DE60219077T2 - RALSTONIA AHL ACYLASE GEN - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der molekularen Biologie. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein N-Acylhomoserinlacton-Acylasegen von Ralstonia sp. XJ12B.The This invention relates to the field of molecular biology. In particular, the invention relates to an N-acyl homoserine lactone acylase gene from Ralstonia sp. XJ12B.
  • N-Acylhomoserinlactone (AHLs), auch als Autoinduktoren bekannt, werden in vielen gramnegativen Bakterien in einem großen Umfang als quorumsensitive Signalmoleküle verwendet. Diese Verbindungen regulieren bestimmte Klassen von Targetgenen in Bakterien, wie Virulenzgene oder Biofilm-Differenzierungsgene. Im Allgemeinen sind quorumsensitive Moleküle hoch konserviert und teilen sich eine identische Homoserinlacton-Komponente. Die Länge und die Struktur von ihren Acylseitenketten sind jedoch unterschiedlich. Obwohl die durch AHLs regulierten Targetgene in unterschiedlichen Bakterienspezies variieren, sind die Grundmechanismen der AHL-Biosynthese und der Genregulation innerhalb der verschiedenen bakteriellen Arten konserviert.N-acylhomoserine lactones (AHLs), also known as autoinducers, are found in many gram-negative bacteria in a big one Scope used as quorum-sensitive signaling molecules. These connections regulate certain classes of target genes in bacteria, such as virulence genes or biofilm differentiation genes. In general, are quorum sensitive molecules highly conserved and share an identical homoserine lactone component. The length and the structure of their acyl side chains, however, are different. Although the AHLs regulated target genes in different Bacterial species vary, are the basic mechanisms of AHL biosynthesis and gene regulation within the various bacterial species preserved.
  • Das allgemeine Merkmal der AHL-vermittelten Genregulation ist ihre Abhängigkeit von der Zellpopulation (Quorumsensitivität). Bakterien geben AHLs in ihre Umgebung ab und die extrazelluläre Konzentration der AHLs nimmt mit dem Wachstum der bakteriellen Zellpopulationen zu. Wenn AHL bis zu einer extrazellulären Schwellenkonzentration akkumuliert, wird die Expression von bestimmten Gruppen von Targetgenen in den Bakterien ausgelöst.The general feature of AHL-mediated gene regulation is its dependence from the cell population (quorum sensitivity). Bacteria enter AHLs their environment and the extracellular concentration of AHLs decreases with the growth of bacterial cell populations too. If AHL up to an extracellular Accumulated threshold concentration, the expression of certain Triggered groups of target genes in the bacteria.
  • Bakterien, welche diese Signalfreisetzung verwenden, detektieren und reagieren auf die Akkumulation der AHL Signalmoleküle mit der Synchronisation der Expression einer besonderen Gruppe von Genen sowie mit der Koordination von zellulären Aktivitäten innerhalb der bakteriellen Zellpopulation. AHLs sind bei der Regulation einer Reihe von biologischen Funktionen beteiligt, einschließlich der Biolumineszenz in Vibrio-Arten (13, 4), dem konjugalen Transfer des Ti-Plasmids in Agrobacterium tumefaciens (31), der Induktion von Virulenzgenen in Burkholderia cepacia, Erwinia carotovora, Erw. chrysanthemi, Erw. stewartii, Pseudomonas aeruginosa und Xenorhabdus nematophilus (3, 6, 12, 17, 19, 22, 23, 24, 26), Regulation der Antibiotikaproduktion in P. aureofaciens und Erw. carotovora (6, 26), Schwarmbeweglichkeit in Serratia liquifaciens (14) und Biofilmbildung in P. fluorescens und P. aeruginosa (1, 8). In vielen anderen Bakterienarten müssen die relevanten biologischen Funktionen, die von AHLs gesteuert werden, noch untersucht werden (2, 5, 11).Bacteria, which use, detect and respond to this signal release on the accumulation of AHL signaling molecules with synchronization the expression of a particular group of genes as well as with the coordination of cellular activities within the bacterial cell population. AHLs are in regulation involved in a number of biological functions, including the Bioluminescence in Vibrio species (13, 4), the conjugal transfer of the Ti plasmid in Agrobacterium tumefaciens (31), induction of virulence genes in Burkholderia cepacia, Erwinia carotovora, Erw. chrysanthemi, Erw. stewartii, Pseudomonas aeruginosa and Xenorhabdus nematophilus (3, 6, 12, 17, 19, 22, 23, 24, 26), regulation of Antibiotic production in P. aureofaciens and Erw. Carotovora (6, 26), swarm motility in Serratia liquifaciens (14) and biofilm formation in P. fluorescens and P. aeruginosa (1, 8). In many other types of bacteria have to the relevant biological functions controlled by AHLs to be investigated (2, 5, 11).
