DE60219077T2

DE60219077T2 - Ralstonia ahl-acylase gen

Info

Publication number: DE60219077T2
Application number: DE60219077T
Authority: DE
Inventors: Lian Hui Zhang; Yi Han Lin; Jin Ling Xu
Original assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Current assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date: 2002-01-23
Filing date: 2002-01-23
Publication date: 2007-07-12
Anticipated expiration: 2022-01-24
Also published as: US20050155088A1; WO2003068951A1; EP1470221B1; US7098014B2; ATE357512T1; DE60219077D1; AU2002225585A1; EP1470221A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der molekularen Biologie. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein N-Acylhomoserinlacton-Acylasegen von Ralstonia sp. XJ12B.
N-Acylhomoserinlactone (AHLs), auch als Autoinduktoren bekannt, werden in vielen gramnegativen Bakterien in einem großen Umfang als quorumsensitive Signalmoleküle verwendet. Diese Verbindungen regulieren bestimmte Klassen von Targetgenen in Bakterien, wie Virulenzgene oder Biofilm-Differenzierungsgene. Im Allgemeinen sind quorumsensitive Moleküle hoch konserviert und teilen sich eine identische Homoserinlacton-Komponente. Die Länge und die Struktur von ihren Acylseitenketten sind jedoch unterschiedlich. Obwohl die durch AHLs regulierten Targetgene in unterschiedlichen Bakterienspezies variieren, sind die Grundmechanismen der AHL-Biosynthese und der Genregulation innerhalb der verschiedenen bakteriellen Arten konserviert.
Das allgemeine Merkmal der AHL-vermittelten Genregulation ist ihre Abhängigkeit von der Zellpopulation (Quorumsensitivität). Bakterien geben AHLs in ihre Umgebung ab und die extrazelluläre Konzentration der AHLs nimmt mit dem Wachstum der bakteriellen Zellpopulationen zu. Wenn AHL bis zu einer extrazellulären Schwellenkonzentration akkumuliert, wird die Expression von bestimmten Gruppen von Targetgenen in den Bakterien ausgelöst.
Bakterien, welche diese Signalfreisetzung verwenden, detektieren und reagieren auf die Akkumulation der AHL Signalmoleküle mit der Synchronisation der Expression einer besonderen Gruppe von Genen sowie mit der Koordination von zellulären Aktivitäten innerhalb der bakteriellen Zellpopulation. AHLs sind bei der Regulation einer Reihe von biologischen Funktionen beteiligt, einschließlich der Biolumineszenz in Vibrio-Arten (13, 4), dem konjugalen Transfer des Ti-Plasmids in Agrobacterium tumefaciens (31), der Induktion von Virulenzgenen in Burkholderia cepacia, Erwinia carotovora, Erw. chrysanthemi, Erw. stewartii, Pseudomonas aeruginosa und Xenorhabdus nematophilus (3, 6, 12, 17, 19, 22, 23, 24, 26), Regulation der Antibiotikaproduktion in P. aureofaciens und Erw. carotovora (6, 26), Schwarmbeweglichkeit in Serratia liquifaciens (14) und Biofilmbildung in P. fluorescens und P. aeruginosa (1, 8). In vielen anderen Bakterienarten müssen die relevanten biologischen Funktionen, die von AHLs gesteuert werden, noch untersucht werden (2, 5, 11).
Eine Reihe von pflanzlichen, tierischen und menschlichen bakteriellen Pathogenen verwenden quorumsensitive AHL-Signale, um die Expression von pathogenen Genen zu regulieren und bei der Bildung von Biofilmen zu helfen. Deshalb sind die quorumsentitiven AHL-Signalmoleküle eine Gruppe von molekularen Zielen für die genetische und chemische Manipulation, da die Unterbrechung von diesen Signalmechanismen die Fähigkeit von diesen Bakterien, pflanzliche und tierische Gewebe zu infizieren oder Biofilme zu bilden, verhindert oder reduziert.
Das Gen, das ein AHL-Inaktivierungsenzym (AiiA) codiert, wurde aus einem grampositiven Bakterium (Bacillusstamm 240B1) kloniert (9). AiiA (auch bekannt als AHL-Lactonase) inaktiviert die AHL-Aktivität durch die Hydrolyse der Lactonbindung der AHLs (10). Die Expression von AiiA in transformierten Erw. carotovora (ein pathogener Stamm, der bei vielen Pflanzen Wurzelfäule verursacht) reduziert signifikant die Freisetzung von AHL, senkt die extrazellulären pektolytischen Enzymaktivitäten ab und schwächt die Pathogenität auf Kartoffel, Aubergine, Chinakohl, Karotte, Sellerie, Blumenkohl und Tabak (9). Transgenische Pflanzen, welche AHL-Lactonase exprimieren, zeigten eine signifikant gesteigerte Resistenz gegenüber einer Erw. carotovora Infektion und eine verzögerte Entwicklung von Symptomen der Wurzelfäule (10). AHL-Inaktivierungsmechanismen scheinen weit verbreitet zu sein. Es wurde zum Beispiel von einem bakteriellen Isolat von Variovorax paradoxus berichtet, das AHL-Moleküle als seine Energie- und Stickstoffquelle verwendet, was die mögliche Gegenwart von AHL-abbauenden Enzymen (18) anzeigt.
Weitere Verfahren, gegen eine AHL-vermittelte pflanzliche, tierische und menschliche Krankheit und gegen die Pflanzenpathogenvirulenz durch Störung bei der bakteriellen interzellulären Kommunikation einzuwirken, wären sehr wünschenswert.
Demgemäß wird in dieser Studie über die Klonierung und die Charakterisierung eines Gens berichtet, welche für eine AHL-Acylase aus dem bakteriellen Isolat Ralstonia sp. JX12B codiert.
Nach einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr. 1 bereit. Nach einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Nukleinsäure bereit, welche die Nukleotide 1234-3618 von SEQ ID Nr. 1 umfasst.
