DE69913380T2

DE69913380T2 - Zusammensetzung zur behandlung von periodontalen erkrankungen

Info

Publication number: DE69913380T2
Application number: DE69913380T
Authority: DE
Inventors: F. Robert CASPER; Charles Howard TENENBAUM
Original assignee: 1333366 Ontario Inc
Current assignee: 1333366 Ontario Inc
Priority date: 1998-12-24
Filing date: 1999-12-23
Publication date: 2004-08-05
Anticipated expiration: 2019-12-24
Also published as: WO2000038620A3; WO2000038620A2; EP1140050B1; EP1140050A2; CA2350396A1; CA2350396C; AU1853000A; DE69913380D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die für die Behandlung von periodontaler Erkrankung geeignet ist. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, die Resveratrol enthält und ihre Verwendung zur Behandlung von Periodontalerkrankung. Sie ist besonders geeignet bei der Behandlung von Individuen mit einem hohen Risiko für die Entwicklung von Periodontalerkrankung, zum Beispiel solcher, die einem hohen Maß an Aryl-Kohlenwasserstoffen ausgesetzt sind, wie etwa die Individuen, die Tabakprodukte rauchen, Individuen, die Tabakrauch aus zweiter Hand ausgesetzt sind und Individuen, welche die Umwelt belastenden AhR-Liganden ausgesetzt sind.
Hintergrund der Erfindung
Periodontalerkrankung ist gekennzeichnet durch gingivale Entzündung, Knochenschwund und Zahnverlust. Es wird angenommen, daß es der am häufigsten verbreitete Grund für Zahnverlust ist, was zu einer signifikanten Zahnsterblichkeit führt.
Raucher haben eine 2,5–6-fach höhere Wahrscheinlichkeit Periodontalerkrankung zu entwickeln als Nichtraucher und es gibt Belege dafür, daß eine direkte Korrelation zwischen der Anzahl der gerauchten Zigaretten und dem Risiko für eine Entwicklung dieser Krankheit besteht (Barbour et al., 1977, Crit Rev Oral Biol Med 8(4): 437–60). Raucher neigen außerdem dazu eine erhöhte Schwere der Periodontalerkrankung zu zeigen und einen erhöhten Geschiebeschwund, erhöhte Taschentiefe und verringerte Knochenkronenhöhe (Barbour et al., supra). Zusätzlich besteht eine starke Verbindung zwischen Rauchen und sowohl Geschiebeschwund und Gaumenrückgang bei jungen Raucher (Linden et al., 1994, Periodontol 65(7): 718–23) und selbst bei Individuen, die minimale oder keine Periodontalerkrankung haben (Gunsolley et al., 1998, J Periodontol 69(2): 165–70).
Derzeit ist es nicht bekannt wie der Zigarettenrauch seine negativen Effekte auf die Knochenbildung oder Knochen-bezogenen Krankheiten wie etwa Osteoporose und Periodontitis bewirkt. (Genco et al. J Int Acad Periodontol. 1999 1(1): 21–33).
Entzündungsfördernde Cytokine, wie Tumor Nekrose Faktor- Alpha (TNF-α) und Interleukin 1β (IL-1β) haben Knochen-resorbierende Eigenschaften und werden im allgemeinen angesehen, daß sie eine Rolle bei der Pathogenese von Peridontalerkrankung spielen (Hou et al., 1995, J Clin Periodontol 22(2): 162–7.; Liu et al., 1996, Cztokine 8(2): 161–7; Galbraith et al., 1997, J Periodontol 68(9): 832–8). Pathogene orale Bakterien konnten als teilungsaktives IL-1β aus pro-IL-1β nachgewiesen werden (Beausejour et al., 1997, Infect Immun 65(8): 3199–202). Blockierende Antikörper, die IL-1/TNF aufweisen, reduzieren sowohl die entzündungsfördernde Zellaushebung, als auch Knochenschwund bei Patienten mit Periodontalerkrankung (Assuma et al, 1998, J Immunol 160(1): 403–9).
Es wurde bereits gezeigt, daß Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor (AhR)-Liganden wie Dioxin und Benzo[a]pyren, die in hohen Konzentrationen im Zigarettenrauch vorliegen, leistungsstarke Stimulatien von IL-1β und TNF-β darstellen und daher bei der Pathogenese von Periodontalerkrankung von Rauchern signifikant sein können. In dieser Hinsicht können AhR-Antagonisten nützlich sein, um die Stimulation von IL-1β und TNF-β zu blockieren und dadurch einige Symptome einer Periodontalerkrankung zu minimieren.
Resveratrol, die Elternverbindung einer Molekülfamilie, die Glukoside und Polymere umfasst, ist ein wirksamer AhR-Antagonist, wie dies bereits in der französischen Patentanmeldung Nr. 9805673, eingereicht am 5. Mai 1998, beschrieben ist. Es handelt sich um ein Antimyotikum oder Phytoalexin, das von Pflanzen erzeugt wird, die als Spermatophyten klassifiziert sind, von denen Weine, Erdnüsse und Kiefern die Hauptvertreter sind (Soleas et al., 1997, Clin Biochemistry, 30: 91–113). Als AhR-Antagonist ist Resveratrol, dessen chemische Bezeichnung 3,5,4'-Trihydroxystilben lautet, nützlich, um allgemein toxische Effekte des Ausgesetztseins von AhR-Liganden in der Umgebung zu vermeiden, einschließlich, zum Beispiel, halogenierten und polyzyklischen Aryl-Kohlenwasserstoffen, polyaromatischen Kohlenwasserstoffen und polychlorierten Biphenylen. Zusätzlich wurde gezeigt, daß Resveratrol die Induktion von entzündungsfördernden Cytokinen, IL-1 Beta durch AhR-Liganden verhindert (Casper et al., 1999. Molecular Pharmacology, 56: 784–790).
Obwohl es viele Behandlungsmethoden für unterschiedliche Aspekte von Periodontalerkrankung gibt, bleibt der Bedarf ein Verfahren zu entwickeln, welches direkter auf der Vorbeugung von Knochenschwund und Zahngeschiebe gerichtet ist, insbesondere bei Patienten, die Tabakprodukte rauchen.
Entsprechend einem Aspekt der Erfindung wird die Verwendung einer Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Periodontalerkrankungen eines Patienten geschaffen, wobei die Zusammensetzung eine therapeutisch wirksame Menge Resveratrol in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
Entsprechend einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Periodontalerkrankungverhindernde Zusammensetzung geschaffen, die Resveratrol, einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und wenigstens einen zusätzlichen aktiven Bestandteil enthält, wobei besagter aktiver Bestandteil ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fluor-Verbindungen, Anti-Karies-Mitteln, Anti-Bakteriellen-Mitteln, Anti-Belag-Mitteln, entzündungshemmenden Mitteln, Mundgeruch verhindernden Mitteln und Fleckenentfernern.