  • Eine Reihe von pflanzlichen, tierischen und menschlichen bakteriellen Pathogenen verwenden quorumsensitive AHL-Signale, um die Expression von pathogenen Genen zu regulieren und bei der Bildung von Biofilmen zu helfen. Deshalb sind die quorumsentitiven AHL-Signalmoleküle eine Gruppe von molekularen Zielen für die genetische und chemische Manipulation, da die Unterbrechung von diesen Signalmechanismen die Fähigkeit von diesen Bakterien, pflanzliche und tierische Gewebe zu infizieren oder Biofilme zu bilden, verhindert oder reduziert.A Series of plant, animal and human bacterial Pathogens use quorum-sensitive AHL signaling to increase expression of pathogenic genes and in the formation of biofilms to help. Therefore, the quorum-sensitive AHL signaling molecules are one Group of molecular targets for the genetic and chemical manipulation, since the interruption of these signaling mechanisms the ability of these bacteria, to infect plant and animal tissues or biofilms too form, prevented or reduced.
  • Das Gen, das ein AHL-Inaktivierungsenzym (AiiA) codiert, wurde aus einem grampositiven Bakterium (Bacillusstamm 240B1) kloniert (9). AiiA (auch bekannt als AHL-Lactonase) inaktiviert die AHL-Aktivität durch die Hydrolyse der Lactonbindung der AHLs (10). Die Expression von AiiA in transformierten Erw. carotovora (ein pathogener Stamm, der bei vielen Pflanzen Wurzelfäule verursacht) reduziert signifikant die Freisetzung von AHL, senkt die extrazellulären pektolytischen Enzymaktivitäten ab und schwächt die Pathogenität auf Kartoffel, Aubergine, Chinakohl, Karotte, Sellerie, Blumenkohl und Tabak (9). Transgenische Pflanzen, welche AHL-Lactonase exprimieren, zeigten eine signifikant gesteigerte Resistenz gegenüber einer Erw. carotovora Infektion und eine verzögerte Entwicklung von Symptomen der Wurzelfäule (10). AHL-Inaktivierungsmechanismen scheinen weit verbreitet zu sein. Es wurde zum Beispiel von einem bakteriellen Isolat von Variovorax paradoxus berichtet, das AHL-Moleküle als seine Energie- und Stickstoffquelle verwendet, was die mögliche Gegenwart von AHL-abbauenden Enzymen (18) anzeigt.The Gene encoding an AHL inactivating enzyme (AiiA) was obtained from a Gram-positive bacterium (Bacillus strain 240B1) cloned (9). AiiA (also known as AHL lactonase) inactivates AHL activity by Hydrolysis of the lactone bond of the AHLs (10). The expression of AiiA in transformed adults carotovora (a pathogenic strain that is found in many plants root rot caused) significantly reduces the release of AHL, lowers the extracellular pectolytic enzyme activities off and weakens the pathogenicity on potato, eggplant, Chinese cabbage, carrot, celery, cauliflower and tobacco (9). Transgenic plants expressing AHL lactonase showed a significantly increased resistance to one Erw. Carotovora infection and a delayed development of symptoms the root rot (10). AHL-inactivation seem to be widely used. It was, for example, one Variovorax paradoxus bacterial isolate reported using the AHL molecules as its Energy and nitrogen source uses what the possible present of AHL-degrading enzymes (18).
