von Proteinen. Eine kristallographische Studie zeigte, dass die Enzyme der Aspartylprotease-Familie zweilappige Moleküle mit einer aktiven Spalte, die zwischen den zwei Lappen angeordnet ist, sind, wobei jeder Lappen ein Asparginsäurerest zu dem Paar des Asparginsäurerestes beiträgt, das für die katalytische Aktivität verantwortlich ist (Sielecki et al., 1991).
Erwinia carotovora ist ein pflanzlicher Pathogen, der Exoenzyme produziert und abgibt, die als Virulenzdeterminanten für die Weichfäulekrankheit bei verschiedenen Pflanzen wirken, einschließlich Kartoffel, Kohl, Tomate, Chili, Karotte, Sellerie, Zwiebel und Salat (Kotoujansky, 1987).
Mutanten, die hinsichtlich der Herstellung von N-3-(Oxohexanoyl)-L-homoserinlacton defekt waren, waren auch defekt hinsichtlich der Synthese der Pectinase-, Cellulase- und Protease-Exoenzymen. Diese Mutanten konnten keine Weichfäulekrankheit in Kartoffelknollen induzieren (Jones, et al., 1993). Es wurde gefunden, dass das expl Gen, das homolog zu dem IuxI Gen von Vibrio fischeri ist, die Autoinduktorproduktion in Erwinia carotovora codiert. Die expl Mutante war avirulent, wenn sie auf einem Tabakblatt inokuliert wurde, wobei die Virulenz durch externe Autoinduktor-Zugabe wieder hergestellt wurde (Pirhonen, et al., 1993). Autoinduktoren sind ein mögliches Ziel für die genetische Manipulation der Krankheitsresistenz gegenüber pflanzlicher Weichfäule. Als ein Zwischentest und zur Bestätigung des Konzeptes wurde der Cosmidklon, der das aiiA Gen enthielt, in den Erwinia carotovora Stamm SCG1 eingebracht. Die Expression des AiiA Enzyms in Erwinia carotovora reduzierte signifikant die Freisetzung der Autoinduktoren und das genetisch modifizierte Erwinia carotovora, welches AiiA exprimierte, induzierte keine oder induzierte nur geringe Weichfäule-Krankheitssymptome auf allen getesteten Pflanzen, einschließlich Kartoffel, Aubergine, Chinakohl, Karotte und Sellerie. Unsere Ergebnisse unterstützen ferner die bedeutende Rolle von Autoinduktoren bei der Regulation der Expression von Virulenzgenen in Erwinia carotovora sowie das Potential des aiiA Gens zur Verleihung von Resistenz gegenüber der Weichfäulekrankheit und anderen Krankheiten, bei denen die Autoinduktoren eine Rolle bei der Regulation der pathogenen Genexpression spielen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Strategie für die genetische Manipulation von Krankheiten bereit. Insbesondere zielt diese Strategie auf die N-Acylhomoserinlacton-Autoinduktoren, welche die Expression von pathogenen Genen von vielen bakteriellen Pathogenen mit einer Schwellenkonzentration induzieren. Durch die Verwendung des obigen Ansatzes zur Prüfung dieses Konzepts belegt die vorliegende Erfindung, dass die Reduktion oder Eliminierung von Autoinduktoren, die von pathogenen Bakterien hergestellt werden, durch ein Autoinduktor-Inaktivierungsenzym die Pathogenität von andererseits virulenten bakteriellen Pathogenen signifikant abschwächt. Da die Expression der pathogenen Gene in den pathogenen Bakterien eine Schwellenkonzentration erfordert, ist diese AI Inaktivierungsstrategie auf alle pflanzlichen, tierischen oder Säugetierkrankheiten anwendbar, wo die Expression der pathogenen Gene des bakteriellen Pathogens durch N-Acylhomoserinlacton-Autoinduktoren induzierbar ist.