Entsprechend einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung von Knochenschwund und/oder Zahngeschiebeschwund geschaffen, welche mit Aryl-Kohlenwasserstoff-Kontakt induzierter Periodontalerkrankung verbunden sind, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge an Resveratrol, einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und wenigstens einen zusätzlichen aktiven Bestandteil, wobei besagter aktiver Bestandteil ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Fluor-Verbindungen, Anti-Karies-Mitteln, Anti-Bakteriellen-Mitteln, Anti-Belag-Mitteln, entzündungshemmenden Mitteln, Mundgeruch verhindernden Mitteln und Fleckenentfernern.
Entsprechend einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Verbindung zur Verwendung bei der Behandlung von Knochenschwund und/oder Zahngeschiebeschwund geschaffen, welche mit Peridontalerkrankung verbunden sind, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge an Resveratrol, einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und wenigstens einen zusätzlichen aktiven Bestandteil, wobei besagter aktiver Bestandteil ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Fluor-Verbindungen, Anti-Karies-Mitteln, Anti-Bakteriellen-Mitteln, Anti-Belag-Mitteln, entzündungshemmenden Mitteln, Mundgeruch verhindernden Mitteln und Fleckenentfernern.
Entsprechend einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Verbindung zur Verwendung bei der Vorbeugung von Periodontalerkrankung bei Rauchern, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge an Resveratrol und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und wenigstens einen zusätzlichen aktiven Bestandteil, wobei besagter aktiver Bestandteil ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Fluor-Verbindungen, Anti-Karies-Mitteln, Anti-Bakteriellen-Mitteln, Anti-Belag-Mitteln, entzündungshemmenden Mitteln, Mundgeruch verhindernden Mitteln und Fleckenentfernern.
Entsprechend einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung von Resveratrol bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Periodontalerkrankung bei Personen, die einem hohen Level an Aryl-Kohlenwasserstoffen ausgesetzt sind, geschaffen.
Entsprechend einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung von Resveratrol zur Herstellung eines Medikaments zur Vermeidung von Knochen oder Zahnbefestigungsschwund, der mit Peridontalerkrankung bei Rauchern verbunden ist, geschaffen.
Entsprechend einem Aspekt der Erfindung wird die Verwendung von Resveratrol bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Periodontalerkrankung geschaffen.
Ausgestaltungen der Erfindung werden nachstehend nur anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, in welchen:
1A–D eine histologische Auswertung von 5 μm dicken, in Paraffin eingebetteten Sektionen, die von Küken periostealen Osteogenese (CPO)-Kulturen erhalten wurden, einschließlich Kontrolle (A), TCDD-behandelten (B), Resveratrol-behandelten (C) und TCDD- und Resveratrol-behandelten Kulturen (D);
2A–C sind Balken-Darstellungen, welche die Effekte von TCDD, Resveratrol und TCDD kombiniert mit Resveratrol auf APA in dem CPO-Modell illustrieren;
3 zeigt Agarose-Gel Elektrophorese-Strukturen für mRNA-Bänder von Knochenproteinen, AP (Alkalinphosphatase), BSP (Knochensialoprotein), Collagen Typ I und OPN (Osteopontin) in CPO-Kontrollkulturen (C), Kulturen, die mit TCDD (T) behandelt wurden, Kulturen, die mit Resveratrol^® ubehandelt wurden und Kulturen, die mit TCDD und Resveratrol (T + R) behandelt wurden;
4 ist eine Balken-Darstellung zur Illustration des Effekts von Resveratrol (R), TCDD (T) und Resveratrol kombiniert mit TCDD (TR) auf mRNA-Levels von Knochenproteinen, AP, BSP, Collagen und OPN in dem CPO-Modell.
5 ist eine Balken-Darstellung zur Illustration des Effekts von TCDD, Resveratrol und TCDD kombiniert mit Resveratrol auf Collagen Typ I Levels in dem CPO-Modell.
6 veranschaulicht den Effekt von verschiedenen TCDD-Konzentrationen bei Vorliegen von steigenden Mengen Resveratrol auf AP-Levels im Ratten SBMC (Stromale Knochenmarkzellen) Modell;
7 veranschaulicht den Effekt von verschiedenen TCDD-Konzentrationen bei Vorliegen steigender Mengen Resveratrol auf die Mineralisierungs-Levels in der Ratten SBMC-Linie;
8A–B sind Graphen, welche die Ergebnisse von unter Wettbewerb stehender Aufnahme von lebenden Zellen (SBMC)/Bindungsproben zwischen Radiomarkiertem TCDD und unmarkiertem Resveratrol veranschaulichen;
9 ist eine Balkendarstellung, welche den Effekt von TCDD auf APA in Ratten-Knochenmarkszellen bei Vorliegen von Resveratrol veranschaulichen, das entweder gleichzeitig mit TCDD oder separat über 4–10 Tage der Kultur hinzugefügt wurde.
10 ist eine Balkendarstellung wie in 3, bei welcher Resveratrol entweder gleichzeitig mit TCDD oder separat über 10–16 Tage der Kultur hinzugefügt wurde; und
11A–E sind eine Serie von Graphen, welche die Effekte steigender Konzentrationen von Resveratrol auf die APA-Aktivität bei Vorliegen von TCDD-Konzentrationen, die in den Graphen von A bis E fallen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Eine neue Zusammensetzung für die Behandlung von Periodontalerkrankung wird geschaffen, enthaltend Resveratrol und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Der Begriff "Behandlung", wie er hier mit Bezug auf Peridontalerkrankung verwendet wird, ist so gemeint, daß er sowohl die Behandlung von vorhandener Periodontalerkrankung, als auch die Vorbeugung von antizipierter Periodontalerkrankung umfasst. In dieser Hinsicht bezieht sich die Vorbeugung und Behandlung von Periodontalerkrankung nach der vorliegenden Erfindung auf die Vermeidung oder wenigstens die Verminderung von Entzündungen, Knochenschwund und/oder Geschiebeschwund, die mit Periodontalerkrankung verbunden sind.
Die vorliegende Zusammensetzung enthält Resveratrol. Der Begriff "Resveratrol" ist so gemeint, das er nicht nur die Elternverbindung, d. h. 3,5,4'-Trihydroxystilben umfasst ist, sondern auch Derivate von Resveratrol, die Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptoren (AhR)-Antagonisten sind. Beispiele für Resveratrol-Derivate, die AhR-Antagonisten sind, umfassen, aber nicht beschränkt sind auf Piceatannol (3,4,3',5'-Tetrahydroxystilben), Oxyresveratrol (2,3',4,5'-Tetrahydroxystilben), 4,4'-Dihydroxystilben und deren Alpha- und Beta-Glucosid, Galactosid- und Mannoside Derivate, wie etwa Piceid.