  • Weitere Verfahren, gegen eine AHL-vermittelte pflanzliche, tierische und menschliche Krankheit und gegen die Pflanzenpathogenvirulenz durch Störung bei der bakteriellen interzellulären Kommunikation einzuwirken, wären sehr wünschenswert.Further Procedures against an AHL-mediated herbal, animal and human disease and against plant pathogen virulence disorder at the bacterial intercellular Interaction would be very desirable.
  • Demgemäß wird in dieser Studie über die Klonierung und die Charakterisierung eines Gens berichtet, welche für eine AHL-Acylase aus dem bakteriellen Isolat Ralstonia sp. JX12B codiert.Accordingly, in this study over the cloning and characterization of a gene is reported, which for one AHL acylase from the bacterial isolate Ralstonia sp. JX12B coded.
  • Nach einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr. 1 bereit. Nach einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Nukleinsäure bereit, welche die Nukleotide 1234-3618 von SEQ ID Nr. 1 umfasst.To an embodiment the invention provides a nucleic acid according to SEQ ID NO: 1. After a another embodiment the invention provides a nucleic acid containing the nucleotides 1234-3618 of SEQ ID NO: 1.
  • Nach einer weitern Ausführungsform stellt die Erfindung ein Peptid mit einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 oder mit einer Sequenz, welche die Aminosäuren 36-217 von SEQ ID Nr. 2 umfasst, oder ein Peptid mit einer Sequenz bereit, welche die Aminosäuren 233-794 von SEQ ID Nr. 2 umfasst.To another embodiment the invention provides a peptide having a sequence according to SEQ ID NO. 2 or with a sequence comprising amino acids 36-217 of SEQ ID NO. 2, or a peptide having a sequence which comprises the amino acids 233-794 of SEQ ID NO: 2.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Peptid mit einer Sequenz bereit, die von einer Nukleinsäure codiert wird, welche aus den Nukleotiden 1234-3618 von SEQ ID Nr. 1 besteht.According to one another embodiment the invention provides a peptide having a sequence derived from a nucleic acid which consists of nucleotides 1234-3618 of SEQ ID NO. 1 exists.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Peptid, wie oben beschrieben, bereit, welches AHL inaktiviert.According to one another embodiment the invention provides a peptide as described above which AHL disabled.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein in vitro Verfahren zur Modulation der AHL Signalaktivität bereit, welches das in Kontaktbringen von AHL mit einem oben beschriebenen Peptid umfasst.According to one another embodiment the invention provides an in vitro method for modulating the AHL signal activity ready to contact AHL with one described above Peptide comprises.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgenische Pflanze oder ein nicht-menschliches Säugetier bereit, welches eine oben beschriebene Nukleinsäure umfasst.According to one another embodiment the invention provides a transgenic plant or a non-human one mammal which comprises a nucleic acid as described above.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine Nukleinsäure oder ein Peptid, wie oben beschrieben, zur Verwendung in der Therapie und die Verwendung von dieser Nukleinsäure und/oder dieses Peptides für die Herstellung eines Medikamentes zur Kontrolle einer bakteriellen Krankheit in einem Säugetier bereit, wobei die Expression der pathogenen Gene von diesen Bakterien durch AHL-Signale reguliert werden.According to one another embodiment the invention provides a nucleic acid or a peptide as above described for use in therapy and the use of this nucleic acid and / or this peptide for the preparation of a drug for the control of a bacterial Disease in a mammal ready, with the expression of pathogenic genes from these bacteria be regulated by AHL signals.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Steuerung einer bakteriellen Krankheit in einer Pflanze bereit, welches die Verabreichung eines Peptides, wie oben beschrieben, zu dieser Pflanze umfasst, wobei die Expression der pathogenen Gene von diesen Bakterien durch AHL-Signale reguliert werden. Alternativ umfasst das Verfahren die Transformation der Pflanze mit einer oben beschriebenen Nukleinsäure.According to one another embodiment the invention provides a method for controlling a bacterial Disease in a plant, which is the administration of a Peptides, as described above, to this plant, wherein the expression of pathogenic genes from these bacteria is regulated by AHL signals become. Alternatively, the method comprises the transformation of Plant with a nucleic acid described above.