Nach einer weitern Ausführungsform stellt die Erfindung ein Peptid mit einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 oder mit einer Sequenz, welche die Aminosäuren 36-217 von SEQ ID Nr. 2 umfasst, oder ein Peptid mit einer Sequenz bereit, welche die Aminosäuren 233-794 von SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Peptid mit einer Sequenz bereit, die von einer Nukleinsäure codiert wird, welche aus den Nukleotiden 1234-3618 von SEQ ID Nr. 1 besteht.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Peptid, wie oben beschrieben, bereit, welches AHL inaktiviert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein in vitro Verfahren zur Modulation der AHL Signalaktivität bereit, welches das in Kontaktbringen von AHL mit einem oben beschriebenen Peptid umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine transgenische Pflanze oder ein nicht-menschliches Säugetier bereit, welches eine oben beschriebene Nukleinsäure umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine Nukleinsäure oder ein Peptid, wie oben beschrieben, zur Verwendung in der Therapie und die Verwendung von dieser Nukleinsäure und/oder dieses Peptides für die Herstellung eines Medikamentes zur Kontrolle einer bakteriellen Krankheit in einem Säugetier bereit, wobei die Expression der pathogenen Gene von diesen Bakterien durch AHL-Signale reguliert werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Steuerung einer bakteriellen Krankheit in einer Pflanze bereit, welches die Verabreichung eines Peptides, wie oben beschrieben, zu dieser Pflanze umfasst, wobei die Expression der pathogenen Gene von diesen Bakterien durch AHL-Signale reguliert werden. Alternativ umfasst das Verfahren die Transformation der Pflanze mit einer oben beschriebenen Nukleinsäure.
Die 1 ist eine Fotographie und zeigt Biotestergebnisse der AHL-Inaktivierung für bakterielle Kulturen und bakterielle Proteine aus den dargestellten bakteriellen Klonen. Die 1A zeigt die Ergebnisse eines Biotests mit bakteriellen Kulturen von E. coli DH5α Stämmen 13H10 (Reihe 1), 2B10 (Reihe 2), MUB3 (Reihe 3), MUC6 (Reihe 4), GST-QsbA (Reihe 5) und GST (Reihe 6), welche die Plasmidklone oder Konstrukte pI3H10, p2B10, pMUB3, pMUC6, pGST-QsbA bzw. pGST enthalten. Die 1B zeigt die Ergebnisse des Biotests für die angezeigten bakteriellen Proteine GST-QsbA und GST.
2 ist ein Diagramm und zeigt die Temperatur- und pH-Optimumprofile der AHL-Acylase.
Die 3 ist eine graphische Darstellung und zeigt den Zeitverlauf der OOHL-Inaktivierung durch gereinigte AHL-Acylase.
Ein bakterielles Isolat von Ralstonia sp. XJ12B aus einer Biofilmprobe in einem Wasserbehandlungssystem war zur enzymatischen Inaktivierung von AHLs, bakteriellen quorumsensitiven Molekülen, in einem Biotest unter Verwendung von dem Agrobacterium tumefaciens Stamm Nt1 (traR; tra::lacZ749) als Indikator für die AHL-Aktivität in der Lage. Das Gen, welches für das Protein codierte, welches diese Enzymaktivität für die AHL-Inaktivierung (qsbA) zeigte, wurde aus einem bakteriellen Stamm kloniert, der aus einer Biofilmprobe isoliert wurde. Das Gen codiert ein Peptid mit 794 Aminosäuren.
Bakterielle Kulturen und bakterielle Proteine wurde hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Inaktivierung von AHL unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens Indikatorzellen getestet. A. tumefaciens wurde bei 28°C in einem MM-Medium kultiviert, wie dies beschrieben ist bei Zhang et al. (31). Die Bakterien oder das zu testende Protein werden zunächst mit einem AHL-Substrat getestet, zum Beispiel N-β-Oxooctanoyl-L-homoserinlacton (OOHL), und die Reaktion (Inaktivierung von AHL) wird laufen gelassen. Wenn eine AHL-Inaktivierungsaktivität in der Probe vorhanden ist (das heißt, AHL wird geschnitten und inaktiviert), werden die inaktivierten AHL-Produkte dann die Expression des lacZ Reportergens nicht auslösen können, das unter der Kontrolle eines TraR-abhängigen Promotors steht. Der Stamm A. tumefaciens NT1, der das lacZ Reportersystem enthält, wird somit in Gegenwart des Substrates 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal) nicht blau werden. Siehe Beispiel 2 für die Details dieses Biotests. Jedes AHL kann in dem Test, falls gewünscht, verwendet werden. Selbstverständlich kann jeder geeignete Test für die Spaltung von AHL, einschließlich traditioneller in vitro Enzymtests, verwendet werden, um die AHL-Inaktivierungsaktivität nachzuweisen. Fachleute werden in der Lage sein, Tests zu modifizieren oder zu ersinnen, um die AHL-Inaktivierung nachzuweisen und/oder zu quantifizieren.
Der Escherichia coli Stamm DH5α wurde als Wirt für die DNA-Manipulation verwendet. Ralstonia sp. und E. coli wurden beide in einem LB-Medium (Trypton: 10 g/l, Hefeextrakt: 5 g/l und NaCl: 10 g/l; pH 7,0) bei 37°C kultiviert. Falls notwendig wurden geeignete Antibiotika mit den folgenden Konzentrationen zugesetzt: Ampicillin, 100 μg/ml; Tetracyclin, 10 μg/ml und Kanamycin, 20 μg/ml.
Das Gen, welches für das Protein codiert, das für die nachgewiesene AHL-Inaktivierung verantwortlich ist, wurde unter Verwendung einer Cosmidbibliothek von 1.600 Klonen mit der genomischen DNA von Ralstonia sp. Stamm XJ12B, konstruiert in E. coli, isoliert. Die E. coli Transfektanten wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Inaktivierung von AHL getestet. Ein Klon, p13H10, wurde hinsichtlich der Fähigkeit zur Inaktivierung von AHL gefunden. Die Cosmid-DNA aus p13H10 wurde geschnitten, in einen Klonierungsvektor fusioniert, ligiert und transformiert in E. coli. Die E. coli Klone wurden wiederum hinsichtlich ihrer Aktivität zur AHL-Inaktivierung gestestet. Ein Klon, der ein 4 kb Insert enthielt, hatte die AHL-Inaktivierungsaktivität.
Die Plasmide wurden anschließend für die Sequenzierung gereinigt. Das 4 kb Fragment aus dem Klon p2B10 wurde vollständig gemäß bekannten Verfahren unter Verwendung von ABI Prism dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems) sequenziert. Siehe die folgende Tabelle I. Die Sequenz enthielt einen offenen Leserahmen von 2.385 Nukleotiden, der das AHL-Inaktivierungsgen, qsbA, darstellte und für das vorhergesagte Polypeptid von 794 Aminosäuren (85.373 Daltons) codierte.
Tabelle I. QsbA-Gen (Ralstonia sp.) Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 1).
Der vorausgesagte offene Leserahmendes qsbA-Gens ist in Großbuchstaben dargestellt, wobei das Startcodon und das Stoppcodon in Fett dargestellt sind. Eine mutmaßliche Ribosomenbindungsstelle (AGGAGA) ist unterstrichen.
