KR100741949B1

KR100741949B1 - 세균의 병원성 유전자의 광범위한 조절물질； 질병저항성을 도모하기 위한 표적으로서, 세균의 자가유도물질불활성화 단백질

Info

Publication number: KR100741949B1
Application number: KR1020017016958A
Authority: KR
Inventors: 리안-후이장; 이후동; 진링수
Original assignee: 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
Priority date: 1999-07-02
Filing date: 1999-11-17
Publication date: 2007-07-23
Also published as: KR20020025097A

Abstract

세균 자가유도물질 불활성화 단백질을 암호화하는 단리된 핵산분자, 암호화된 단백질 및 그것에 대한 항생물질로서의 사용이 개시되어 있다.

Description

세균의 병원성 유전자의 광범위한 조절물질； 질병 저항성을 도모하기 위한 표적으로서, 세균의 자가유도물질 불활성화 단백질{Global regulators of bacterial pathogenic genes； bacterial autoinducer inactivation protein, as targets for engineering disease resistance}

관련 출원에 대한 교차참조에 관한 해당 사항이 없다.

연구 또는 개발을 연방정부가 후원한 것에 관한 언급에 대한 해당 사항이 없다.

발명의 배경

1. 발명의 분야

본 발명은 세균의 병원성 유전자의 광범위한(global) 조절물질 및 질병의 저항성을 부여하는 그들의 용도에 관한 것이다.

2. 관련 기술의 설명

도서목록은 본 발명의 상세한 설명의 끝부분에 있다. 그 나열된 참고문헌은 참조로 모두 여기에 통합되어 있다.

작은 신호 분자를 통한 세포 간의 소통은 동물 및 식물과 같은 다세포 생물에게 매우 중요할 뿐만 아니라 그것은 또한 세균과 같은 단세포 생물의 집단 구성 원간의 기능적 조정에 있어도 중요한 역할을 한다. 지난 몇 년동안 신속한 진전이 이루어져 자가유도물질(AIs)로서 알려진 N-아실-호모세린 락톤이 그람음성균에 있어 광범위하게 보존된 신호 분자라는 것이 확립되었다. AIs는 해양의 비브리오속 세균의 생물발광 조절에서 처음 발견되었다(Eberhard, 등, 1981; Cao 및 Meighen, 1989). 최근 몇 년 사이에, AIs는 광범위한 그람음성균에서 동정되었다. AIs는 Agrobacterium tumefacienss에서의 Ti 플라스미드 접합전달(Ahang 등, 1993), Erwinia carotovora, Pseudomonas aeruginosa, Erwinia stewartii, Xenorhabdus nematophilus, Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas solanacerum 및 Xanthomonas campestris에서의 독성 유전자의 유도(Jones 등, 1993; Passador 등, 1993; Pirhonen 등, 1993; Pearson 등, 1994, Beck von Bodman 및 Farrand, 1995; Barber 등, 1997; Clough 등, 1997, Costa 및 Loper, 1997; Dunphy 등, 1997, Nasser 등, 1998), Peudomonas aureofaciens 및 Erwinia carotovora에서의 항생물질 생산의 조절(Pierson 등,1994; Costa 및 Loper, 1997), Serratia liquifaciens에서의 유주운동의 조절(Eberl 등, 1996), 및 Pseudomonas fluorescens 및 P. aeruginosa에서의 균막의 형성(Allison 등, 1998; Davies 등, 1998)을 포함한 어느 정도 범위의 생물학적 기능의 조절에 연루된다는 것이 밝혀졌다. 더 많은 종의 세균들이 AIs를 생산한다고 알려져 있지만 그와 관련된 생물학적 기능은 아직 확립되지 않았다(Bassler 등, 1997; Dumenyo 등, 1998; Cha 등, 1998).

서로 다른 세균 종들은 서로 다른 AIs를 생산할 수 있다. 모든 AI 유도체가 동일한 호모세린락톤 부분을 갖고 있지만 아실기의 길이 및 구조에 있어 차이가 있 다. AI-매개 유전자 조절 시스템의 주요 성분은 LuxI 및 LuxR 형 단백질이다. LuxI 형 단백질이 기질로서 아실-ACPs 및 AdoMet(S-아데노실메티오닌)을 이용하는 자가유도물질 합성효소로서 작용한다는 것이 현재 확립되어 있다(More 등, 1996; Schaefer 등, 1996). LuxR 형 단백질은 AIs에 대한 수용체이며 lux 프로모터 바로 상류의 DNA에 결합하는 AI-의존성 전사 조절인자라고 제안되었다(Meighen, 1994; Sitnikov 등, 1995). 발광 오페론의 전사 개시 부위의 상류 44 뉴클레오티드의 중앙에 위치한 20-뉴클레오티드 역반복배열이 동정되었다. lux 박스라고 불리는 이 시퀀스는 LuxR에 의한 전사 활성화에 필요하며 아마도 LuxR 결합부위일 것이다(Fuqua 등, 1994). 유사한 180bp tra 박스가 적어도 3개의 TraR-조절 프로모터의 상류에서 발견되었고 이러한 요소들의 붕괴는 TraR에 의한 전사 활성화를 제거한다(Frqua 및 Winans, 1996a).

LuxR 형 단백질은 두 개의 모듈로 구성되는 것 같다(Choi 및 Greenberg, 1991; Hanzelka 및 Greenberg, 1995). 그것들의 카르복실 말단 부분은 추정의 프로브형 헬릭스-턴-헬릭스 모티프(helix-turn-helix motif)인 19-아미노산의 보존된 짧은 시퀀스를 함유하며 표적 프로모터와의 결합에 연루된다고 예상하고 있다. 활성화의 일반적 기전은 LuxR 형 단백질의 N-말단 도메인이 부정적으로 작용하여 그것의 C-말단 도메인과 표적 DNA 결합부위 간의 작용을 억제하는 것에 의한다고 제안되고 있다. 이러한 억제는 자가유도물질 리간드의 작용에 의해 완화될 수 있다. LuxR의 N-말단 도메인의 제거가 luxR의 본질적으로 활성인 대립형질유전자에 이르게 되고 반면에 상기 DNA 결합 도메인이라고 예상되는 부분을 제거하는 더 큰 제거 는 전사 활성화를 제거한다는 것은 강력한 증거가 된다(Choi 및 Greenberg, 1991). 그러나, 다른 멤버들은 다른 기전을 사용할 수 있다. 최근 유전학 연구에서는 EsaR 및 ExpR은 그들의 표적 유전자의 활성화제라기 보다는 억제제인 것 같다고 하였다. EsaR 및 ExpR 에 의해 억제되는 유전자의 발현은 자가유도물질에 의해 증가된다(Beckvon Bodman 및 Farrand 1995; Throup, 등. 1995) 이러한 단백질의 프로모터 부분의 표적 부위와의 결합은 억제를 일으키고, 그러므로 자가조절물질 리간드는 작용하여 결합 친화도를 감소시키는 것 같다.

자가조절물질 결합부위는 LuxR 단백질의 아미노 말단 부분에 있다는 증거가 밝혀졌다(Hanzelka 및 Greenberg, 1995). 변이된 아미노 말단부분을 갖는 LuxR 대립형질유전자는 야생형이 갖는 더 높은 수준의 이러한 신호를 요구하며, 리간드 상호작용에 요구되는 부위를 나타낸다(Slock 등, 1990; Shadel 등, 1990). 이 부위(aa 79-127) 및 DNA-결합 도메인내의 부위(aa 180-230)에서는 이러한 폴리펩티드의 다른 부분보다 LuxR 및 그것의 동족체(homologs)(ca 50% 동일)사이의 더 높은 정도의 보존을 보여주고 있다. 그러나, 제안된 LuxR 및 자가조절물질 간의 단백질-리간드 상호작용은 아직 증명되지 않았다. 야생형 및 변이 LuxR 대립형질유전자를 함유하는 메로디플로이드(merodiploid) E. coli 균주의 분석으로 인해 LuxR이 동형다합체(homomultimer)로서 작용하고 다합체화를 위해 요구되는 부위가 아미노산 잔기 116 및 161 내에 있다는 것이 제안되었다(Choi 및 Greenberg, 1992).

발명의 간략한 요약

한 측면에서, 본 발명은 세균의 자가유도물질 불활성화 단백질을 암호화하는 단리된 핵산분자에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 세균의 자가유도물질 불활성화 단백질을 암호화하는 핵산분자를 포함하는 발현벡터에 관한 것이며, 여기서 발현벡터는 원핵세포 또는 진핵세포에서 증식한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 발현벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션된 원핵세포 및 진핵세포에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 시퀀스를 포함하는 단백질인, 세균의 자가유도 불활성화 활성을 갖는 단리된 단백질에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 세균의 자가유도물질 불활성화 단백질을 암호화하는 핵산 시퀀스를 식물 또는 동물의 세포에 상기 세포가 상기 핵산 시퀀스를 발현하도록 하는 방법으로 도입하는 것을 포함하는, 식물 또는 동물에서 질병의 저항성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 세균의 위해를 억제하거나 감소시킬 필요가 있는 식물 또는 동물에게 유효량의 세균 자가유도물질 불활성화 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 식물 또는 동물에게 세균의 위해를 억제하거나 감소시키는 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 a) 세균의 자가유도물질 불활성화 단백질 유효량; 및 b) 적절한 담체를 포함하는 식물 또는 동물에게 세균의 위해를 감소시키기 위한 조성물에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 SEQ ID NO:2 단백질이 세균의 자가유도물질(AIs)의 활성을 줄이거나 제거하는 효과를 갖는다는 발견에 기초한다. 결과적으로, 상기 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 모든 핵산이 그러한 세균의 영향을 감소시키거나 제거하고자 하는 다양한 상황에 사용될 수 있다.

하나의 바람직한 측면에서, 본 발명은 다음으로 구성되는 그룹에서 선택된 핵산분자를 제공한다:

a) SEQ ID NO:1의 시퀀스를 갖는 핵산;

b) SEQ ID NO;2의 아미노산 시퀀스를 암호화하는 핵산;

c) 상기 a) 또는 b)와 혼성화 하는 핵산, 여기서 양의 혼성화 신호는 1 ×SSC 및 0.1% SDS로 55℃에서 1시간 세척한 후에 관찰된다. 상기 핵산은 선택적으로 어떤 시퀀스의 신호 펩티드 암호화 부위를 포함한다.

상기 핵산 시퀀스를 이용하여 식물 또는 동물에게 세균의 저항성을 부여할 수도 있다. 세균 자가유도물질 불활성화 단백질을 암호화하는 핵산을 세포에 도입하여 불활성화 단백질을 식물 또는 동물에 의해 발현되게 할 수 있다.

상기 핵산 시퀀스를 사용하여 병원성 유전자의 발현이 Pseudomonas aeruginosa, Erwinia stewartii, Xenorhabdus nematophilus, Erwinia chrysanthemi, Pseudomonas solanacerum, 및 Xanthomonas campestris에 의해 유발되는 병과 같이 병원성 유전자의 발현이 자가유도물질에 의해 조절되는 질병에 대한 저항성을 부여할 수 있다(Passador 등, 1993; Pirhonen 등, 1993; Pearson 등, 1994; Beck von Bodman 및 Farrand, 1995; Barber 등, 1997; Clough 등, 1997; Costa 및 Loper, 1997; Dunphy 등, 1997; Nasser 등, 1998). 바람직하게는, 농업 분야에서 상기 시퀀스를 사용하여 감자, 가지, 중국 양배추, 당근 및 셀러리와 같은 감염되기 쉬운 식물에게 연성 부패증에 대한 저항성을 부여할 수도 있다.

상기 시퀀스를 식물 또는 동물 세포에 잘 알려진 방법으로 도입할 수 있다. 진핵세포를 외인성 핵산 시퀀스로 형질전환 또는 트랜스펙션 하기 위한 방법은 Agrobacterium tumefaciens에 의한 트랜스펙션, 분출성 충격요법, 일렉트로포레이션(electroporation)을 포함한다. 이러한 방법은 분자생물학 및 생명공학에 통상의 지식을 가진 사람에게 매우 익숙하며 여기에 자세하게 설명할 필요는 없다. 병원성 세균 세포를 식물 조직의 세포 내 부위에 한정시킬 때, AiiA 단백질을 세포내 공간으로 표적화하는 것이 바람직하다. 그것은 분비신호 펩티드를 AiiA 단백질로 융합시킴으로써 이루어 질 수 있다(Sato 등, 1995; Firek 등, 1993; Conrad 및 Fiedler, 1998; Borisjuk 등, 1999). 택일적으로, 식물막 부착 모티프를 식물 세포막의 외부 표면에 AiiA 효소를 부착시키기 위한 AiiA의 펩티드 시퀀스로 통합할 수 있다.

본 발명은 질병에 대한 저항성을 조작하기 위한 새로운 전략을 제공한다. 특히, 이러한 전략은 역치의 농도로 많은 세균성 병원균의 병원성 유전자의 발현을 유도하는 N-아실 호모세린 락톤 자가유도물질을 표적으로 한다. 이러한 전략은 모든 식물, 동물 또는 포유류의 질병에 적용될 수 있으며, 여기서 세균성 병원균의 병원성 유전자의 발현이 N-아실 호모세린 락톤 자가유도물질에 의해 유도될 수 있 다.

본 발명은 또한 세균의 위해를 직접적으로 치료하거나 억제하는 세균의 자가유도물질 불활성화 단백질의 사용에 관한 것이다. 예를 들어, 상기 단백질을 그러한 치료 또는 예방을 필요로 하는 식물에 직접적으로 적용할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 단백질을 유효량의 단백질 및 적절한 담체를 포함하는 조성물의 형태로 적용한다. 상기 조성물은 액제, 산제, 유제, 현탁제, 페이스트, 에어로졸 등을 포함하는 매우 다양한 형태를 갖을 수 있다.

상기 세균 자가유도물질 불활성화 단백질은 또한 인간을 포함한 동물의 세균 감염을 치료하는데 사용할 수 있다. 그러한 적용에서, 유효량의 상기 활성물질을 그러한 치료를 필요로 하는 동물에게 투여한다.

치료학적 처리를 위해, 상기 활성 성분을 유효량의 활성성분, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 완충용액, 보존제, 계면활성제 등을 포함하는 약제학적 조성물로 제제화 할 수 있다. 조성물은 또한 필요하거나 바람직하다면 하나이상의 다른 활성성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물을 당해 기술분야에 통상적인 지식을 갖고 있는 사람에게 자명한 수많은 방법으로 투여할 수 있다. 투여는 예를 들어,국소, 경구, 흡입, 또는 비경구로 행할 수 있다.

국소제제에는 연고, 로숀, 크림, 겔, 점적제, 좌제, 스프레이제, 액제 및 산제가 있다. 경구제제에는 예를 들어 산제, 과립제, 수성 또는 비수성 매질의 현탁제 또는 액제, 캡슐 또는 정제가 있다. 점증제, 방향제, 희석제, 유화제, 현탁화제 또는 결합제를 필요한 경우 사용할 수 있다.

비경구 제제에는 또한 완충화제, 희석제 및 다른 적절한 첨가제를 함유하는 멸균의 수용액이 있다.

투여 요법은 치료해야할 상태의 심각도 및 반응도와 같은 쉽게 결정될 수 있는 많은 인자에 의존할 것이다.

본 발명의 양상을 다음의 비제한적인 실시예를 통하여 설명할 것이다.

도 1은 Bacillus 속 균주 240BI로부터의 세포 추출물에 의한 AIs 불활성화의 시간의 추이를 나타낸 것이다. 100㎍의 총단백질을 함유하는 0.2M 인산완충용액(pH 7.0)에서의 세포 추출물을 OHHL을 함유하는 동일한 완충용액에 부가하여 최종농도가 20μM이 되도록 하였다. 상기 반응을 1,5ml Eppendorf 원심분리 튜브에서 최종 부피 200㎕로 수행하였고 28℃에서 배양하였다. 상기 인산완충용액에서 동일한 농도의 OHHL을 대조군으로 사용하였다. 표본을 10분 간격으로 60분까지 채취하여 3분동안 끓임으로써 상기 반응을 중지시켰다. 상기 표본을 벤치 탑 원심분리기(bench top centrifuge)에서 최고 속도로 5분간 원심분리 하고, 언급한 바와 같이 AIs 활성을 시험하였다(Zhang, 1993). 파란색의 콜로니는 lacz 리포터 유전자(reporter gene)를 활성화 하는 AI의 존재를 나타내고, 흰 콜로니는 AI의 부재를 나타낸다. 왼쪽부터 오른쪽으로의 열; 1, 단백질 추출물이 없는 OHHL 대조군; 2-7, 10, 20, 30, 40, 50, 60분간의 효소 작용 후의 표본.

도 2는 AIs 불활성화 효소의 분자량을 평가한 것을 나타낸다. 세포 추출물의 600㎕ 일정부분을 Centricon 30(Amicon)에 부가하고 5000×g의 속도로 30분 동안 4℃에서 원심분리 하였다. 통과 분획(550 마이크로리터) 및 비통과 분획(50마이크로리터)를 각각 탑재하고 0.2M 인산완충용액(pH 7.0)을 부가함으로써 최종부피가 최종 부피가 600㎕가 되도록 하였다. 생물학적 검정을 위해, 서로 다른 양의 표본을 OHHL을 함유하는 튜브에 부가하여 최종농도가 20μM이 되도록 하였다. 열 1에서 6까지 단백질 표본이 2, 4, 6, 8, 10 및 0㎕ 가해졌고 최종 반응 부피는 각 반응에 대해 20㎕였다. 플레이트 A: 통과 분획, 플레이트 B: 비통과 분획.

도 3은 Bacillus 속 균주 240B1 AI 불활성화 부분의 클로닝 및 결실 분석을 보여준다. 코스미드 클론 E7-R3는 중복 코스미드 클론의 제한 분석에 의해 동정된 4.3-kb EcoRK 단편을 함유한다. 결실 분석을 위해, 동일한 단편을 클론 E7-7 세대를 위한 클로닝 벡터 pGEM-72f(+)로 클론하였다. 결실 서브클론을 제한효소분해 및 클론 E7-7으로부터의 Dnase I 처리에 의해에 생산하였다. 코스미드 및 pGEM-7zf(+) 클론에서의 Ptac 촉진 유전자의 위치 및 방향을 화살표로 나타내었다. 상기 클론의 AI 불활성화 활성이 두 번째 칼럼에서 나타났다: +, AI 불활성화 활성을 갖는 경우; -, AI 불활성화 활성을 갖지 않는 경우. 제한효소: E, EcoRI; H, HindIII; Ev, EcoRV; St, StyI. aiiA ORF의 전사 위치 및 방향을 오픈 화살표로 나타냈다.

