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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Mikroskope und Verfahren zum Erhalten
von Bildern mit diesen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Viele
Jahre lang sind Lichtmikroskope als eine vollentwickelte Technik
angesehen worden. Während
viele bemerkenswerte Versuche unternommen wurden, die Fähigkeiten
des Lichtmikroskops auszuweiten, haben bis jetzt solche Versuche
keine wesentlichen Leistungssteigerungen erzielt und sind allgemein
zu bedeutend erhöhten
Kosten erhalten worden. Schwingungen in Mikroskopen sind als ein Hauptfaktor
bekannt gewesen, der zur Grenze der Auflösungsleistung beiträgt. Man
hat früher
verursacht, Schwingungen im Mikroskoprahmen durch Bauen sehr starrer
oder schwerer Rahmen, oder durch Konstruieren horizontaler Mikroskope
auf massiven Rahmen im optischen Bankstil zu bewältigen. Andere Versuche zum
Verbessern der Schwingungsleistungen haben passive oder aktive Schwingungsdämpfungstische,
-Füße oder – Plattformen
verwendet.
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Die
Erzeugung von Bildkontrast in Mikroskopen ist ein Bereich, wo in
der Vergangenheit beträchtliche
Arbeit ausgeführt
wurde. Versuche, den Kontrast beobachteter biologischer Proben zu
vergrößern, haben
zu vielen neuen Verfahren wie zum Beispiel Phasenkontrast, Interferenzkontrast,
Hoffmann-Modulationskontrast, Differenzinterferenzkontrast, Mikroskopie
mit polarisiertem Licht, Dunkelfeldmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie
geführt. Die
Herausforderung, Bildkontrast an der äußersten Auflösungsgrenze
zu erzeugen, ergab solche Techniken wie Hochleistungs-Immersionsdunkelfeld
und ultramikroskopische Beleuchtung. Phasen- und Interferenzkontrasttechniken
führten
Artefakte ein, von denen einige asymmetrisch waren, die es schwierig machten,
die Bilder in bezug zu der echten Struktur der betrachteten Proben
zu bringen. Dunkelfeld- und Fluoreszenztechniken stellten Bildausbildung
in einer Form dar, die Sehfähigkeiten
höchst
unvertraut ist, in sehr ähnlicher
Weise, wie wir unfähig
sind, Informationen aus einem photographischen oder elektronischen "Negativ-" Bild zu extrahieren.
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Versuche,
mehr Informationen über
Zellen in Echtzeit zu erhalten, haben konfokale Mikroskopie, die
Hochleistungs-Laserlichtquellen
verwendet, welche den Probenbereich abtasten, um ein Endbild der Probe
aufzubauen, und neuere maskierte konfokale Techniken hervorgebracht,
die Bilder lebender Proben mit höherer
Geschwindigkeit aufbauen können. Allgemein
ist die Vollbild/Halbbildrate der konfokalen Systeme zu langsam
zum Untersuchen von Bewegung hoher Geschwindigkeit vieler Komponenten
in biologischen Systemen, da sie Bewegung hoher Geschwindigkeit
aufweisen.
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Versuche,
hohe Auflösung
zu erzielen, basierten auf der Formel für mikroskopische Auflösung, die
zuerst durch Ernst Abbe entwickelt wurde, Auflösungsgrenze = Wellenlänge von
Licht/(k × numerische
Apertur des Objektivs). Werte für
k im Bereich von 1,6 bis 2 sind über
50 Jahre lang akzeptiert worden, aber die neuste Arbeit des Erfinders
legt nahe, dass der Wert von k gesenkt werden kann und ausführlicher
untersucht werden muss, wenn er auf verbesserte optische Systeme
mit neuen Beleuchtungsverfahren und Abbildungsmitteln angewendet
wird.
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Da
Mikroskopsysteme komplexer geworden sind, haben mehr Glasoberflächen größeren Lichtverlust
aufgrund von Übertragungsverlusten
in den Glaselementen, Innenreflexion und Streulicht erzeugt. Das
Streulicht trug zu schlechtem Kontrast bei, und die Innenreflexionen
und Übertragungsverluste
zusammen mit dem Streulicht bedeuteten, dass fortschreitend stärkere Lichtquellen
zum Erzeugen verwendbarer Bildhelligkeit benötigt wurden. Diese Hochenergiequellen
müssen
das Licht mit hohen Intensitäten
durch den Probenraum weiterleiten, da die meisten der verlustbehafteten
Komponenten sich zwischen der Probe und dem Abbildungsmittel befinden.
Moderne binokulare und trinokulare Systeme mit ihren zugehörigen Prismen,
Spiegeln und Linsen sind besonders unwirksam und erfordern höhere Lichtpegel.
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Das
deutsche Gebrauchsmuster G 9 004 328.6 beschreibt ein Mikroskop
mit einem Kopf, einem Rahmen und einer Basis, wobei die Stabilität durch
ein vertikales Stützelement
zwischen der Basis und dem Kopf verbessert wird.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Schwingungshemmende
Mittel gemäß den Ansprüchen 1 und
11 sind auch zum Steuern der Bewegung des Objektivs in bezug zu
der betrachteten Probe und der Stellung der Abbildungseinrichtung
in bezug zum Objektiv vorgesehen.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Vorzugsweise
sollen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung nun, nur beispielhaft, unter Bezugnahme
auf die beigefügten
Figuren beschrieben werden, in denen:
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1 eine
Ausführungsform
eines IDC-Mikroskops in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung zeigt;
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2 eine
Ausführungsform
der Anordnung des Videosystems des IDC-Mikroskops zeigt;
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3 eine
Ausführungsform
einer piezoelektrisch betätigten
Abstützung
zeigt; und
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4 einen
Querschnitt eines typischen Objektivs zeigt, das in einem IDC-Mikroskop
in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird; und
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4a das
Detail des bei A in 4 identifizierten Bereichs zeigt.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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In
konventionellen Mikroskopen werden Wolfram-, Wolframhalogen-, Quarzhalogen-
oder Lichtbogen-Lichtquellen verwendet. Diese Lichtquellen sind
nicht gut hinsichtlich der Stellung der lichtemittierenden Oberfläche der
Quelle gesteuert, und folglich ist gewöhnlich ein Mittel zum Zentrieren
der lichtemittierenden Oberfläche
in der X-, Y- und Z-Richtung in bezug zum Strahlengang des Mikroskops
vorhanden.
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Das
vorliegende Mikroskop, das allgemein bei 10 angezeigt ist,
kann eine Lichtquelle 14 verwenden, in der die genaue Position
der lichtemittierenden Komponente genau durch den Körper der
Lichtquelle 14 und/oder die Fassung gesteuert wird, in
der sie angebracht ist. Dies beseitigt die Notwendigkeit eines Zentriermechanismus
für die
Lichtquelle 14 und stellt sicher, dass im wesentlichen
die höchstmögliche Intensität und geometrische
Steuerung des Strahls und Wiederholbarkeit erreicht wird. Geeignete
Beispiele solcher Lichtquellen sind die Welch Allen-Lampen für medizinische
Anwendungen, die ILC-Lichtbogenlampen, die vorfokussierten GE- und Sylvania-
Lampen und andere, ähnliche
Lichtquellen. Soweit es dem vorliegenden Erfinder bekannt ist, sind
diese Lichtquellen bis jetzt nicht mit Lichtmikroskopen verwendet
worden.
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In
dem Mikroskop 10 wird die Lichtquelle 14, der
die benötigte
Energie von einer geeigneten Stromversorgung 16 zugeführt wird,
so angebracht, dass so viel Licht wie möglich aus der/den lichtemittierenden
Oberfläche
oder Oberflächen
durch ein geeignetes Beleuchtungsfokussiermittel, wie zum Beispiel
einen Spiegel 18 hinter der Lichtquelle 14 und/oder
eine Linse 22 vor der Lichtquelle 14, fokussiert
wird. Das Licht von der Rückseite
der Lichtquelle 14 wird auf oder angrenzend an die emittierende(n) Oberfläche(n) der
Lichtquelle 14 durch den Spiegel 18 zurück fokussiert.
Das Licht von der Vorderseite der Lichtquelle 14 und das
durch den Spiegel 18 zurückgeführte wird durch die Linse 22 oder
einen Satz von Linsen vor der Lichtquelle 22 zu einem gebündelten
Strahl fokussiert. Geeignete Aperturen 26, Ablenkplatten 30 oder
Röhrenstrukturen
(nicht gezeigt) werden verwendet, um sicherzustellen, dass das Licht
von der Linse 22 im wesentlichen vollständig gebündelt wird. Es ist erwünscht, das
Licht von der Linse 22 so zu bündeln, dass wenig oder kein
von der Achse abweichendes Licht in das im folgenden beschriebene
Kondensorsystem des Mikroskops 10 eintritt. Solches von
der Achse abweichendes Licht würde
im optischen Abbildungssystem zu "Streulicht" werden und würde den Kontrast des Endbilds
verschlechtern.
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Da
die meisten Lichtquellen Licht emittieren, das sich außerhalb
des Bereichs menschlichen Sehvermögens und dem korrigierten Bereich
von Mikroskopoptik befindet, ist ein Filtermittel 34 in
dem Weg des Beleuchtungsstrahls vorgesehen, um das Licht zu filtern,
damit es so nahe wie möglich
dem Bereich von Wellenlängen
entspricht, für
den die Optik des Mikroskops 10 ausgelegt ist. Das Filtermittel 34 kann irgendwo
in dem Beleuchtungsstrahlengang zwischen der Lichtquelle 14 und
der Endoptik des Kondensors 38 eingeschlossen sein, und
das Filtermittel 34 kann aus einem oder mehreren Wärmefiltern
wie zum Beispiel Schott KG1- oder KG5-Glas bestehen, und kann zusätzliche
Interferenzfilter zum Dämpfen des
roten oder blauen Endes des Lichtspektrums enthalten, und kann den
ultravioletten Anteil des Spektrums mit Filtern zum Beispiel der
Schott WG- oder GG-Baureihe ausschließen. Durch Beseitigung des Infrarotanteils
des Spektrums wird Erhitzung der Probe mit seiner damit verknüpften Auswirkung
auf lebende Proben umfassend reduziert. Beseitigung des ultravioletten
Lichts hoher Energie aus dem die Probe erreichenden Licht bedeutet,
dass die Proben nicht so viel DNA-, Zell- und Entfärbungsbeschädigung ausgesetzt
werden. Dies bedeutet, dass Proben während kontinuierlicher Untersuchung
für längere Zeitspannen
auf dem Mikroskop gehalten werden können. Es bedeutet auch, dass
die untersuchten Proben nicht den unnormalen Pegeln von Infrarotlicht
und Ultraviolettlicht von den gewöhnlichen, in Mikroskopen verwendeten
Quellen ausgesetzt werden, die allgemein Glüh-, Metallhalogen- oder Xenon-
oder Quecksilberlichtbogenquellen sind, verglichen mit dem Verhältnis von
infrarotem zu sichtbarem zu ultraviolettem in dem von der Sonne
kommenden Licht. Es ist ein wichtiges Merkmal dieses Mikroskops,
dass lebende Proben nur Verhältnissen
von infrarotem zu sichtbarem Licht und ultraviolettem zu sichtbarem
Licht bei oder weniger als den Verhältnissen ausgesetzt werden,
denen die Proben in der Natur ausgesetzt werden würden.
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Dieses
Merkmal bedeutet, dass Proben sich in einer Weise verhalten, die
stärker
analog zu ihrem Verhalten in ihrer natürlichen Umgebung ist.
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Durch
Begrenzen der Wellenlängen
von in dem Beleuchtungsstrahl vorhandenem Licht ist es möglich, das
Objektiv 40 des Mikroskops 10 mit Licht zu bedienen,
das ein Bild höherer
Auflösung
des Objekts aufgrund der Anpassung des Lichts an die Auslegungsspezifikationen
des Objektivs 40 des Mikroskops 10 bildet. Auf
diese Weise kann das durch die Proben hindurchgehende Licht darauf
begrenzt werden, an die besten sphärischen und chromatischen Aberrationskorrekturpunkte
des Objektivs angepasst zu werden. Typischerweise würde das
Licht auf zwei Wellenlängenbereiche
für ein
achromatisches Objektiv oder drei Wellenlängenbereiche für ein apochromatisches
Objektiv begrenzt sein. Diese Begrenzung der Wellenlänge des
Lichts reduziert weiter Probenerhitzung und nicht mit Wärme verknüpfte Effekte.
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Es
wird erwogen, dass nichtebene Optik allgemein die besten Bilder
ergeben wird. Dies liegt darin begründet, dass keine Kompromisse
für Feldebenheit
vorhanden sind und das IDC-System
nur einen kleinen Teil des Innenbereichs des Gesamtbilds verwendet.
Dementsprechend ist Feldebenheit nicht so ein großes Problem,
wie es in anderen Mikroskopsystemen der Fall wäre, die das vollständige Sichtfeld
des Objektivs verwenden.
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Wo
es erwünscht
ist, Fluoreszenzvermögen für das Mikroskop 10 einzuschließen, kann
eine Stellung in dem Filtermittel 34 für einen Beleuchtungsfilter
vorgesehen werden, der die Beleuchtungsstrahl-Wellenlängen nur
auf diejenigen Wellenlängen begrenzt,
die zum Erregen der mit der Probe verwendeten Fluorophore wichtig
sind. In diesem Fahl sollte das Substrat dieses Filters so dünn wie möglich gehalten
wer den, so dass der Strahlengang des Beleuchtungsstrahls so wenig
wie möglich
unterbrochen wird. Da das Beleuchtungsverfahren Dunkelfeld ist,
kann Fluoreszenzabbildung auf dieses Verfahren mit beinahe der gleichen
Ergebnisqualität
wie bei reflektierter Lichtmikroskopie angewendet werden, obwohl
das Bild von dem IDC-Mikroskop eine durch "Hellfeld" übertragene
Lichttechnik zu sein scheint und nominell darstellt. Um den Beleuchtungsstrahl an
Charakteristiken des verwendeten Kondensors 38 anzupassen,
werden zusätzliche
optische Systeme verwendet. Genau ausgedrückt, geht der gebündelte Beleuchtungsstrahl
von der Lichtquelle 14 durch einen oder beide der beiden
Typen optischer Systeme hindurch. Der erste optische Systemtyp ist
bedienbar, um die Beleuchtungsstrahlabmessung abzuwandeln, um zu
den optischen Anforderungen des Kondensors 38 zu passen.
Dieses System kann ein System aus fixierten Linsen 42 und 46 oder
eine Zoomlinseneinrichtung (nicht gezeigt) darstellen, die beide arbeiten,
um im wesentlichen die höchstmögliche Lichtmenge
von der Beleuchtungsquelle 14 zu dem Kondensor 38 in
einer Strahlgeometrie zu liefern, die so gewählt ist, um die Charakteristiken
des Kondensors 38 vollständig auszunutzen.
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Wenn
ein Dunkelfeldkondensor verwendet wird, kann ein paralleler Lichtstrahl
am vorteilhaftesten sein, während
in einem konventionellen Hellfeldkondensor ein konvergierender Lichtstrahl
erwünscht ist,
wobei der konvergierende Strahl das Bild des Glühfadens der Lampe auf der hinteren
Brennebene des Kondensors zum Erreichen von Kohler-Beleuchtung präsentiert.
Bei Bedarf kann der Beleuchtungsstrahl durch ein zweites optisches
System (nicht gezeigt) hindurchgehen, um den Beleuchtungsstrahl zum
Erreichen von Kohler-Beleuchtung
umzuformen, wie es im technischen Gebiet gut bekannt ist.
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Der
Kondensor 38 kann ein Dunkelfeldkondensor mit hoher numerischer
Apertur eines jeglichen Typs sein, wie den Fachleuten in diesem
Gebiet bekannt ist. Die Auslegung des Kondensors 38 sollte einen
inneren und äußeren Beleuchtungskegel
mit einer numerischen Apertur erzeugen, die an die optischen Charakteristiken
des verwendeten Objektivs 40 angepasst ist oder diese übersteigt.
Die momentan bevorzugten numerischen Aperturen für Kondensoren 38 sind
1,27 für
den inneren Kegel und 1,33 für den äußeren Kegel
für die
meisten biologischen Anwendungen, obwohl für Objektive kleinerer Leistung mit
niedrigen numerischen Aperturen ein Dunkelfeldkondensor einer niedrigen
NA verwendet werden kann. Dies ist durch Verwendung eines x63 Objektivs mit
einer NA von 0,7 und einem Kondensor mit einer NA des inneren Kegels
von 0,71 und NA des äußeren Kegels
von 0,75 dargestellt.
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Wie
oben erwähnt
ist, ist momentan für
viele biologische Anwendungen eine numerische Apertur von 1,27 für den inneren
Kegel bevorzugt, so dass Objektive einer numerischen Apertur von
1,25 verwendet werden können,
ohne zusätzliche
Blenden oder Irisblenden zum Steuern ihrer numerischen Apertur und
des Kontrastes des Dunkelfeldeffekts zu benötigen. Eine numerische Apertur
von 1,33 ist in ähnlicher
Weise für
den äußeren Kegel
bevorzugt, um zu dem Brechungsindex wässriger Medien zu passen. Wie
den Fachleuten in diesem Gebiet klar sein wird, kann es für Medien
mit höherem
Index und zum Hervorheben von Materialien mit hohem Index, die direkt
in Kontakt mit dem Objektträger
sind, dann bevorzugt sein, in dem Kondensor 38 eine Apertur von
1,4 oder größer für den äußeren Kegel
zu verwenden. Für "extreme" Anwendungen, und
wenn die Charakteristiken des die Probe umgebenden Medium und die
Probe selbst es zulassen, ist es momentan bevorzugt, einen Kondensor 38 mit
einer numerischen Apertur von 1,42 für den inneren Kegel und von
1,47 oder höher
für den äußeren Kegel
zu verwenden. Dies ermög licht,
dass nur Objekte mit einem Brechungsindex größer als 1,4, die in engem Kontakt mit
dem Mikroskopobjektträger
sind, gegenüber
einem sehr schwarzen Hintergrund hervorgehoben werden, da das einzige
Licht, das in die Probe gelangen kann, wenn sie in einem wässrigen
Medium angebracht ist, das Licht ist, das in die Probe an dem Bereich
von Kontakt mit dem Objektträger
fließt.
Die Probenobjekte erscheinen daher leuchtend gegenüber einem
vollständig
dunklen Hintergrund. Diese Betriebsart ermöglicht die Verwendung von Objektiven
einer NA von 1,4 für
die höchstmögliche Auflösung. Die
Nachteile dieses Verfahrens sind, dass jegliche Objekte, die entweder
in Fixierungsmedien schwimmen oder nicht optisch mit dem Teil der
Probe verbunden werden, die optisch mit dem Objektträger verbunden
ist, verschwinden werden, was ein falsches Bild der vollständigen Umgebung
der Probe ergeben wird und möglicherweise
einen Teil des Feindetails der Probe selbst verlieren wird; und
diese Objekte können
scheinbar vollständig
spurlos verschwinden, wenn sie plötzlich Kontakt mit dem Objektträger verlieren.
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Einer
der Gründe
zum Reduzieren der numerischen Apertur des anderen Beleuchtungskegels
in wässrigen
Anwendungen besteht darin, das Streulicht zu begrenzen, das ansonsten
resultieren würde, wenn
ein Teil des Beleuchtungskegels von dem Kondensor 38 durch
vollständige
Innenreflexion an der Berührungsfläche von
Wasser und Glas der Probe zurück
in den Kondensor 38 reflektiert wird, wo es zu Streulicht
wird. Alternativ kann zurückgeführtes Streulicht
eingefangen und in Lichtfallen oder Ablässen absorbiert werden, die
durch geeignet abgelenkte oder ausgelegte Oberflächengeometrien erzeugt werden.
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Die
momentan bevorzugten Konstruktionstypen für Kondensoren 38 umfassen
den Zeiss-Ultradunkelfeldkondensor, den Leitz-Dunkelfeldkondensor älteren Designs für Ölimmersionsverwen dung, oder
jetzt produzierte LOMO-Dunkelfeldkondensoren mit hoher numerischer
Apertur mit einer inneren NA von wenigstens 1,2.
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Es
ist derzeit bevorzugt, dass der Kondensor 38 den Kegeldunkelfeldbeleuchter,
oder den koaxialen Dunkelfeld/Hellfeldbeleuchter verwendet, die
beide nach der Arbeit von J. E. Barnard etwa 1933 bzw. 1925 entworfen
sind und die in verschiedenen Artikeln und Veröffentlichungen beschrieben
sind. Genau ausgedrückt,
geht bei dem in 1 dargestellte Kegelkondensor
der Beleuchtungsstrahl durch ein konisches Prisma 50 hindurch,
das einen abgewinkelten, aber weiterhin gebündelten Lichtring bildet. Dieser
Ring wird von der Oberfläche
eines kreisförmigen
Spielrings 54 weg reflektiert, welcher das Licht zu einem
hohlen Kegel der gewünschten
Geometrie fokussiert. Die Elemente des Kondensors 38 sind
in einem geeigneten Gehäuse 58 enthalten.
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Der
den Kondensor 38 verlassende Beleuchtungsstrahl geht durch
eine sphärische
Linse 62 in solcher Weise hindurch, dass die Strahlen von
der Oberfläche
des Spiegelrings 54 durch die Oberfläche der Linse 62 in
rechten Winkeln hindurchgehen und nicht abgelenkt werden. Ein Kondensor 38 ist
achromatisch, er kann gleichermaßen gut für Abbildungsanwendungen von
infrarotem, sichtbarem oder ultraviolettem Licht verwendet werden.
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Der
Beleuchtungsstrahl von dem Kondensor 38 geht durch den
Objekttisch 66 des Mikroskops 10 und den Objektträger 70 hindurch,
der die abzubildende Probe/das abzubildende Objekt 74 hält. Unter den
meisten Umständen
wird die Probe 74 mit einem Deckglas 78 bedeckt
sein. Aufgrund der verwendeten hohen numerischen Aperturen wird
der Kondensor 38 vorzugsweise mit dem Objektträger 70 durch einen
Film aus Im mersionsöl
verbunden, wie es den Fachleuten in diesem Gebiet gut bekannt ist.
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Mikroskope
sind historisch mit C-förmigen Rahmen
mit dem Objektiv und dem Okular an einem oberen Ende des Rahmens
und der Lichtquelle und dem Objekttisch an dem unteren Ende des
Rahmens aufgebaut worden. Der vorliegende Erfinder hat festgestellt,
dass während
konventionelle C-förmige Rahmen
bequem zu verwenden und herzustellen sind, sie unter Nachteilen
darin leiden, dass diese Rahmen anfällig für unerwünschte Schwingungen sind und
tatsächlich
sehr ähnlich
wie Stimmgabeln geformt sind und überraschenderweise wie diese
wirken. Es ist festgestellt worden, dass äußere Schwingungen von einer
jeglichen Quelle und praktisch jeder Frequenz die Neigung haben,
die Stimmgabelform des konventionellen C-förmigen Rahmens zu erregen,
um bei seiner eigenen Resonanzfrequenz und verknüpften harmonischen Schwingungen
zu schwingen, und dies kann das durch den Mikroskop aufgelöste Bild
verzerren. Diese Nachteile sind besonders verschlimmert bei der
vorliegenden Erfindung, die ansonsten dem Mikroskop 10 erlauben kann,
Objekte kleiner als 250 Nanometer oder weniger aufzulösen, und
Objekte so klein wie 50 Nanometer zu detektieren. Dementsprechend
ist es bevorzugt, Schwingung des Mikroskoprahmens zu dämpfen, so
dass unerwünschte
Bewegung des Objektivs 40 in bezug zu der abzubildenden
Probe 74 gehemmt wird.