  • Die 1 ist eine Fotographie und zeigt Biotestergebnisse der AHL-Inaktivierung für bakterielle Kulturen und bakterielle Proteine aus den dargestellten bakteriellen Klonen. Die 1A zeigt die Ergebnisse eines Biotests mit bakteriellen Kulturen von E. coli DH5α Stämmen 13H10 (Reihe 1), 2B10 (Reihe 2), MUB3 (Reihe 3), MUC6 (Reihe 4), GST-QsbA (Reihe 5) und GST (Reihe 6), welche die Plasmidklone oder Konstrukte pI3H10, p2B10, pMUB3, pMUC6, pGST-QsbA bzw. pGST enthalten. Die 1B zeigt die Ergebnisse des Biotests für die angezeigten bakteriellen Proteine GST-QsbA und GST.The 1 Figure 3 is a photograph showing bioassay results of AHL inactivation for bacterial cultures and bacterial proteins from the bacterial clones shown. The 1A shows the results of a bioassay with bacterial cultures of E. coli DH5α strains 13H10 (row 1), 2B10 (row 2), MUB3 (row 3), MUC6 (row 4), GST-QsbA (row 5) and GST (row 6 ) containing the plasmid clones or constructs pI3H10, p2B10, pMUB3, pMUC6, pGST-QsbA and pGST, respectively. The 1B shows the results of the bioassay for the indicated bacterial proteins GST-QsbA and GST.
  • 2 ist ein Diagramm und zeigt die Temperatur- und pH-Optimumprofile der AHL-Acylase. 2 Figure 2 is a graph showing the temperature and pH optimum profiles of the AHL acylase.
  • Die 3 ist eine graphische Darstellung und zeigt den Zeitverlauf der OOHL-Inaktivierung durch gereinigte AHL-Acylase.The 3 Figure 9 is a graph showing the time course of OOHL inactivation by purified AHL acylase.
  • Ein bakterielles Isolat von Ralstonia sp. XJ12B aus einer Biofilmprobe in einem Wasserbehandlungssystem war zur enzymatischen Inaktivierung von AHLs, bakteriellen quorumsensitiven Molekülen, in einem Biotest unter Verwendung von dem Agrobacterium tumefaciens Stamm Nt1 (traR; tra::lacZ749) als Indikator für die AHL-Aktivität in der Lage. Das Gen, welches für das Protein codierte, welches diese Enzymaktivität für die AHL-Inaktivierung (qsbA) zeigte, wurde aus einem bakteriellen Stamm kloniert, der aus einer Biofilmprobe isoliert wurde. Das Gen codiert ein Peptid mit 794 Aminosäuren.One bacterial isolate of Ralstonia sp. XJ12B from a biofilm sample in a water treatment system was for enzymatic inactivation of AHLs, bacterial quorum-sensitive molecules, in a biotest below Use of the Agrobacterium tumefaciens strain Nt1 (traR; tra :: lacZ749) as an indicator of the AHL activity in a position. The gene for encoded the protein expressing this enzyme activity for AHL inactivation (qsbA) was cloned from a bacterial strain that came from a Biofilm sample was isolated. The gene encodes a 794 peptide Amino acids.