도 4a는 aiiA 유전자의 뉴클레오티드 시퀀스[SEQ ID NO:1]를 보여준다. 강력한 리보솜 결합 시퀀스 및 -10 촉진 유전자 부분에 각각 밑줄 긋고 이중으로 밑줄을 그었다. 암호화 부분은 염기 1에서 시작한다. 추정적인 인자-의존적 종결 부위를 두꺼운 밑줄로 표시하였다. 도 4b는 aiiA 유전자 산물의 예상되는 아미노산 시퀀스[SEQ ID NO:2]를 나타낸다. 아스파르틸 프로테아제 활성 부위 일치 모티프에 유사한 짧은 펩티드 시퀀스에 밑줄을 그었다.

도 5는 공통 아스파르틸 프로테아제 활성부위 모티프(Asp)에 대한 aiia 유전자 산물(AiiA)의 아미노산 시퀀스의 가장 좋은 매치(match)를 보여준다. 심벌: X, 모든 아미노산. 수직선은 완전한 매치를 보여준다.

도 6은 Bacillus 속 균주 240B1, E.coli 클론에서의 AIs 불활성화 활성 및 Erwinia carotovora에서의 AIs 생산 활성을 위한 생물학적 검정을 나타낸다. 열 1, OHHL 대조군; 열 2, Bacillus 속 균종 240BI; 열 3, E.coli DH5α; 열 4, E. coli DH5α(pE7-R3); 열 5, E. coli DH5α(pF41); 열 6, Erw. carotovora SCGl(pE7R3); 열 7, Erw. carotovora SCGl(pLAFR3); 열 8, Erw. carotovora SCGl. 생물학적 검정법에서, OHHL을 부가하여 줄 1에서 5까지의 표본의 최종농도가 20μM이 되도록 하였다. 열 6 내지 8까지의 표본에는 어떤 외인성 AIs도 부가하지 않았다.

도 7은 (A), 감자; (B) 가지; (C), 중국 양배추; (D), 당근; 및 (E), 셀러리에서의 병원성에 대한 Erw. carotovora에서의 aiiA 유전자 발현의 효과를 보여준다. 가장 위쪽: 식물 조직을 Erw. carotovora SCGl로 접종하였다. 바닥: 식물조직을 Erw. carotovora SCGl(pE7-R3)로 접종하였다. 상기 활발하게 자라는 세균을 1분 동안 3000×g에서 원심분리하고, YEB 액체배지로 재현탁하여 10⁰ 접종물로서 설계된 OD600=1.3(2×10⁹ cfu/ml)로 하였다.상기 10⁰ 접종물을 각각 5 내지 10배 희석하여 10^-1/2 및 10^-1 희석액을 제조하였다. 상기 식물조직에 4-㎕ 부피의 세균 접종물을 피 펫 팁으로 바로 잘라낸 표면 또는 구멍낸 상처부위에 부가함으로써 접종하였다. 왼쪽 플레이트에서 오른쪽 플레이트로의 접종 농도는: 10⁰; 10^-1/2; 및 10^-1이다. 상기 접종된 식물 조직을 플라스틱 플레이트에 위치시키고 28℃에서 배양하였다. 48시간 후에 사진을 찍었다.

실시예 1

세균의 단리물질 240B1을 N-β-옥소-헥사노일-L-호모세린 락톤(OHHL), N-β-옥소옥타노일-L-호모세린 락톤(OOHL), N-β-옥소데카노일-L-호모세린 락톤(ODHL)의 불활성화를 위한 기능에 근거하여 토양 현탁액으로부터 단리하였다(Zhang 등, 1993). 달리 언급하지 않았다면, OHHL을 통상적인 생물학적 검정법을 위해 사용하였다. Erwinia carotovora 균주 SCG1을 연성 부패증을 나타내는 중국 양배추로부터 분리하였다. SCG1 균주가 AIs를 생산하고 감자 및 중국 양배추에서의 연성 부패증을 유발한다는 것이 확립되어 있다. Escherichia coli 균주 DH5α를 DNA 클로닝 및 서브클로닝을 위한 숙주로서 사용하였다. Agrobacterium tumefaciens 균주 NT1(traR; tra::lacz749)를 AI 활성의 생물학적 검정법에서 지표로 사용하였다(Piper 등, 1993). E. coli 균주를 Luria-Bertani(LB) 배지에서 37℃로 배양하였고 다른 균주를 LB(Miller, 1972) 또는 YEB 배지(리터 당 카제인 가수분해물 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 10g, 수크로오스 5g, MgSO4˙7H₂O 0.5g, 아가 15g, pH 7.2를 함유한다)에서 28℃로 배양하였다. 탄소 및 질소의 원천으로서 만니톨 및 (NH₄)₂SO₄를 갖는 최소 염 배지(minimal salt medium)를 OHHL의 생물학적 검정을 위해 사용하였다(Petit 및 Tempe, 1978). 적절한 항생제를 부가하여 다음 농도를 나타내도록 하였다: 암피실린, 100㎍/ml; 테트라사이클린, 20㎍/ml 및 가나마이신, 50㎍/ml.

AIs 활성의 생물학적 검정

AIs 활성의 결정을 위한 정성 및 정량의 생물학적 검정법을 앞서 기재하였다(Zhang, 1993). 야생형 및 유전학적으로 변경된 Erwinia 균주의 AIs 생산능을 결정하기 위해, OHHL을 세균 배양물에 부가하지 않는 것을 제외하고 동일한 생물학적 검정 방법을 사용하였다.

AiiA 유전자의 클로닝 및 시퀀싱

240B1에서의 게놈 DNA를 EcoRI로 부분적으로 분해하였다. DNA 단편을 코스미드 벡터 pLAFR3의 탈인산 EcoRI에 연결(ligation)하였다(Staskawicz 등, 1987). 연결된 DNA를 Gigapack III XL Packaging Extract(Stratagene)로 포장(package)하고 E. coli DH5α에 트랜스펙션 하였다. OHHL 불활성화 활성을 갖는 코스미드 클론을 상기한 생물학적 검정법을 사용하여 동정하였다. 시퀀싱 벡터 pGEM-7zf(+)로의 서브클로닝을 통상적인 기법에 따라 수행하였다(Sambrook 등, 1989). 결실분석을 Lin 등(1985)에 의해 기술된 DnaseI 방법을 사용하여 수행하였다. 시퀀싱은 ABI PRISM^TM dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PE Applied Biosystems)를 사용하여 양쪽 가닥 모두에서 수행하였다. 핵산 시퀀스 데이터 및 밝혀진 아미노산 시퀀스를 DNASTAR^TM 시퀀스 분석 소프트웨어 패키지(DNASTAR Inc.) 로 분석하고 데이터베이스 연구를 BLASTA 연구 알고리즘(Altschul 등, 1990)을 이용하여 수행하였다.

Erwinia 균주 SCG1의 유전학적 변경

코스미드 벡터 pLAFR3에서 aiiA 유전자를 운반하는 E7-R3 플라스미드를 Erwinia 균주 SCG1에 헬퍼 균주(helper strain)인 RK2013으로 트리퍼런털 메이팅(triparental mating)에 의해 이식하였다. 전이배합체(transconjugant)를 테트라사이클린과 함께 최소 배지를 함유하는 플레이트 상에서 선택하고 aiiA 유전자에 특이적인 프라이머로 PCR에 의해 확인하였다.

독성 테스트

야생형 Erw. carolovora 균주 SCG1 및 aiiA 유전자 형질전환체 SCG1(E7-R3)의 독성을 접종함으로써 평가하였다. 4㎕의 초기 고정상 세균 현탁액(~2×10⁹ 세포/ml를 함유하는) 또는 희석된 세균을 절단 표면 또는 식물 조직의 상처부위에 부가하였다. 상기 접종된 식물조직을 페트리 디쉬에서 28℃에서 밤새 배양하였다. 상기 연성 부패증의 심각성을 접종 48시간 후에 조사하였다.

결과

세균 및 불활성 AIs의 스크리닝

식물 및 토양 표본으로부터의 세균 분리물을 AIs의 효소적 불활성화를 위해 스크린하였다. AIs의 활성을 제거하는 강력한 능력을 나타내는 세균 분리물 240B1 을 더 이상의 연구를 위해 선택하였다. 분리된 240B1으로부터의 총 단백질 추출물은 한시간 동안의 배양동안 AIs의 활성을 완전히 제거하였고(도 1), AIs를 불활성화 하는 단백질 추출물의 능력은 한시간 동안의 프로틴아제 K의 처리 또는 5분간 끓임으로써 제거되었다. 이러한 관찰로써 세균 단리물 240B1에 의한 AIs의 효소적 불활성화를 알 수 있다. 다음과 같은 특성을 갖기 때문에 상기 단리물을 분류학적으로 Bacillus 속으로 특정하였다: 그람양성, 막대모양, 카탈라제 양성, 임의 혐기성균 및 다른 바실루스속 세균과의 16rRNA 시퀀스 상동.

AIs 불활성화 하는 효소의 분자량은 30kDa보다 큰 것 같다. 그것의 활성은 단백질 추출물을 Centricon 30(Amicon)을 통해 통과시킨 후에 소실되었지만, 상기 활성은 Centricon 30을 통과하는데 실패한 재현탁된 분획에서 회복되었다(도 2).

AIs 불활성화 부위의 클로닝 및 국소화(localization)

AIs 불활성화를 암호화하는 유전자를 동정하기 위해 코스미드 라이브러리를 Listera 속 균주 240B1의 유전자 DNA로 구성하였다. 1200 클론을 AIs 불활성화 활성을 위해 스크린하였다. AIs 불활성화 기능을 보여주는 세 개의 클론을 동정하였다. 제한 분석법에 의해 3개의 클론이 EcoRI 분해에 의해 생성되는 4.3-kb의 공통된 밴드를 갖는다고 나타났다. 이러한 4.3-kb EcoRI 단편을 함유하는 서브클론 E7-7을 가지고 생물학적 검정법을 행한 결과 이 단편이 AIs 불활성화 기능을 암호화한다는 것이 확인되었다(도 3). AIs 불활성화 유전자(aiiA)의 최소크기 및 위치를 확인하기 위해 일련의 결실 클론을 DNaseI 방법으로 이런 4.3-kb 단편의 양쪽 말단으로부터 결실에 의해 생성시켰다(Lin 등, 1985). 상기 결과는 aiiA 유전자가 클론 F41의 1.2Kb 단편에 함유되어 있다는 것을 나타낸다(도 3).

AiiA 유전자는 새로운 단백질을 암호화 한다.

클론 41의 1.2-kb DNA 삽입물을 완전히 양쪽 가닥으로부터 시퀀스하였다. aiiA의 뉴클레오티드 시퀀스 및 그 예상되는 아미노산 시퀀스를 도 4에 나타내었다. 상기 DNA 삽입물의 완전한 시퀀스는 1,222 염기쌍을 함유하고 1, 42, 156 및 228의 뉴클로에티드 위치에서 각각 시작하는 4 개의 강력한 인프레임 해독틀(in-frame open reading frame)(ORF)이 있다. 결실분석법에 의해, 클론 R34를 가장 긴 ORF에서 48bp 프로모터 및 1에서 13의 뉴클레오티드를 제거할 경우 남아있는 DNA 삽입물이 기능적 Ptac 프로모터의 지배 하에 있다고 할지라도 클론 R34가 AI 불활성화 기능을 완전히 소실하기 때문에 가장 긴 유일한 ORF가 AIs 불활성화 기능을 암호화한다는 것을 알아내었다. 이것은 가장 긴 ORF를 동일한 ORF에 있는 글루타치온 S-트랜스퍼라제 유전자에 융합시키고 상기 정제된 융합 단백질의 AI 불활성화 활성을 시험함으로써 확인되었다(데이타를 나타내지는 않았다). 이 ORF는 750 bp 뉴클레오티드를 함유하고 19개의 강염기 아미노산 잔기 및 39개의 강산 아미노산 잔기를 갖기 때문에 28,036달톤의 예상 분자량 및 등전점이 4.7인 250개의 아미노산을 갖는 단백질을 암호화 한다. 추정적인 개시 코돈이 E.coli 16S rRNA의 3' 말단에 상보적인 강력한 리보솜-결합 시퀀스(AAGGTGG)에 의해 7bp의 간격으로 선행된다. 공통-10 프로모터 요소(TATAAT)에 대한 가장 좋은 시퀀스 매치(TATTGT)는 개시코돈의 상류 35bp에 있다. 강력한 인자-의존성 종결부위를 닮은 T-리치 부위(T-rich region) 다음의 TCTT 박스가 종결코드의 하부에서 발견된다(Brendel, 1986). aiiA 유전자의 총 GC 양은 37%이고 상기 코돈의 세 번째 부위에서 GC 양은 27.2%이다.

데이터베이스 연구에서는 뉴클레오티드 또는 펩티드 시퀀스 레벨 중 어느 하나에서 FASTA 및 BLAST 분석법에 의하면 aiiA 유전자가 주요 데이터베이스(GenBank, European Molocular Biology Laboratory, Protein Information Resource, 및 Swiss-Prot)에서 알려진 시퀀스와 상당한 유사성을 보이지 않았으며, 이는 AiiA가 새로운 단백질임을 제시한다. Genetics Computer Group(Madison, WI) MOTIF 프로그램을 사용한 동일한 단백질 모티프 연구에서는 짧은 펩티드 시퀀스인, AiiA에서 위치 47에서 58까지의 "ILVDTGMPESAV"가 아스파르틸 프로테아제 활성 부위 사인 패턴과 유사하지만 동일하지는 않다는 것을 보여주었다(Rawlings 및 Barrett, 1995)(도 5).

Erwinia carotovora에서의 aiiA 유전자 발현은 AIs 분비를 감소시키고 독성을 약화시킨다.

코스미드 클론 E7-R3를 트리퍼런털 메이팅(triparental mating)에 이해 Erwinia carotovora 균주 SCG1에 이식시켰다. pLAFR3 벡터를 선택 압력 없이 Erwinia carotovora에서 안전하게 유지하였다. 생물학적 검정법에 의하면 Erwinia carotovora에 의해 분비되는 AIs가 현저히 감소하였지만(도 6, 레인 6), 반면에 Erwinia carotovora에 코스미드 벡터 pLAFR3 단독으로 존재 시에는 AIs의 생산에 영향을 미치지 않았다(도 6, 레인 7)는 것을 알 수 있었다. 데이터는 Erwinia carotovora 균주 SCG1에 의해 생산된 대부분의 AIs는 aiiA 유전자 산물에 의해 불 활성화 되었다는 것을 제시한다.

AiiA 단백질을 발현하는 Erwinia carotovora SCG1(E7-R3)은 감자, 가지, 중국 양배추, 당근 및 셀러리에서 단지 대수롭지 않은 연성부패증 증상을 유발하거나 유발하지 않지만, 그것의 모체 균주는 심각한 증상을 유발하였다(도 7A, B, C, D, E). 유전적 변이로 인한 실험의 오류를 막기 위개 Erwinia carotovora 균주 SCG1으로부터의 4개의 콜로니 및 그것의 aiiA 유전자 형질전환체를 각각 AIs 생산 및 감자에 대한 독성을 시험하기 위해 무작위로 선택하였다. 유사한 결과를 양쪽 모두의 실험에서 얻었다. 코스미드 벡터를 함유하는 Erwinia carotovora 균주 SCGI(pLAFR3)는 모체 Erwinia carotovora 균주 SCGI와 동일한 정도로 심각한 질병을 유발하였다(도 7F).

토의

Bacillus 속으로 동정된 세균 단리물 240B I는 시험되는 AIs, 즉 N-β-옥소-헥사노일-L-호모세린 락톤, N-β-옥소옥타노일-L-호모세린 락톤, 및 N-β-옥소데카노일-L-호모세린 락톤을 효과적으로 불활성화 할 수 있는 효소를 생산한다. AI 불활성화 효소를 암호화하는 유전자(aiiA)를 클론하여 완전히 시퀀스하였다. 형질전환된 E. coli 및 병원성 세균 Erwinia carolovora에서의 aiiA 유전자의 발현은 AI 불활성화 능력을 부여하고 Erwinia carolovora로부의 AIs 분비를 현저하게 감소시킨다. 우리가 알기에 그것은 다양한 세균 종에서 전체적인 유전자 조절을 위한 자가유도물질인 N-아실-호모세린 락톤의 효소적 불활성화가 가능하다고 동정된 첫 단백질이다.

AiiA는 새로운 단백질이다. 주요 데이터베이스에서 알려진 단백질과 현저한 상동성이 없다. 아스파르틸 프로테아제 활성 부위의 동일 패턴과 유사점을 공유한다(Rawlings 및 Barret, 1995). 산 프로테아제로 알려진 아스파르틸 프로테아제는 척추동물, 진균, 식물, 레트로바이러스, 및 일부 식물 바이러스에 널리 분포한다. 대부분의 레트로바이러스 및 일부 식물 바이러스로부터의 아스파르틸 프로테아제는 호모다이머(homodimer)이다. AiiA 단백질의 분자량은 약 28kDa 이지만, 30kDa의 컷오프 사이즈를 갖는 분자체를 통과할 수 없으며, 이는 천연 조건 하에서 AiiA 단백질이 호모다이머 또는 호모멀티머로서 존재할 가능성을 나타낸다. 그러나, AiiA 모노머가 불규칙한 3차원의 구조를 가지고 있어 분자체의 통과가 방해될 가능성도 또한 있다. 아스파르틸 프로테아제는 엔도펩티다제이고 단백질의 아미드 연결을 가수분해 한다. 결정학적 연구로 아스파르틸 프로테아제의 효소군은 파편(lobe) 사이에 위치한 활성부위 파편을 갖는 이열편이 있는 분자이며, 각각의 파편은 촉매 활성에 책임이 있는 아스파르트산 잔기 짝 중 하나를 제공한다(Sielecki 등, 1991).

Erwinia carotovora는 감자, 양배추, 토마토, 칠리, 당근, 셀러리, 양파 및 양상추를 포함한 다양한 식물에서의 연성부패증의 독성 결정요인으로 작용하는 엑소효소를 생산하고 분비하는 식물 병원균이다(Kotoujansky, 1987).