Die vorliegende Zusammensetzung enthält Resveratrol zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. In diesem Zusammenhang ist mit dem Begriff "pharmazeutisch akzeptabel" akzeptabel für die Verwendung im pharmazeutischen – und Veterinärbereich gemeint, d. h. ein Träger, der nicht toxisch ist und der keine gegenläufige Wirkung auf die Wirksamkeit von Resveratrol bei der Behandlung von Periodontalerkrankung hat. Pharmazeutisch akzeptable Träger, die für die Zubereitung der vorliegenden Zusammensetzung für die Verabreichung geeignet sind, umfassen konventionelle Träger, die bei der Rezeptur von Alkohol-löslichen Heilmitteln verwendet werden, wie Verdünnungsmittel, Arzneiträger und dergleichen. Es wird Bezug genommen auf „Remington's Pharmaceutical Sciences", 17. Ausgabe., Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1985, allgemein für Anleitung zur Rezeptur von Heilmitteln. Es versteht sich, daß pharmazeutische Träger, die für die Zubereitung von Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung von der gewünschten Darreichungsform abhängen.
Nach einem Ausführungsbeispiel der Erfindung ist die geeigneteste Darreichungsform der vorliegenden Zusammensetzung die topische Dosierform, die auf die betroffenen Bereiche des Mundraums angewendet werden kann. Angemessene topische Dosierformen umfassen Pasten, Gele, Sprays (Aerosol oder andere), Puder für die Rekonstitution, Tabletten oder Gummis.
Wie oben ausgeführt variieren der Träger und andere Komponenten der Zusammensetzung mit der ausgewählten verabreichbaren Dosierform. Für die Zubereitung der vorliegenden Erfindung zum Beispiel in einer Spülung oder in einem Spray, kann das Resveratrol zunächst einem geeigneten Alkohol zugemischt werden, d. h. einem Alkohol, der für die Verabreichung im Mundraum eines Patienten geeignet ist und in der verabreichten Dosierung nicht toxisch ist. Ein Beispiel für einen geeigneten Alkohol ist, zum Beispiel, Ethylalkohol in einer Menge zwischen etwa 5% bis etwa 30% bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung. In Übereinstimmung mit einer wirtschaftlich akzeptablen Spülungsrezeptur wird der aktive Bestandteil (die aktiven Bestandteile) einer Menge Alkohol von etwa 27% bezogen auf das Gewicht der gesamten Zusammensetzung zugemischt. Sobald sie einmal in einen geeigneten Alkohol gemischt ist, kann die Resveratrol-Lösung weiteren Additiven zugemischt werden, wie es noch ausführlicher beschrieben wird, um für die Verabreichung geeignet zu sein. Für die Zubereitung der vorliegenden Zusammensetzung in eine andere Dosierform als eine Lösung, d. h. ein Paste, Gel, Puder oder Gumme, muß das Resveratrol erst in Mikroteilchen zerkleinert werden, wobei übliche physikalische Verfahren verwendet werden, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind, bevor sie den geeigneten Trägern zugemischt werden.
Im Fall einer Paste wird in Mikroteilchen zerkleinertes Resveratrol mit Trägern kombiniert, die üblicherweise für die Rezeptur einer Paste verwendet werden, einschließlich Verdickungsmittel, wie Methylcellulose oder Hydroxypropylmethylcellulose, Befeuchtungsmitteln und Tensiden, wie dies ausführlicher in der EP 568 160 und US 5 496 541 beschrieben ist und deren Inhalt hier durch Bezugnahme umfasst ist.
Im Fall eines Gels wird in Mikroteilchen zerkleinertes Resveratrol Gel-Trägern wie Gelatine, Polyethylenglykol, Guargummi oder deren Kombinationen zugemischet. Strukturierende Verbindungen liegen normalerweise ebenfalls in einem Gel vor, von denen Beispiele Polyoxyethylen-Polyoxypropylencopolymere umfassen. Solche Strukturmittel sind im allgemeinen in Mengen vorhanden, die zwischen 18 und 25% bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung liegen.
Zahnpasta oder Gelformen der vorliegenden Zusammensetzung können weiterhin ein Abriebmittel enthalten. Beispiele für geeignete Abriebmittel umfassen Wasser-unlösliche Alkali- oder Erdalkalimetallsalze von Metaphosphat, Calciumcarbonat, Aluminat und Silikat. Die Menge solcher Abriebmittel, die im allgemeinen in einer Zahnpasta oder Gel enthalten ist, reicht von etwa 5% bis etwa 80% bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung.
Um mit der vorliegenden Zusammensetzung ein Kaugummi herzustellen, kann das zu Mikroteilchen zerkleinerte Resveratrol mit gewöhnlich verwendeten Trägern kombiniert werden, einschließlich einem oder mehreren natürlichen oder synthetischen Elastomeren, die optional mit einem oder mehreren Lösungsmitteln, Weichmachern oder Füllmitteln versetzt werden. Natürliche elastomere, die für die Verwendung geeignet sind, umfassen Substanzen pflanzlichen Ursprungs wie Chicle, Jelutong, Guttapercha, Guayule und Krongummi. Beispiele für synthetische Elastomere umfassen Butadienstyren-Copolymere, Isobutylenisopren-Copolymere, Polyethylen, Polyisobutylen, Polyvinylacetat und deren Kombinationen. Das Elastomer enthält im allgemeinen 14% bis 50% bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung. Geeignete Lösungsmittel umfassen Methyl-, Gycerol- oder Pentaerythritolester von Harzen oder modifizierten Harzen, wie hydrierte, dimerisierte oder polymerisierte Harze, sowie Terpenharze, wie Polyterpen. Besondere Beispiele solcher Lösungsmittel umfassen Pentaerythritolester von Holzharz, Glycerolester von teildimerisiertem oder polymerisiertem Harz, Gycerolester von Tallharz oder Holzharz oder teilhydrierter Methylester von Harz. Solche Lösungsmittel können in einer Menge zwischen etwa 10% bis etwa 75% bezogen auf die Zusammensetzung verwendet werden. Resveratrol kann in solchen Lösungsmitteln aufgelöst werden oder zu Mikroteilchen zerkleinert und in dem Lösungsmittel oder in der elastomeren Phase des Präparats suspendiert werden. Plastifizierer, Weichmacher und Emulsionsmittel können ebenfalls in der Gummizusammensetzung ein einer Menge von bis zu 30% bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung enthalten sein. Beispiele für diese Komponenten umfassen Lanolin, Lecithin, Gycerylmonostearat, Stearinsäure, Natriumstearat, Kaliumstearat, Glyceryltriacetat, Triacetin und Glycerin, sowie natürliche Wachse, Petroleumwachse, Paraffinwachse und Mikrokristalline Wachse zur Verbesserung der Struktur und der Konsistenz.