  • Bakterielle Kulturen und bakterielle Proteine wurde hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Inaktivierung von AHL unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens Indikatorzellen getestet. A. tumefaciens wurde bei 28°C in einem MM-Medium kultiviert, wie dies beschrieben ist bei Zhang et al. (31). Die Bakterien oder das zu testende Protein werden zunächst mit einem AHL-Substrat getestet, zum Beispiel N-β-Oxooctanoyl-L-homoserinlacton (OOHL), und die Reaktion (Inaktivierung von AHL) wird laufen gelassen. Wenn eine AHL-Inaktivierungsaktivität in der Probe vorhanden ist (das heißt, AHL wird geschnitten und inaktiviert), werden die inaktivierten AHL-Produkte dann die Expression des lacZ Reportergens nicht auslösen können, das unter der Kontrolle eines TraR-abhängigen Promotors steht. Der Stamm A. tumefaciens NT1, der das lacZ Reportersystem enthält, wird somit in Gegenwart des Substrates 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal) nicht blau werden. Siehe Beispiel 2 für die Details dieses Biotests. Jedes AHL kann in dem Test, falls gewünscht, verwendet werden. Selbstverständlich kann jeder geeignete Test für die Spaltung von AHL, einschließlich traditioneller in vitro Enzymtests, verwendet werden, um die AHL-Inaktivierungsaktivität nachzuweisen. Fachleute werden in der Lage sein, Tests zu modifizieren oder zu ersinnen, um die AHL-Inaktivierung nachzuweisen und/oder zu quantifizieren.Bacterial cultures and bacterial proteins were tested for their ability to inactivate AHL using Agrobacterium tumefaciens indicator cells. A. tumefaciens was cultured at 28 ° C in an MM medium as described in Zhang et al. (31). The bacteria or protein to be tested are first tested with an AHL substrate, for example N-β-oxooctanoyl-L-homoserine lactone (OOHL), and the reaction (inactivation of AHL) is allowed to proceed. If an AHL inactivating activity is present in the sample (that is, AHL is cut and inactivated), then the inactivated AHL products will not be able to induce expression of the lacZ reporter gene, which is under the control of a TraR-dependent promoter. The A. tumefaciens NT1 strain containing the lacZ reporter system will thus not turn blue in the presence of the substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal). See Example 2 for the details of this bioassay. Any AHL can be used in the test, if desired. Of course, any suitable assay for the cleavage of AHL, including traditional in vitro enzyme assays, can be used to detect AHL inactivating activity. professionals will be able to modify or devise tests to detect and / or quantify AHL inactivation.
  • Der Escherichia coli Stamm DH5α wurde als Wirt für die DNA-Manipulation verwendet. Ralstonia sp. und E. coli wurden beide in einem LB-Medium (Trypton: 10 g/l, Hefeextrakt: 5 g/l und NaCl: 10 g/l; pH 7,0) bei 37°C kultiviert. Falls notwendig wurden geeignete Antibiotika mit den folgenden Konzentrationen zugesetzt: Ampicillin, 100 μg/ml; Tetracyclin, 10 μg/ml und Kanamycin, 20 μg/ml.Of the Escherichia coli strain DH5α was as a host for the DNA manipulation used. Ralstonia sp. and E. coli were both in an LB medium (Tryptone: 10 g / l, yeast extract: 5 g / l and NaCl: 10 g / l, pH 7.0) at 37 ° C. If necessary, appropriate antibiotics were obtained with the following concentrations added: ampicillin, 100 μg / ml; Tetracycline, 10 μg / ml and kanamycin, 20 μg / ml.
  • Das Gen, welches für das Protein codiert, das für die nachgewiesene AHL-Inaktivierung verantwortlich ist, wurde unter Verwendung einer Cosmidbibliothek von 1.600 Klonen mit der genomischen DNA von Ralstonia sp. Stamm XJ12B, konstruiert in E. coli, isoliert. Die E. coli Transfektanten wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Inaktivierung von AHL getestet. Ein Klon, p13H10, wurde hinsichtlich der Fähigkeit zur Inaktivierung von AHL gefunden. Die Cosmid-DNA aus p13H10 wurde geschnitten, in einen Klonierungsvektor fusioniert, ligiert und transformiert in E. coli. Die E. coli Klone wurden wiederum hinsichtlich ihrer Aktivität zur AHL-Inaktivierung gestestet. Ein Klon, der ein 4 kb Insert enthielt, hatte die AHL-Inaktivierungsaktivität.The Gene, which for the protein that codes for the proven AHL inactivation is responsible Use of a cosmid library of 1,600 clones with the genomic DNA from Ralstonia sp. Strain XJ12B, constructed in E. coli, isolated. The E. coli transfectants were assessed for their ability tested for inactivation of AHL. One clone, p13H10, was made the ability found to inactivate AHL. The cosmid DNA from p13H10 was cut, fused into a cloning vector, ligated and transformed in E. coli. The E. coli clones were again examined their activity tested for AHL inactivation. A clone containing a 4 kb insert had the AHL inactivation activity.