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Der
vorliegende Erfinder hat zwei Ansätze zum Dämpfen oder Beseitigen dieser
unerwünschten Schwingung
bestimmt. Der momentan bevorzugte erste Ansatz besteht darin, Abstützungen 78 einzuschließen oder
hinzuzufügen,
die den Kopf des Mikroskops 82 mit dem Boden 86 des
Mikroskops 10 verbinden. Die Abstützungen 78 werden
an dem Mikroskop 10 entlang der vertikalen optischen Achse und
auf beiden Seiten des Objekttischs 66 des Mikroskops 10 befestigt.
Die Abstützungen 78 können hergestellt,
bearbeitet oder gegossen werden und bestehen vorzugsweise aus einem
Material oder Materialien, wie zum Beispiel Flugzeugaluminiumlegierungen
oder Stahllegierungen, die eine relativ niedrige Elastizität und Schwingungstendenz
aufweisen. In einigen Fällen
kann es erwünscht
sein, die Abstützungen
als Verbundstoff oder Sandwichschichten aus verschiedenen Materialien
aufzubauen, um die Abstützung
weiter zu versteifen und die Schwingungstendenz zu senken. Vorzugsweise
sind die Abstützungen 78 ausgelegt,
um so wenig Resonanzschwingung wie möglich aufzuweisen, und von
der Schwingung, die nicht beseitigt werden kann, sind die Abstützungen 78 so
ausgelegt, dass ihre Resonanzfrequenz keine harmonische Schwingung
oder subharmonische Schwingung der Grundfrequenz der Schwingung
des C-förmigen Mikroskoprahmens
darstellt. Auf diese Weise hat die Schwingung sowohl des Rahmens
als auch der Abstützungen 78 die
Tendenz, die Schwingungen des anderen zu dämpfen.
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Das
Verfahren zum Entwerfen der Abstützungen
besteht darin, zuerst die Schwingungsarten des C-Rahmens so vollständig wie
möglich
zu charakterisieren, mit dem vollständigen Bereich von Zubehörteilen,
die mit in dem Mikroskop verwendet werden können (da die Schwingung mit
den verwendeten Zubehörteilen
variieren kann). Wenn die Schwingungsarten verstanden wurden, dann
werden die Abstützungen
zum Reduzieren der Schwingungen entworfen und zum Versuchen, welche
Schwingungen auch immer zurückbleiben,
zu "Normalmodus" zu machen, so dass
alle Komponenten des Mikroskops in Phase schwingen, so dass in typischer
Verwendung geringe oder keine "Netto-" Schwingung von dem
Punkt des Abbildungsmittels in bezug zu dem Objekt vorliegt.
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Ein
anderer Ansatz zum Beseitigen der Schwingung in einem Lichtmikroskop
besteht in der Verwendung eines Röhrendesigns für den Rahmen des
Mikroskops 10, wobei die Röhre den Objekttisch 6 des
Mikroskops 10 in sehr ähnlicher
Weise wie das Design von Probenkammern und Säulen konventioneller Raster-
und Transmissionselektronenmikroskope umschließt. Ein solches Röhrendesign
kann praktisch die Z-Achsen-Schwingungen
des Objektivs 40 in bezug zur Probe 74 beseitigen.
Während
das Röhrendesign
Zugang zu dem Probenbereich streng begrenzt, ist der Anstieg in
Schwingungsleistung beträchtlich
und kann durchaus in Fällen
die Unbequemlichkeit wert sein, in denen die bestmögliche Auflösung erwünscht ist.
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Das
Objektiv 40 des Mikroskops 10 kann als ein Objektiv
feststehender Brennweite ausgelegt werden, um ein vollständig korrigiertes
Bild an einer ersten Bildebene des Objektivs 40 zu erzeugen.
Außerdem
ist das Objektiv 40 vorzugsweise derart ausgelegt, dass
jegliches Streulicht von der Probe 74, das nicht einen
scharfen Teil des Endbilds bilden soll, durch Blenden, Irisblenden
oder geometrische Lichteinfangmittel gedämpft wird. Wie hier verwendet,
sollen die Ausdrücke "geometrisches Lichteinfangen" und "mit geometrischer
Oberfläche" eine jegliche Oberfläche mit
niedrigem Reflexionsvermögen
in den Wellenlängenbereichen
von Interesse darstellen und die Oberflächen aufweisen, die geometrisch
angeordnet sind, um eine auf sie auftreffende Lichtmenge, wie klein
sie auch sein mag, in Richtung auf andere geometrische Lichteinfangflächen oder "sichere" Bereiche zu lenken,
wo das Licht nicht den Betrieb oder die Kontrastausbildung des optischen
Geräts
verschlechtern wird. Daher wird das meiste oder alles des eingefangenen
oder gedämpften
Lichts während Reflexionen
von aufeinanderfolgenden Oberflächen der
geometrischen Oberfläche
absorbiert. In einigen Fällen
sind nur ein oder wenige Sprünge
erforderlich, um das Licht ausreichend zu dämpfen, während in anderen Fällen eine
große
Anzahl von Sprüngen
erforderlich ist, um den gewünschten
Dämpfungsgrad zu
erhalten. Diese geometri schen Oberflächen sind in der Theorie ähnlich den
absorbierenden Oberflächen
einer akustischen echofreien Kammer oder der Antiradaroberflächen eines
schwer erkennbaren Flugzeugs.
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Die
Verwendung einer Apertur 90 oder einer einstellbaren Irisblende
(nicht gezeigt) an der gleichen Stelle ist erwünscht, um den Beleuchtungsstrahl
genau an die numerische Apertur des Objektivs 40 zur Sicherstellung
anzupassen, dass das bestmögliche
Dunkelfeldbild erhalten wird.
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Es
ist momentan bevorzugt, eine einstellbare anstelle einer feststehenden
Irisblende im Mikroskopobjektiv 40 zu verwenden, da die Öffnung einer
solchen einstellbaren Irisblende auf ihre vollständige NA in einem Hochleistungsobjektiv
mit einem NA größer als
1,25, bei Verwendung mit einem Dunkelfeldkondensor mit einem inneren
Kegel einer NA von 1,25, dem Objektiv 40 erlauben soll,
bei einer größeren Apertur
als dem inneren Beleuchtungskegel des Kondensors 38 zu
arbeiten. In diesem Aufbau kann das Mikroskop 10 in einer
ungewöhnlichen
Hellfeldbetriebsart verwendet werden, die die Oberflächentopographie
der Probe 74 hervorhebt, während im wesentlichen ein hoher
Kontrast und eine hohe Auflösung
des erhaltenen Bilds aufrechterhalten wird. Bei Invertierung scheint
dieses Bild einem konventionellen SEM-Bild auf einer Oberfläche zu ähneln. Ferner kann
eine geringfügige
Verbesserung der Auflösungsstärke des
Objektivs 40 aufgrund der Vergrößerung in der numerischen Apertur
erhalten werden. Diese Hellfeldbetriebsart kann eine neue Bilderscheinung
liefern, um Bildinformationen zu liefern, die vorhergehend nicht
erhältlich
waren.
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Wenn
das Objektiv 40 ein für
unendlich korrigiertes Objektiv ist, dann wird eine geeignete passende
Röhrenlinse
(nicht gezeigt) verwendet, um das Unendlichlicht zu Licht fester
Brennweite zu konvertieren. Es ist vorteilhaft, eine Röhrenlinse
mit einer kürzestmöglichen
Brennweite zu verwenden, um die Länge einer Kopplungsröhre zwischen
der Röhrenlinse
und dem Abbildungsmittel auf einem Minimum zu halten. Diese kurze
Kopplerlänge
hilft bei der Reduzierung von Gewicht und Schwingung des Abbildungsmittels
in bezug zu dem Objekt und/oder der Röhrenlinse.
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Normalerweise
erzeugt das Objektiv 40 oder die Röhrenlinse in einem für unendlich
korrigierten System ein primäres
Bild mit einem Kreisdurchmesser von ungefähr 20 bis 25 mm. Da das IDC-Mikroskop
ein Abbildungsmittel allgemein in der ersten Bildebene des Objektivs
oder der Röhrenlinse
aufweist, ist es oft der Fall, dass das Abbildungsmittel eine aktive
Fläche
von nur 8 bis 12 mm auf einer Seite in einem quadratischen oder
rechteckigen Format aufweist. In diesem Fall muss der das Bild tragende Strahlengang
mit geometrischen Lichtblendenflächen
abgeblendet oder gedämpft
werden, um das Licht außerhalb
der aktiven Bildfläche
zu beseitigen, so dass das außerhalb
der aktiven Bildfläche
fallende Bild kein Streulicht in dem System wird.
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Wenn
eine Fluoreszenzfähigkeit
für das
Mikroskop 10 vorgesehen ist und ein für unendlich korrigiertes Objektiv 40 und
eine passende Röhrenlinse in
dem Mikroskop 10 verwendet werden, können ein Emissionsfilter (nicht
gezeigt) oder Filter (wie zum Beispiel ein konventioneller Filterwürfelsatz
mit Emissions-, Erregungs- und Strahlteilelementen wie sie gewöhnlich in
Reflexionslichtmikroskopen verwendet werden und die hier auch mit
einem Standardsystem aus Lichtquelle und Optik für Reflexionsfluoreszenz-Lichtmikroskopie
verwendet werden können) zwischen
dem Objektiv 40 und der Röhrenlinse in dem Unendlichraum
vorgesehen werden. Wenn ein Objektiv 40 mit fester Brennweite
verwendet wird, dann kann/können
der Emissionsfilter oder die Emissionsfilter für Fluoreszenzmikroskopie im
Kopf 82 des Mikroskops 10 eingeschlossen werden.
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Wenn
dieser Emissionsfilter (oder die Filter) mit Objektiven fester Breitweite
verwendet werden, ist es bevorzugt, den Emissionsfilter auf das
dünnmöglichste
Filtersubstrat zu schichten, so dass die Abweichungen des Bilds
aufgrund des Brechungsindex der Filterbeschichtungen und des Substrats
so klein wie möglich
sein werden. Der oder die Filter können sich auf einem Objektträger befinden
oder können
auf einer Revolverkopf- oder Filterradanordnung sein, wie den Fachleuten
in diesem Gebiet klar sein wird. Wenn diese Filter zum Erzeugen
künstlicher
Farbe verwendet werden, bei Verwendung einer monochromen Digitalkamera,
oder wenn sie für Mehrfluoreszenztechniken
verwendet werden oder wenn numerisch verarbeitete computergesteuerte Pseudofarbabbildung
verwendet wird, dann können der
Filterrevolverkopf oder das Rad digital gesteuert und elektrisch
angetrieben sein.
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Es
kann erwartet werden, dass ein Objektiv fester Brennweite ein helleres
(photonwirksameres) und ein stärker
korrigiertes Bild in der ersten Bildebene als bei einem auf unendlich
korrigierten System aufgrund der kleineren Anzahl von Oberflächen und Komponenten
in bezug zu einem auf unendlich fokussierten Objektiv erzeugt. Wenn
Objektive mit fester Brennweite verwendet werden, kann es erwünscht sein,
die Objektive mit einem viel kürzeren Brennpunktabstand
von der Linsenrückseite
auszulegen, um die Gesamthöhe
des Mikroskops wesentlich zu reduzieren, wie oben für auf unendlich
korrigierte Röhrenlinsen
zu Abbildungsmittelkopplung beschrieben wurde.
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Das
Mikroskop 10 kann ein einzelnes Objektiv 40 einschließen oder
kann zwei oder mehr Objektive 40 einschließen, die
wie gewünscht
zum Gebrauch ausgewählt
werden können.
In diesem letzteren Fall können
die Objektive 40 an einem jeglichen geeigneten Halterungsmittel
angebracht sein, wie zum Beispiel dem in vielen Mikroskopdesigns
verwendeten konventionellen Objektivwechselrevolver.
-
Das
das Objektiv 40 verlassende Licht geht durch eine erste
Apertur 94 hindurch und dann, wenn es den Kopf 82 des
Mikroskops 10 verlässt,
durch eine sorgfältig
gesteuerte zweite Apertur 96, die jegliche Lichtstrahlen
blockiert, die nicht in dem gewünschten
Bildausbildungsstrahl enthalten sind. Die Wände des Kopfs 82 und
einer Kopplungseinrichtung 98 haben einen relativ großen Innendurchmesser, um
weiter das Streulicht zu reduzieren und Bildkontrast zu verbessern.
Die Innenflächen
des Kopfes 82 und der Kopplungseinrichtung 98 können auch
mit geometrischen Oberflächen
hergestellt werden, zum Steuern von und zum wesentlichen Verhindern,
dass Lichtreflexionen das Abbildungsmittel erreichen, wie im folgenden
erörtert
ist.
-
Die
Innenflächen
des Objektivs 40, des Kopfes 82 und der Kopplungseinrichtung 98 werden
vorzugsweise mit einer flachen schwarzen oder anderen geeigneten
Beschichtung überzogen,
um den niedrigstmöglichen
Reflexionsquotienten für
Licht der Wellenlängen
zu erhalten, die zum Bilden des Endbilds verwendet werden. Allgemein
werden dieses flache schwarze oder eloxierte schwarze Überzüge sein.
-
Bevor
das die Bildinformationen enthaltende Licht das Abbildungsmittel
erreicht, geht es durch eine andere Apertur oder Blende 102 hindurch,
die geformt ist, um Streulicht weiter zu begrenzen. Diese Apertur
kann eine quadratisch oder anders geformte Apertur sein, um zur
Geometrie des Abbildungsmittels zu passen.
-
Es
ist es zum Verwenden von Objektiven neuster Herstellung erwünscht, den
Objektiven Streulichtsteuermittel hinzuzufügen. Diese Streulichtsteuermittel
umfassen Nachbearbeiten der Kanten der Linse zu einer Feinlinienoberfläche (für plankonvexe
und doppeltkonvexe Linsenelemente), Schwärzen der äußeren Umfangsoberflächen der
Linsen und/oder Nachbearbeiten der Umfangsflächen auf geometrische Konfigurationen
zum Steuern des Streulichtabpralls, Hinzufügen von Aperturen oder Blenden,
Vorsehen von Oberflächen
ultraniedriger Reflexion oder geometrisch bearbeiteten Oberflächen auf
Innendurchmessern von Linsenhalterungen und Hülsen, und sorgfältiges Steuern
der Antireflexionsbeschichtungen zum Verhindern, dass Streulicht in
Richtung auf das Abbildungsmittel wandert.
-
Objektive
zum Gebrauch in IDC-Mikroskopen sollten auch streng geprüft werden,
zur Bestimmung, wie dicht sie ihre theoretischen Grenzen für ein Objektiv
ihres Designs und für
die physikalische Grenze entsprechend der Physik für ein solches
Objektivdesign erreichen. Komponenten des Objektivs sollten dann
angepasst werden, um die höchstmögliche Übereinstimmung
mit theoretischen Leistungsmöglichkeiten
zu erreichen. Die Verwendung eines geeigneten Testobjektträgers, wie
zum Beispiel dem, der unter dem Namen "Richardson Test Slide" durch Bio-Microtech.
Inc., P.O.Box 23, Bolton, Ontario, L7E 5T1 verkauft, und in Richardson
T. (1998), Test Slides: Diatoms to Divisions- What are you looking at?
[Testobjektträger:
Diatome bis Division – Was
betrachten Sie?] beschrieben ist, ist sehr nützlich beim Bestätigen der
Leistung jedes Aspekts des IDC-Systems einschließlich der Beleuchtungs-, Objektiv-
und Abbildungskomponenten und aller der Verbindungskomponenten in
oder angrenzend an den Strahlengang.
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Traditionelle
Okulare, egal ob Teil eines monokularen, binokularen oder trinokularen
Designs, sind in diesem Design beseitigt worden, um die Photoneffizienz
des Systems zu verbessern und die Notwendigkeit zu entfernen, die
Optik in dem Okularsystem auf die gleichen hohen Standards wie das übrige optische
System zu korrigieren. Entfernung des Okularsystems reduziert weiter
die Materialkosten, liefert ein leichteres, kompakteres Design und
bietet der Bedienungsperson eine benutzerfreundlichere Schnittstelle
mit weniger Ermüdungserscheinungen und
praktisch unendlicher ergonomischer Flexibilität, da das Endbild auf einem
Video- oder Digitalmonitor betrachtet wird, der praktisch überall positioniert
werden kann, um zu der Ergonomie der Situation zu passen.
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In
der in 1 gezeigten Ausführungsform ist das Abbildungsmittel 106 eine
CCD-Kamera mit drei Detektoren wie zum Beispiel ein Model GU-US532,
das durch Panasonic hergestellt wird, mit einem internen Prisma 110 und
drei ladungsgekoppelten Arraydetektoren 114, 118 und 122,
das an der primären
Bildebene des Objektivs (oder der Objektiv-Röhrenlinsen-Kombination
im Fall von für
unendlich korrigierten Systemen) vorgesehen wird. Das Vorsehen des
Abbildungsmittels 106 in der ersten Fokalebene des Objektivs
wird derzeit als vorteilhaft angesehen, da es die Bildhelligkeit
verbessert, da ansonsten das Vorliegen jeglicher störender Optik Lichtverluste
einführen
würde,
und da es die höchstmögliche Bildauflösung und
den höchstmöglichen Kontrast
aufrecht erhält,
der ansonsten durch jegliche andere störende Optik verschlechtert
werden würde.
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Eine
Videokamera mit Fernsehrundfunkqualität mit geringem Licht, wie zum
Beispiel ein Modell WV-E590 hergestellt durch Panasonic, kann auch
als das Abbildungsmittel verwendet werden. Dieser Kameratyp ist
besonders für
Arbeit bei geringem Licht geeignet, wo Photonbeschädigung der
Probe auf einem Minimum gehalten werden muss. Er ist weiter für Fluoreszenzarbeit
geeignet, wo das Bild geringe Lichtstärken aufweist und wo Erregungsenergie
auf einem Minimum gehalten werden muss, um Photonbeschädigung und
Entfärben
der Probe und der Fluorophore zu reduzieren.
-
Das
durch die Abbildungsmittel 106 erfasste elektronische Bild
wird einer Steuereinheit 128 zugeführt, die automatische Verstärkungssteuerungen, Weißabgleichs-,
Schwarzabgleichs- und Autoirisblendenfunktionen enthalten kann,
die alle durch die Bedienungsperson des Systems für maximale
Abbildungssteuerung und Flexibilität gesteuert oder begrenzt werden
können.
-
Ein
besonderer Vorteil dieses Systems ist die Verwendung einer Videokamera
mit der Fähigkeit, Halbbilder
von Bildern gegenüber
Vollbildern anzuzeigen. Wenn nur die ungeraden oder geraden Halbbilder
angezeigt werden und die Verknüpfungsfunktion
von den angrenzenden Halbbildern interpoliert wird, dann können wirksame
Vollbildgeschwindigkeiten gleich der Halbbildrate erzielt werden.
Dies ist wichtig, wenn es erwünscht
ist, Bewegung sehr hoher Geschwindigkeit mit einem Minimum von Bewegung
während
der Bilderfassungszeit zu untersuchen. Es ist weiter nützlich,
um elektronisches Verschließen
zum Begrenzen der Bewegung während einer
Halbbilddauer zu verwenden.
-
Das
elektronische Signal von dem Abbildungsmittel 106 und der
Steuereinheit 128 wird dann einem Bildinvertierungsmittel 132 zugeführt, das
es elektrisch konvertiert, um ein Negativbild entweder mit Luminanz,
Chrominanz oder Luminanz und Chrominanz des diesem von der Steuereinheit 128 zugeführten Bilds
zu erhalten. Ein triviales Beispiel der Funktion des Bildinvertierungssystems 132 würde sein,
dass ein Bild eines schwarzen Punkts auf einem weißen Hintergrund
zu einem weißen
Punkt auf einem schwarzen Hintergrund konvertiert wird, wenn sowohl
Luminanz als auch Chrominanz invertiert werden. Sowohl die Steuereinheit 128 als
auch das Bildinvertierungssystem 132 können als interne oder integrale
Komponenten der Abbildungsmittel 106 eingeschlossen werden.
-
Alternativ
kann interne oder schaltbare Programmierung der Steuereinheit 128 zum
Erzielen von Bildinvertierung verwendet werden. Dies ist besonders
nützlich,
wenn erwünscht
ist, dass das Mikroskop jederzeit in der invertierten Betriebsart
arbeitet, wobei eine oder beide der Luminanz- oder Chrominanzinformationen
invertiert werden.
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Abhängig davon,
wie die Chrominanzinformation durch das Bildinvertierungssystem 132 zu verarbeiten
ist, kann dann die resultierende Farbe in dem Endbild, das das Bildinvertierungssystem 132 verlässt, entweder
ein farbkorrektes Bild oder ein farbnegatives Bild des dem System 128 gelieferten Bilds
darstellen. Weiter kann es abhängig
davon, welcher Typ von Bildern von der Probe 74 erhalten wird,
erwünscht
sein, das Bild ohne Durchführung
der invertierenden Konversion zu betrachten. Dementsprechend kann
das Bildinvertierungssystem 132 sowohl das invertierte
Bild als auch das nichtinvertierte Bild weiterleiten. Auf diese
Weise liefert das Bildinvertierungssystem 132 so viele
wie vier Arten von Ausgabebildern. Die erste Art ist das normale
positive Bild, die zweite Art ist das negative Bild mit Farbe in
dem Negativ (wenn Luminanz und Chrominanz invertiert sind), die
dritte Art ist, wenn Farbe nicht in dem Negativ enthalten ist, aber
die Helligkeit negativ ist (wenn nur Luminanz invertiert ist, was
besonders nützlich
sein kann, wenn das System zum Betrachen von Proben mit Verfärbungen
verwendet wird, wie zum Beispiel Vitalfärbungen, oder be kannter Farbe) und
die vierte Art ist, wenn Farbe negativ ist, Helligkeit jedoch nicht
negativ ist (was für
Untersuchung von Farbunterschieden verwendbar ist, die bei Invertierung
derselben hervorgehoben werden, aufgrund der Charakteristiken des
menschlichen Auges oder der Kamera oder des Videomonitors).
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In
der Ausführungsform
von 1 macht das Bildinvertierungssystem 132 nichts,
um die Auflösung
oder den Kontrast des Bilds zu ändern.
Die Auflösung
und die Kontrastinformation wird lediglich von den verwendeten optischen
Verfahren abgeleitet, die Dunkelfeldbeleuchtung, optimale Korrektur der
Optik zum Liefern hervorragender Bildqualität und Photoneffizienz, Schwingungssteuerung
und Dämpfung,
und sorgfältige
Beachtung von Photonenetats, um im wesentlichen alle die die Lichtquelle 14 verlassenden
Photonen zu berücksichtigen,
zur Sicherstellung, dass sie zu dem scharfen Endbild beitragen.
Steuerung von Streulicht im Mikroskop 10 ist ein wichtiger
Faktor beim Schalten des Endbilds mit hohem Kontrast.
-
Das
menschliche Sehsystem ist viel besser für Verarbeitung von Information
ausgelegt und an diese gewöhnt,
wenn Bildinformationen als Schwarz oder Farbe auf einem im wesentlichen
weißen
Hintergrund dargeboten werden, so wie Text normalerweise auf Papier
angezeigt wird. Das Dunkelfeldbild ist dem normalen Betrachter visuell
nicht vertraut und daher hat das Gehirn Schwierigkeiten, die meisten Informationen
aus dem Bild zu extrahieren. Ein gutes Beispiel ist die Schwierigkeit,
die wir beim Versuch haben, Bildinformationen beim Betrachten eines
photographischen Negativs entweder einer Farb- oder Schwarz- und
Weißszene
zu interpretieren oder zu verstehen. Wenn wir ein positives Bild
des selben Negativs betrachten, können wir einfach die Informationen "korrekt" interpretieren,
obwohl sowohl das positive als auch das negative Bild die gleichen
Informationen enthalten und das eine nur die Luminanz- und Chrominanzumkehrung
des anderen darstellt. Es ist festgestellt worden, dass das von
dem IDC-System erzeugte Bild allgemein nicht durch digitale Bildverarbeitungstechniken
verbessert werden muss, da es in dem Bereich von Informationen angeordnet
zu sein scheint, der am besten durch das menschliche Gehirn interpretiert
wird. Die einzigen Anpassungen, die sich oft als hilfreich herausgestellt
haben, sind Anpassungen des Schwarz- und Weißpegelversatzes auf dem analogen
oder digitalen Steuersystem, um mehr Informationen über schwache
Merkmale zu liefern.