Das aiiA Gen könnte auch ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der Rolle von Als in solchen Bakterien spielen, bei denen die biologischen Funktionen, welche durch Als reguliert sind, noch nicht aufgedeckt sind. In den letzten Jahren wurde für viele bakterielle Arten gezeigt, dass sie Als herstellen (Bassler, et al., 1997; Dumenyo, et al., 1998; Cha, et al., 1998; Surette, et al., 1999). Einige von diesen Arten sind wichtige pflanzliche Pathogene, wie Pseudomonas- und Xanthomonas- Arten. Der Ansatz zur Genausschaltung auf Basis von Sequenzhomologie könnte schwierig sein. Das allgemeine Niveau der Sequenzähnlichkeit von Als Synthase und den verwandten regulatorischen Proteinen von verschiedenen Arten ist ziemlich niedrig, oft nicht größer als 28–35% Identität zwischen den Proteinen des LuxI-Typs und 18–25% Identität für die Proteine des LuxR-Typs (Fuqua et al., 1996). Es ist jedoch durchführbar und einfach, dass aiiA Gen in diese Bakterien einzuführen, um die biologischen Funktionen, die von Als reguliert werden, zu sondieren.
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Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches für ein bakterielles Autoinducer(Signalmolekül)-Inaktivierungs-Protein codiert, wobei das Nukleinsäuremolekül ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus: a) einer Nukleinsäure, die die Sequenz des codierenden Bereichs von SEQ ID NO: 1 aufweist; b) einer Nukleinsäure, die für die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 codiert; und c) einer Nukleinsäure, die mit den obigen a) oder b) hybridisiert, wobei ein positives Hybridisierungssignal nach Waschen mit 1 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C während einer Stunde beobachtet wird.
Molekül nach Anspruch 1, welches darüber hinaus eine für ein Signalpeptid codierende Region beliebiger Sequenz umfasst.
Expressionsvektor, welcher das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 umfasst, wobei sich der Expressionsvektor in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle vermehrt.
Zelle eines Prokaryonten oder Eukaryonten, die mit dem Expressionsvektor aus Anspruch 3 transformiert oder transfiziert wurde.
Isoliertes Protein, welches eine bakterielle Autoinducer-Inaktivierungs-Aktivität aufweist, wobei das Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 umfasst.
Nukleinsäuresequenz, welche für ein bakterielles Autoinducer-Inaktivierungs-Protein zur Verwendung in der Therapie codiert, wobei die Nukleinsäuresequenz ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus: a) einer Nukleinsäure, die die Sequenz des codierenden Bereichs von SEQ ID NO: 1 aufweist; b) einer Nukleinsäure, die für die Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 2 kodiert.
Verfahren zur Erhöhung der Krankheitsresistenz in einer Pflanze, wobei das Verfahren Einführung einer Nukleinsäuresequenz in eine Zelle einer solchen Pflanze umfasst, die für ein bakterielles Autoinducer-Inaktivierungs-Protein codiert, in einer Weise, welcher der Zelle die Exprimierung dieser Nukleinsäuresequenz ermöglicht, wobei die Nukleinsäuresequenz ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus: a) einer Nukleinsäure, welche die Sequenz des codierenden Bereichs von SEQ ID NO: 1 aufweist; b) einer Nukleinsäure, die für die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 codiert.
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 6 oder Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Nukleinsäuresequenz darüber hinaus eine für ein Signalpeptid codierende Region beliebiger Sequenz umfasst.
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 6 oder Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Nukleinsäuresequenz darüber hinaus eine für eine Membran-Bindungsdomäne codierende Region beliebigen Ursprungs umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Pflanze gegen die bakterielle Weichwurzelerkrankung empfindlich ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Pflanze ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus Kartoffel, Aubergine, Chinakohl, Karotten und Sellerie.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Pflanze für eine bakterielle Erkrankung empfindlich ist, bei der die Expression eines Virulenzgens durch einen N-Acyl-Homoserin-Lacton-Autoinducer reguliert wird.