Die vorliegende Zusammensetzung kann auch so aufgebaut werden, daß sie einen oder mehrere zusätzliche wirksame Zusätze enthält, vorrausgesetzt, daß keiner dieser zusätzlichen wirksamen Zusätze einen nachteiligen Einfluß auf die Wirksamkeit der Zusammensetzung zur Behandlung von Periodontalerkrankung hat. Zusätzliche wirksame Bestandteile können zum Beispiel Fluoridverbindungen umfassen, wie Natriumfluorid, Kaliumfluorid, Kalziumfluorid, Magnesiumfluorid, Stannousmonofluorphosphat, Natriummonofluorphospat und Kupferfluorid. Antibakterielle Mittel, wie Ketoprofen und Benzymidin; Mundgeruchshemmer; Fleckenentferner; und andere Bestandteile, die dem Fachmann wohl bekannt sind.
Andere Zusätze können ebenfalls in der vorliegenden Zusammensetzung vorliegen, um deren Reiz zu erhöhen. Es können der Zusammensetzung zum Beispiel Geschmacksmittel zugefügt werden, die auf Grüne-Minzöl oder Pfefferminzöl basieren, um einen gewünschten Geschmackskomposition zu schaffen. Andere Verbindungen, die dazu verwendet werden können, eine Zusammensetzung mit angenehmen Geschmack zu schaffen, umfassen Menthol, Nelken, wintergrüner Eukalyptus und Anis. Eine Menge Geschmacksmittel, die für den Zusatz zur vorliegenden Zusammensetzung geeignet ist, kann im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 5% bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung liegen. Beispiele für geeignete Süßstoffe umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Saccharin, Natriumcyclamat, Aspartam, Xylitol und Sucrose. Süßstoffe sind im allgemeinen in einer Menge zwischen etwa 0,1 bis etwa 5% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung enthalten. Farbstoffe wie Titandioxid, Anti-Oxidationsmittel, wie Ascorbinsäure oder Alpha-Tocopherol, Puffer um den pH-Wert auf einem akzeptablen Wert zu halten, einschließlich beispielsweise Kaliumphosphat, Konservierungsstoffe wie Kaliumsorbat oder Kalziumpropionat, Silikon oder andere synthetische oder natürliche Polymere, die ebenfalls der vorliegenden Zusammensetzung in Mengen hinzugefügt werden können, die keinen nachteiligen Effekt auf die Wirksamkeit der Zusammensetzung haben, wie sich dies für den Fachmann versteht. Für weitere Diskussion und Beispiele für Zusätze, die der vorliegenden Zusammensetzung hinzugefügt werden können, wird Bezug genommen auf die U.S. 5 496 541, U.S. 5 585 110, U.S. 5 298 237 und U.S. 5 616 313, deren Inhalte hier durch Bezugnahme eingefügt werden.
Für die Verwendung bei der Behandlung von Einzelpersonen mit Periodontalerkrankung wird eine therapeutisch wirksame Menge der vorliegenden Zusammensetzung in den Mundraum der Person über eine geeignete Zeitspanne verabreicht. Der Begriff „therapeutisch wirksame Menge" meint eine Menge Resveratrol, die ausreicht die Periodontalerkrankung zu behandeln, ohne nicht-tolerierbare Nebenwirkungen zu erzeugen. Genaue Dosierungen der Zusammensetzung, die für die Verwendung bei der Behandlung einer Person angemessen sind, werden in angemessen gesteuerten klinischen Versuchen ermittelt. Es ist verständlich, daß die angemessene Dosierung der vorliegenden Zusammensetzung mit der Darreichungsform der Zusammensetzung variiert. So wird zum Beispiel antizipiert, daß ein wirksames Behandlungskonzept die Darreichung einer Dosis im Bereich von wenigstens 1 mg/g bis zu etwa 20 mg/g Paste oder Gel umfasst oder bis zu einer Menge an Resveratrol, die von der Paste oder dem Gel absorbiert werden kann, solange sie immer noch kosteneffektiv ist. Ein Bereich von wenigstens 0,2 mg/Stange Gummi bis etwa 200 mg/Stange Gummi, oder bis zu einer Menge an Resveratrol, die von dem Gummi absorbiert werden kann, solange sie immer noch kosteneffektiv ist; und ein Bereich von etwa 0,001–5 g/Liter flüssiger Spülung oder Spray, wobei eine bevorzugte Dosis davon durch etwa 0,02 g Resveratrol/Liter repräsentiert wird.
Es wird angenommen, daß die vorliegende Zusammensetzung mit den betroffenen Bereichen der Mundhöhle für einen akzeptablen Zeitraum pro Anwendung in Kontakt treten muß um für die Behandlung von Periodontalerkrankung effektiv zu sein und daß sie wenigstens 1 bis 3 mal pro Tag angewendet werden muß. Die Behandlungsdauer variiert mit der Darreichungsform der Zusammensetzung. In Form einer Spülung, zum Beispiel, wird die Zusammensetzung vorzugsweise über 30–60 Sekunden pro Anwendung, 2–3 mal täglich angewendet, in Form eines Gels oder einer Paste wird die Zusammensetzung vorzugsweise über 1–2 Minuten, 2–3 mal täglich angewendet; und in Form eines Gummis wird die Zusammensetzung vorzugsweise über eine längere Zeitspanne als bei den anderen Dosierformen angewendet, im allgemeinen über wenigstens einige Minuten pro Stange Gummi.
Für die Verwendung bei der Behandlung von Periodontalerkrankung schaft die vorliegende Erfindung in einem ihrer anderen Aspekte ein Herstellungsprodukt, daß Verpackungsmaterial umfasst, in welchem eine pharmazeutisch akzeptabel Resveratrol-Zusammensetzung enthalten ist, die für die Behandlung von Periodontalerkrankung wirksam ist. Das Verpackungsmaterial enthält eine Markierung, die darauf hinweist, daß die Zusammensetzung für die Behandlung von Periodontalerkrankung verwendet werden kann.
Spezielle Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden nachstehend in den folgenden spezifischen Beispielen ausführlicher beschrieben, die aber nicht als beschränkend gedacht sind.
Beispiel 1 – Bestimmung von Dioxin-induziertem Knochenschwund und Wirkung von Resveratrol
In diesem Experiment wurde das Küken Periosteal Osteogenese (CPO) Modell verwendet, um den von Dioxin induzierten Knochenschwund zu bestimmen. Das CPO-Modell wurde bereits ausführlich beschrieben (Nijweide, Proc. Kon. Ned. Akad. Wet. 1975. C78: 410–417) und für die Zwecke dieses Experiments wie unten ausgeführt vorbereitet.
Nach der Tötung wurden zwei dreieckige Wadenexplantate durch Schnitte entlang der zentralen Naht, transversal entlang der hinteren Naht und lateral über dem Auge eines 17 Tage alten, embryonalen Kükens entnommen. Das ectocraniale Periosteum (äußere gekrümmte Oberfläche) wurde abgepellt, wobei unter mikroskopischer Vergrößerung Zangen verwendet wurden, und so gefaltet, daß die Oberfläche, die ursprünglich auf die Knochen gerichtet war, auf in Apposition mit sich selbst befand, wie dies bereits beschreiben wurde (Tenenbaum et al., Calcif Tissue Int. 34; 76–79). Das gefaltete Explantat wurde dann auf ein Millipore Filter (HA 0,45 μm) aufgebracht, das auf ein Gitter aus rostfreiem Stahl überführt wurde, welches in der Mittenvertiefung einer Schale für organische Kulturen (Falcon Plastics, Lincoln Park, NJ, USA) sitzt, die mit Kultivierungsmittel bis zu einem Niveau gefüllt ist, daß die Kultur an der Gas-Flüssig-Schnittstelle unterstützt wird (~1,5 ml des Mediums). Drei Kulturen wurden in jede Schale eingebracht, die dann abgedeckt und bei 37°C in feuchter Atmosphäre, die 5% CO₂ in Luft enthält inkubiert. Medienwechsel erfolgten an den Tagen 2 und 4 und das Medium enthielt BGJ_b-Medium (Fitton-Jackson-Modifikation) mit L-glutamin (Gibco, Grand Island, NY, USA) und mit 2% Antibiotikum (10 000 Einheiten/ml Penicillin G Natrium, 10 000 μg/ml Streptomycinsulfat in 0,85 Salzlösung (Gibco), 10% fötalem Kalbsserum (Gibco), 10^–7 M-Dexamethason (Sigma, St. Louis, MO, USA), 10 mM (β-Glycerophosphat und 300 μg/ml L-Ascorbat (Gibco) versetzt.
Für die Zwecke dieser Untersuchung wurden die Wirkungen eines starken Aryl-Kohlenwasserstoffs, TCDD (2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-Dioxin oder Dioxin) auf die frühen Ereignisse, die während der Osteogenes aufreten, bestimmt. Das CPO-Modell überspannt eine Reihe von Osteogenese-Phasen. Es war daher möglich, vorläufige, oder "Fenster"-Experimente zu entwerfen, um die Osteogenese-Phasen zu bestimmen, die TCDD- und/oder Resveratrol-empfindlich sind. CPO-Kulturen wurden mit 10^–9 M TCDD, 10^–6M Resveratrol ± 10^–9 M TCDD oder Träger behandelt. Alle Kulturen wurden über einen kompletten 6-Tage-Zeitraum beibehalten. Die Verbindungen wurden über vier unterschiedliche zeitliche Phasen verabreicht, wie die un unten stehendem Zeitstrahl-Diagramm veranschaulicht ist: a) Tage 0–6; b) Tage 0–2; c) Tage 2–4; oder d) Tage 4–6 (Anmerkung: Alle Kulturen wurden bei 6 Tagen angehalten). Die Ergebnisse wurden mit e) dem Träger allein über 0–6 Tage verglichen.
Die Kulturen erhielten eine Trägersteuerung, wenn sie kein Resveratrol ± TCDD erhielten und die Medien wurden alle 48 Stunden ausgewechselt. Wenn gemeinsam hinzugefügt wurden TCDD und Resveratrol simultan hinzugefügt um ihre Wirkung in direkter Kombination zu ermitteln. An Tag 6 wurden die Kulturschalen auf Eis gelegt und einzelne Kulturen wurden in separate Reagenzgläser überführt und bei –20°C für die weitere Analyse gelagert.
Da gezeigt werden konnte, daß die Aktivität von Alkaliphosphatase (APA) in diesem Modell-System eine zuverlässige Markierung ist, wurde sie als Hauptergebnismaß ausgewählt (Tenenbaum et al., J. Histochem. Cytochem., 34: 769–773, 1986b). Es wurden Proben von CPO-Kulturen zur Untersuchung der AP-Aktivität genommen, wobei Paranitrophenolphosphat (pN-p) als Substrat verwendet wurde (Demetriou et al. J Biol Chem. 1996. 271(22)12755–61). Die Intensität des Farbwechsels wurde unter Verwendung von Titertek^® Multiskan^® MCC/340 Spektrometer (Flow Laboratories, Mississauge, ON, Kanada) ausgewertet und mit einer Standardkurve verglichen, die aus der Reihenverdünnung von 10 mM pN mit Bicarbonat-Puffer (pH 7,4) in Titertek 96-Stehteller, erhalten wurde, wie bereits beschrieben (Demetriou et al., 1996, supra). Die Reaktion wurde mit 100 μl 0,2 N NaOH angehalten und die nN-p-Levels bei 405 nm auf dem Titertek ausgelesen. Der Calcium-Gehalt wurde in einem Niederschlag bestimmt, der aus der Zentrifugierung der homogenisierten CPO-Kulturen erzeugt wurde, der auf die Hydrierung in 500 μl 0,5 N HCl folgte und anschließend unter Verwendung von Atomabsorptionsspektrometrie gemessen wurde (Sukhu et al. Endocrinology.. 1997.138(8): 3269–75).
Die Isolierung des gesamten RNA von den periostealen Kulturen zur Bestimmung der Auswirkung von TCDD auf Meldelevel von Knochenproteinen wurde unter Verwendung von QUIAGEN Rneasy^® Kit und QIAShredder^® (Hilden, Germany) entsprechend den Herstellerangaben durchgeführt. Das gesamte RNA wurde zurück transcribiert, wobei SuperScript II^TM RNase H^– Reverse Transcriptase (Gibco BRL, City Country) verwendet wurde. Die PCR-Reaktionen wurden in 2 μl Reaktionen durchgeführt bei einer Zykluszahl, die in lineares Verstärkungsprofil sicherstellt (BSP, 5 min bei 94°C, 30 Zyklen [20 s bei 94°C, 20 s bei 55°C, 20 s bei 72°C]; Collagen 5 min bei 94°C, 30 Zyklen [20 s bei 94°C, 20 s bei 58°C, 20 s 72°C]; AP 5 min bei 94°C, 30 Zyklen [20 s bei 94°C, 20 s bei 59°C, 20 s bei 72°C]; OPN 5 min bei 85°C, 5 min bei 94°C, 25 Zyklen [20 s bei 94°C, 20 s bei 60°C, 20 s bei 72°C] 7 min bei 72°C). Die Oligonucleotide für BSP (Sense: 5'-GAGCGGGCACCGGTACTA-3'; Antisense: 5'-CTCTAGACACTGACATCCTGCTC-3') AP (Sense: 5'-ACCGCTGCAACACCACCA- 3'; Antisense: 5'-TCCCCGCAGGCTTAGTGT-3'), Collagen (Sense: 5'-ACCCGACCCTAAGACAAA-3'; Antisense: 5'-TCGGCGTTGGGGCAGT-3'); OPN (Sense 5'-AGGCCGGGGTGACAGTGT-3'; Antisense 5'-CCCCGCAGGCAGCACTC-3') wurden von Life Technologies (Gibco BRL, Rockville, MD) sythetisiert. PCR-Produkte wurden der Elektrophorese auf 1,5 (Gew.-Vol)% Agarosegel mit 0,1 μl/ml Ethidiumbromid. Die Gele wurden auf einem UV-Transilluminator visualisiert und mit einem 667 Polaroid-Film fotographiert. Die inversen Bilder der Fotographien wurden mit Densitometrie analysiert. Alle Werte wurden normalisiert für die interne Kontrolle, (β-Aktin.
Radiomarkiertes Collagen wurde in den CPO-Kulturen gemessen, die mit ¹⁴C-Glycin (Amersham, 59 mCi/mMol) bei einer Konzentration von 10 μci/ml Medium in jeder Gruppe über 4–6 Tage inkubiert wurden. Die Kulturen wurden in 0,1 ml 0,1 N HCl hydrolysiert und verwirbelt. Nach 15 Minuten wurde der Überstand entfernt und in eine 2 ml Eppendorf-Tube überführt. Die Kultur wurde in eine 0,5 ml Eppendorf-Tube, die 0,1 ml Pepsin enthält (50 μg/ml in 0,1% Eisessig), für den weiteren Aufschluß des markierten Collagens überführt. Diese wurden in einem 15°C-Wasserbad für 5 Stunden stehen gelassen, wobei die Proben jede Stunde verwirbelt wurden. Der Überstand wurde in eine neue 0,5 ml Eppendorf-Tube überführt und über Nacht gefriergetrocknet. Die Menge an radiomarkiertem Collagen wurde durch Gel-Elektrophorese wie nachstehend beschrieben bestimmt. Die gefriergetrockneten Proben wurden mit 0,1 ml einer Lösung, die aus 70% Probenpuffer (10 mM Tris·HCl und 1 mM EDTA, pH 8,0) (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Canada), 2,5% SDS (Sigma), 5% β-Mercaptoethanol (Sigma) und 0,01% Bromophenol-blue (Sigma) besteht, wiedergewonnen. Die Proben wurden 5 Minuten gekocht und auf ein 7,5%-iges SDS-Gel (Amersham Pharmacia Biotech, Inc, Quebec) aufgebracht. Das Gel lief dann auf dem PhastSystem^TM (Pharmacia, Quebec) bei 250 V, 10.0 mA, 3.0 W, 15°C für 20 Minuten.
Es wurde die Fluorgraphie verwendet, um die Menge des neu sythetisierten ¹⁴C-markierten Collagen in jeder Probe zu analysieren. Jedes Gel wurde mit 20% PPO in DMSO beschichtet. Die Gele wurden dann für 2 Tage bei –80°C einem photographischen Film (Kodak, Rochester, NY, USA) ausgesetzt und der Film danach entwickelt. Die Intensität der resultierenden Bänder auf dem Film wurden quantifiziert, wobei ein Laserdensitometer verwendet wurde, um ein Maß für die Menge des neu synthetisierten Collage jeder Probe anzugeben.
Ergebnisse:
Knochenbildung im CPO-Modell
Wie in 1A–D gezeigt, ergaben sich offensichtliche Veränderungen bei der Knochenbildung in CPO-Kulturen, die mit TCDD behandelt wurden. Obwohl morphometrische Messungen nicht durchgeführt wurden, mußten die TCDD-behandelten Proben (1B) abgetrennt werden um überhaupt irgendeinen Knochen zu visualisieren. In diesen Kulturen erschien jedoch die geringe Knochenmenge, die sich überhaupt gebildet hatte, mehr oder weniger normal zu sein, insofern, als eine Knochenmatrix erkennbar war, die osteocytische Zellen hatte, die ebenfalls von Osteoblast-artigen Zellen umgeben waren. Es schien eine vollständige Umkehrung der TCDD-Wirkung bei Kulturen zu geben, die sowohl mit TCDD, als auch mit Resveratrol behandelt wurden (1D). Große Knochensäume konnten visualisiert werden und der Knochen, der von einer Multischicht aus Knochenbildnern (Pfeilkopf) umgeben war, enthielt einige Osteocyten (kleiner Pfeil). Der Knochensaum und die Knochenbildner waren umgeben von einer Collagen-reichen Schicht aus faserigem Periosteum (f). Die Kulturen, die sowohl mit TCDD, als auch mit Resveratrol behandelt wurden, waren nicht zu unterscheiden von den Kontroll-Kulturen (1A), die leicht erkennbare Säume mineralisierter Knochen (M) enthielten, welche von unmineralisiertem Osteoid (O) umgeben waren. Kulturen, die nur mit Resveratrol behandelt wurden (1C) zeigten ebenfalls große Knochenablagerungen, ähnlich zu den Kontrollkulturen.
Biochemische Markierungen von Osteogenese in CPO
Kulturen, die mit 10^–9 M TCDD über eine Zeitspanne von 6 Tagen behandelt wurden, zeigten eine 80%-ige Reduzierung der AP-Aktivität gegenüber Kulturen mit nur dem Träger. Resveratrol in Dosierungen von 10^–5M, 10^–6M und 10^–7 M verhinderten teilweise die hemmenden Effekte von TCDD durch Erhöhen der AP-Aktivität um ein 2–4-faches im Vergleich zu TCDD allein (2a). Die Verabreichung von 10^–9 M TCDD allein während der Tage 2–4 oder 4–6 änderte die AP-Aktivität nicht signifikant, aber die Verabreichung während der Tage 0-2 reduzierte die AP-Aktivität um 53% ähnlich zur 6-Tage-Behandlung (p < 0,05 vs. Träger) (2b). Es wurde keine signifikante Änderung der AP-Aktivität festgestellt, wenn 10^–6M Resveratrol alleine über Tage 0–6, Tage 0–2, Tage 2–4 oder Tage 4–6 zugefügt wurden (2c). Wie in den 3 und 4 dargestellt, sind die Meldungslevels für AP ebenfalls um etwa 50% (p < 0,05) bei Kulturen reduziert, die mit TCDD im Vergleich zur Kontrolle behandelt wurden. In Kulturen, die sowohl mit TCDD, als auch mit Resveratrol behandelt wurden, waren die mRNA-Levels ähnlich wie bei der Kontrolle. Parallel zu AP, mRNA waren die OPN-Levels um etwa 40 % (p < 0,05) bei Vorliegen von TCDD reduziert und in Kulturen, die sowohl mit TCDD als auch mit Resveratrol behandelt wurden, wieder hergestellt. Ein ähnliches Profil wurde für BSP dargestellt, bei welchem eine etwa 4-fache Reduktion in mRNA für BSP bei Vorliegen von TCDD (p < 0,05), wie in 3 & 4 gezeigt, vorlag. Diese Hemmung wurde mit Resveratrol vollständig umgekehrt. Interessanterweise schien Resveratrol alleine teilweise die Meldung für Collagen und BSP nach unten zu regulieren, aber keine anderen Transcripts. β-Aktin-Banden waren in allen Gruppen (TCDD-behandelt, Resveratrol-behandelt, TCDD- und Resveratrol-behandelt und Kontrollgruppe) konsistent, wie es für dieses „Hausverwaltergen" erwartet wird.
Matrix Synthese in der CPO
Die Levels für das neu synthetisierte Collagen Typ I (aufgetragen als Absorbance Einheiten (AU) × mm) wurden um etwa 30% bei den Behandlungsgruppen reduziert, die nur 10^–9 M TCDD (p > 0,05) erhielten, während 10^–6 M Resveratrol allein keinen Effekt im Vergleich zum Träger hatte (5). Die Co-Behandlung mit TCDD und Resveratrol steigerte die Levels des neu synthetisierten Collagen Typ I (5a), aber dies war nicht signifikant unterschiedlich zu den Collagen Levels, die für Kulturen, die nur mit TCDD behandelt wurden, gezeigt wurden. Wie es jedoch in den 3 & 4 gezeigt ist, wurden die mRNA-Levels für Typ I Collagen im Beisein von TCDD signifikant (50%, p < 0,05) reduziert im Vergleich zur Kontrolle, während die Kulturen, die sowohl mit TCDD, als auch mit Resveratrol behandelt wurden, identische mRNA-Level für Typ I Collagen hatten.
Statistische Methoden
Alle CPO-Experimente wurden mit 9 Kulturen pro Gruppe (n = 9) durchgeführt, ausgenommen der mRNA-Extraktion, bei welcher 12 Kulturen pro Gruppe verwendet wurden (n = 12). Die Ratten SBMC-Linien Experimente (beschrieben im folgenden Beispiel 2) wurden in allen Fällen mit 3 Wiederholungen (n = 3) durchgeführt. In allen Experimenten wuden die Ergebnisse jeder Behandlungsgruppe nur gegenüber der Gruppe verglichen, die Träger-enthaltendes Medium erhielten (in den Graphen als „Träger" bezeichnet). In den RT-PCR-Experimenten, wurden Mehrfach-Vergleiche zwischen den Gruppen durchgeführt, wobei one-way-ANOVA und der Student-Newman Keul-Test für die nachträgliche Analyse verwendet wurden.
Beispiel 2 Effekte von Resveratrol auf Dioxin-vermittelte Hemmung von Knochenzellenteilung in der Ratten Stromal Knochenmark-Zelllinie (RSBMC)
Zellen für das Ratten SBMC-Modell wurden von Dr. Sandu Pitaru (Tel Aviv University, Israel) erhalten und in T₂₅-Gewebekultur-Kolben (Sarstedt, Newton, NC, USA) in einem Medium aufbewahrt, das aus αMEM + RNA + DNA + Antibiotikum, das mit 10% fötalem Kalbsserum versetzt war, 10 mM β-Glycerophosphat, 10^–8 M Dexamethason, 50 μg/ml Vitamin C und 3 ng/ml Fibroblast Wachstumsfaktor zusammengesetzt war. Die Medien wurden alle 48 Stunden ausgewechselt und die Zellen subkultiviert, wenn sie fast konfluent waren (etwa alle 72 Stunden). Die Zellen wuchsen über einen Zeitraum von 1– 2 Wochen, damit die Bildung mineralisierter Knochennadeln ermöglicht wurde.
Die SBMC-Kulturen wurden auf AP-Aktivität untersucht, wobei Paranitrophenolphosphat (pN-p) wie oben beschrieben als Substrat für die CPO-Kulturen verwendet wurde. In einigen Fällen wurde die AP-Aktivität auch durch direktes Färben der SBMC-Kulturen in 96 Wellplates gemessen, wie bereits beschrieben (Tenenbaum et al., Anat Rec. 1995. 242(2): 200–10). Die Mineralisierung in SBMC-Kulturen wurde bestimmt, indem Alizarin Rotfärbung in situ verwendet wurde, welche mit dem Titertek Spektrophotometer bei 525 nm vermessen wurde.
Untersuchung der konkurrierenden Bindungen für TCDD und Resveratrol
Vier Proben wurden verwendet um die Untersuchung der konkurrierenden Bindungen lebender, ganzer Zellen (RSBMC) durchzuführen, damit der spezifische Rezeptor, der die Aufnahme des radiomarkierten TCDD aufnimmt, gezeigt werden kann. Diese Technik wurde bereits beschrieben (Tenenbaum et al. Anat Rec. 1995. 242(2): 200–10) und zeigt Ergebnisse, die mit den herkömmlicheren Bindungsuntersuchungen vergleichbar sind, die auf Cytosol-Zubereitungen basieren. Es sollte jedoch hervorgehoben werden, daß die Bindungskurven, die unter Verwendung von lebenden Zelluntersuchungen erzeugt werden, unterschiedlich zu denen sein können, die unter Verwendung der eher dem Standard entsprechenden Cytosol-Bindungsuntersuchungen erzeugt wurden. Es ist daher nicht möglich in diesen Untersuchungen Kd zu berechnen. Diese Lebendzellen-Aufnahme/-bindung kann jedoch mit wesentlich weniger Zellen bewerkstelligt werden, als dies ansonsten erforderlich ist um eine angemessene Menge an Cytosol für herkömmlichere Untersuchungen zu erzeugen. Bemerkenswerterweise werden die Cytosol-Präparate allgemein aus ganzen Organen erhalten. Wir bevorzugen daher Lebendzellen-Aufnahmeuntersuchungen trotz der Tatsache, daß "klassische" konkurrierende/Bindungskurven nicht unbedingt mit dieser Herangehensweise zugänglich sind, da Massenkulturen von Zellen erforderlich wären, um verwendbare Mengen an Cytosol zu erhalten. Das Erfordernis der Präinkubation (s. u.) kann weiterhin die Konkurrenz-Kinetik bei diesem Typ der Bindungsuntersuchung verändern. Die Zellen wurden bei einer Dichte von 10 000 pro Well in Titertek 96-Well plates aufgenommen und über Nacht stehen gelassen um im Medium gebunden zu werden. Das Medium wurde durch Ansaugen entfernt und die verschiedenen Konzentrationen des kalten Heilmittels (TCDD, Resveratrol) wurden zubereitet und den Wells mit einem Volumen von 90 μl zugefügt. Die Zellen wurden eine Stunde vor der Zugabe von radiomarkiertem TCDD (spezifische Aktivität 33,4 Ci/mmol; Chemsyn Lab, Kansas) mit kaltem Heilmittel präinkubiert (Pilotstudien haben gezeigt, daß die Präinkubation erforderlich war um Konkurrenz zu detektieren). Ein Satz Wells wurde ohne kaltes Heilmittel inkubiert, damit die Gesamtbindung bestimmt werden konnte. ³H-TCDD (10000 cpm/Well in einem Volumen von 10 μl) wurden hinzugefügt und für 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Medien wurden abgesaugt und die Zellen 4× mit 100 μl PBS gewaschen. 100 μl 0,1 N Schwefelsäure wurde hinzugefügt und die Zellen wurden bei 37°C über Nacht inkubiert um die Zellen aufzubrechen. 80 μl Lysat wurden zu 5 ml Scintillationsfluid hinzugefügt und in einem β-Zähler gezählt.