  • Die Plasmide wurden anschließend für die Sequenzierung gereinigt. Das 4 kb Fragment aus dem Klon p2B10 wurde vollständig gemäß bekannten Verfahren unter Verwendung von ABI Prism dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems) sequenziert. Siehe die folgende Tabelle I. Die Sequenz enthielt einen offenen Leserahmen von 2.385 Nukleotiden, der das AHL-Inaktivierungsgen, qsbA, darstellte und für das vorhergesagte Polypeptid von 794 Aminosäuren (85.373 Daltons) codierte.The Plasmids were subsequently for the Purified sequencing. The 4 kb fragment from clone p2B10 was Completely according to known Method Using ABI Prism dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems) sequenced. See the following Table I. The sequence contained an open reading frame of 2,385 nucleotides containing the AHL inactivation gene, qsbA, represented and for the predicted polypeptide encoded 794 amino acids (85,373 daltons).
  • Tabelle I. QsbA-Gen (Ralstonia sp.) Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 1).
    Figure 00070001
    Table I. QsbA gene (Ralstonia sp.) Nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1).
    Figure 00070001
  • Der vorausgesagte offene Leserahmendes qsbA-Gens ist in Großbuchstaben dargestellt, wobei das Startcodon und das Stoppcodon in Fett dargestellt sind. Eine mutmaßliche Ribosomenbindungsstelle (AGGAGA) ist unterstrichen.Of the predicted open reading frame qsbA gene is in capital letters with the start codon and the stop codon shown in bold are. A suspected Ribosome binding site (AGGAGA) is underlined.
  • Die Sequenzanalyse von diesem Peptid zeigte, dass QsbA keine signifikante Homologie mit dem bekannten, quorumsensitiven AHL-Lactonase -Molekülinaktivator zeigt, der von dem aiiA-Gen aus Bacillus sp. 240B1 codiert wird. Die abgeleitete Peptidsequenz war jedoch typisch für die Primärstruktur von Aculeacin A Acylasen (AACs) und Penicillin G Acylasen mit einer Signalpeptid-α Untereinheit-Spacer-β Untereinheit-Organisation (16, 30). Die Ralstonia-Sequenz teilt sich eine substantielle Identität mit den AACs aus Deinococcus radiodurans Stamm R1, Actinoplanes utahensis und einer mutmaßlichen Acylase aus Pseudomonas aeruginosa, die alle die Desacylierung ihrer Substrate katalysieren. Diese AAC-Gene werden als einzelnes Vorläufer-Polypeptid translatiert und dann zu der aktiven Form verarbeitet, die zwei Untereinheiten hat. Aculeacin A ist ein pilzwirksames Antibiotikum des Echinocandin-Typs mit einer langen Fettsäure-Seitenkette. Aculeacin A Acylasen, die aus A. utahensis gereinigt sind, katalysieren die Hydrolyse der Amidbindung an der Palmitoyl-Seitenkette von Aculeacin A (29). Die Primärstruktur des Proteins sowie die Enzymaktivitätsanalyse mit verschiedenen Substraten, die unten diskutiert wird, zeigen somit, dass qsbA für eine AHL-Acylase codiert, welche die Amidverbindung zwischen der Acylseitenkette und der Homoserinlacton-Komponente der AHLs spaltet.Sequence analysis of this peptide showed that QsbA shows no significant homology with the known, quorum-sensitive AHL lactonase molecule activator derived from the aiiA gene from Bacillus sp. 240B1 is encoded. However, the deduced peptide sequence was typical of the primary structure of aculeacin A acylases (AACs) and penicillin G acylases with a signal peptide-α subunit-spacer-β subunit organization (16, 30). The Ralstonia sequence shares a substantial identity with the AACs from Deinococcus radiodurans strain R1, Actinoplanes utahensis, and a putative Pseudomonas aeruginosa acylase, all of which catalyze the deacylation of their substrates. These AAC genes are translated as a single precursor polypeptide and then processed to the active form, which has two subunits. Aculeacin A is a fungal echinocandin type antibiotic with a long fatty acid side chain. Aculeacin A acylases purified from A. utahensis catalyze the hydrolysis of the amide bond on the palmitoyl side chain of aculeacin A (29). The primary structure of the protein as well as the enzyme activity analysis with various substrates discussed below thus demonstrate that qsbA encodes an AHL acylase which cleaves the amide linkage between the acyl side chain and the homoserine lactone moiety of the AHLs.