N-3-(옥소헥사노일)-L-호모세린 락톤을 생산하지 못하는 돌연변이체는 또한 펙티나제, 셀룰라제 및 프로테아제 엑소효소의 합성도 못한다. 이런 돌연변이체는 감자 덩이줄기에 연성부패증을 유발하지 못한다(Jones 등, 1993). Vibrio fischeri의 luxI 유전자와 동일한 expI 유전자는 Erwinia carotovora의 자가유도물질 생산 을 암호화 한다. expI 돌연변이체는 그것을 담배잎에 접종하였을 때 독성이 없지만 외부의 자가유도물질 부가에 의해 독성이 회복된다(Pirhonen 등, 1993). 확실히 자가유도물질은 식물의 연성 부패증 저항성의 유전학적 조작을 위한 강력한 표적이다. 중간시험 및 개념 증명 접근으로서, aiiA 유전자를 함유하는 코스미드 클론을 Erwinia carotovora 균주 SCG1에 도입하였다. Erwinia carotovora에서의 AiiA 효소의 발현은 현저하게 자가유도물질의 분비를 감소시켰고, AiiA를 발현하는 유전적으로 변경된 Erwinia carotovora는 감자, 가지, 중국 양배추, 당근 및 셀러리를 포함한 시험된 모든 식물에서 연성부패증을 전혀 유도하지 않거나 유도하더라도 매우 미미하게 유도하였다. 우리의 결과에 의해 Erwinia carotovora에서의 병원성 유전자의 발현의 조절에 있어서 자가유도물질의 중요한 역할과, 자가유도물질이 병원성 유전자의 발현의 조절에 연루되는 연성 부패증 및 다른 질병에 대한 저항성을 부여하는 aiiA 유전자의 잠재능력이 지지된다. 본 발명은 질병에 대한 저항성을 조작하기 위한 새로운 전략을 제공한다. 특히, 이러한 전략은 역치 농도에서 많은 세균성 병원균의 병원성 유전자의 발현을 유도하는 N-아실 호모세린 락톤 자가유도물질을 표적으로 한다. 상기 언급한 개념-증명 접근을 사용함으로써, 본 발명은 병원성 세균에 의해 생산된 자가유도물질의 자가유도물질 불활성화 효소에 의한 감소 또는 제거가 그렇지 않다면 독성인 세균성 병원균의 병원성을 현저히 약화시킨다는 것을 증명한다. 병원성 세균에 의한 병원성 유전자의 발현이역치의 농도를 요구하기 때문에 AI-불활성화 전략이 세균성 병원균의 병원성 유전자의 발현이 N-아실-호모세린 락톤 자가유도물질에 의해 유도될 수 있는 모든 식물, 동물 또는 포유류의 질병 에 적용 가능하다.

aiiA 유전자는 AIs에 의해 조절되는 생물학적 기능이 정립되지 않은 세균에서의 AIs의 역할을 조사하기 위한 유용한 도구가 될 수 있다. 최근 몇 년간, 더 많은 세균종이 AIs를 생산한다고 밝혀졌다(Bassler 등, 1997; Dumenyo 등, 1998; Cha 등, 1998; Surette 등, 1999). 그들 중 일부는 Pseudomonas 및 Xanthomonas 속과 같은 중요한 식물 병원균이다. 시퀀스의 상동성에 기초한 상기 유전자의 넉아웃(knock out) 접근은 어려울 수 있다. AIs 합성효소 및 다른 속의 관련된 조절 단백질의 시퀀스 유사성의 전체적인 수준은 다소 낮아 종종 LuxI-형 단백질과는 28-35% 그리고 LuxR 형 단백질과는 18-25% 이하의 동일성을 갖는다(Fuqua 등, 1996). 그러나, AIs에 의해 조절되는 생물학적 기능을 조사하기 위해 aiiA 유전자를 이러한 세균에 도입하는 것은 실현가능하며 간단하다.

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<110> INSTITUTE OF MOLECULAR AGROBIOLOGY <120> Global regulators of bacterial pathogenic genes; bacterial autoinducer inactivation protein, as targets for engineering disease resistance <130> 2577-127 <150> SG9903146-0 <151> 1999-07-02 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1222 <212> DNA <213> Bacillus sp. <400> 1 ctttactgta ttgttttatt caaaactaaa tgtaaaggtg gatacataat gacagtaaag 60 aagctttatt tcgtcccagc aggtcgttgt atgttggatc attcgtctgt taatagtaca 120 ttaacaccag gagaattatt agacttaccg gtttggtgtt atcttttgga gactgaagaa 180 ggacctattt tagtagatac aggtatgcca gaaagtgcag ttaataatga aggtcttttt 240 aacggtacat ttgtcgaagg gcaggtttta ccgaaaatga ctgaagaaga tagaatcgtg 300 aatattttaa aacgggttgg ttatgagccg gaagaccttc tttatattat tagttctcac 360 ttgcattttg atcatgcagg aggaaatggc gcttttataa atacaccaat cattgtacag 420 cgtgctgaat atgaggcggc gcagcatagc gaagaatatt tgaaagaatg tatattgccg 480 aatttaaact acaaaatcat tgaaggtgat tatgaagtcg taccaggagt tcaattattg 540 catacaccag gccatactcc agggcatcaa tcgctattaa ttgagacaga aaaatccggt 600 cctgtattat taacgattga tgcatcgtat acgaaagaga attttgaaaa tgaagtgcca 660 tttgcgggat ttgattcaga attagcttta tcttcaatta aacgtttaaa agaagtggtg 720 atgaaagaga agccgattgt tttctttgga catgatatag agcaggaaag gggatgtaaa 780 gtgttccctg aatatatata gtacaaaaag tcatgagctt attcgctcat gactttttcg 840 tttaaatgat ttttttaaat aagttataaa cttttttaga actatcttca tttaattgat 900 agtacgtaag gtttacatca ttaggagtat cttgttgagc aatcatcact tcgttactgt 960 gatggtcaac tacccatatg aaatattttt tataagtccc atcctcgaaa gtaatccaca 1020 tatcacagtc tattaaatct gatccttctt catctaatgt taattttcct tttttggcgg 1080 tatccatact gttaatgaat gtttttaatt catctgtttt tgtgagaaag atatcctttt 1140 ttgttttaat tgactcgaca tgtatatctt ttatttcttg ttttcctaaa aagacagggg 1200 gctcatttgg gtctctttga gt 1222 <210> 2 <211> 250 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 2 Met Thr Val Lys Lys Leu Tyr Phe Val Pro Ala Gly Arg Cys Met Leu 1 5 10 15 Asp His Ser Ser Val Asn Ser Thr Leu Thr Pro Gly Glu Leu Leu Asp 20 25 30 Leu Pro Val Trp Cys Tyr Leu Leu Glu Thr Glu Glu Gly Pro Ile Leu 35 40 45 Val Asp Thr Gly Met Pro Glu Ser Ala Val Asn Asn Glu Gly Leu Phe 50 55 60 Asn Gly Thr Phe Val Glu Gly Gln Val Leu Pro Lys Met Thr Glu Glu 65 70 75 80 Asp Arg Ile Val Asn Ile Leu Lys Arg Val Gly Tyr Glu Pro Glu Asp 85 90 95 Leu Leu Tyr Ile Ile Ser Ser His Leu His Phe Asp His Ala Gly Gly 100 105 110 Asn Gly Ala Phe Ile Asn Thr Pro Ile Ile Val Gln Arg Ala Glu Tyr 115 120 125 Glu Ala Ala Gln His Ser Glu Glu Tyr Leu Lys Glu Cys Ile Leu Pro 130 135 140 Asn Leu Asn Tyr Lys Ile Ile Glu Gly Asp Tyr Glu Val Val Pro Gly 145 150 155 160 Val Gln Leu Leu His Thr Pro Gly His Thr Pro Gly His Gln Ser Leu 165 170 175 Leu Ile Glu Thr Glu Lys Ser Gly Pro Val Leu Leu Thr Ile Asp Ala 180 185 190 Ser Tyr Thr Lys Glu Asn Phe Glu Asn Glu Val Pro Phe Ala Gly Phe 195 200 205 Asp Ser Glu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Lys Arg Leu Lys Glu Val Val 210 215 220 Met Lys Glu Lys Pro Ile Val Phe Phe Gly His Asp Ile Glu Gln Glu 225 230 235 240 Arg Gly Cys Lys Val Phe Pro Glu Tyr Ile 245 250