Die Sequenzanalyse von diesem Peptid zeigte, dass QsbA keine signifikante Homologie mit dem bekannten, quorumsensitiven AHL-Lactonase -Molekülinaktivator zeigt, der von dem aiiA-Gen aus Bacillus sp. 240B1 codiert wird. Die abgeleitete Peptidsequenz war jedoch typisch für die Primärstruktur von Aculeacin A Acylasen (AACs) und Penicillin G Acylasen mit einer Signalpeptid-α Untereinheit-Spacer-β Untereinheit-Organisation (16, 30). Die Ralstonia-Sequenz teilt sich eine substantielle Identität mit den AACs aus Deinococcus radiodurans Stamm R1, Actinoplanes utahensis und einer mutmaßlichen Acylase aus Pseudomonas aeruginosa, die alle die Desacylierung ihrer Substrate katalysieren. Diese AAC-Gene werden als einzelnes Vorläufer-Polypeptid translatiert und dann zu der aktiven Form verarbeitet, die zwei Untereinheiten hat. Aculeacin A ist ein pilzwirksames Antibiotikum des Echinocandin-Typs mit einer langen Fettsäure-Seitenkette. Aculeacin A Acylasen, die aus A. utahensis gereinigt sind, katalysieren die Hydrolyse der Amidbindung an der Palmitoyl-Seitenkette von Aculeacin A (29). Die Primärstruktur des Proteins sowie die Enzymaktivitätsanalyse mit verschiedenen Substraten, die unten diskutiert wird, zeigen somit, dass qsbA für eine AHL-Acylase codiert, welche die Amidverbindung zwischen der Acylseitenkette und der Homoserinlacton-Komponente der AHLs spaltet.
Die vermuteten α und β Untereinheiten von QsbA sind an den Aminosäurepositionen 36-217 bzw. 233-794 von SEQ ID Nr. 2 lokalisiert, wobei dazwischen ein Spacer von 15 Aminosäuren liegt, gemäß der Bestimmung durch vergleichende Anordnung mit den Peptidsequenzen aus D. radiodurans Stamm R1, A. utahensis und P. Aeruginosa. Siehe Tabelle II. Tabelle II. Ausgerichtete Aminosäuresequenzen von QsbA aus Ralstonia sp. XJ12B (SEQ ID Nr. 2), D. radiodurans Stamm R1 Acylase (SEQ ID Nr. 3), A. utahensis Acylase (SEQ ID Nr. 4) und P. aeruginosa Acylase (SEQ ID Nr. 5).

* = identische Reste; : = konservierte Substitutionen; . = semi-konservierte Substitutionen;
| = post-translationale Verarbeitungsstellen für Signalpeptid und Untereineinheiten; - = Spacer.

Die codierende Region des qsbA-Gens wurde mittels PCR amplifiziert. Die amplifizierten PCR Produkte wurden geschnitten, in die codierende Sequenz des Glutathion S Transferase (GST) Gens gemäß dem Leseraster angeordnet und in E. coli exprimiert. Die Proteinextrakte von den rekombinanten E. coli Zellen wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Inaktivierung von AHL getestet. Proteine aus E. coli, die GST alleine exprimierten, dienten als Kontrolle. Die Ergebnisse zeigen, dass das GST-QsbA Fusionsprotein die AHL-Aktivität effektiv eliminierte. Siehe 1B.
Die Substratspezifität von QsbA wurde durch Test des gesamten löslichen Proteins, welches aus rekombinanten E. coli (pGST-QsbA) extrahiert wurde, auf Inaktivierung von AHLs unter Verwendung von Subtraten mit Acylketten von unterschiedlichen Längen bestimmt. QsbA war fähig zur vollständigen Inaktivierung von 3-Oxogruppe-Acyl-HSLs mit Acylketten von 8, 10 und 12 Kohlenstoffatomen. QsbA inaktivierte auch stark Methylengruppe-Acyl-HSLs mit Acylketten von 8 und 10 Kohlenstoffatomen. QsbA inaktivierte auch die Butyl- und Hexylester von N-β-Octanoyl-L-homoserin, während die AHL-Lactonase, die durch aiiA codiert wurde, nicht zu deren Inaktivierung in der Lage war. Die Daten der Substratspezifität zeigen, dass QsbA eine AHL-Acylase ist.
QsbA und qsbA stellen neue Werkzeuge für die Herabregulierung von AHL-vermittelten, biologischen Aktivitäten dar, wie die Expression von Virulenzgenen und die Biofilm-Differenzierung in pathogenen Bakterien, beides in vitro und in vivo. Das qsbA Gen, welches für das AHL Inaktivierungsenzym (QsbA) codiert, oder ein funktionelles Fragment, eine Untereinheit oder eine im wesentlichen homologe Variante davon können in ein pflanzliches Genom eingeführt werden, um eine genetisch modifizierte Pflanze mit der Fähigkeit herzustellen, einen quorumsensitiven pathogenen Signalstoff zu löschen. Transgenische Pflanzen, die ein Enzym exprimieren, welches AHLs inaktiviert, können eine signifikant gesteigerte Resistenz gegenüber einer Infektion durch bakterielle Pathogene zeigen, selbst wenn die Bakterien in hohen Konzentrationen vorhanden sind.
Verfahren zur genetischen Manipulation und Transformation von pflanzlichen Zellen sind im Stand der Technik gut bekannt sowie Verfahren zur Regeneration von fertilen, lebensfähigen, transformierten Pflanzen. Allgemein kann jedes Verfahren zur Klonierung der codierenden Region von qsbA oder eines funktionellen Fragmentes oder einer im wesentlichen homologen Variante davon in einen geeigneten Expressionsvektor verwendet werden. Es ist günstig, die qsbA codierende Region in einen Vektor zu ligieren und anschließend durch Ligation in einen pflanzlichen Transformationsvektor, wobei jedoch Fachleuten auf dem Gebiet auch alternative Verfahren zur Erzielung der gleichen Ergebnisse bewusst sein werden. Jeder geeignete pflanzliche Transformationsvektor kann verwendet werden. Der Vektor enthält das qsbA Gen oder ein funktionelles Fragment, eine Untereinheit oder eine im wesentlichen homologe Variante davon solange wie die Expression des Gens zu einem QsbA Protein oder einem funktionellen Fragment, einer Untereinheit oder einer Variante davon führt, die AHL inaktiviert.
Ein funktioneller Promotor steuert vorzugsweise die Expression. Viele geeignete Promotoren sind im Stand der Technik bekannt, so dass ein geeigneter Promotor von einem Fachmann in Abhängigkeit von dem verwendeten Expressionssystem einfach ausgewählt werden kann. Solch eine Auswahl eines geeigneten Promotors, um das gewünschte Niveau der translationalen Expression zu erzielen, wird als Routine im Stand der Technik angesehen. Es ist zum Beispiel vorteilhaft, die qsbA Expression durch die Modifikation der Codonverwendung und durch Kopplung an einen starken Promotor, wie der doppelte 35S Promotor, zu optimieren.
Ein geeignetes Markergen, wie die Kanamycinresistenz, das grüne Fluoreszenzprotein oder jeder andere geeignete Marker, wird vorteilhaft verwendet. Variationen der allgemein verwendeten und gut bekannten Verfahren für die Transformation von Pflanzen mit einem Gen, sind für den Fachmann auf dem Gebiet der genetischen Manipulation von Pflanzen gut bekannt. Expressionskonstrukte können eine Signalsequenz enthalten, um die Sekretion des exprimierten QsbA Proteins zu steuern, oder, falls gewünscht, kann eine solche Sequenz fehlen. Die pflanzlichen Transformationsvektoren, die das qsbA Gen und ein Markergen enthalten, können verwendet werden, um pflanzliche Zellen unter Verwendung der Agrobacterium-vermittelten Transformation zu transformieren. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation wird geeignet verwendet, um Pflanzen mit dem qsbA Gen zu transformieren, wobei jedoch in Abhängigkeit von der zu transformierenden Pflanze auch andere geeignete Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden können. Zum Beispiel werden bestimmte monokotyle Pflanzen effizienter transformiert durch die Anwendung von anderen Verfahren, wie die Beschießung mit Mikroprojektilen, die Vakuumfiltration oder jedem anderen Verfahren, das im Stand der Technik bekannt ist, um DNA Plasmide oder Fragmente in das pflanzliche Genom einzuführen und zu integrieren. Fachleute auf dem Gebiet kennen Mittel, um Gymnospermen, Monokotyle und Dikotyle zu transformieren. Alle diese im Stand der Technik bekannten Verfahren werden für die Verwendung bei der Erfindung beachtet.
Nach Auswahl der Transformanten, welche das qsbA Gen tragen, werden transgenische Pflanzen gemäß bekannten Verfahren regeneriert. Auf ein Markergen selektierte Pflanzen, zum Beispiel Kanamycinresistenz, können getestet werden, zum Beispiel durch PCR- und DNA-Gelblot, um zu bestimmen, wie viele Kopien des qsbA Gens in dem pflanzlichen Gewebe vorhanden sind. Jedes im Stand der Technik bekannte und geeignete Verfahren wird dabei beachtet zur Verwendung mit dem Gen gemäß der Erfindung. Die QsbA Enzymaktivität kann in transgenischen Pflanzen, die mit dem qsbA Gen transformiert sind, durch das Biotestverfahren nachgewiesen werden, welches im Beispiel 2 beschrieben ist, oder durch jedes geeignete Verfahren.
Mit „funktionelles Fragment, Untereinheit oder eine im wesentlichen homologe Variante davon" ist bei Bezug auf eine qsbA Nukleotidsequenz jedes Fragment, Untereinheit, Variante oder homologe Sequenz von qsbA gemeint (Nukleotide 1234-3618 von SEQ ID Nr. 1), die für ein Protein oder eine Peptidsequenz codiert, welche zur Inaktivierung von N-Acylhomoserinlactonen in der Lage ist. „Im Wesentlichen homologe Varianten" einer Nukleotidsequenz sind im Allgemeinen solche, deren Komplement mit qsbA unter stringenten oder hochstringenten Bedingungen hybridisiert, zum Beispiel bei Temperaturen von etwa 30°C bis etwa 50°C, zum Beispiel 30°C, 35°C, 37°C, 40°C, 45°C oder 50°C, und/oder bei Salzkonzentrationen von etwa 200 mM bis etwa 1.000 mM NaCl oder die äquivalente ionische Stärke, zum Beispiel 200 mM, 250 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM, 750 mM oder 1.000 mM. Die stringenten Bedingungen sind abhängig von der Länge der Nukleinsäure und der Basenzusammensetzung der Nukleinsäure und können durch im Stand der Technik bekannte Techniken bestimmt werden. Fachleute auf dem Gebiet sind familiär mit diesen Bedingungen und Bereichen, die nützlich sind. Im Allgemeinen ist eine im Wesentlichen homologe Nukleotidsequenz wenigstens zu etwa 75 % homolog zu SEQ ID Nr. 1 oder einem Fragment oder einer Untereinheit davon, vorzugsweise wenigstens zu etwa 85 % homolog und am meisten bevorzugt zu 90 %, 95 % oder 99 % homolog oder mehr.
Die Fachleute sind vertraut mit der Degeneration des genetischen Codes und sind sich somit bewusst, dass Nukleinsäuresequenzen weniger als 100 % homolog sein können und dennoch für das gleiche Protein oder die gleiche Peptidsequenz codieren können. Solche Variationen in jeder der Sequenzen, Fragmente, Untereinheiten oder der im wesentlichen homologen Varianten werden auch als Teil von dieser Erfindung erachtet.
Peptid- und Proteinsequenzen, die von dieser Erfindung umfasst sind, umfassen alle Sequenzen, die durch das qsbA Gen oder einem Fragment, einer Untereinheit oder einer im wesentlichen homologen Variante davon codiert werden. Solche Sequenzen umfassen somit jedes funktionelle Protein oder Peptid, welches die Fähigkeit zur Inaktivierung von AHL zurückbehält, einschließlich Protein- und Peptidfragmente des vollständigen QsbA Proteins, wie zum Beispiel die Sequenzen der Aminosäuren 36-217 und 233-794, die von SEQ ID Nr. 1 und im wesentlichen homologen Varianten davon codiert werden. Eine im wesentlichen homologe Variante des QsbA Proteins umfasst Sequenzen, die zu wenigstens etwa 50 % homolog sind, vorzugsweise wenigstens etwa 60 % homolog und am meisten bevorzugt 70 %, 80 % oder 90 % homolog oder mehr sind. Somit ist ein Protein, das eine substantiell homologe Variante von QsbA darstellt, zu etwa 50 % bis etwa 99,9 % homolog zu QsbA. Konservative und nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen werden beide beachtet, sowie Sequenzen, die nicht-traditionelle oder modifizierte Aminosäuren, wie solche, die im Stand der Technik bekannt sind, enthalten.
Der Ausdruck „Fragment" soll jeden Nukleotidabschnitt von SEQ ID Nr. 1 oder jede Protein/Peptidsequenz von SEQ ID Nr. 2 anzeigen, das größer ist als etwa 300 Nukleotidbasen oder etwa 100 Aminosäuren und bis zu einem Nukleotid oder einer Aminosäure weniger als die gesamte Sequenz. Der Ausdruck „Untereinheit" soll jede funktionelle Einheit des QsbA Proteins umfassen, wie zum Beispiel die Aminosäuren 36-217 oder 233-794 von SEQ ID Nr. 2.
Eine Protein- oder Peptidsequenz, die hinsichtlich der Inaktivierung von N-Acylhomoserinlactonen berücksichtigt wird, ist jede Sequenz, die zur Inaktivierung von wenigstens 55 pMolen N-Acylhomoserinlacton (OOHL) pro μg Protein pro Minute bei 30°C in der Lage ist.
Es wurde zuvor gezeigt, dass die Löschung der bakteriellen Quorumsensitivität durch die Inaktivierung von N-Acylhomoserinlacton mit AHL-Lactonase eine bakterielle Infektion stoppt (9, 10). Das hier beschriebene Gen und Protein, welches wahrscheinlich eine AHL-Acylase ist, stellt ein neues und wirksames Mittel zur Inaktivierung von AHL Signalen dar und kontrolliert somit eine bakterielle Infektion. In ähnlicher Weise zielten das hier beschriebene Gen und Protein auf die quorumsensitiven AHL Signale, welche die Expression von pathogenen Genen von vielen bakteriellen Pathogenen mit einer Schwellenkonzentration regulieren. Dieses Werkzeug ist auf alle pflanzlichen, tierischen und menschlichen Krankheiten anwendbar, wo die Expression der pathogenen Gene der bakteriellen Pathogene durch AHL Signale aktiviert werden, wie zum Beispiel die pflanzliche Pathogene Erw. carotovora, Erw. chrysanthemi, Erw. stewartii; die menschlichen Pathogene P. aeruginosa, B. cepacia sowie die tierischen Pathogene X. nematophilus, P. fluorescens (1, 3, 6, 12, 17, 19, 22, 23, 24, 26).
Literaturverzeichnis

1. Allison, et al., "Extracellular products as mediators of the formation and detachment of Pseudomonas fluorescens biofilms," FEMS Microbiol. Lett. 167:179–184, 1998.
2. Bassler, et al., "Cross-species induction of luminescence in the quorum-sensing bacterium Vibrio harveyi," J. Bacteriol. 179:4043–4045, 1997.
3. Beck von Badman, and Ferrand, "Capsular polysaccharide biosynthesis and pathogenicity in Erwinia stewartii require induction by an N-acyl homoserine lactone autoinducer," J. Bacteriol. 177:5000–5008, 1995.
4. Cao and Meighen, "Purification and structural identification of an autoinducer for the luminescence system of Vibrio harveyi," J. Biol. Chem. 264:21670–21676, 1989.
5. Cha et al., "Production of acyl-homoserine lactone quorum-sensing signals by gram-negative plant associated bacteria," Mol. Plant Microbe Interact. 11:1119–1129, 1998.
6. Costa and Loper, "EcbI and EcbR: homologs of LuxI and LuxR affecting antibiotic and exoenzyme production by Erwinia carotovora subsp. betavasculorum," Can. J. Microbiol. 43:1164–1171, 1997.
7. Daumy et al., "Role of protein subunits in Proteus retigeri penicillin G acylase," J. Bacteriol. 163:1279–1281, 1985.
8. Davies et al., "The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm," Science 280:295–298, 1998.
9. Dong et al., "AiiA, an enzyme that inactivates the acyl homoserine lactone quorum-sening signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3526–3531, 2000.
10. Dong et al., "Quenching quorum sensing-dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase," Nature 411:813–817, 2001.
11. Dumenyo et al., "Genetic and physiological evidence for the production of N-acyl homoserine lactones by Pseudomonas syringae pv. syringae and other fluorescent plant pathogenic Pseudomonas species," Eur. J. Plant Pathol. 104:569–582, 1998.
12. Dunphy et al., "A homoserine lactone autoinducer regulates virulence of an insect-pathogenic bacterium, Xenorhabdus nematophilus (Enterobacteriaceae)," J. Bacteriol. 179:5288–5291, 1997.
13. Eberhard et al., Structural identification of autoinducer of Photobacterium fischeri luciferase," Biochemistry 20:2444–2449, 1981.
14. Eberl et al., "Involvement of N-acyl-L-homoserine lactone autoinducers in controlling the multicellular behaviour of Serratia liquefaciens," Mol. Microbiol. 20:127–136, 1996.
15. Fuqua and Winans, "Conserved cis-acting promoter elements are required for density-dependent transcription of Agrobacterium tumefaciens conjugal transfer genes," J. Bacteriol. 178:435–440, 1996.
16. Inokoshi et al., "Cloning and sequencing of the aculeacin A acylase-encoding gene from Actinoplanes utahensis and expression in Streptomyces lividans, " Gene 119:29–35, 1992.
17. Jones et al., "The Lux autoinducer regulates the production of exoenzyme virulence determination in Erwinia carotovora and Pseudomonas aeruginosa," EMBO J. 12:2477–2482, 1993.
18. Leadbetter and Greenberg, "Metabolism of acyl-homoserine lactone quorum sensing signals by Variovorax paradoxus," J. Bacteriol. 182:6921–6926, 2000.
19. Lewenza et al., "Quorum sensing in Burkholderia cepacia: identification of the LuxRI homologs CepRI," J. Bacteriol. 181:748–756, 1999.
20. Matsuda and Komatsu, "Molecular cloning and structure of the gene for 7β-(4-carboxybutanamido)cephalosporadic acid acylase from a Pseudomonas strain," J. Bacteriol. 163:1222–1228, 1985.
21. Matsuda et al., "Nucleotide sequence of the genes for two distinct cephalosporin acylases from a Pseudomonas strain," J. Bacteriol. 169:5821–5826, 1987.
22. Nasser et al., "Characterization of the Erwinia chrysanthemi expl-expR locus directing the synthesis of two N-acyl-homoserine lactone signal molecules," Mol. Microbiol. 29:1391–1405, 1998.
23. Passador et al., "Expression of Pseudomonas aeruginosa virulence genes requires cell-to-cell communication," Science 260:1127–1130, 1993.
24. Pearson et al., "Structure of the autoinducer required for expression of Pseudomonas aeruginosa virulence genes," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:197–201, 1994
25. Piper et al., "Conjugation factor of Agrobacterium tumefaciens regulates Ti plasmid transfer by autoinduction," Nature 362:448–450, 1993.
26. Pirhonen et al., "A small diffusible signal molecule is responsible for the global control of virulence and exoenzyme production in the plant pathogen Erwinia carotovora," EMBO J. 12:2467–2476, 1993.
27. Schumacher et al., "Penicillin acylase from E. coli: unique gene-protein relation," Nucleic Acids Res. 14:5713–5727, 1986.
28. Staskawicz et al., "Molecular characterization of cloned avirulence genes from race 0 and race 1 of Pseudomonas syringae pv. glycinea," J. Bacteriol. 169:5789–5794, 1987.
29. Takeshima et al., "A deacylation enzyme for aculeacin A, a neutral lipopeptide antibiotic, from Actinoplanes utahensis: purification and characterization," J. Biochem. 105:606–610, 1989.
30. Verhaert et al., "Molecular cloning and analysis of the gene encoding the thermostable penicillin G acylase from Alcaligenes faecalis," Appl. Env. Microbiol. 63:3412–3418, 1997.
31. Zhang et al., "Agrobacterium conjugation and gene regulation by N-acyl-L-homoserine lactones," Nature 362:446–447, 1993.

Die folgenden Beispiele sollen die hier beschriebene Erfindung veranschaulichen, wobei sie aber nicht als Einschränkungen der beigefügten Ansprüche ausgelegt werden sollen.
Beispiele
Beispiel 1. Bakterielle Isolierung.
Eine bakterielle Biofilm probe wurde aus einem Wasserbehandlungssystem gesammelt und getestet, um bakterielle Stämme mit AHL-Inaktivierung zu isolieren. Die bakterielle Mischung wurde in sterilisiertem Wasser durch Schütteln für 1 Stunde suspendiert, bevor sie auf YEB-Medium-Platten verteilt wurde (Hefeextrakt: 5 g/l; Caseinhydrolysat: 10 g/l; NaCl: 5 g/l; Saccharose: 5 g/l; MgSO₄ × 7H₂O: 0,5 g/l und Agar: 15 g/l). Einzelne Kolonien wurden wieder auf neue Platten ausgestrichen, um die Reinheit der Isolate sicherzustellen. Die bakteriellen Isolate wurden in LB-Medium (Trypton: 10 g/l; Hefeextrakt: 5 g/l und NaCl: 10 g/l; pH 7,0) in 1,5 ml Eppendorf^TM-Röhrchen oder in Platten mit 96 Vertiefungen bei 28°C unter Schütteln über Nacht kultiviert und hinsichtlich einer AHL-Inaktivierungsaktivität getestet.
Beispiel 2. AHL-Inaktivierungsbiotest.
Die zu testende, bakterielle Kultur wurde mit einem gleichen Volumen von frischem Medium gemischt, welches 20 μM N-β-Oxooctanoyl-L-homoserinlacton (OOHL) oder ein anderes AHL, wenn dies angegeben ist, enthielt, um eine Reaktionsmischung herzustellen. Die Reaktionsmischung wurde bei 28°C für 4 bis 5 Stunden inkubiert und anschließend unter UV-Licht für 30 Minuten sterilisiert. Es wurden Platten mit 20 ml MM Agar-Medium hergestellt (K₂HPO₄: 10,5 g/l; KH₂PO₄: 4,5 g/l; MgSO₄ × 7H₂O: 0,2 g/l; FeSO₄: 4,5 mg/l; CaCl₂: 10 mg/l; MnCl₂: 2 mg/l; (NH₄)₂SO₄: 2,0 g/l; Mannit: 2,0 g/l; pH 7,0), ergänzt mit 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal, 40 μg/ml). Das verfestigte Medium wurde noch in der Platte in getrennte Scheiben (etwa 1 cm Breite) geschnitten. Siehe die 1. Fünf Mikroliter sterilisierte Reaktionsmischung wurden von oben auf den MM-Agarstreifen aufgetragen und dann wurden 0,7 μl einer Zellsuspension von AHL-Indikatorzellen (Agrobacterium tumefaciens Stamm NT1 (traR; tra::lacZ749) (25), mit einer optischen Dichte von 0,4 bei 600 nm) mit zunehmend größeren Abständen von den beladenen Proben aufgetragen. Die Platten wurden bei 28°C für 24 Stunden inkubiert. Ein positives Ergebnis für eine AHL-Inaktivierung wird durch die Abwesenheit von blauen Kolonien auf der Scheibe dargestellt. Ein negatives Ergebnis hinsichtlich einer AHL-Inaktivierung wird durch die Gegenwart von blauen Kolonien auf der Scheibe gezeigt. Für den Proteintest auf Enzymaktivität wurde das lösliche, bakterielle Gesamtprotein mit 20 μM von OOHL (oder einem anderen AHL) bei 37°C für 1 Stunde als Reaktionsmischung inkubiert.
Beispiel 3. Identifizierung und Klonierung des qsbA-Gens.
Zwei bakterielle Isolate von der Biofilmprobe mit unterschiedlichen Phänotypen, XJ12B und XJ12A, wurden gefunden, welche die Fähigkeit zur Inaktivierung von AHL besaßen, wobei XJ12B die stärkere Enzymaktivität zeigte. Das XJ12B-Isolat wurde kultiviert, zentrifugiert und beschallt.
Die stärkste Enzymaktivität war eher mit der Fraktion der Zellreste als mit den löslichen Protein- und Überstandfraktionen assoziiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die AHL-Inaktivierungsaktivität Membran-assoziiert ist. Die Sequenzierung von 16S rRNA wurde durchgeführt, um die XJ12A- und XJ12B-Isolate zu identifizieren. Die 16S rRNA Sequenzen von diesen Isolaten zeigten eine 97 % bzw. 96 % Identität mit den Sequenzen von Ralstonia eutropha.
Um das Gen, welches für die AHL-Inaktivierung codiert, zu identifizieren, wurde eine Cosmidbibliothek von 1.600 Klonen in E. coli mit der genomischen DNA von Ralstonia sp. Stamm XJ12B hergestellt. Die genomische DNA von dem isolierten Ralstonia sp. Stamm XJ12B wurde mit Sau3A teilweise verdaut. Die erzielten DNA-Fragmente wurden mit der dephosphorylierten BamH1 Seite des Cosmidvektors pLAFR3 (28) ligiert. Die ligierte DNA wurde mit Gigapack IIIXL Packaging Extract (Stratagene) verpackt und in E. coli DH5alpha transfiziert. Diese E. coli Transfektanten wurden auf AHL-Inaktivierungsenergie gemäß den Verfahren, die im Beispiel 2 beschrieben sind, und unter Verwendung von OOHL als Substrat überprüft. Nur ein einzelner Klon (p13H10) wurde mit einer AHL-Inaktivierungsaktivität identifiziert (siehe 1A, Scheibe 1). Um das Gen, welches die nachgewiesene Aktivität codiert, subklonieren zu können, wurde die Cosmid-DNA von dem positiven Klon p13H10 teilweise mit Sau3A verdaut und in den mit BamH1 geschnittenen Klonierungsvektor pGEM-3Zf (+) eingebracht. Die Plasmide wurde ligiert und in E. coli transformiert und die E. coli wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Inaktivierung von AHL, wie im Beispiel 2 beschrieben, getestet. Der Klon p2B10, der ein 4 kb Insert enthielt, hatte die AHL-Inaktivierungsaktivität (siehe 1A, Scheibe 2). Das TGS^TM Template Generation System F-700 (Finnzymes OY) wurde verwendet, um die p2B10 Plasmid-DNA durch den zufälligen Einbau des artifiziellen Mu-Transposons zu mutieren gemäß den Anweisungen des Herstellers. Der Plasmidklon p2B10, der das 4 kb Insert mit dem qsbA-Gen enthielt, wurde als Matrize verwendet. 15 mutierte Klone wurden hergestellt und keiner war in der Lage, AHL zu inaktivieren. Die bakteriellen Kulturen von E. coli DH5α, die pMUG3 und pMUC6 enthielten, sind als Beispiele in der 1A, Scheiben 3 und 4, gezeigt. Die Plasmide wurden anschließend für die Sequenzierung gereinigt, wobei die Primer, die dem Kit beilagen, verwendet wurden.
Beispiel 4. Sequenzierung und Sequenzanalyse des qsbA-Gens.
Die Sequenzierung wurde gemäß bekannten Verfahren unter Verwendung von des ABI Prism dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Eimer Applied Biosystems) durchgeführt. Das 4 kb Fragment von dem Klon p2B10 wurde vollständig sequenziert und ist in der Tabelle I dargestellt. Die Sequenz enthält einen offenen Leserahmen von 2.385 Nukleotiden mit einem ATG Startcodon und einem TGA Stoppcodon (SEQ ID Nr. 1, Nukleotide 1259-3643). Basierend auf der MU-Transposonmutagenesedaten, die im Beispiel 3 beschrieben sind, ist dieser offene Leserahmen die codierende Region des AHL-Inaktivierungsgens, welches als qsbA bezeichnet wurde. Eine mutmaßliche Ribosomenbindungsstelle (AGGAGA) ist sechs Basenpaare stromauf von dem ersten ATG Startcodon (in der Tabelle I unterstrichen) angeordnet.
Die abgeleitete Peptidsequenz zeigt die typische primäre Polypeptidstruktur von Aculeacin A Acylasen (AACs) und Penicillin G Acylasen mit einer Signalpeptid-α Untereinheit-Spacer-β Untereinheit-Organisation (16, 30). Es gibt vier zusätzliche, mögliche Startcodons, die bei 3, 36, 189 und 384 stromabwärts von dem ersten ATG angeordnet sind. Der längste offene Leserahmen codiert für 794 Aminosäuren mit einem vermuteten Molekulargewicht von 85.373 Daltons. Das abgeleitete Peptid hat 78 stark basische und stark saure Aminosäurereste und einen angenommenen isoelektrischen Punkt von 7,48. Die ersten 20 Aminosäurereste des angenommen offenen Leserahmens scheinen ein Signalpeptid zu sein.
Die von dem offenen Leserahmen abgeleitete Peptidsequenz von qsbA ist zu 40–52 % identisch mit den AACs von Deinococcus radiodurans Stamm R1, Actinoplanes utahensis und einer mutmaßlichen Acylase aus Pseudomonas aeruginosa. Die AACs' katalysieren die Deacylierung ihrer Substrate. Diese AAC-Gene werden als ein einzelnes Vorläufer-Polypeptid translatiert und dann in die aktive Form von zwei Untereinheiten verarbeitet. Durch Ausrichtung mit den Peptidsequenzen von D. radiodurans Stamm R1, A. utahensis und P. aeruginosa, Tabelle II, wurden die angenommenen α- und β-Untereinheiten an den Aminopositionen 36-217 und 233-794 mit einem dazwischen liegenden 15 Aminosäure-Spacer lokalisiert. QsbA teilt sich weniger als 28 % Homologie mit der Penicillin G Acylase (20) und mit der Cephalosporin-Acylase (21). Siehe Tabelle II. Die Ausrichtung der Aminosäuresequenz in der Tabelle II wurde mit dem Clustal W Programm analysiert, das verfügbar ist von der European Bioinformatics Institute website (http://www.ebi.ac.uk).
Beispiel 5. Expression des QsbA-Gens.
Die codierende Region des qsbA-Gens wurde mittels PCR amplifiziert unter Verwendung eines Vorwärts-Primer
5'-CGTGGATCCATGATGCAGGATTCGCCGCTGCGC-3' (SEQ ID Nr. 6) und eines Rückwärts-Primer 5'-CGCGAATTCACCGGCAGCCCTCATGCGACAAC-3' (SEQ ID Nr. 7), welche die BamH1 und EcoR1 Restriktionsstellen enthalten. Die amplifizierten PCR Produkte wurden unter Verwendung der obigen Restriktionsenzyme geschnitten und im Leserahmen an die codierende Sequenz des Glutathion S Transferase (GST) Gens unter der Kontrolle des durch Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induzierbaren lac Promotors im Vektor pGEX-2T (Amersham Pharmacia) fusioniert, um das Konstrukt pGST-QsbA zu erzeugen. pGST-QsbA wurde in E. coli transformiert und exprimiert.
Das lösliche Gesamtprotein wurde aus den rekombinanten E. coli Zellen, welche das GST-QsbA codierende Fusionskonstrukt aufwies, gemäß im Stand der Technik bekannten Verfahren und basierend auf den Verfahren, die in Dong et al. (9) beschrieben sind, extrahiert und hinsichtlich einer AHL-Inaktivierung getestet. Das lösliche Gesamtprotein von E. coli, das nur den GST-Vektor enthielt, wurde als Kontrolle verwendet. Für den Biotest wurden 50 μl der löslichen Proteinpräparation (20 μg/μl) zu dem gleichen Volumen von 40 μM AHL, zum Beispiel OOHL, zugegeben. Nach einer Inkubation von 1 Stunde bei 37°C wurde die Reaktionsmischung getestet, wie dies im Beispiel 2 beschrieben ist. Repräsentative Daten, die in der 1B, Scheibe 1, dargestellt sind, zeigen, dass das lösliche GST-QsbA Fusionsprotein die OOHL-Aktivität effektiv eliminiert.
Beispiel 6. Charakterisierung des Substratspektrums des GST-QsbA Fusionsproteins, exprimiert in E. coli.
Um das Substratspektrum von QsbA zu bestimmen, wurde das lösliche Gesamtprotein von dem rekombinanten E. coli (pGST-QsbA) hinsichtlich der Inaktivierung von AHLs mit Acylketten von unterschiedlichen Längen gemäß den Verfahren des Beispiels 2 getestet. Die folgenden AHLs wurden gemäß bekannten Verfahren synthetisiert, wie dies beschrieben ist von Zhang et al. (31): (1) N-Octanoyl-L-homoserinlacton (C8HSL, OOHL); (2) N-Decanoyl-L-homoserinlacton (C1DHSL, DHL); (3) N-β-Oxohexanoyl-L-homoserinlacton (3-oxo-C6HSL, OHHL); (4) N-β-Oxohexanoyl-L-homoserinlacton (3-oxo-C12HSL, OdDHL); (5) N-β-Oxohexanoyl-L-homoserinlacton (3-oxo-C8HSL, OOHL). Die Butyl- und Hexylester von N-β-Oxohexanoyl-L-homoserin wurden durch Veresterung von N-β-Oxohexanoyl-L-homoserinlacton mit 1-Butanol bzw. 1-Hexanol in Gegenwart einer geringen Menge von Dowex 50H+ Harz (Aldrich) hergestellt. Die Reaktion wurde bei 60°C für 2 Stunden durchgeführt und die Produkte wurden durch Kieselgelsäulenchromatographie gereinigt.
QsbA inaktivierte vollständig OOHL, N-β-Oxodecanoyl-L-homoserin (ODHL) und N-β-Oxododecanoyl-L-homoserin (OdDHL), die Acylketten von 8, 10 und 12 Kohlenstoffen aufweisen, bei den getesteten Konzentrationen (Daten nicht gezeigt). QsbA inaktivierte stark N-β-Octanoyl-L-homoserin (OHL) und N-β-Decanoyl-L-homoserin (DHL), die 8 bzw. 10 Kohlenstoffatome aufweisen (Daten nicht gezeigt). Unter den gleichen Reaktionsbedingungen hatte QsbA je doch eine geringere Inaktivierungsaktivität für N-β-Oxohexanoyl-L-homoserin (OHHL), das eine Acylkette von 6 Kohlenstoffatomen aufweist (Daten nicht gezeigt). Der lösliche Gesamtproteinextrakt aus der Kontrolle E. coli (pGST) zeigte keine Aktivität gegen die AHLs (Daten nicht gezeigt).
QsbA inaktivierte auch vollständig die Butyl- und Hexylester von N-β-Octanoyl-L-homoserin (Daten nicht gezeigt). Diese zwei Ester von N-β-Octanoyl-L-homoserin zeigten eine vergleichbare Induktionsaktivität mit OOHL, wenn sie mit dem AHL Reporterstamm A. tumefaciens NT1 (traR; tra::lacZ749) (Daten nicht gezeigt) getestet wurden. AHL-Lactonase (codiert durch aiiA) inaktivierte diese Substrate nicht. Diese Daten der Substratspezifität sind konsistent mit der Identifizierung von QsbA als eine AHL-Acylase.
Beispiel 7. Reinigung der durch das qsbA Gen codierten AHL-Acylase.
Das GST-[AHL-Acylase] Fusionsprotein wurde unter Verwendung einer Glutathion-Sepharose-4B Affinitätssäule gemäß den Anweisungen des Herstellers (Pharmacia) gereinigt. Die AHL-Acylase wurde durch Verdau mit Thrombin (Sigma) geschnitten. Die Proteinkonzentration wurde durch Messung bei OD₂₈₀ bestimmt.
Die gereinigte AHL-Acylase wurde mit OOHL für 20 Minuten inkubiert und die relative Enzymaktivität wurde durch Bestimmung des restlichen OOHL in der Reaktionsmischung gemessen, die 8 μM OOHL und etwa 0,6 μg AHL-Acylase in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 ml 1 × PBS Puffer enthielt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 1 % SDS gestoppt, bevor sie auf die Testplatten geladen wurden. Die Bestimmung der OOHL-Aktivität wurde in vierfacher Ausfertigung durchgeführt. AHL-Acylase baute OOHL in einem Temperaturbereich von 22–42°C bei einem pH von 7,0 ab. Siehe 2. Die optimale Temperatur für die Enzymaktivität wurde bei etwa 28°C gefunden. Eine Reaktionstemperatur von mehr als 42°C führte zu einem starken Abfall der Enzymaktivität. Der optimale pH für die Enzymaktivität wurde auch bestimmt. Die AHL-Acylasen haben einen relativ engen, optimalen pH-Bereich von pH 6,0 bis 7,5. Siehe 2. Der Zeitverlauf der OOHL-Inaktivierung durch die gereinigte AHL-Acylase wurde bei 30°C bestimmt. Siehe 3. Nach 10 Minuten waren mehr als 82 % OOHL abgebaut. Die Reaktionsrate wurde zu etwa 55 pMole pro μg AHL-Acylase pro Minute bestimmt. Sequenzliste

Claims

Nukleinsäure gemäß SEQ ID Nr. 1.
Nukleinsäure, welche die Nukleotide 1234-3618 von SEQ ID Nr. 1 umfasst.
Peptid mit einer Sequenz, welche von einer Nukleinsäure codiert wird, die aus den Nukleotiden 1234-3618 von SEQ ID Nr. 1 besteht.
Peptid mit einer Sequenz gemäß SEQ ID Nr. 2.
Peptid mit einer Sequenz, welche die Aminosäuren 36-217 von SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Peptid mit einer Sequenz, welche die Aminosäuren 233-794 von SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Peptid nach Anspruch 4, welches AHL inaktiviert.
In vitro Verfahren zur Modulation der AHL-Signalaktivität, welches das in Kontaktbringen von AHL mit einem Peptid nach einem der Ansprüche 3 bis 7 umfasst.
Transgenische Pflanze, die eine Nukleinsäure nach Anspruch 2 umfasst.
Transgenisches, nicht-menschliches Tier, welches eine Nukleinsäure nach Anspruch 2 umfasst.
Verfahren zur Kontrolle einer bakteriellen Krankheit in einer Pflanze, welches die Verabreichung eines Peptides nach einem der Ansprüche 3 bis 7 zu dieser Pflanze umfasst, wobei die Expression der pathogenen Gene der Bakterien durch die AHL-Signale reguliert werden.
Verfahren zur Kontrolle einer bakteriellen Krankheit in einer Pflanze, welches die Transformation der Pflanze mit einer Nukleinsäure nach Anspruch 2 umfasst.
Verfahren zur Kontrolle einer bakteriellen Krankheit in einer Pflanze unter Verwendung eines Bakteriums, das mit einer Nukleinsäure nach Anspruch 2 transformiert ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 2 oder Peptid nach einem der Ansprüche 3 bis 7 zur Verwendung in der Therapie.
Verwendung einer Nukleinsäure nach Anspruch 2 und seines Peptidproduktes für die Herstellung eines Medikamentes zur Kontrolle einer bakteriellen Krankheit in einem Säugetier, wobei die Expression der pathogenen Gene der Bakterien durch die AHL-Signale reguliert werden.
Verwendung eines Peptides nach einem der Ansprüche 3 bis 7 für die Herstellung eines Medikamentes zur Kontrolle einer bakteriellen Krankheit in einem Säugetier, wobei die Expression der pathogenen Gene der Bakterien durch die AHL-Signale reguliert werden.
Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, wobei das Säugetier ein Mensch ist.