  • Die vermuteten α und β Untereinheiten von QsbA sind an den Aminosäurepositionen 36-217 bzw. 233-794 von SEQ ID Nr. 2 lokalisiert, wobei dazwischen ein Spacer von 15 Aminosäuren liegt, gemäß der Bestimmung durch vergleichende Anordnung mit den Peptidsequenzen aus D. radiodurans Stamm R1, A. utahensis und P. Aeruginosa. Siehe Tabelle II. Tabelle II. Ausgerichtete Aminosäuresequenzen von QsbA aus Ralstonia sp. XJ12B (SEQ ID Nr. 2), D. radiodurans Stamm R1 Acylase (SEQ ID Nr. 3), A. utahensis Acylase (SEQ ID Nr. 4) und P. aeruginosa Acylase (SEQ ID Nr. 5).
    Figure 00080001
    The putative α and β subunits of QsbA are located at amino acid positions 36-217 and 233-794, respectively, of SEQ ID NO: 2, with a spacer of 15 amino acids between them, as determined by comparison with the D. radiodurans peptide sequences Strain R1, A. utahensis and P. aeruginosa. See Table II. Table II. Aligned amino acid sequences of QsbA from Ralstonia sp. XJ12B (SEQ ID NO: 2), D. radiodurans strain R1 acylase (SEQ ID NO: 3), A. utahensis acylase (SEQ ID NO: 4) and P. aeruginosa acylase (SEQ ID NO: 5).
    Figure 00080001
  • Figure 00090001
    Figure 00090001
    • * = identische Reste; : = konservierte Substitutionen; . = semi-konservierte Substitutionen;* = identical residues; : = conserved substitutions; , = semi-conserved substitutions;
    • | = post-translationale Verarbeitungsstellen für Signalpeptid und Untereineinheiten; - = Spacer.| = post-translational processing sites for signal peptide and subunits; - = spacer.