-
In
normalem Gebrauch wird die Beleuchtungssteuerung, die lineare Anpassung
des Lichtpegels von null bis zum Maximum der Fähigkeit der Lichtquelle 14 liefert,
in Verbindung mit den elektronischen Verstärkungssteuerungen der Abbildungsmittel 106 verwendet,
um das beste Bild für
die gewünschten
Informationen zu liefern. Um die feinen Details in einer Probe zu
untersuchen, werden hohe Beleuchtungspegel verwendet, und niedrige
elektronische Verstärkung
wird verwendet, so dass elektronisches Rauschen minimiert und Feinauflösung maximiert
wird. Für
langfristige Untersuchungen bei niedrigerer Auflösung wird der Lichtpegel auf
dem niedrigstmöglichen
Pegel gehalten, und die elektronische Verstärkung wird auf die höchstmögliche Einstellung
umgeschaltet, so dass ein verwendbares Bild aus der Sichtweise der
Probe betrachtet bei einem niedrigen Lichtpegel geliefert wird.
Für hochempfindliche
Detektion kleiner Partikeln, von Hintergrundorganismen oder Strukturen
werden sowohl der Lichtpegel als auch die Verstärkung auf ihr Maximum gesetzt,
was starken Kontrast in feinen Strukturen und hohe optische Verstärkung erzeugt,
so dass diese kleinen Strukturen eine Erscheinung mit hohem Kontrast
und eine elektronisch stark rauschende und daher einfach unterscheidbare
Erscheinung annehmen.
-
Alternativ
kann das Bildinvertierungssystem 132 in einem computergestützten Bildverarbeitungssystem
(nicht gezeigt) realisiert werden, wobei das Abbildungsmittel eine
Analogkamera ist und der Computer eine Bildeinfangkarte zum Konvertieren des
analogen Bilds in ein digitales Bild enthält, oder wo das Abbildungsmittel
eine Digitalkamera darstellt und der Computer die digitalen Daten
direkt verarbeitet. Der Vorteil der Verwendung des computergestützten Bildverarbeitungssystems
dieses Typs von Mikroskopie besteht darin, dass Farbe auf dem erfassten
Bild in einer definierten Weise abgebildet werden kann, um am besten
zur Anwendung zu passen. Kontrasterweiterungs- und Pseudofarbtechniken
zusammen mit anderen bekannten Bildverarbeitungstechniken wie zum
Beispiel Kantenvergrößerung,
können
nützlich
zum Extrahieren weiterer Informationen aus den erhaltenen Bildern
sein.
-
Das
erfasste und verarbeitete Endbild wird der Bedienungsperson auf
einem Monitor 136 angezeigt, der ein Analogmonitor oder
ein Computermonitor sein kann. Es kann erwünscht sein, Schalter wie zum
Beispiel 140 und 144 zum Auswählen des betrachteten Videomodus
vorzusehen. In der Ausführungsform
von 1 wählt
ein Schalter 140 das positive Videobild aus, das über einen
Anschluss 148 geliefert wird, und der Schalter 144 wählt das
negative Videobild über
den Anschluss 152 aus.
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Das
Endbild kann unter Verwendung von analogen Mitteln wie zum Beispiel
auf Videoband oder digital als digitale Video- oder digitale Bilddateien entweder
als Einzelvideobild (wie zum Beispiel TIFF- oder JPEG-Dateien) oder
Bewegungsvideobild (wie zum Beispiel MPEG-, MPEG2- oder AVI-Dateien)
auf gezeichnet werden. Aktuelle IDC-Systeme verwenden Recorder mit
S-VHS-Format, oder professionelle RGB-Videorecorder. Es ist geplant,
dass DVD oder ein RAID-Array oder ähnliche digitale Aufzeichnungsstrategien
als die Aufzeichnungsmittel angeboten werden, wie diese im Handel
erhältlich und
kostenwirksamer werden. Zeitraffer-Videorecorder vom "Casino-" Typ werden auch
seit kurzem mit dem IDC verwendet, um Untersuchungen von Proben über lange
Zeitspannen von Stunden bis zu Tagen zu ermöglichen.
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Wie
in 2 gezeigt ist, erfolgt digitales Einfangen von
dem Abbildungsmittel 106, dessen S-Videosignal 300 dem
Bildinvertierungssystem 132 zugeführt wird, welches Luminanzinverter 301 und Chrominanzinverter 302 und
einen Luminanzinvertierungs-/Nichtinvertierungsschalter 303 und
Chrominanzinvertierungs-/Nichtinvertierungsschalter 304 enthält. Das
Signal von dem Bildinvertierungssystem 132 wird einem S-Videorecorder 305 zugeführt und das
Signal wird zu einem Zeitrafferrecorder 306, Monitor 136 und
einem in den Computer 307 eingebauten Bildeinfangsystem
durchgeführt.
Die momentan mit IDC-Systemen gelieferten Bildeinfangsysteme enthalten
IOMEGA Buzz-Bildeinfangsysteme oder ein MATROX Genesis – Bildeinfangsystem
in Verbindung mit einem geeigneten PC-Computersystem. Das Buzz bietet
ein kostengünstiges
Verfahren für universales
Einfangen von Bildern. Das Genesis ist ein Bildeinfangsystem professioneller
Qualität,
das Sammlung von mehr Details ermöglicht.
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Dieses
Verfahren von Mikroskopie kann mit Hochleistungsobjektiven hoher
numerischer Apertur oder mit Objektiven niedriger Leistung verwendet werden.
Der Hauptbegrenzungsfaktor ist die numerische Apertur des Objektivs,
so dass die Objektivapertur kleiner als der innere Beleuchtungskegel
des Beleuchtungssystems ist. Dies gestaltet Mikroskope in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung ideal zum Untersuchen von Zellen,
wie zum Beispiel Biopsie beim Menschen oder Pflanzenzellen, zuerst bei
kleinen Vergrößerungen
und dann späterer
Umschaltung auf höhere
Vergrößerungen
für detailliertere
Analyse.
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Wie
den Fachleuten in diesem Gebiet klar sein wird, ist es möglich, auf
Elektrochemie, Elektrolumineszenz, Fluoreszenz, Flüssigkristall
oder Bildverstärker
basierende Schemata zu verwenden, um die Konversion von positiv
zu negativ in diesem Verfahren zu liefern. Wenn solche Mittel verwendet
werden, dann können
konventionelle Binokulare oder Trinokulare verwendet werden, um
das Bild des Objekts zu betrachten, aber ein gewisser Teil des Kontrastes
und der Auflösung
wird verloren gehen.
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Es
ist weiter erwogen, dass ultrafeine Fokussierung des Mikroskops
durch gesteuerte Verzerrung der Schwingungssteuerabstützungen 78 des
Mikroskops 10 erreicht werden kann. Wenn zum Beispiel ein
Hydraulikzylinder (nicht gezeigt) verwendet wird, um die Abstützungen 78 aneinander
zu koppeln, dann wird das Hinzufügen
von Fluid zu dem Hydraulikzylinder die Abstützungen 78 auseinander
drücken und
das Objektiv 40 sehr gering in Richtung auf die Probe 74 ablenken,
wodurch eine sehr feine Fokussteuerung geliefert wird. Wenn eine
sehr feine Schraube (nicht gezeigt) verwendet wird, um einen Kolben
(nicht gezeigt) mit sehr kleiner Bohrung in einen Zylinder (nicht
gezeigt) zu treiben, der mit Hydrauliköl gefüllt ist und das resultierende
Drucköl
dem die Abstützungen 78 verbindenden
Hydraulikzylinder zugeführt
wird, dann kann ein sehr ultrafeiner Fokus realisiert werden. Eine
solche Einstellschraube kann unter Computer- oder externer elektrischer Steuerung
sein. Der gleiche Funktionstyp kann mit einem Schraubenmechanismus
entweder in Spannung oder Kompression zwischen den Abstützungen 78 erreicht
werden, so dass Anpassung des Schraubenmechanismus den feinen Fokus
erzielt.
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Es
ist ferner erwogen, dass der Mikroskop 10 eine oder mehrere
piezoelektrische Streben 78 (nicht gezeigt) zwischen den
Abstützungen 78 verwenden kann,
um die ultrafeine Fokussierung des Mikroskops zu erreichen. Variationen
der Spannung der piezoelektrischen Streben werden den Fokus des
Mikroskops leicht verschieben. Alternativ können die Streben in zwei Einheiten
hergestellt werden und können eine
piezoelektrische Schicht sandwichartig eingefügt zwischen den oberen und
unteren Hälften
der Abstützungen
einschließen,
so dass das piezoelektrische Element seine Dicke variieren und hierdurch die
Länge der
Abstützungen ändern kann.
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3 zeigt
eine solche Konfiguration von zwei Abstützungen, die piezoelektrische
Elemente für
aktive Z-Positionssteuerung einschließen. Der obere Teil des Körpers des
Mikroskops 82 wird mit den oberen Hälften jeder Abstützung 202 verbunden. Die
untere Oberfläche
der Abstützung 202 wird
an eine isolierende und leitfähige
obere Elektrode 203 geklebt, die den Anschluss des Piezoelements
an eine Spannungsquelle ermöglicht.
Die Elektrode 203 ist an das piezoelektrische Element 204 angeschlossen,
das an die untere Elektrode 205 geklebt ist. Die Elektrode 205 wird
an die untere Hälfte
der Abstützung 201 geklebt.
Eine zwischen den Elektroden 203 und 205 angelegte
Spannung verursacht eine Änderung
in der Abmessung des Piezoelements 204 und bewegt das Abbildungsmittel
und verknüpfte
Optik in bezug zu dem Probenobjekt 74. Eine weitere Anwendung
dieses piezoelektrischen Systems besteht in der Bewegung der Mikroskop-Z-Einstellung synchron mit
einer schwingenden Probe 74, um Bilder von Proben zu erhalten,
die feststehende Frequenzschwingungen durchmachen oder zeigen, welche
offenbar die Bewegung der Probe angehalten haben, zumindest in der
Z- Ebene. Alternativ
kann eine dreiachsige Piezohalterung verwendet werden, um das Objektiv an
dem Mikroskopkörper
zu befestigen. Durch Antreiben dieser Halterung in synchronisierten
dreidimensionalen Mustern kann es möglich sein, die Bewegung eines
Probenobjekts in schneller Oszillation durch Anpassen der Bewegung
des Objektivs an die Bewegung des Objekts einzufrieren.
-
Es
ist möglich,
dass Reflexionen von der Oberfläche
der CCD-Kamera oder einem anderen Abbildungsmittel in dem Raum zwischen
der CCD-Kamera und der Rücklinse
des Objektivs 40 oder der Röhrenlinse hin- und herspringen
können. Es
ist geplant, dass ein Vorteil durch Einführen eines Photonenventils
erhalten werden kann, wie zum Beispiel eines Einwegespiegels (nicht
gezeigt), um von dem Abbildungsmittel zu der Objektivlinse zurückkehrendes
Licht zu beseitigen und dadurch eine mögliche Quelle von Streulicht
zu beseitigen und den Kontrast zu verbessern.
-
Die
Gesamtgröße des Mikroskops 10 kann wesentlich
durch Einbau der Lichtquelle 14 in das interne Gehäuse des
Kondensors 38 reduziert werden. Ein solches Verfahren wurde
durch Zeiss in dem Dunkelfeld-Kondensor von 1930 vorgeschlagen. Wenn
ein Hellfeld- und Dunkelfeldkombinationskondensor wie zum Beispiel
der oben beschriebene koaxiale von Barnard verwendet wird, dann
kann die Größe sehr
klein gehalten werden, während
sowohl Hellfeld- als auch IDC-Betriebsarten
aufrechterhalten werden.
-
Um
ein extrem robustes und kompaktes IDC-Mikroskop niedriger Leistung
für Feldgebrauch in
rauen Umgebungen zu schaffen, können
eine oder mehrere lichtemittierende Dioden (nicht gezeigt) als die
Lichtquelle verwendet werden, und ein konischer Kondensor vom Prismatyp
kann verwendet werden, um diesen Beleuchtungstyp am besten zu nutzen.
-
Wo
Farbkorrektur ein wichtiger Faktor ist, kann eine Gruppe von lichtemittierenden
Dioden verschiedener Wellenlängen
mit einem LED-Steuermittel verwendet werden, um die relative Helligkeit
von jeder der LED zu variieren. Auf diese Weise kann ein farbangepasstes
Beleuchtungssystem erhalten werden. Abhängig davon, wie die LED angeordnet
sind, kann die Farbe und die Position und der Stil von Beleuchtung
variiert werden, um die Anforderungen der Anwendung zu erfüllen.
-
4 zeigt
einen Ausschnitt des Innenaufbaus eines Objektivs für ein IDC-Mikroskop.
Licht tritt in das Objektiv 40 durch die erste Linse 400 ein,
die hier als eine Ölimmersionslinse
gezeigt ist, Streulicht oder Licht hoher numerischer Apertur, das,
wie durch Verwendung von Photonenetattechniken bestimmt, keinen
Teil in dem scharfen Bild bilden soll, fällt auf die untere Oberfläche einer
Halterung 408 für
die Linse 405 ein. Scharf eingestelltes Licht geht durch
die Linse 405 hindurch. Die geometrischen Lichteinfangmerkmale
der Halterung 408 sind auf der oberen 416 und
unteren 412 Oberfläche
der Halterung 408 angeordnet. Das Detail 460 zeigt,
dass die Merkmale 412 und 416 nicht symmetrisch
sind, sondern stattdessen Oberflächen 444 und 448 auf
der unteren Oberfläche aufweisen,
die ausgelegt sind, um ankommendes Licht 480 als reflektiertes
Licht 470 von der optischen Achse weg und in die geometrische
Oberfläche 404 auf
der Innenseite der Objektivhalterung oder des Objektivgehäuses zu
reflektieren. Wenn die Außenkante
einer Linse 405 flach ist, da kann die Außenkante
flach schwarz gestrichen werden, um Reflexionen und Streulicht zu
reduzieren. Wenn die Kante der Linse es wie bei der doppelten konvexen
Linse 424 und der plankonvexen Linse 432 zulässt, wird
die Außenkante
zu einer feinen Spitze oder einer feinen Oberfläche poliert, so dass interne
Reflexionen oder Diffusionen minimiert werden. Streulicht im oberen Abschnitt
des Objektivs wird durch geometrische Lichteinfangflächen 416 auf
den Linsenhalterungen 408 gesteuert. Die oberen Linsen
werden in der Komponente 412 mit den Linsen 424 und 432 und
den geometrischen Lichteinfangflächen 420, 422, 428 angebracht.
Streulicht wird durch eine Aperturblende 440 und ihre innere
geometrische Lichtsteuerfläche 436, die
in Verbindung mit der Oberfläche 347 wirken,
am Verlassen des Objektivs gehindert. Reflexionen von der Röhrenlinse
oder dem Abbildungsmittel werden weiter durch eine geometrische
Lichteinfangfläche 436 gesteuert.
-
Die
oben beschriebenen Ausführungsformen der
Erfindung sollen Beispiele der vorliegenden Erfindung sein und Änderungen
und Abwandlungen können
daran durch die Fachleute vorgenommen werden, ohne vom Umfang der
Erfindung abzuweichen, die lediglich durch die hierzu anliegenden
Ansprüche definiert
ist.