Claims

a) SEQ ID NO:1인 암호화 부분의 시퀀스를 갖는 핵산;

b) SEQ ID NO:2의 아미노산 시퀀스를 암호화하는 핵산: 및/또는

c) 상기 a) 또는 b)에 상보적인 핵산으로 구성된 그룹에서 선택된, 세균 자가유도물질 불활성화 단백질을 암호화하는 단리된 핵산 분자.
삭제
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원핵세포 또는 진핵세포에서 증식하는, 제 1 항의 핵산분자를 포함하는 발현벡터.
제 4 항의 발현벡터로 형질전환 또는 트랜스펙션된 원핵세포 또는 진핵세포.
SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 구성되는, 세균 자가유도물질 불활성화 활성을 갖는 단리 단백질.
a) SEQ ID NO:1의 암호화 부분의 시퀀스를 갖는 핵산; 및

b) SEQ ID NO:2의 아미노산 시퀀스를 암호화하는 핵산으로 구성된 그룹에서 선택된, 세균 자가유도물질 불활성화 단백질을 암호화하는 핵산 시퀀스를 식물 또는 동물세포에 상기 세포가 상기 핵산 시퀀스를 발현하게 하는 방식으로 도입하는 것을 포함하는, 인간을 제외한 식물 또는 동물에 질병의 저항성을 증가시키는 방법.
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제 7 항에 있어서, 상기 식물은 세균의 연성 부패증에 감염되기 쉬운 것임을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 식물은 감자, 가지, 중국 양배추, 당근 및 셀러리로 구성된 구룹에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 식물은 독성 유전자의 발현이 N-아실 호모세린 락톤 자가유도물질에 의해 조절되는 세균의 질병에 감염되기 쉬운 것임을 특징으로 하는 방법.
억제 또는 감소가 필요한 식물 또는 동물에게 유효량의 SEQ ID NO: 2의 세균 자가유도물질 불활성화 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 인간을 제외한 식물 또는 동물에게 세균의 위해를 억제하거나 감소시키는 방법.
삭제
식물 또는 동물에 대한 세균의 위해를 억제하거나 감소시키기 위한 다음 성분을 포함하는 조성물:

a) 유효량의 SEQ ID NO: 2로 구성되는 세균의 자가유도물질 불활성화 단백질; 및

b) 적절한 담체.
삭제
세균 단리물을 자가유도물질 불활성화 활성에 대해 다음 단계를 포함하는 스크리닝 방법:

a) 토양 또는 식물의 표본으로부터의 단일 콜로니 세균 배양물을 단리하는 단계;

b) 상기 배양물을 SEQ ID No:2의 단백질이 나타내는 자가유도물질 불활성화 활성에 대해 스크리닝하는 단계;

c) 상기 배양물로부터 조단백질 추출물을 제조하는 단계;

d) 상기 조단백질 추출물에 의한 자가유도물질 활성의 효소적 불활성화를 확인하는 단계.
다음 단계를 포함하는, 제 1 항의 핵산을 단리하는 방법:

a) 적절한 숙주 생명체에서 제 1 항의 핵산을 함유하는 공여자 생명체로부터 유전자 은행을 제조하는 단계;

b) 상기 유전자 은행의 클론을 스크리닝하는 단계; 및

c) 제 1 항의 핵산을 함유하는 클론을 단리하는 단계.
제 19 항에 있어서, E.coli를 숙주 생명체로서 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19 항에 있어서, 상기 유전자 은행을 제조하고, 클론을 스크리닝하고, 그리고 상기 클론을 단리하는 단계가 자가유도물질을 불활성화 하지 않는 E. coli 균주에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
다음 단계를 포함하는 방법:

a) 제 1 항의 핵산 시퀀스를 세균 세포에 도입하는 단계; 및

b) 단계 a)로부터 획득된 세균세포를 변화된 생물학적 기능에 대해 스크리닝하는 단계.
제 22 항에 있어서, 상기 변화된 생물학적 기능은 단계 a)의 결과로서 소실되는 기능인 것을 특징으로 하는 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 변화된 생물학적 기능은 단계 a)의 결과로서 억제되는 기능인 것을 특징으로 하는 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 생물학적 기능이 단계 a)의 결과로서 증진되는 기능인 것을 특징으로 하는 방법.