  • Die codierende Region des qsbA-Gens wurde mittels PCR amplifiziert. Die amplifizierten PCR Produkte wurden geschnitten, in die codierende Sequenz des Glutathion S Transferase (GST) Gens gemäß dem Leseraster angeordnet und in E. coli exprimiert. Die Proteinextrakte von den rekombinanten E. coli Zellen wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Inaktivierung von AHL getestet. Proteine aus E. coli, die GST alleine exprimierten, dienten als Kontrolle. Die Ergebnisse zeigen, dass das GST-QsbA Fusionsprotein die AHL-Aktivität effektiv eliminierte. Siehe 1B.The coding region of the qsbA gene was amplified by PCR. The amplified PCR products were cut, placed in the coding sequence of the glutathione S transferase (GST) gene in frame and expressed in E. coli. The protein extracts from the recombinant E. coli cells were tested for their ability to inactivate AHL. Proteins from E. coli expressing GST alone served as controls. The results show that the GST-QsbA fusion protein effectively eliminated AHL activity. Please refer 1B ,
  • Die Substratspezifität von QsbA wurde durch Test des gesamten löslichen Proteins, welches aus rekombinanten E. coli (pGST-QsbA) extrahiert wurde, auf Inaktivierung von AHLs unter Verwendung von Subtraten mit Acylketten von unterschiedlichen Längen bestimmt. QsbA war fähig zur vollständigen Inaktivierung von 3-Oxogruppe-Acyl-HSLs mit Acylketten von 8, 10 und 12 Kohlenstoffatomen. QsbA inaktivierte auch stark Methylengruppe-Acyl-HSLs mit Acylketten von 8 und 10 Kohlenstoffatomen. QsbA inaktivierte auch die Butyl- und Hexylester von N-β-Octanoyl-L-homoserin, während die AHL-Lactonase, die durch aiiA codiert wurde, nicht zu deren Inaktivierung in der Lage war. Die Daten der Substratspezifität zeigen, dass QsbA eine AHL-Acylase ist.The substrate specificity of QsbA was assessed by assaying the total soluble protein, which was derived from re Combinant E. coli (pGST-QsbA) was extracted for inactivation of AHLs using substrates with acyl chains of different lengths. QsbA was capable of completely inactivating 3-oxo group acyl HSLs with acyl chains of 8, 10, and 12 carbon atoms. QsbA also strongly inactivated methylene group acyl HSLs with acyl chains of 8 and 10 carbon atoms. QsbA also inactivated the butyl and hexyl esters of N-β-octanoyl-L-homoserine while the AHL lactonase encoded by aiiA was unable to inactivate them. Substrate specificity data show that QsbA is an AHL acylase.
  • QsbA und qsbA stellen neue Werkzeuge für die Herabregulierung von AHL-vermittelten, biologischen Aktivitäten dar, wie die Expression von Virulenzgenen und die Biofilm-Differenzierung in pathogenen Bakterien, beides in vitro und in vivo. Das qsbA Gen, welches für das AHL Inaktivierungsenzym (QsbA) codiert, oder ein funktionelles Fragment, eine Untereinheit oder eine im wesentlichen homologe Variante davon können in ein pflanzliches Genom eingeführt werden, um eine genetisch modifizierte Pflanze mit der Fähigkeit herzustellen, einen quorumsensitiven pathogenen Signalstoff zu löschen. Transgenische Pflanzen, die ein Enzym exprimieren, welches AHLs inaktiviert, können eine signifikant gesteigerte Resistenz gegenüber einer Infektion durch bakterielle Pathogene zeigen, selbst wenn die Bakterien in hohen Konzentrationen vorhanden sind.QsbA and qsbA introduce new down-regulation tools AHL mediated biological activities, such as expression of virulence genes and biofilm differentiation into pathogenic Bacteria, both in vitro and in vivo. The qsbA gene, which is responsible for the AHL Inactivation enzyme (QsbA), or a functional fragment, a subunit or a substantially homologous variant thereof can introduced into a plant genome Become a genetically modified plant with the ability to quench a quorum-sensitive pathogenic signaling agent. transgenic Plants expressing an enzyme that inactivates AHLs may have a significantly increased resistance to infection by bacterial Pathogens show even when the bacteria are in high concentrations available.
  • Verfahren zur genetischen Manipulation und Transformation von pflanzlichen Zellen sind im Stand der Technik gut bekannt sowie Verfahren zur Regeneration von fertilen, lebensfähigen, transformierten Pflanzen. Allgemein kann jedes Verfahren zur Klonierung der codierenden Region von qsbA oder eines funktionellen Fragmentes oder einer im wesentlichen homologen Variante davon in einen geeigneten Expressionsvektor verwendet werden. Es ist günstig, die qsbA codierende Region in einen Vektor zu ligieren und anschließend durch Ligation in einen pflanzlichen Transformationsvektor, wobei jedoch Fachleuten auf dem Gebiet auch alternative Verfahren zur Erzielung der gleichen Ergebnisse bewusst sein werden. Jeder geeignete pflanzliche Transformationsvektor kann verwendet werden. Der Vektor enthält das qsbA Gen oder ein funktionelle