Bakterielles Autoinducer-Inaktivierungs-Protein, umfassend SEQ ID NO: 2 zur Verwendung in der Therapie.
Verfahren zur Vorbeugung oder Verminderung von bakteriellen Schäden an einer Pflanze, wobei das Verfahren Verabreichung einer wirksamen Menge eines bakteriellen Autoinducer-Inaktivierungs-Proteins an eine Pflanze umfasst, die einen Bedarf an einer solchen Vorbeugung oder Verminderung aufweist, wobei das Protein SEQ ID NO: 2 umfasst.
Zusammensetzung, welche umfasst: a) ein bakterielles Autoinducer-Inaktivierungs-Protein; und b) einen geeigneten Träger, zur Verwendung in der Therapie, wobei das Protein SEQ ID NO: 2 umfasst.
Zusammensetzung zur Vorbeugung oder Verminderung von bakteriellen Schäden an einer Pflanze, welche umfasst: a) eine wirksame Menge eines bakteriellen Autoinducer-Inaktivierungs-Proteins; und b) einen geeigneten Träger, wobei das Protein SEQ ID NO: 2 umfasst.
Verfahren zum Screenen von bakteriellen Isolaten hinsichtlich einer Autoinducer-Inaktivierungs-Aktivität, welches umfasst: a) Isolieren einer Einzelkolonie-Bakterienkultur aus Boden- oder Pflanzenproben; b) Screenen der Kultur hinsichtlich Autoinducer-Inaktivierungs-Aktivität wie durch das Protein der SEQ ID NO: 2 exprimiert; c) Herstellung eines rohen Proteinextrakts aus der Kultur; und d) Bestätigung der enzymatischen Inaktivierung der Autoinducer-Aktivität durch den rohen Proteinextrakt.
Verfahren zur Isolierung der Nukleinsäure nach Anspruch 1, welches die Schritte umfasst: a) Herstellung einer Genbank aus einem Donororganismus, der eine Nukleinsäuresequenz enthält, welche für ein Protein mit einer Autoinducer-Inaktivierungs-Aktivität kodiert, in einem geeigneten Wirtsorganismus; b) Screenen der Klone der Genbank mit einer Sonde, die eine wie in Anspruch 1 definierte Nukleinsäure umfasst; und c) Isolierung der Klone, welche eine Nukleinsäure enthalten, die für ein Protein mit Autoinducer-Inaktivierungs-Aktivität kodiert.
Verfahren wie in Anspruch 18 beansprucht, wobei E. coli als Wirtsorganismus verwendet wird.
Verfahren wie in Anspruch 18 beansprucht, wobei die Schritte der Herstellung einer Genbank, Screenen der Klone und Isolieren der Klone in einem E. coli-Stamm durchgeführt werden, der den Autoinducer nicht inaktiviert.
Verfahren, welches umfasst: a) Einführung der Nukleinsäuresequenz aus Anspruch 1 in eine bakterielle Zelle; und b) Screenen der aus Schritt a) erhaltenen bakteriellen Zelle hinsichtlich einer veränderten biologischen Funktion.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die veränderte biologische Funktion eine Funktion ist, die als Ergebnis von Schritt a) verloren ging.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die veränderte biologische Funktion eine Funktion ist, die als Ergebnis von Schritt a) unterdrückt wird.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die veränderte biologische Funktion eine Funktion ist, die als Ergebnis von Schritt a) verstärkt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Krankheitsresistenz eine Resistenz gegen die pflanzenpathogenen Bakterien Erwinia carotorova ist.
Pflanze, die erhöhte Krankheitsresistenz aufweist, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 7.
Pflanze nach Anspruch 26, welche das AiiA-Protein exprimiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist.
Pflanzenzelle, welche erhöhte Krankheitsresistenz aufweist, hergestellt nach dem Verfahren von Anspruch 7.
Pflanzenzelle nach Anspruch 28, welche das AiiA-Protein exprimiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist..