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Hintergrund
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Die
Festbettfermentation wird schon seit Jahrhunderten ausgeführt, zumeist
in Verbindung mit der Nahrungsmittelherstellung, und kann als Technik definiert
werden zum Züchten
von Mikroorganismen wie Pilzen, Hefen und Bakterien, auf feuchten
festen Substraten. In den letzten Jahren war eine Wiederkehr des
Interesses an der Festbettfermentation und dessen Anwendbarkeit
für die
Herstellung von Enzymen, Metaboliten und organischen Verbindungen festzustellen.
Vorrichtungen für
die Festbettfermentation weisen einige Vorteile verglichen mit den
normalerweise verwendeten Flüssigfermentierungsverfahren
bezogen auf die Produktausbeute, Kosten und Einfachheit der Verwendung
auf. Trotz ihrer ökonomischen
Vorteile war die Kommerzialisierung von Befürchtungen für die Festbettfermentation
wegen des Fehlens von effizienten und praktischen Ausführungen
begrenzt.
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Eine
große
Vielzahl an Festbettfermentationsvorrichtungen wurden bereits beschrieben
(siehe zusammenfassend, Larroche et al., "Special Transformation Process Using
Fungal Spores and Immobilized Cells", Adv. Biochem. Eng. Biotech., (1997), Band
55, Seiten 179ff; Roussos et al., "Zymotis: A large Scale Solid State Fermenter", Applied Biochemistry
and Biotechnology, (1993), Band 42, Seiten 37-52; Smits et al., "Solid-State Fermentation-A
Mini Review, 1998), Argro-Food-Industriy Hi-Tech, März/April Seite
29-36). Diese Vorrichtungen bilden zwei Kategorien, wobei diese
Kategorien statische Systeme und gerührte Systeme sind. In statischen
Systemen liegt das feste Medium während des Fermentationsprozesses
stationär
vor. Beispiel für
statische Systeme, die für
die Festbettfermentation verwendet wurden umfassen Flaschen, Petrischalen,
Schalen, Festbettsäulen
und Sterilisatoren. Gerührte
Systeme stellen Mittel für
das Mischen des festen Mediums während
des Fermentationsverfahrens bereit. Ein Hauptproblem sowohl bei
statischen als auch bei gemischten Festbettfermentationssystemen
ist es, eine wirksame Entfernung der während des Fermentationsverfahrens
gebildeten Wärme
zu erreichen. Eine Methode, die Wärme zu entfernen, welche bei
verschiedenen Festbettfermentationssystemen verwendet wird, ist
die Belüftung.
Der Nachteil der Verwendung der Belüftung als Mittel zur Entfernung
von Wärme
ist es, dass nicht nur die Wärme
entfernt wird, sondern dass auch Wasser aus der festen Matrix entfernt
wird, wodurch es zur Austrocknung des Substrats kommt. Eine konstante
Belüftung
macht es außerdem
schwieriger, ein stabiles Milieu im Inneren des Bioreaktors hinsichtlich
der Konzentrationen an Sauerstoff und Kohlendioxid beizubehalten.
Ein anderes Mittel, um die Wärmebildung
zu vermeiden ist das Rühren
des Substratwerts. Unglücklicherweise führt das
Rühren
während
der Fermentation zur Beschädigung
der Zellen und zur groben Aggregation von Substratpartikeln. Die
Aggregation des Substrats führt
zu Inhomogenitäten
der lokalen Substrattemperatur, woraus lokale Unterschiede im Wachstum
der Biomasse und der Aktivität
resultieren. Diese Probleme werden in den Systemen großen Maßstabs,
die meistens für
die industrielle Herstellung bestimmter Produkte notwendig sind,
verschlimmert. Die Durchführung
der Festbettfermentation in großem
Maßstab unter
Verwendung der im Fachgebiet verfügbaren Vorrichtung weist weiterhin
den zusätzlichen
Nachteil auf, dass sie arbeitsintensiv sind.
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Die
mit der Festbettfermentation verbundenen Stufen umfassen, 1) die
Sterilisierung der Kultivierungsvorrichtung und des Kultivierungsmediums, 2)
die Inokulation des Kultivierungsmediums mit den Mikroorganismen,
3) die Kultivierung der Mikroorganismen, 4) die Extraktion der biologischen
Produkte aus den kultivierten Mikroorganismen, und 5) nach der Extraktion
die Behandlung der Abfallmaterialien und der Kultivierungsvorrichtung.
Es ist außerdem wünschenswert,
dass das Kultivierungssystem einen Mechanismus bereitstellt, wodurch
die Wachstumsbedingung während
des Kultivierungsverfahrens präzise
kontrolliert wird, so dass ausgewählte Bedingungen während des
gesamten Kultivierungsverfahrens aufrecht erhalten werden. Keine
der heutzutage verfügbaren
Vorrichtungen für
die Festbettfermentation stellen sicher, dass alle für die Festbettfermentation erforderlichen
Stufen in einer einzigen Fermentationsvorrichtung ausgeführt werden.
Bis heute umfasst die Ausführung
der Festbettfermentation mehrfache Eingriffe, die sowohl lästig als
auch unpraktisch sind. Diese Eingriffe beinhalten oft das Risiko,
das Kultivierungsmilieu Kontaminanten von außerhalb des Kultivierungsmilieus
auszusetzen, schließen
die Möglichkeit
aus, die Kultivierung effizient und präzise zu kontrollieren, und
führen
zur reduzierten Produktqualität
und/oder Ausbeute.
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Es
besteht daher ein Bedarf nach einem kompakten Reaktor, der alle
mit der Festbettfermentation in Zusammenhang stehenden Abläufe kombiniert
in einer einzigen Vorrichtung, welche fähig ist, auf abgeschlossene
Art und Weise zu arbeiten, und das Milieu innerhalb des Bioreaktor
zu kontrollieren, ohne das Wachstum der Mikroorganismen zu inhibieren.
Weiterhin besteht Bedarf nach einer Vorrichtung, die die homogene
Zufügung
von Chemikalien und Nährstoffen
in den Bioreaktor ohne Kontamination erlaubt.
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GB-A-1,156,739,
US-A-4,212,949 und Ep-A-0,225,479 stellen Stand der Technik auf
dem Gebiet der vorliegenden Erfindung, welche wie in den Ansprüchen beansprucht
ist, dar.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine verbesserte Vorrichtung für die Festbettfermentation
zur Kultivierung von Mikroorganismen bereit. Im Allgemeinen stellt
die Erfindung einen Bioreaktor und ein Verfahren zur Verwendung
des Bioreaktors für
die Kultivierung von Mikroorganismen auf festen Medien bereit. Die
Anmelder bezeichnen den Bioreaktor der vorliegenden Erfindung im
Weiteren als PLAFRACTORTM. In bevorzugten
Ausführungsbeispielen stellt
die Erfindung einen Bioreaktor bereit, welcher von modularem Aufbau
ist, und alle Verfahren der Festbettfermentation in einem einzigen,
abgeschlossenen Milieu ausführt.
Der modulare Aufbau des Bioreaktors erlaubt es, die Größe des Bioreaktors
den Bedürfnissen
des Nutzers anzupassen. Die Konstruktion des Bioreaktors erlaubt
es, die Festbettfermentation so auszuführen, dass die fermentierten
Mikroorganismen isoliert von der äußeren Umgebung während des
Verlaufs des Fermentationsverfahrens gehalten werden können. In
bestimmten bevorzugten Ausführungsbeispielen
wird das Milieu innerhalb der Module präzise kontrolliert, um die gewählten Bedingungen
einzuhalten.
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Ein
Gesichtspunkt des Bioreaktors ist ein Mechanismus zur Entfernung
von Wärme,
die während
der Fermentation im Innern des Bioreaktors akkumuliert durch Ableitung.
Insbesondere wird der Bioreaktor durch Stapel individueller Module
konstruiert. Die modulare Konstruktion des Bioreaktors stellt mehrfache
Module bereit, die aufeinander gestapelt sind, wobei jedes eine
Basis aufweist, welche mit einem Rahmen verbunden ist, zur Aufnahme
des festen Mediums isoliert von der äußeren Umgebung. Die Basisplatte
des Bioreaktors weist mehrfache Kanäle auf, die nicht kommunizierende
Kanäle
genannt werden, die Erwärmungs-
und Abkühlungsfluide,
die zwischen zwei Folien gesandwicht sind, abgeleitet. Wärme wird
in und aus den Modulen über
Ableitung transferiert. Auf diese Weise wird die Temperatur der Module
präzise
beibehalten, um den spezifischen Anforderungen der unterschiedlichen
Mikroorganismen Genüge
zu tun.
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Ein
anderer Gesichtspunkt des Bioreaktors ist ein Mechanismus, flüssige Stoffe
in das Innere der Module hinzuzufügen. In diesem Ausführungsbeispiel
umfasst die oben erwähnte
Basis der Module einen zweiten Satz an Kanälen, die kommunizierende Kanäle genannt
werden, die flüssige
Stoffe in das Innere der Module liefern, und so eine Möglichkeit
bereitstellen, den Feuchtigkeits- und Sauerstoffgehalt im Bioreaktor
einzustellen. Beispielsweise brauchen manche Mikroorganismen für das optimale
Wachstum hohe Kohlenstoffdioxidkonzentrationen. Ein anderer Gesichtspunkt
dieses Ausführungsbeispiels stellt
einen Mechanismus bereit, durch den interessierende Verbindungen
aus den Mikroorganismen extrahiert werden können. Beispielsweise können Extraktionsfluide
durch die kommunizierenden Kanäle
zur Extraktion von interessierenden Verbindungen zur Sammlung geschickt
werden. In noch einem weiteren Gesichtspunkt dieses Ausführungsbeispiels können die
kommunizierenden Kanäle
Dampf, Gas (z. B. Ethylenoxid oder Ozon), oder Chemikalien (z. B.
beta-Propiolakton, Wasserstoffperoxyd oder Pyrocarbonsäure-Diethylester) in
den Bioreaktor zur Sterilisation des Bioreaktors und dessen Inhaltsstoffen vor
und nach der Fermentation führen.
Ein Schlussaspekt der vorliegenden Erfindung ist es, dass Materialien
(z. B. Chemikalien und/oder Nährstoffe)
dem Bioreaktor zugeführt
werden können,
während
der Bioreaktor betrieben wird.
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In
einem weiteren Ausführungsbeispiel
stellt die vorliegende Erfindung einen Mechanismus bereit, um den
Inhalt des Bioreaktors zu mischen. Erfindungsgemäß weist das Innere jeden Moduls
einen Mischungsarm auf, der während
der Rotation sich um die zentrale Achse des Moduls dreht. Das Mischen kann
zu jedem Punkt des Fermentationsverfahrens ausgeführt werden,
wenn das Mischen für
wesentlich angesehen wird. Vorzugsweise wird das Mischen nach der
Inokulation des Mediums innerhalb des Bioreaktors durchgeführt, um
das Inokulum gleichmäßig in dem
Medium innerhalb des Bioreaktors zu verteilen.
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Die
Lehren der vorliegenden Erfindung sind insbesondere für die Produktion
und Extraktion von mikrobiellen Produkten anwendbar. In bestimmten bevorzugten
Ausführungsbeispielen
produzieren die Mikroorganismen biologisch verwendbare Produkte, welche
aus dem Mikroorganismus in dem Bioreaktor extrahiert werden können und
für medizinische
und industrielle Verwendungen geerntet werden. Einige Beispiele
für medizinische
Produkte, die erfindungsgemäß hergestellt
werden können,
sind Lovastitin und Cyclosporin. Ein Produkt, das für industrielle
Anwendungen verwendbar ist, umfasst das mikrobielle Enzym Rennet
und Peptidase. Eine Vielzahl von mikrobiellen Organismen können erfindungsgemäß verwendet
werden.
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Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
eine schematische Darstellung eines zirkulären Bioreaktors.
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2 ist
eine schematische Darstellung eines rechteckigen Bioreaktors.
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3 ist
eine schematische Darstellung der kommunizierenden und nicht kommunizierenden
Kanäle
in einer Basisplatte und der Anordnung der Basisplatte und der Rahmen,
um einen vertikalen Stapel zu bilden.
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4 ist
eine schematische Darstellung eines Modulstapels, welcher mit Gummidichtungen verschlossen
ist, und eine Überblicksansicht
der kommunizierenden und nicht kommunizierenden Kanäle in einem
einzelnen Modul.
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5 ist eine schematische Darstellung, wobei
die Emitter- und Sammelplatten (oben) und das Fließen der
Fluide durch den Bioreaktor während
der Sterilisierung (Mitte) und der Extraktion (unten) dargestellt
sind.
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6 ist
ein Diagramm eines Mischungsarms mit Schaufeln.
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Detaillierte
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele
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Definitionen
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"Festbettfermentation" oder "Festbettkultivierung": Der Ausdruck "Festbettfermentation" oder "Festbettkultivierung", teilweise als "Halb-Festbettfermentation" bezeichnet, bedeutet
vorliegend ein Verfahren zur Fermentierung von Mikroorganismen auf einem
festen Medium, welches Verankerungspunkte für die Mikroorganismen in Abwesenheit
von jeglicher frei fließender
Substanz bereitstellt. Die Menge an Wasser in dem festen Medium
kann jede Menge an Wasser sein. Beispielsweise kann das feste Medium
praktisch trocken sein oder es kann matschig sein. Der Fachmann
weiß,
dass die Ausdrücke "Festbettfermentation" und "Halb-Festbettfermentation" austauschbar sind.
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"Bioreaktor": Der Ausdruck "Bioreaktor" bedeutet vorliegend
eine Vorrichtung, welche fähig
ist, Fermentationsmedien, welche mit Mirkoorganismen inokuliert
sind, aufzunehmen, und im geschlossenen Betrieb ein Verfahren zur
Festbettfermentation auszuführen.
Ein Bioreaktor kann zur Zucht von jeglichem Mikroorganismus verwendet
werden, welcher fähig
ist, unter gewählten
Bedingungen in einem geschlossenen Milieu zu wachsen. Einige Beispiele
für Mikroorganismen
die fähig
sind, in ein einem Bioreaktor zu wachsen, sind Pilze, Hefen und
Bakterien. Insbesondere bevorzugte Mikroorganismen sind Pilze. Erfindungsgemäß verwendbare
Pilze umfassen septierte und nicht septierte Pilze. Septierte Pilze können extrazellulär oder intrazellulär septierte
Pilze sein.
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"Kultivierungsanlage": Mit dem Ausdruck Kultivierungsanlage
wird vorliegend ein Bioreaktor bezeichnet, mit dem Mikroorganismen
in einem geschlossenen Milieu gezüchtet werden können, einschließlich des
Hilfsequipments, welche nötig
ist, um die Bioreaktorvorrichtung zu betreiben. Eine erfindungsgemäße Kultivierungsanlage
besteht aus mehreren verbundenen Modulstapeln in Kombination mit Hilfsequipment,
welches mit dem Betrieb der Kultivierungsanlage verbunden ist. Einige
Beispiele für
solches Hilfsequipment sind Temperatursonden, Feuchtigkeitssensoren,
Abgasanalysatoren, Drucksensoren, Luftströmungssensoren, Anzuchtsfermenter, Wasser-
oder Nährstoffzusatztanks,
Kontrollrohrgerüste
und Gewichtssensoren. Verschiedene weitere Hilfsmittel, die durch
einen Computer automatisiert werden können, umfassen die Bewegung
von Kühlwasser,
Dampf und gefilterter kondensierter Luft. Andere schließen den
Vakuumbetrieb, den Impftransfer, das Zufügen von Wasser oder Nährstoffen
zu den Modulen und die Kontrolle des Rohrgerüsts ein. Beispiele für ein solches
Hilfsequipment und die Automatisierung durch Computer sind im Fachgebiet
bekannt.
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"Module": Wie hier verwendet,
bezeichnet der Begriff Modul eine Struktur, die aus einer Basisplatte
und einem Rahmen gebildet wird. Die Basisplatte bildet den Boden
und der Rahmen bildet die Seiten der Struktur, welche als Behältnis für die Aufbewahrung
des Mediums dienen kann. Die einzelnen Module weisen weitere Komponenten
auf, die die Kontrolle des Milieus des Moduls erlauben, beispielsweise
Rührarme
sowie kommunizierende und nicht kommunizierende Kanäle, welche
weiter unten detailliert beschrieben werden. Individuelle Module
können
aufeinander gestapelt werden, um so ein abgeschlossenes inneres
Milieu zu bilden, welche das Austreten des Inhalts der Module in
die äußere Umgebung
verhindert, und auch die Kontamination des Inneren der Module mit
Partikeln aus der Umgebung außerhalb
der Module verhindert.
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"Stapel": Wie hierin verwendet,
bedeutet der Ausdruck "Stapel" die Vielzahl von
Modulen innerhalb der Kultivierungsanlage, die aufeinander platziert
sind, um einen Bioreaktor mit einstellbarer Höhe zu bilden.
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"Abgeschlossen": Der Ausdruck "abgeschlossen", wie hierin verwendet,
deckt sowohl die Definitionen für "abgeschlossen" als auch "aseptisch" ab. Das Wort "abgeschlossen" impliziert, dass
es möglich
ist, die Mikroorganismen, die innerhalb des Bioreaktors wachsen,
zu umschließen
(z. B. lebende Mikroorganismen aus dem Reaktor können nicht mit der Umgebung
in Kontakt treten und die Umgebung verschmutzen). Diese Eigenschaft
ist insbesondere günstig,
wenn der Bioreaktor zur Kultivierung von pathogenen Mikroorganismen
oder genetisch modifizierten Mikroorganismen verwendet wird, bei
denen örtliche
Gesetzgebungen meistens das Wachsen in einem geschlossenen Milieu
erforderlich machen. Die Definition des "Abgeschlossenseins" fokussiert damit darauf, dass die Umgebung
vor dem Reaktorinhalt geschützt
ist, und nicht dass der Reaktorinhalt vor der Umgebung geschützt ist.
Beispielsweise ist es möglich,
Abgeschlossensein sicherzustellen, indem man einen geringen Systemdruck
etabliert, welches Dinge aus der Außenumgebung in den Bioreaktor
verfrachtet, es jedoch nicht erlaubt, dass der Inhalt des Bioreaktors
die Außenumgebung
kontaminiert.
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Die "aseptische" Art und Weise, auf
welcher der Bioreaktor der vorliegenden Erfindung betrieben wird,
liegt darin, den Inhalt des Bioreaktors vor Kontamination durch
die Umgebung zu bewahren. Eine aseptische Betriebsweise ist nützlich,
da nur die gewünschten
Mikroorganismen innerhalb des Bioreaktors wachsen dürfen, um
ein homogenes Zielprodukt reproduzierbar zu produzieren. Das aseptische
Milieu stellt sicher, dass die fertigen Produkte nicht mit einem
unbekannten externen Mikroorganismus kontaminiert sind, welches
Variabilität
in den Produktionsprozess eindringen würden.
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Daher
wird der Bioreaktor in abgeschlossener Weise betrieben, d. h. der
Bioreaktor schützt
den Inhalt des Bioreaktors vor der Kontamination aus der Umgebung
und beschützt
die Umgebung vor seinem Inhalt. Andere vorteilhafte Gesichtspunkte
des Bioreaktors, welcher in einem abgeschlossenen Milieu betrieben
wird, ist es, dass der Feuchtigkeitsinhalt, der Sauerstoffinhalt
und die Temperatur präzise
kontrolliert werden können,
um die geforderten Bedingungen einhalten zu können.
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"Natürlich hergestellt": Der Ausdruck "natürlich hergestellt" bedeutet wie vorliegend
verwendet ein Protein oder ein chemisches Produkt, welches von einem
Mikroorganismus in dessen natürlicher Umgebung
ohne menschliche Intervention oder genetische Manipulation hergestellt
ist.
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"Genetisch verändert": Der Ausdruck "genetisch verändert" oder "genetisch modifiziert" wird vorliegend
bezüglich
jeglichen biologischen Produkts verwendet, welches durch einen Mikroorganismus als
Resultat einer menschlichen Intervention durch genetische Manipulation
hergestellt wird oder der Mikroorganismus selbst wurde durch genetische
Manipulation oder rekombinante DNA-Technologie gentechnisch verändert. Beispielsweise
kann ein Gen, welches für
ein ausgewähltes
interessierendes Protein kodiert, in einen Mikroorganismus über rekombinante
DNA-Technologie eingeführt
werden, so dass der Mikroorganismus das Protein produziert (siehe Ausubel
et al., "Current
Protocols in Molecular Biology",
Greene Publishing Associates, New York, V, 1 & 2 1996).
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"Fluid": Der Ausdruck "Fluid" bedeutet wie vorliegend
verwendet, jede Substanz, welche durch einen kommunizierenden oder
nicht kommunizierenden Kanal geführt
werden kann. Einige nicht begrenzende Beispiele für Fluide
sind Wasser, Dampf und sterile Luft. Das Fluid kann jedes Nährmedium sein,
welches Mikroorganismen enthält.
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"Kanäle": "Kanäle" wie vorliegend verwendet bedeutet
jegliche Transportleitung, welche fähig ist, eine Substanz zu leiten,
beispielsweise Luft oder Wasser. Wie hierin verwendet umfasst Kanäle sowohl
kommunizierend als auch nicht kommunizierende Kanäle. Kanäle können sich
von Röhren
(oder Leitungen) unterscheiden, da Röhren nur ein besonderer Typ
einer Konstruktion sind, welche Leitungssysteme für das Fortleiten
von Fluiden bilden. Beispielsweise umfasst eine Basisplattenkonstruktion
das Verschmelzen von Röhren
ineinander. Die Röhren dienen
als kommunizierende und nicht kommunizierende Kanäle.
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Festbettfermentation
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Wie
oben erwähnt,
stellt die vorliegende Erfindung einen Bioreaktor zur Kultivierung
von Mikroorganismen auf einen Festbett unter ausgewählten Bedingungen
bereit. Der Bioreaktor ist so konstruiert, dass er alle Betriebsabläufe kombiniert,
welche mit dem Durchführen
einer Festbettfermentation in einer Vorrichtung in Verbindung stehen,
wobei die Betriebsabläufe
umfassen
- (a) das Sterilisieren der Kultivierungsvorrichtung und
des innerhalb der Vorrichtung angeordneten Kultivierungsmediums;
- (b) Inokulieren des Kultivierungsmediums mit den Mikroorganismen;
- (c) Kultivieren der Mikroorganismen unter ausgewählten Bedingungen;
- (d) Extraktion der biologischen Produkte aus den kultivierten
Mikroorganismen;
- (e) die Nachextraktionsbehandlung der Abfallmaterialien und
der Kultivierungsvorrichtung.
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Die
Vorrichtung der vorliegenden Erfindung stellt deutliche Vorteile über bekannte
und existierende Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen auf
festen Medien auf den Gebieten der Eindämmung, der Materialbehandlung,
der Kontrolle des Kultivierungsverfahrens, dem Zusetzen von chemischen
Nährstoffen
während
des Verfahrens, der Extraktion der Zielprodukte und der Behandlung
der Rückstände vor
der Abfallentsorgung bereit. Die Eindämmung, wie hierin verwendet,
betrifft sowohl die abgeschlossene als auch die aseptische Natur
des Bioreaktors. Beispielsweise wird der Reaktor in einer abgeschlossenen
Art und Weise betrieben, indem der Inhalt des Bioreaktors vor Verunreinigung
aus der Außenumgebung
geschützt
wird (Betrieb in aseptischer Art und Weise) und indem die Umgebung
vor potenziell gefährlichen
oder pathogenen Mikroorganismen, welche im Bioreaktor wachsen, geschützt wird
(Betrieb in abgeschlossener Art und Weise). Die geschlossene Natur
dieser Vorrichtung erlaubt es, den gesamten Prozess der Festbettfermentation
isoliert von der Außenumgebung
durchzuführen,
wodurch zusätzlich
der Vorteil des Aufrechterhaltens eines sterilen Milieus während des
gesamten Fermentationsverfahrens sicher gestellt wird. Die geschlossene
Natur des Bioreaktors der vorliegenden Erfindung stellt weiterhin
die Möglichkeit
bereit, dass in situ sterilisiert, inokuliert und die Temperatur
des Fermentationsmediums und der Feuchtigkeitsgehalt kontrolliert
werden kann. Außerdem
kann die Extraktion der biologischen Produkte aus dem Fermentationsmedium
erreicht werden, ohne dass der Reaktor geöffnet oder abgebaut werden
muss. Nach der Extraktion des Produkts kann der Reaktorinhalt in
situ sterilisiert werden. Der Reaktor kann dann abgebaut werden,
um das sterilisierte, verbrauchte Substrat zu entfernen, wonach
er gesäubert
und im nächsten Fermentationszyklus
wieder verwendet werden kann.
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Der
Reaktor erreicht die Geschlossenheit auf folgenden Arten:
- 1) Der Bioreaktorinhalt wird vor der Inokulation sterilisiert,
um alle Mikroorganismen im Innern des Bioreaktors vor dem Start
des Fermentationsverfahrens zu eliminieren.
- 2) Der Transfer des Inokulums von den Anzuchtsgefäßen zu dem
Bioreaktor kann erreicht werden, ohne die Mikroorganismen der Umgebung
auszusetzen (z. B. durch versiegelte, sterilisierte Röhren, die
mit dem Anzuchtsgefäß und dem
Reaktor verbunden sind, wobei der Transfer über eine Druckdifferenz zwischen
dem Anzuchtsgefäß und dem
Bioreaktor stattfindet). Dieses Verfahren schützt die Mikroorganismen, welche überführt werden
ebenfalls vor Kontamination durch die Umgebung.
- 3) Luft, die aus dem Reaktor ausgeblasen wird (welche möglicherweise
Sporen der kultivierten Mikroorganismen trägt), wird durch einen Abgasfilter
geführt,
der Mikroorganismen abtrennen kann (solche Abgasfilter sind auf
dem Fachgebiet gut bekannt und werden als Standardequipment für Flüssigkulturen
verwendet). Luft, die in den Bioreaktor geführt wird, kann in gleicher
Weise gefiltert werden, um die Kontamination des Reaktorinhalts
zu verhindern.
- 4) Nachdem das Produkt aus dem Bioreaktor extrahiert wurde,
kann der Reaktor in situ sterilisiert werden. Bevor die Vorrichtung
geöffnet
wird, wird jeglicher lebender Mikroorganismus in dem Reaktor zerstört, bevor
dessen Inhalt in Kontakt mit der Umgebung gebracht wird.
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Der Bioreaktor
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Der
erfindungsgemäße Bioreaktor
(siehe 1-5) ist in Form
von mehrfachen individuellen Modulen 3 konstruiert, welche
aufeinander gestapelt werden können,
um einen "Stapel" 4 jedweder
gewünschten
Höhe zu
bilden. Die aufeinander gestapelten Module arbeiten parallel, wodurch
eine einzelne funktionale Einheit gebildet wird, die hierin als "Kultivierungsanlage" oder "Bioreaktor" bezeichnet wird.
Der Bioreaktor kann aus jedwedem geeigneten Material konstruiert
sein, welches den Betrieb gestattet, wobei zwei Beispiele, welche
nicht begrenzend verstanden werden sollen, rostfreier Stahl und
Polykarbonat sind. Jedes individuelle Modul weist eine Platte 2 auf,
die den Boden des Moduls bildet und einen Rahmen 1, welcher
die Seiten des Moduls bilden. In gewissen bevorzugten Ausführungsbeispielen
ist der Umriss des Moduls ein Quadrat. Beispielsweise ein quadratischer
Rahmen, angebracht auf einer quadratischen Basisplatte. In einem
anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel
ist der Umriss des Moduls resteckig. In anderen bevorzugten Ausführungsbeispielen
ist der Umriss des Moduls kreisförmig.
Vorzugsweise ist der Umriss des Moduls kreisförmig.
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Die
Platte 2 bildet die Basis des Moduls und wird hierin als "Basisplatte" bezeichnet. Der
Rahmen 1 ist auf der Basisplatte angebracht und ist so
abgedichtet, dass Undichtigkeit von innerhalb der Module gegenüber der äußeren Umgebung
verhindert wird. Ein nicht begrenzendes Beispiel für eine Dichtung
ist eine Gummidichtung 5, welche zwischen dem Boden der
Basisplatte 2 eines Moduls und dem Rand des Rahmens 1 eines
anderen Moduls liegt, und durch Kompression oder nach unten gerichteten
Druck befestigt wird, um sicherzustellen, dass die Dichtung sicher
ist. Der Rahmen 1 bildet die Seiten des Moduls und seine
Funktion besteht darin, ein Behältnis
zu bilden, welches das Medium aufnimmt. Die Höhe des Rahmens ist vorzugsweise
4-8 cm. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das innerhalb
des Bioreaktors 6 angebrachte Medium ein festes Medium. Erfindungsgemäß können Mikroorganismen,
welche fähig
sind auf festem Medium zu wachsen, kultiviert werden. Die Abmessung
des Moduls und die Größe des Modulstapels
kann variieren und in Anpassung an die Umstände, unter denen es verwendet
wird, eine bestimmte Größe annehmen.
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Die
Basisplatte kann eine von zwei Basiskonstruktionen darstellen. In
einem Ausführungsbeispiel
ist die Basisplatte aus Röhren 7 konstruiert,
die zwischen zwei flache Blätter
aus irgendeinem Material, welches fähig ist, Wärme zu leiten 8, eingelegt sind.
Die Röhren
sind voneinander räumlich
getrennt, wodurch ein Kanal zwischen benachbarten Röhren gebildet
werden kann. Die Seiten der Kanäle
sind durch die Röhren
gebildet und die obere und untere Begrenzung des Kanals werden durch
die flachen Blätter
gebildet. Diese Kanäle
sind die nicht kommunizierenden Kanäle, wie weiter unten noch detaillierter diskutiert
werden wird. In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird die Basisplatte
durch nebeneinander legen einer Vielzahl von Röhren auf einer flachen Ebene
und Verschweißen
derselben konstruiert. In diesem besonderen Ausführungsbeispiel brauchen die
Röhren
nicht zwischen die Blätter
eingelegt zu werden.
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Wie
oben erwähnt,
können
die Module jede geeignete Größe oder
jeden geeigneten Umfang annehmen. In einer quadratischen oder rechteckigen Konstruktionsform
laufen die Kanäle 7 parallel
zueinander. Beispielsweise Nebeneinanderlegen einer Vielzahl von
Röhren
auf einer flachen Ebene und Verschweißen derselben 10.
In einer kreisförmigen Konstruktion
(siehe 3) strahlen eine Serie von Röhren 7 in einem kreisförmigen Muster
von der Zentralachse des Moduls aus.
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Es
ist ein wichtiger Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung, dass
zwei getrennte Serien von Kanälen
gebildet werden, wobei diese die kommunizierenden 11 und
die nicht kommunizierenden 12 Kanäle sind. Die kommunizierenden
und nicht kommunizierenden Kanäle
alternieren jeweils bezogen auf ihre Anordnung auf der Basisplatte 2.
Die kommunizierenden Kanäle
tragen Fluide in das Modul, so dass die Fluide mit dem Inneren des
Moduls in Kontakt kommen. Die kommunizierenden Kanäle in ihrer zirkulären Konstruktion
verzweigen sich auch in Form eines "Y" bei
dem Ausstrahlen, um eine gleichförmigere
Verteilung der Fluide, welche durch die Röhren in das Innere des Moduls
gelangen, sicherzustellen. In die kommunizierenden Kanäle 11 gebohrte Löcher 13 erlauben
es den Fluiden aus den kommunizierenden Kanal 11 auszutreten
und beispielsweise mit der festen Matrix, welche im Modul 6 liegt,
in Kontakt zu treten. Die Löcher 13 sind
so angebracht, dass jedes Loch 13 eine gleiche Oberflächen der Platte 2 bedient.
Löcher 13 werden
auch in die Metallblätter 8 gebohrt,
in welche die kommunizierenden 11 Kanäle eingebettet sind, die mit
den Löchern 13 in den
kommunizierenden Kanälen 11 abgeglichen sind,
so dass die von den kommunizierenden Kanälen 11 transportierten
Fluide in die Module 3 verteilt werden können. In
einem Modul einer quadratischen Konstruktion weisen die Löcher vorzugsweise
jeweils eine identische Distanz voneinander auf. In einem Modul
zirkulärer
Konstruktion 3 reduziert sich der Abstand zwischen den
Löchern
vorzugsweise vom Zentrum nach Außen progressiv, um den nicht
linearen Anstieg der Fläche
der Platte steigendem Radius zu kompensieren.
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Die
Fachleute auf dem Gebiet werden verstehen, dass eine Vielzahl von
Fluiden durch die kommunizierenden Kanäle 11 verteilt werden
können.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
kann das Innere des Bioreaktors 6 durch Beschickung mit Dampf
durch die kommunizierenden 11 und die nicht kommunizierenden 12 Kanäle sterilisiert
werden.
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In
einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel
können
die kommunizierenden Kanäle 11 vor
der Sterilisation an einer Vakuumquelle angeschlossen werden, um
Luft aus dem Inneren des Bioreaktors zu entfernen. Die Sterilisierung
kann unter Verwendung von Dampf oder einem sterilisierenden Gas,
beispielsweise Ethylenoxid durchgeführt werden. Geeignete Bedingungen
für die
Sterilisierung unter Verwendung entweder von Dampf oder Gas können durch
die Fachleute auf dem Gebiet einfach bestimmt werden. In anderen
bevorzugten Ausführungsbeispielen
wird das Kulturmedium mit Mikroorganismen durch Beschickung mit
einem Fluid, welches die Mikroorganismen enthält, durch die kommunizierenden
Kanäle 11 angeimpft.
Das die Mikroorganismen enthaltenes Fluid kann ein Nährmedium
sein.
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Sobald
die Mikroorganismen im Innern des Bioreaktors wachsen, stellt ein
weiterer Gesichtspunkt der Erfindung sicher, dass das Milieu im
Innern des Bioreaktors über
die kommunizierenden Kanäle 11 eingestellt
werden kann. Beispielsweise kann die Feuchtigkeit des Moduls durch
Beschicken mit Wasser über
die kommunizierenden Kanäle 11 im
Modul eingestellt werden. Zusätzlich
können
chemische Chemikalien und/oder Nährstoffe
durch die kommunizierenden Kanäle
eingebracht werden, während der
Bioreaktor betrieben wird (ein Verfahren, welches auf dem Fachgebiet
als "fed batch" bezeichnet wird). Das
Beschicken mit Chemikalien und/oder Nährstoffen wird so ausgeführt, dass
die Verteilung der Chemikalien und/oder Nährstoffe homogen ist (z. B. gleichförmige Verteilung
im gesamten Bioreaktor). Beispielsweise ist es vorteilhaft, Zucker
dem Fermentationsmedium zuzufügen,
sobald die Fermentation in Gange ist. Die Möglichkeit, dem Mikroorganismen kontinuierlich zu
füttern,
anstelle der Gabe einer begrenzten Startmenge von Nährstoffen,
die während des
gesamten Fermentationsverfahrens ständig abnimmt (z. B. wie es
bei der festen Oberflächenfermentation
der Fall ist), resultiert in einer höheren Produktqualität und einer
größeren Produktausbeute. Außerdem kann
das Wachstum der Mikroben inhibiert werden, wenn ein Nährstoffbolus
am Beginn des Fermentationsverfahrens gegeben wird. Es wird bevorzugt,
dass die Nährstoffe
für ein
optimales Wachstum der Mikroorganismen auf einen nicht inhibitorischen
Spiegel begrenzt werden.
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Alternativ
hierzu können
die kommunizierenden Kanäle 11 verwendet
werden, um den Sauerstoffgehalt innerhalb des Moduls durch Beschicken mit
steriler Luft durch die kommunizierenden Kanäle 11 einzustellen. Ähnlich kann
der Kohlendioxid- oder der Stickstoffgehalt des Moduls bestimmten
Bedingungen angepasst werden, wobei der Bereich verglichen mit der
Flüssigfermentation
signifikant verbessert ist. Tatsächlich
kann jedwedes Gas in präzise kontrollierten
Mengen dem Bioreaktor zugefügt
werden. Damit bietet die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung
deutliche Vorteile, die vorher auf dem Fachgebiet nicht erreichbar
waren.
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Sobald
die Mikroorganismen die Wachstumsphase abgeschlossen haben kann
es wünschenswert
sein, zur Abtrennung der interessierenden biologischen Verbindungen
Extraktionsfluide, wie organische Lösungsmittel, durch die kommunizierenden Kanäle 11 zu
beschicken. Wie noch gezeigt werden wird, können die Abfallmaterialien
nach Vervollständigung
des Extraktionsverfahrens in geeigneter Weise beispielsweise über Sterilisation
oder irgend ein anderes für
den gebildeten Abfall geeignetes Mittel behandelt werden, während sie
noch immer im Bioreaktor enthalten sind. Diese Beispiele sollen
die Vielzahl von Fluiden demonstrieren, die über die kommunizierenden Kanäle 11 in
das Innere des Bioreaktors geführt
werden können,
und sollen nicht den Umfang der Verwendbarkeit der kommunizierenden
Kanäle 11 beschränken.
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Es
ist ein anderer Gesichtspunkt der erfindungsgemäßen Konstruktion, dass die
kommunizierenden Kanäle 11 mit
einem Verteilungsanschluss 14 verbunden sind, welcher Fluide
an die kommunizierenden Kanäle 11 sendet.
Die Lage des Verteilungsrings 15 kann abhängig von
dem Umriss des Moduls 3 variieren. In der quadratischen
Konstruktion (1, 2 und 4)
der vorliegenden Erfindung ist der Verteilungshahn 14 an
einem Ende des Moduls platziert. In der zirkulären Konstruktion der vorliegenden
Erfindung ist ein „Verteilungsring" 15 zentral
angebracht, wobei die kommunizierenden Kanäle 11 nach außen von
dem zentralen Verteilungsring 15 ausstrahlen.
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Der
Bioreaktor wird weiterhin so zusammengefügt, dass die aufeinander folgenden
Platten des Stapels als Emitter- 23 und Sammelplatten 24 bezeichnet
werden (siehe 5). Die Emitterplatten 23 ermöglichen
es, dass Fluide in den Bioreaktor gelangen und die Sammelplatten 24 erlauben
die Passage von Fluiden aus dem Bioreaktor. In den Röhren, welche
die Fluide diesen Platten zuführen,
sind Ventile vorhanden. Die Röhren
und Ventile sind an den kommunizierenden Kanälen angebracht, welche Fluide transportieren,
die mit dem Medium innerhalb des Reaktors in Kontakt kommen. In
bevorzugten Ausführungsbeispielen
werden die Sterilisierung, die Inokulation und die Fermentation,
Dampf und Inokulation durch die Emitter- 23 oder Sammelplatte 24 werden
eingebracht oder ausgelassen. Die Fließrichtung kann wie je nach
Verfahren erforderlich umgekehrt werden. Ein Beispiel, welches die
Umkehrung der Flussrichtung erforderlich macht ist es, wenn ein Feuchtigkeitsgradient
in dem Bioreaktor aufgebaut worden ist. Die Belüftungsrichtung kann umgekehrt werden,
um die angehäufte
Feuchtigkeit in die andere Richtung zu bewegen.
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Während des
Sterilisierungs- und des Fermentierungsbetriebs stellen andere bevorzugte
Ausführungsbeispiele
Mittel für
den Aufbau eines Gegendrucks durch teilweises Verschließen der
Belüftungsventile
bereit. In einem letzten Ausführungsbeispiel werden
die Extraktionsfluide durch die oben liegende Emitterplatte 23 beschickt
und das extrahierte Material wird aus der unten liegenden Sammelplatte 24 entnommen.
Während
dieses Vorgangs sind die mit den dazwischen liegenden Platten verbundenen Ventile
geschlossen. Nur die Ventile an der oberen und der unten liegenden
Platte bleiben offen. Es ist ebenfalls möglich, durch Beschicken von
Extraktionsfluiden durch die unten liegende Emitterplatte 23 und über die
oben liegende Sammelplatte 24 zu extrahieren.
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Eine
besondere Eigenschaft der Konstruktion des Bioreaktors, welche das
Extraktionsverfahren möglich
macht, ist es, dass die kommunizierenden Kanäle der Zwischenplatten, die
zwischen der oben und der unten liegenden Platte liegen, auf der
gesamten Länge
Löcher
für die
Verteilung von Fluiden an die oberhalb und unterhalb liegenden Module
aufweisen. Die oben liegende Platte weist Löcher nur im Boden der Röhren auf,
welche die kommunizierenden Kanäle
bilden, und die Bodenplatte weist Löcher nur auf der Oberseite
der Röhren,
welche die kommunizierenden Kanäle
bilden, auf. Diese Eigenschaft erlaubt es, extrahierende oder andere
Fluide beispielsweise der oben liegenden Platte zuzufügen, von
wo die Fluide durch jede dazwischen liegende Platte bis zur Bodenplatte
sickern werden. Die extrahierte Substanz kann dann von der Bodenplatte
gesammelt werden. Natürlich
müssen
die durchreichenden Löcher
nicht auf die dazwischen liegenden Platten begrenzt sein. Zusätzlich kann
die Anordnung der durchreichenden Löcher auf der Röhre von der
oben beschriebenen abweichen, beispielsweise können die Löcher gegeneinander verschoben
anstelle von gegenüberliegend
liegen.
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Wie
auf dem Fachgebiet gut bekannt ist, können unter die Bodenplatte
und über
die oben liegende Platte konkave gewölbte Böden 21 angeordnet sein
(siehe 4), um den Extrakt, welcher durch die durchgehenden
Löcher
in den kommunizierenden Kanälen
in der oben liegenden und der unten liegenden Platte läuft, aufzunehmen.
Obwohl diese gewölbten
Böden für den Betrieb
des Bioreaktors nicht unbedingt notwendig sind, stellen sie jedoch
zusätzliche
Sicherheit bereit, falls der Reaktor unter hohem Druck betrieben
wird. Bei Geräten,
die unter Druck betrieben werden, sind gewölbte Böden Standard, da sie fähig sind,
dem Druck besser standzuhalten als flache Böden.
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Wie
oben ausgeführt,
bilden die Röhren kommunizierende 11 und
nicht kommunizierende Kanäle 12.
Die nicht kommunizierenden Kanäle 12 sind mit
den kommunizierenden Kanälen 11 alternierend angeordnet,
und im Gegensatz zu den kommunizierenden Kanälen 11 weisen sie
keine Bohrlöcher 13 auf.
Die nicht kommunizierenden Kanäle 12 transportieren
wärmende
und kühlende
Fluide durch die Basisplatte 2 und bewirken so die Kontrolle
der Temperatur des Milieus innerhalb des Moduls 3 über Ableitung.
Ein Beispiel für
ein Fluid, welches verwendet werden kann, um Modul 3 zu
erwärmen
oder abzukühlen,
ist Wasser. Alternativ hierzu kann jedes Fluid, welches das Modul 3 über Ableitung
erwärmen
oder abkühlen
kann, erfindungsgemäß verwendet
werden. Vorzugsweise wird die Temperatur innerhalb des Moduls 3 überwacht
und geregelt, um den spezifischen Bedingungen entsprechend des durchgeführten Verfahrens
einzustellen. In einem Ausführungsbeispiel
der vorliegenden Erfindung weist der Bioreaktor eine eingebaute
Sonde auf, welche fähig
ist, die Temperatur der Module zu überwachen. Erfindungsgemäß kann die
Temperatur innerhalb des Moduls 3 in einem Bereich von
Temperaturen eingestellt werden. Beispielsweise würde man
im Falle der Sterilisation des Bioreaktors die Module 3 auf
eine sehr hohe Temperatur erwärmen
wollen. In einem anderen Beispiel, wenn Mikroorganismen gezüchtet werden, würde man
die Temperatur in einem geeigneten Bereich für das Wachstum der ausgewählten Mikroorganismen
einstellen wollen.
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Die
nicht kommunizierenden Kanäle 12 der vorliegenden
Erfindung sind mit einem System von Kopfstücken 16 verbunden,
die um die Peripherie von Modul 3 herum platziert sind,
und ebenso zwischen die zwei Metallfolien 8 eingefügt sein
können. Dieses
Kopfstückarrangement 16 führt Fluide
zu den nicht kommunizierenden Kanälen 12. Wie oben erwähnt können die
Module 3 eine Vielzahl von Umrissen annehmen, und deswegen
kann das Kopfstückarrangement 16 ebenso
bezüglich
des Umfangs variieren, um zu dem Modul 3, an welches es
angefügt ist,
zu passen. Falls das Modul 3 ein Quadrat ist, kann das
Kopfstückarrangement 16 an
der Seite des Moduls 3 angebracht sein. Falls das Modul 3 zirkulär ist, muss
das Kopfstückarrangement 16 einen
geeigneten Durchmesser und Konstruktion aufweisen, um Fluide an
die nicht kommunizierenden Kanäle 12, welche
von dem Äußeren nach
innen auf das Zentrum des Moduls 3 gerichtet sind, abgeben
zu können.
Die entsprechende Variabilität
bezüglich
Größe und Konstruktion
trifft ebenso auf den Sammelanschluss 17 zu. Bei einem
quadratischen Modul 3 (siehe, 1) kann
der Sammelanschluss 17 an der Seite des Moduls 3 platziert
sein. Ist das Modul 3 (siehe, 3) zirkulär, verlassen
Fluide die Basisplatte durch einen "Sammelring" 17, welcher mit dem oben beschriebenen
Verteilungsring 15 konzentrisch ist, und gerade innerhalb
des Verteilungsrings 15 liegt. Der Durchmesser des inneren
Sammelrings 17 ist so gewählt, dass er größer ist
als der Durchmesser des Verteilungsrings 15, wodurch die
Fluide, welche von dem zirkulären
Kopfstück
an der Peripherie in die nicht kommunizierenden Kanäle 12 eintreten, über den
Verteilungsring 15 austreten und durch den Sammelring 17 nach
Innen oder Außen
fließen
können. Der
Fachmann wird verstehen, dass die oben beschriebenen Konstruktionen
nur als Beispiele verstanden werden können, und dass das Kopfstückarrangement 16 und
der Sammelanschluss 17 in irgendeiner Weise konstruiert
werden können,
die sicherstellt, dass deren Funktionen aufrechterhalten werden.
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Zusätzlich zu
der Basisplatte 2 und dem Rahmen 1 kann jedes
Modul auch eine Mischvorrichtung (4 18)
aufweisen. Die Funktion der Mischvorrichtung 18 ist es,
das feste Medium innerhalb des Moduls 6 zu rühren. Das
Rühren
kann beispielsweise ausgeführt
werden, nachdem das Medium mit dem Mikroorganismus inokuliert wurde.
Das Rühren
kann auch ausgeführt
werden während
des Extrahierens von biologisch verwendbaren Produkten aus dem Mikroorganismus.
Der Fachmann wird verstehen, dass das Rühren jederzeit während des
Fermentationsverfahrens ausgeführt
werden kann, falls das Rühren als
notwendig angesehen wird, obwohl vorzugsweise ein intensives Mischen
während
des Fermentationsprozesses nicht auftritt, da ansonsten potentiell
die Mikroorganismen geschädigt
werden können,
insbesondere Pilze.
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In
der vorliegenden Erfindung ist die Mischungsvorrichtung 18 vorzugsweise
im Zentrum des Moduls 3 platziert. In einem Gesichtspunkt
der Erfindung weist die Mischvorrichtung einen oder mehrerer Mischärme 22,
vorzugsweise 2 Mischärme, auf.
Die Mischärme
können
beispielsweise mit flachen Ruderblättern 25 (siehe 6)
ausgestattet sein, können
jedoch auch mit Zähnen
oder mit irgendeiner anderen Ausgestaltung ausgestattet sein, die
bei dem Mischen, welches für
die ausgewählte Anwendung
nötig ist,
für die
der Bioreaktor verwendet wird, hilfreich ist. Eine besonders bevorzugte Schaufelkonstruktion
ist es, wenn kurze Schaufeln um den Durchmesser des Mischarms herum
versetzt angeordnet sind, zwischen den kurzen Schaufeln jedoch keine
Lücke Seite
an Seite oder horizontale Überlappung
existiert.
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Unter
einem anderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung rotieren
die Mischärme
während sie
sich um die Zentralachse des Moduls drehen. Diese Rotation während der
Drehung kann durch zwei konzentrische Wellen 19 im Zentrum
der Mischvorrichtung erreicht werden, welche von zwei unabhängigen Motoren 20 angetrieben
werden. Die innere Welle kann die zwei Mischärme rotieren, während die äußere Welle
die Ärme
um die zentrale Achse des Moduls dreht. Die besondere Anordnung
der Wellen und Motoren wie sie hier beschrieben sind, sollen die Erfindung
nicht auf dieses eine Arrangement begrenzen. Jede Anordnung der
Mischvorrichtung, welche das gleichzeitige Drehen und Rotieren sicherstellt,
kann als innerhalb der Erfindung liegend angesehen werden. Beispielsweise
kann die vorliegende Erfindung einen Motor mit einen Planetengetriebesystem
verwenden.
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Ein
insbesondere bevorzugter Gesichtspunkt des Mischungsgesichtspunkt
der vorliegenden Erfindung ist es, dass die Geschwindigkeit der
Drehung des sich um die Zentralachse drehenden Arms auf einen präzisen Anteil
der Geschwindigkeit der Rotation des Arms eingestellt werden kann.
Dieser Gesichtspunkt betrifft das korrekte Mischen des Inhalts des
Bioreaktors, um eine Bewegung der Inhalte des Bioreaktors in großen Gebinden
zu verhindern. Um zu verhindern, dass die Inhalte des Bioreaktors
in einer kreisförmigen
Bewegung in einer Masse geschoben werden, dreht sich der Mischungsarm
nur um eine Strecke, die gleich ist zu der, welche über die das
vor dem rotierenden Arm liegende Medium anhebenden und es hinter
dem rotierenden Arm ablagernden, rotierenden Schaufeln bewegt werden
kann. Werden zwei getrennt Motoren verwendet, um die Mischungsvorrichtung
zu kontrollieren, kann die Geschwindigkeit jedes Motors getrennt
kontrolliert werden. Wird ein Motor verwendet, kann das Verhältnis der
Umdrehung nur zur Rotation durch die Getriebewahl präzise eingestellt
werden, so dass diese Bewegungen aufeinander abgestimmt werden,
um eine effiziente Mischung und eine gleichförmige Wiederverteilung der
Inhalte des Bioreaktors zu erreichen.
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Wie
schon erwähnt,
ist der Bioreaktor so konstruiert, dass die präzise Kontrolle des Milieus
im Innern des Bioreaktors 6 ermöglicht wird. Um dies zu ermöglichen
kann es wünschenswert
sein, den Bioreaktor mit Sonden auszustatten, die das Milieu im Innern
des Bioreaktors überwachen
können.
Es können
Sonden zur Überwachung
der Temperatur, der Feuchtigkeit, der Sauerstoffkonzentration oder
der Kohlenstoffdioxidkonzentration im Innern des Bioreaktors 6 nötig sein.
Andere Sonden umfassen Analysevorrichtungen für das Abgas, Drucksensoren,
Luftströmungssensoren
und Gewichtssensoren. Darüber hinaus
können
bestimmte Betriebsabläufe
des Bioreaktors automatisiert werden (z. B. das Durchströmen des
Kühlwassers,
von Dampf, von gefilterter kondensierter Luft, von Vakuumbetrieb,
von Transfer des Inokulums, dem Zusatz von Wasser oder Nährstoffen, und
der Kontrolle des Rohrgerüstes
sowie dem An- und
Abschalten von Motoren und Pumpen zu ausgewählten Zeiten). Ein solches
wie oben aufgelistetes Hilfsequipment wird allgemein für die Automatisierung
von Flüssigkulturen
verwendet und ist jedem Fachmann bekannt.
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Betrieb des Bioreaktors:
-
Wie
oben ausgeführt,
erlaubt der Bioreaktor der vorliegenden Erfindung es, alle Schritte
der Festbettfermentation in einer einzigen Vorrichtung und in abgeschlossener
Art und Weise auszuführen.
Der Bioreaktor der vorliegenden Erfindung führt die Stufen 1) Sterilisieren
der Kultivierungsvorrichtung und des Kultivierungsmediums, 2) Animpfen
des Kultivierungsmedium mit den Mikroorganismen, 3) Kultivierung
der Mikroorganismen, 4) Extraktion von biologischen Produkten aus
den kultivierten Mikroorganismen und 5) Nachextraktionsverfahren
durch, ohne die Materialien im Innern der Module des Bioreaktors der äußeren Umgebung
auszusetzen. Der Bioreaktor der vorliegenden Erfindung reguliert
darüber
hinaus präzise
die Wachstumsumgebung innerhalb des Bioreaktors. Diese Gesichtspunkte
der vorliegenden Erfindung stellen eine große Erleichterung bereit, verglichen
mit größeren Festbettfermentationsvorrichtungen,
welche vielfache Eingriffe in jeder Stufe des Fermentationsverfahrens
erforderlich machen, beispielsweise das Autoklavieren des Mediums
außerhalb
des Festbettfermentationsvorrichtung und dem dann folgenden Transferieren
des Mediums in die Fermentationsvorrichtung.
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Erfindungsgemäß umfasst
das Verfahren zur Verwendung des Bioreaktors für die Kultivierung von Mikroorganismen
zunächst
das Befüllen
der gesäuberten Module 3 mit
dem Fermentationsmedium 6. Jegliches Festbettfermentationsmedium
kann erfindungsgemäß verwendet
werden. Einige Beispiele für Festbettmedien
sind Maiskleie, Mais, Weizen, Sojaschote, Sojabohnen, andere Cerealien,
Mineralien (z. B. Vermikulit, Celit, Polyurethanschaum) oder jedes
andere Trägermaterial,
welches fähig
ist, wässrige
Lösungen
zu absorbieren.
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Nach
dem Beladen des Bioreaktors mit dem Medium werden die Module 3 zusammengebaut,
um den Stapel 4 zu bilden. Mehrere Stapel 4 können tandemweise
betrieben werden. Erfindungsgemäß ist das
Innere des Bioreaktors, sobald dieser zusammengefügt ist,
von der äußeren Umgebung
isoliert. Mehrere Stapel 4 können tandemweise betrieben werden,
um eine Batchgröße so groß wie erforderlich zu
ergeben. Sobald der Stapel 4 gesichert ist, werden durch
die kommunizierenden Kanäle 11 sterilisierende
Fluide, beispielsweise Dampf oder Gas, in das Modul geschickt, um
die Matrix zu sterilisieren. Gleichzeitig wird Dampf durch die nicht
kommunizierenden Kanäle
geschickt, um den Bioreaktor auf eine Temperatur, die für die Sterilisation
geeignet ist, zu erwärmen
(121°C für Dampf,
50°C für Ethylenoxid). In
manchen bevorzugten Ausführungsbeispielen kann
die Luft aus dem Bioreaktor durch Verbinden der kommunizierenden
Kanäle 11 mit
einer Vakuumquelle vor dem Bedampfen entfernt werden. Die sterilisierte
Matrix im Innern der Module kann durch Beschicken mit Kühlwasser
durch die nicht kommunizierenden Kanäle 12 und zusätzlich durch
Führen
von steriler kalter Luft durch die Module 3 des Reaktors abgekühlt werden.
Während
des Abkühlungsprozesses
kann der Reaktor mit steriler Luft unter positivem Druck gehalten
werden, bis die gewünschte
Kultivierungstemperatur erreicht ist. Luft, welche innerhalb des
Reaktors eingeschlossen ist, kann, falls erforderlich, durch die
kommunizierenden Kanäle
abgelassen werden. Vorzugsweise geschieht das Ablassen der Luft
durch die Ventile alternierender Platten.
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Nach
der Sterilisierung kann ein flüssiges
Inokulum des zu kultivierenden Mikroorganismus in die Module 3 des
Bioreaktorstapels 4 durch die kommunizierenden Kanäle 11 gepumpt
werden. Die in dem erfindungsgemäßen Bioreaktor
kultivierten Mikroorganismen können
Bakterien, Hefen oder Pilze sein. Der Zweck der Kultivierung dieser
Organismen kann die Nahrungsmittelproduktion oder die industrielle Produktion
von bevorzugten Verbindungen wie biologisch aktiven Molekülen sein.
Sobald die geeignete Menge von Mikroorganismen dem Modul zugefügt wurde
und der Feuchtigkeitsgehalt eingestellt wurde, kann die Mischvorrichtung 18 für eine Zeitdauer
eingeschaltet werden, um das Inokulum mit der festen Matrix zu vermischen.
Die Mischvorrichtung 18 wird dann gestoppt und es wird
den Mikroorganismen ermöglicht,
die Matrix zu besiedeln. Das Mischen des Inokulums mit der Matrix
vor der Fermentation erlaubt, verglichen mit dem Mischen während des
Fermentationsverfahrens, die homogene Verteilung des Inokulums,
bevor der Mikroorganismus eine Chance hat zu wachsen.
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Während der
Wachstumsperiode wird das Milieu innerhalb des Bioreaktors beispielsweise durch
eine Sonde überwacht
und sorgfältig
aufrechterhalten. Wie vorher schon beschrieben, wird sterile Luft
durch die kommunizierenden Kanäle 11 in
den Bioreaktor beschickt, um den Sauerstoff, welcher für den Wachstum
der Mikroorganismen notwendig ist, zu liefern. Der Feuchtigkeitsgehalt
des Bioreaktors kann durch Beschicken des Bioreaktors mit Fluid ebenso
durch die kommunizierenden Kanäle 11 eingestellt
werden. Vorzugsweise wird der Fluidgehalt vor dem Mischen eingestellt,
so dass die Feuchtigkeit gleichförmig über die
Matrix verteilt wird. Die Temperatur des Moduls 3 wird
durch Beschicken mit Wasser durch die nicht kommunizierenden Kanäle 12 kontrolliert.
Die Sterilisierungs-, Inokulations-, Temperaturkontroll-, Extraktions-
und Nachextraktionsabläufe können unter
Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten und verwendeten Technologien
automatisiert werden.
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Das
Verfahren zur Fermentation von Mikroorganismen generiert Wärme. Die
Bildung von Wärme
im Inneren des Bioreaktors kann für das Fermentationsverfahren
problematisch sein. Eine Möglichkeit,
erfindungsgemäß Wärme zu entfernen
ist es, ein Verdunstungskühlen
durchzuführen.
Verdunstungskühlen
kann die bevorzugte Methode zur Entfernung von Wärme sein, wenn es wünschenswert
ist, Wasser aus dem Bioreaktor zu entfernen (z. B. falls das Medium
zu viel Feuchtigkeit enthält).
Eine Verdunstungskühlung
kann durch Beschicken von Luft durch die 23 Platten in die kommunizierenden
Kanäle
und Auslassen der Luft durch die Sammelplatten 24 erreicht
werden. Falls es nicht wünschenswert
ist, Wasser aus dem Bioreaktor zu entfernen, wird es bevorzugt,
dass in der vorliegenden Erfindung das Verfahren der Ableitung als
Wärmeentfernung
verwendet wird. Das Verfahren der Wärmeentfernung über Ableitung,
wie hierin beschrieben, erfordert die Passage von kühlenden
Fluiden durch die nicht kommunizierenden Kanäle 12.
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Es
gibt zwei Vorteile, falls die während
der Fermentation gebildete Wärme über Ableitung
entfernt wird. Ein Vorteil ist es, dass nur die für das zur Verfügung stellen
des Sauerstoffbedarfs nötige
Anteil an Luft in das Modul 3 beschickt werden muss. Die Unabhängigkeit
von Abkühlungserfordernissen
erleichtert es außerdem,
eine bestimmte Atmosphäre innerhalb
des Bioreaktors aufrecht zu erhalten, welche für die Kultivierung bestimmter
Mikroorganismen nötig
sein kann. Beispielsweise kann es sein, dass ein bestimmter Mikroorganismus
eine hohe Kohlenstoffdioxidkonzentration benötigt.
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Ein
zweiter Vorteil des Entfernens der Wärme über Ableitung und nicht durch
Verdunsten von Feuchtigkeit aus dem Bett ist es, dass über die
Ableitung kein Wasser aus dem Fermentationsmedium entfernt wird.
Verdunstungskühlung
resultiert in Wasserverlust aus dem Fermentationsmedium. Wird das Fermentationsmedium
zu trocken, kann diese Trockenheit das Fermentationswachstum der
Mikroorganismen negativ beeinflussen. Um die verlorene Feuchtigkeit
auszugleichen, muss die verdunstete Feuchtigkeit berechnet werden,
und dem Fermentationsmedium wieder zugefügt werden.
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Nach
dem Ersatz der Feuchtigkeit kann es sein, dass das Bett erneut sorgfältig gemischt
werden muss, um Inhomogenitäten
des Feuchtigkeitsgehalts des Betts zu verhindern, nachdem die geeignete Temperatur
erreicht wurde. Das Mischen von filamentösen Mikroorganismen, wie beispielsweise
Pilzen, resultiert jedoch in einem Brechen des Myzels und in vielen
Fällen,
insbesondere bei der Fermentation von nicht septierten Pilzgattungen
wie beispielsweise Rhizhomucor, resultiert daraus eine Abnahme der
Menge des gebildeten Produkt, weshalb es bevorzugt ist, dass das
Mischen zu Beginn des Fermentationsverfahrens durchgeführt wird,
und auf ein Minimum beschränkt
wird, sobald die Fermentation begonnen hat.
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Obwohl
potentiell für
bestimmte Mikroorganismen gefährlich,
kann das Mischen überschießende Feuchtigkeitsdruckabfälle durch
das Bett aufgrund von verfilzten Myzelien, insbesondere im Fall von
Pilzfermentationen verhindern. Selbst wenn nur ein geringer Luftstrom
aufrechterhalten wird, kann der Fluidsverlust nie eliminiert werden
und über
eine Periode von mehreren Tagen kann sich ein Feuchtigkeitsgradient
einstellen (z. B. kann der Bioreaktor am Boden trocken und an der
Spitze feucht sein). Diese Gradienten werden praktisch eliminiert,
wenn die Richtung des Luftstroms im Abstand von wenigen Stunden
regelmäßig umgekehrt
wird. Das Zeitregime dieser Umkehrung des Luftstroms kann automatisiert werden,
so dass die Luftstromrichtung im Abstand weniger Stunden umgekehrt
wird (z. B. alle 4 Stunden). Unter Verwendung dieses Verfahrens
kann eine Homogenität
des Feuchtigkeitsgehalts über
den ganzen Bioreaktor hinweg aufrechterhalten werden.
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Eine
Entfernung von Wärme
wurde auch teilweise durch Mischen des fermentierenden Mediums während des
Fermentationsverfahrens ermöglicht. Neben
intensivem Aufbrechen und Beschädigen
der Myzelmasse kann auch eine signifikante Aggregation auftreten,
die ebenso vom Verfilzen des Myzeliums und einer reduzierten Produktqualität und Ausbeute resultiert.
Die Entfernung von Wärme über Ableitung vermeidet
die Notwendigkeit, die Wärme
durch Mischen während
der Fermentation zu entfernen.
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Oft
werden Mikroorganismen kultiviert, da sie die Fähigkeit haben, bioaktive Produkte
extrazellulär
zu produzieren, beispielsweise sekretieren viele Mikroorganismen
Antibiotika. Manche Mikroorganismen stellen natürlicherweise ein bioaktives
Produkt her, welches in biotechnologischen Anwendungen nützlich ist.
Es ist im Fachgebiet gut bekannt, dass Gene von Mikroorganismen
genetisch verändert
werden können,
um ein bioaktives Produkt besonderen Interesses herzustellen. (Siehe
Ausubel et al., supra, hierin durch Inbezugnahme mit aufgenommen)
Daher kann es nach Abschluss der Kultivierungsperiode wünschenswert
sein, die bioaktiven Moleküle
aus den Mikroorganismen zu extrahieren. Extraktionsfluide, beispielsweise
ein organisches Lösungsmittel, können durch
die Emitterplatten 23 in die kommunizierenden Kanäle 11 beschickt
werden, um die interessierenden Metabolite zu extrahieren. Das Extraktionsfluid ist
jedes geeignete Fluid, welches das interessierende Produkt lösen kann,
und es aus dem Reaktor zur Sammelplatte 24 bringen kann,
so dass das Produkt gewonnen werden kann. Alternativ hierzu kann
das Extraktionsverfahren durch Ultraschall oder Beschallung für den Bruch
der Zellen erleichtert werden. Während
der Dauer des Extraktionsverfahrens kann die Temperatur des Bioreaktors
auf jeden gewünschten
Level durch Beschicken von erwärmenden
oder kühlenden
Fluiden durch die nicht kommunizierenden Kanäle 12 kontrolliert
werden. Die Fähigkeit,
dieselbe Vorrichtung sowohl für
die Fermentation als auch für
die Extraktion verwenden zu können, ist
ein besonderer Vorteil, welcher durch die vorliegende Erfindung
bereitgestellt wird.
-
In
bevorzugten Ausführungsbeispielen
ist die Sammelplatte 24 direkt mit einem zusätzlichen
Apparat oder zusätzlichen
Apparaten (z. B. Ultrafiltrationsvorrichtung, Mikrofiltrationsvorrichtungen
oder Chromatographiesäulen)
für die
Reinigung des gewünschten
Produkts verbunden.
-
Die
Verbindung wird so ausgeführt,
dass ein steriles und abgeschlossenes Milieu beibehalten wird. Von
der Inokulation bis Sammeln des Endproduktes gibt es keinen Zeitpunkt
an dem eine Kontamination auftreten kann. Daher eliminiert dieser
Apparat die Chance, dass das Produkt kontaminiert wird, durch die äußere Umgebung,
verglichen mit den Verfahren, die früher verfügbar waren. Zusätzlich stellt
eine Probe des Bioreaktorinhalts eine genaue Wiedergabe des Bioreaktors
dar, da das innere Milieu des Bioreaktors abgeschlossen und homogen
ist. Außerdem
kann eine Probe zur Bewertung ob eine Kontamination des Bioreaktors
vorgekommen ist stattfinden, ohne die Sterilität zu brechen. Eine Probe, die
negativ auf eine Kontamination hingetestet wurde, garantiert es,
dass der gesamte Inhalt des Bioreaktors steril ist. Diese Eigenschaft
ist auch dann von Vorteil, wenn das interessierende Produkt toxisch
ist (z. B. das Immunosupressant Cyclosporin). Der Fachmann auf dem
Gebiet wird erkennen, dass das Extraktionsverfahren optional ist
und nicht bei jeder Fermentation auftreten muss.
-
Die
Automatisierung des Reinigungsverfahrens erlaubt es, alle Parameter
des gesamten Produktionsverfahrens präzise zu kontrollieren. Insgesamt
stellt der Bioreaktor der vorliegenden Erfindung ein verbessertes
Verfahren zur Zucht von Mikroorganismen und zum Extrahieren von
Produkten daraus bereit, insbesondere hinsichtlich der Gesichtspunkte Sicherheit
und Handling der Mikroorganismen. Diese Eigenschaften machen dem
Bioreaktor der vorliegenden Erfindung eine sehr attraktive Option
zur Zucht von genetisch modifizierten Mikroorganismen, die auf einem
festen Substrat wachsen. Eine besondere Verwendung für die für einen
solchen Bioreaktor, ist die Zucht von Mikroorganismen, welche ein Produkt
herstellen, das die Sterilitätsstandards
für die
FDA-Zulassung einhalten muss.
-
Nach
Abschluss des Extraktionsverfahrens kann das innerhalb des Bioreaktors
verbleibende Material auf irgendeine geeignete Weise behandelt werden,
während
es noch immer im Bioreaktor ist. Beispielsweise kann das Material
einer Wärmebehandlung
(z. B. Sterilisierung), einer Abkühlung oder einer Reaktion des
Materials mit einer geeigneten Lösung
unterzogen werden. Etliche Arten der Behandlung, die das Material
für die
Entsorgung geeignet machen, kann bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung
verwendet werden, bevor die Vorrichtung abgebaut wird. Sobald der
Stapel abgebaut ist, werden die verbleibenden Materialien verworfen
und der Bioreaktor kann gewaschen und für eine weitere Fermentation
wieder verwendet werden.
-
Beispiele
-
Die
vorliegende Erfindung kann durch Studium der folgenden nicht limitierenden
Beispiele noch weiter verstanden werden.
-
Beispiel 1:
-
Verwendung des Bioreaktors
zur Produktion und Extraktion eines extrazellularen Metabolits (z.
B. eines Lebensmittelprodukt)
-
3
Kilogramm Weizenkleie wurden in die Module des Bioreaktors mit einer
gesamten Plattenfläche
von etwa 2.500 cm2 geladen. Der Bioreaktor
wurde zusammengefügt
und die Luft wurde aus dem Bioreaktor evakuiert durch Anlegen eines
Vakuums an die kommunizierenden Kanäle. Darauf folgend wurde gleichzeitig
Dampf durch die kommunizierenden und die nicht kommunizierenden
Kanäle
beschickt, um den Bioreaktor und dessen Inhalte auf einer Temperatur
von 121 °C
zu erwärmen.
Der Bioreaktor wurde bei dieser Temperatur 45 Minuten belassen,
wobei der Dampfdruck freigesetzt wurde. Gleichzeitig wurde sterile
Luft in die kommunizierenden Kanäle
beschickt, während
Kühlungswasser
von etwa 25°C
in die nicht kommunizierenden Kanäle beschickt wurde. Sobald
der Bioreaktor auf 37°C
abgekühlt
war, wurde er mit einem gut gewachsenen Inokulum des Stammes Rihzhomucor
pusillus inokuliert, welcher eine Protease Art produziert, welche
Milch-Gerinnungs-Enzym genannt wird (auch bekannt als mikrobielles
Rennin). Dieses Enzym wird in der Käseindustrie verwendet. Die
beimpfte Kleie wurde für
eine Dauer von 4 Tagen bei einer Temperatur von 37°C inkubiert,
um dem Pilz zu erlauben, die Substrathöhe komplett zu besiedeln. Während dieser
Dauer wurde die Temperatur der Kleie durch Durchströmen von warmem
oder kaltem Wasser durch die nicht kommunizierenden Kanäle kontrolliert.
Gleichzeitig wurde der Bioreaktor mit steriler Luft in einer Strömungsrate von
7 Litern/Minute durch die kommunizierenden Kanäle von benachbarten Platten
beschickt, und die Luft wurde durch die kommunizierenden Kanäle der Sammelplatten
abgelassen. Die Richtung des Luftstroms wurde im Abstand weniger
Stunden umgekehrt, um Feuchtigkeitsgradienten im Bett zu verhindern.
-
Nach
4 Tagen wurden 15 Liter Wasser in die kommunizierenden Kanäle der oben
liegenden Platte beschickt, und durch die Löcher in den kommunizierenden
Kanälen
der Platten des Stapels nach unten sickern gelassen. Der wässrige Extrakt,
welcher das Enzym enthielt, wurde am Boden des Stapels gesammelt.
Danach wurde durch die oben liegende Platte Luft beschickt, um die
maximale Menge verbleibenden Extrakts, welcher im Bett gefangen
war, auszublasen. Dann wurde Dampf durch die kommunizierenden und
die nicht kommunizierenden Kanäle geschickt,
um die extrahierte Pilzkleie zu sterilisieren. Diese sterilisierte,
verbrauchte Kleie wurde dann verworfen. Der wässrige Extrakt enthält das Enzym,
wie denn konzentriert durch Ultrafiltration.
-
Beispiel 2:
-
Verwendung
des Bioreaktors zur Produktion eines intrazellulären Metabolits (z. B. eines
pharmazeutischen Produkts).
-
20
Kilo Weizenkleie wurden in einen Bioreaktor von etwa 22.600 cm2 Fläche
geladen. Der Bioreaktor wurde wie in Beispiel 1 beschrieben sterilisiert. Nach
der Sterilisierung wurde der Bioreaktor auf 30°C abgekühlt und mit einem gut gewachsenen
Inokulum eines Stammes von Fusarium solanii, welcher intrazellulär ein Immunosupressant
namens Cyclosporin produziert, inokuliert. Cyclosporin wird verwendet,
um die Abstoßung
transplantierter Organe zu verhindern. Das Inokulum wurde gewissenhaft
mit der sterilisierten Kleie unter Verwendung der Mischärme für eine Dauer
von 1 Stunde vermischt. Die inokulierte Kleie wurde dann 120 Stunden
inkubiert.
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Der
Bioreaktor wurde kontinuierlich mit steriler Luft bei einer Fließrate von
75 Liter/Minute beschickt. Die Temperatur des Bioreaktors wurde
für die ersten
24 Stunden auf 29°C,
für die
nächsten
48 Stunden auf 32°C
und für
die letzten 48 Stunden auf 29°C
eingestellt.
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Danach
wurde der Bioreaktor mit 120 Litern Methanol folgendermaßen extrahiert:
Zunächst
wurden 60 Liter Methanol durch die oben liegende Platte eingeführt, und
in den Bioreaktor einsickern und mit der kultivierten Kleie in Kontakt
kommen gelassen. Diese Methanol wurde 24 Stunden in dem Biorektor belassen
um die Diffusion des intrazellulären
Cyclosporins aus den Pilzzellen in das Methanol zu ermöglichen.
Diese "erste Tränkung" wurde dann durch
die Bodenplatte drainiert und mit dem nächsten Anteil an 60 Liter ersetzt,
welcher mit der Kleie für
die Dauer von 6 Stunden in Kontakt gelassen wurde. Der zweite Anteil
wurde drainiert und der verbleibende Extrakt wurde aus dem Bett
mit Luft ausgespült.
Unter Verwendung dieses Verfahrens konnte eine effiziente Extraktion
von Cyclosporin durchgeführt
werden.
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Die
verbrauchte Kleie im Bioreaktor wurde mit Wasser gewaschen, um Spuren
von verbleibendem Methanol zu entfernen. Dann wurde der Bioreaktor
geöffnet
und die verbrauchte Kleie wurde als Abfall entsorgt. Es gab keine
Notwendigkeit, den Bioreaktor vor Öffnung zu sterilisieren, da
dass Methanol aufgrund seiner Natur schon jedes lebende Material
in dem Bioreaktor getötet hatte.
Der Methanolextrakt, welcher das Cyclosporin enthielt, wurde unter Vakuum
getrocknet, und unter Verwendung von Säulenchromatographie weiter
gereinigt.
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Beispiel 3
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Verwendung des Bioreaktors
zur Produktion eines teilweise intrazellulären Metabolits und teilweise
extrazellulären
Metabolits (z. B. eines pharmazeutischen Produkts).
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15
Kilo Weizenkleie wurden in einen Bioreaktor von etwa 14.500 cm2 Fläche
geladen. Der Bioreaktor wurde wie unten beschrieben sterilisiert:
Der Bioreaktor wurde zusammengefügt
und dann wurden gleichzeitig die kommunizierenden und die nicht kommunizierenden
Kanäle
alternierender Emitterplatten mit Dampf beschickt, um den Bioreaktor
und dessen Inhalte zu erwärmen.
Gleichzeitig wurden Luft und Dampf über die kommunizierenden und
die nicht kommunizierenden Kanälen
der zwischenliegenden Sammelplatten (siehe 5)
abgelassen. Das Mischungssystem wurde auch eingeschaltet, und die
Inhalte des Reaktors wurden kontinuierlich aufgebrochen, um alle
Lufttaschen zu entleeren, während
das Belüften
in Gange war. Sobald die Temperatur des Bioreaktors 100°C erreichte,
wurde das Belüften
mit Dampf gestoppt. Das Mischen wurde auch gestoppt. Der Reaktor
wurde weiter auf eine Temperatur von 120°C erhitzt. Der Bioreaktor wurde bei
dieser Temperatur 60 Minuten belassen, wonach der Dampfdruck freigesetzt
wurde. Gleichzeitig wurde sterile Luft in die kommunizierenden Kanäle und Kühlungswasser
von etwa 25°C
in die nicht kommunizierenden Kanäle beschickt.
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Nach
der Sterilisierung wurde der Bioreaktor auf 30°C abgekühlt und mit einem gut gewachsenen Inokulum
des Stammes Aspergillus flavipes inokuliert, welcher Mevinolinsäure produziert.
Ein Teil der produzierten Mevinolinsäure wird in das Medium sekretiert,
während
ein anderer Teil in dem Pilzmyzelium eingeschlossen bleibt. Mevinolinsäure wird
verwendet, um die Verbindung Lovastatin herzustellen, welche bei
der Behandlung von Hypercholesteremia verwendet wird. Das Inokulum
wurde sorgfältig
mit der sterilisierten Kleie vermischt, unter Verwendung der Mischärme, für eine Dauer
von 1 Stunde. Die beimpfte Kleie wurde dann für eine Dauer von 120 Stunden
inkubiert. Sterile Luft wurde mit einer Flussrate von 50 Lit pro
Minute kontinuierlich in den Bioreaktor beschickt. Die Temperatur
des Bioreaktors wurde während
der gesamten Inkubationsdauer bei 30°C kontrolliert. Die Richtung
des Luftstroms wurde im Abstand von 1 Stunde unter Verwendung von
automatischen Kontrollventilen verändert.
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Nach
dem Wachstum wurden die Mischärme 20
Minuten angeschalten, um die Pilzkleie aufzubrechen und für die Extraktion
bereitzumachen. Der Bioreaktor wurde mit 90 Litern Azeton auf folgender
Weise extrahiert. Zunächst
wurden 45 Liter Methanol durch die oben liegende Platte eingeführt, und
in den Bioreaktor einsickern und mit der kultivierten Kleie in Kontakt
kommen gelassen. Dieses Azeton wurde dann in den Bioreaktor für eine Dauer
von 16 Stunden belassen. Diese "erste
Tränkung" wurde dann durch
die Bodenplatte drainiert und mit dem nächsten Anteil an 45 Liter ersetzt,
welcher mit der Kleie für
die Dauer von 6 Stunden in Kontakt gelassen wurde. Der zweite Anteil
wurde drainiert und die bleibende Extrakt wurde aus dem Bett mit
Luft ausgespült.
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Unter
Verwendung dieses Verfahrens konnte eine effiziente Extraktion von
Mevinolinsäure
durchgeführt
werden. Die verbrauchte Kleie im Bioreaktor wurde mit Wasser gewaschen,
um Spuren von verbleibendem Azeton zu entfernen. Dann wurde der
Bioreaktor geöffnet
und die verbrauchte Kleie wurde als Abfall entsorgt. Es gab keine
Notwendigkeit, den Bioreaktor zu sterilisieren vor Öffnung,
da dass Azeton schon jedes lebende Material in dem Bioreaktor getötet hatte.
Der Azetonextrakt, welcher die Mevinolinsäure enthielt, wurde getrocknet
und mit Ethylazetat reextrahiert. Der Ehtylazetatextrakt wurde unter
Vakuum getrocknet, um die Mevinolinsäure zu Lovastatin zu lakonisieren.
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Das
Lovastatin wurde aus dem Ethylazetatkonzentrat auskristallisiert
und über
Rekristallisation im Methanol und Azeton gereinigt.
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Beispiel 4:
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Verwendung des Bioreaktors
zur Herstellung eines bakteriellen Enzyms, welches für die Brauindustrie nützlich ist.
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1,5
kg Maltodextrin und 15 kg Weizenkleie wurden in einen Bioreaktor
von etwa 14.500 cm2 Fläche geladen. Die Inhalte des
Bioreaktors wurden wie in Beispiel 3 erklärt sterilisiert. Nach dem Abkühlen des
Reaktors wurden 10 Liter eines Inokulums des gewählten Stammes Bacillus subtilis
in den Bioreaktor überführt und
unter Verwendung der Mischärme sorgfältig gemischt.
Dieser Stamm von Bacillus produziert ein Gemisch von neutralen bakteriellen
Proteasen, beta-Glukanasen und Amylasen, die verwendet werden, um
höhere
Ausbeuten an Extrakt aus gemälzter
Gerste in der Brauindustrie herzustellen.
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Die
Temperatur der Kultivierung wurde auf 32°C eingestellt. Die Kultivierungsdauer
war 72 Stunden. Nach der Fermentation wurde der Bioreaktor auf 15°C durch Zirkulieren
von gekühltem
Wasser von 10°C
durch die nicht kommunizierenden Kanäle abgekühlt. Dann wurden 60 Liter Wasser
in den Bioreaktor in einer Flussrate von 15 Litern pro Stunde beschickt,
um das Enzym in 4 Stunden komplett zu extrahieren. Die Extraktion
unter kalten Bedingungen half dabei, die Denaturierung dieser temperatursensitiven
Protease zu minimieren. Nach der Extraktion wurde der Reaktor mit
Dampf sterilisiert und der Extrakt wurde unter Verwendung von Mikrofiltration
und Ultrafiltration verarbeitet, um das Endprodukt zu erhalten.
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Beispiel 5:
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Verwendung des Bioreaktors
zur Herstellung wohlschmeckenden Aromastoffen unter Verwendung von Sojabohnen.
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Der
in den Beispielen 3 und 4 beschriebene Bioreaktor wurde mit 10 kg
Sojabohnen beladen und sterilisiert. Dies wurde dann nach dem Abkühlen mit einem
Stamm von Aspergillus oryzae inokuliert und bei 30°C 2 Tage
wachsen gelassen. Nach der Fermentation wurde der Bioreaktor mit
Wasser, welches 5 Natriumchlorid (Salz) enthielt beschickt, und
die Temperatur wurde auf 50°C
erhöht,
indem heißes Wasser
durch die nicht kommunizierenden Kanäle beschickt wurde. Die Mischungsärme wurden
in periodischen Abständen
für 20
Minuten alle 6 Stunden angeschaltet. Diese Bedingung wurde eine
Woche aufrechterhalten, während
dessen der größte Anteil des
Proteins der Sojabohnen hydrolisiert wurde. Der Inhalt des Reaktors
wurde sterilisiert und die Fluid wurde trainiert. Diese Fluid wurde
gefiltert und früh getrocknet,
um ein wohlschmeckendes aromatisiertes Proteinhydrolisat zu erhalten.
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Beispiel 6:
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Verwendung von Ethylenoxid
für die
Sterilisierung des Bioreaktors.
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15
kg rohe Weizenkleie mit etwa 10 % Anfangsfeuchtigkeit wurden in
einem Bioreaktor von etwa 14.500 cm2 Fläche geladen,
nachdem der Reaktor vollständig
zusammengebaut wurde. Er war mit einer Vakuumquelle verbunden und
ein Vakuum von etwa 28 Inch Quecksilber wurde angelegt. Gleichzeitig
wurde in dem Rohrgeflecht heißes
Wasser zirkuliert, um die Temperatur des Bioreaktors auf 50°C zu bringen.
Ein Gemisch aus Ethylenoxid und Kohlenstoffdioxid im Verhältnis von
90:10 wurde dann in den Bioreaktor beschickt. Die Menge des Gases
wurde so berechnet, dass eine Konzentration von etwa 760 ppm Ethylenoxid
erhalten wurde. Das Ethylenoxid wurde dann für eine Dauer von ungefähr 6 Stunden im
Bioreaktor belassen, wonach ein Vakuum erneut auf einen Spiegel
von etwa 28 Inch gezogen wurde. Das Vakuum wurde dann durch Beschicken
mit Kohlenstoffdioxid über
0,45 Mikronsterilfilter gebrochen. Das Kohlendioxid wurde durch
sterile Luft ausgespült.
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Der
Reaktor wurde dann auf 30°C
abgekühlt und
mit einem gut gewachsenen Inokulum der Art Rhizhopus delemar inokuliert,
welcher ein Rohstärke hydrolysierendes
Enzym produziert. Aus vorhergehenden Untersuchungen war bekannt,
dass das Rohstärke
hydrolysierendes Enzym effizienter auf steriler Rohkleie hergestellt
werden kann, welche durch eine Ethylenoxidbehandlung sterilisiert
wurde (wobei die Stärke
nicht gelatinisiert wurde), verglichen mit Kleie welche durch Dampf
bei 121 °C
sterilisiert wurde (wobei die Stärke
der Kleie gelatinisiert wird). Die Aktivität der Rohstärke Hydrolysierung wird für eine Reihe
von Anwendungen in der Nahrungsmittelindustrie einschließlich der
Herstellung von Alkohol verwendet.
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Die
Kultur wurde 96 Stunden bei 30°C
wachsen gelassen. Nach dieser Inkubation wurde die Kultur mit Wasser
extrahiert und der Extrakt wurde unter Verwendung von Mikrofiltration
gefolgt von Ultrafiltration konzentriert. Der Reaktor wurde dann
mit Dampf vor dem Verwerfen der Inhalte sterilisiert.