Ergebnisse SBMC-Linie
Alkaliphosphatase
Wie in 6 gezeigt, induziert TCDD (3,3 × 10^–9 M und mehr) eine 33%-ige Reduzierung der AP-Aktivität gegenüber der Kontrolle, aber diese Reduktion wurde nicht durch die Verabreichung von Resveratrol in unterschiedlichen Konzentrationen rückgängig gemacht. Eine 33%-ige Reduzierung der AP-Aktivität wurde ebenfalls nach der Behandlung mit geringeren Konzentrationen an TCDD (1,1 × 10^–9 M) gezeigt. In diesem Fall wurden jedoch die Wirkungen von TCDD bei steigenden Konzentrationen an Resveratrol (4 × 10^–8 M bis 1 × 10^–5 M) beeinflusst und brachten die AP-Aktivität zurück oder sogar über die, welche bei den Kontrollkulturen beobachtet wurden. Dieses Muster wurde bei den Kulturen, die geringer Levels an TCDD erhielten, wiederholt. Die ursprüngliche Reduktion der AP-Aktivität aufgrund von TCDD war Dosis-abhängig (3,3 × 10^–9 M bis 4,12 × 10^–11 M). Die Beeinflussung der Wirkung von TCDD bei steigenden Resveratrol-Konzentrationen wurde bei jedem Level der TCDD-Verabreichung deutlich bis eine Konzentration von 4,12 × 10^–11 M TCDD erreicht wurde. Bei dieser Konzentration war die AP-Aktivität nicht betroffen (d. h. ähnlich wie bei der Kontrolle) und steigende Konzentrationen an Resveratrol hatten ebenfalls keine Wirkung. Bei einigen der TCDD-Konzentrationen verursachte die Zugabe der höchsten Maße an Resveratrol eine Steigerung der AP-Aktivität über die, die in der Kontrollgruppe gefunden wurde. Interessanterweise wurde dies in CPO angenommen, wo mRNA ebenfalls eine Tendenz für AP zeigte höher als die Kontrolle zu sein (siehe 3 & 4).
Mineralisierung der Ratten SBMC-Linie
Es gab eine Dosis-abhängige Reduzierung der Mineralisierung (d. h. Alizarin Rotfärbung) bei Vorliegen von 4,12 × 10^–11 M bis 1,52 × 10^–12 M TCDD (7). Die Mineralisierung verringerte sich um etwa 75% bei Vorliegen von TCDD, das durch Resveratrol verstärkt wurde. Interessanterweise wurden nicht nur die TCDD-Wirkungen bei den höchsten Konzentrationen von Resveratrol verstärkt, sondern es erschien eine 3-fache Steigerung gegenüber den Kontroll-Levels zu geben.
Spezifische Bindung von TCDD und Resveratrol
Steigende Konzentrationen an TCDD, die effektiv mit ³H-TCDD für ihren Cognat-Rezeptor konkurrieren, und reduziertes Binden auf Untergrundlevels bei 3,3 × 10^–8 M legt daher die Existenz des AhR in SBMC-Zellen nahe, trotz der Tatsache, daß „klassische" Konkurrenzkurven nicht gezeigt wurden. Näherungsweise 50% der Konkurrenz wurde bei 3,7 × 10^–9M TCDD erreicht (8a). Resveratrol konkurrierte mit ³H-TCDD in ähnlicher Weise. Resveratrol (1,37 × 10^–9M) reduziert ebenfalls die radiomarkierten TCDD-Bindungen auf Untergrundlevel, während 50% Konkurrenz bei ~1,8 × 10^–10M Resveratrol auftrat, einer Dosis, die 20× geringer ist, als die Dosis an unmarkiertem TCDD, die erforderlich ist um diesen Level an Konkurrenz zu erzeugen (8b).
Beispiel 3 – Die Effekte von Resveratrol auf Dioxin-vermittelte Hemmung von Knochenzellenteilung in Ratten-Hauptknochenmarkzellen (RBMC) Knochenbildungs-System
Ratten-Knochenmarkzellen wurden von Oberschenkelknochen von erwachsenen, männlichen Wistar-Ratten erhalten, wie bereits beschrieben (Maniatopoulos et al., Cell Tissue Res, 1988, 254(2): 317–330). Diese Zellen, die zusammen mit Dexamethason, Vitmin C und b-Glycerophosphat kultiviert wurden, teilten sich in Osteoblasts, wie durch die Steigerungen bei APA gezeigt wurde, und in die Produktion von mineralisierten Knochenknötchen innerhalb von 12–14 Tagen. Für die Zwecke dieser Unterwuchung analysierten wir 10–16 Tage Kulturen auf APA, da dies eine zuverlässige Markierung für osteoblasische Teilung in diesem System darstellt.
Wenn es zu den Zellen in einer Konzentration von 10^–9 in Alkohol hinzugefügt wird, hemmt TCDD Osteoteilung im Vergleich zu Alkohol-behandelten Kontrollen, wie es bei APA gemessen wurde, um etwa 50%, während Resveratrol allein keine signifikanten Effekte zeigte. Resveratrol in einer Konzentration von 10^–6 molar in Alkohol verhindert die Effekte von TCDD vollständig, wenn beide Mittel zusammen hinzugefügt werden, oder einzeln zwischen den Tagen 4–10 (9). Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet, wenn RBMC-Kulturen TCDD und Resveratrol über die Tage 10–16 ausgesetzt wurden (10).
Beispiel 4 Die Wirkungen von Resveratrol auf Dioxin-vermittelte Hemmung von Knochenzellenteilung in Ratten-Knochenmarkzellen-Linien (RBMCL)
Wie bei CPO und RBMC-Kulturen gezeigt wurde, war Resveratrol in der Lage TCDD-Wirkungen auf osteoblastische Teilung in RBMCL zu hemmen, wie dies mit APA ermittelt wurde. Interessanterweise schien bei RBMCL eine geringere Dosis TCDD in der Lage zu sein osteogenische Teilung zu hemmen, wie dies in 6-Tage-Kulturen zu sehen war, im Vergleich zu der, die bei CPO und RBMC verwendet wurde. In jedem Fall war Resveratrol bei Konzentrationen von 4 × 10^–8 M bis 3 × 10^–5 M nicht nur in der Lage TCDD-vermittelte Hemmung von osteoblastischer Teilung zu hemmen, sondern schien auch APA im Vergleich zur Kontrolle zu stimulieren (11A–E).
Beispiel 5 – Die Wirkungen von Resveratrol auf Benzo-a-pyren-induzierten Knochenschwund
In diesem Experiment wurden die Wirkungen des Aryl-Kohlenwasserstoffs, Benzo-a-pyren (BaP) auf frühe Ereignisse bestimmt, die währende der Osteogenese auftreten. Zehn Tage alte Rattenknochenmark-Kulturen wurden mit steigenden Konzentrationen BaP behandelt. Die Wirkung dieser Behandlung wurde mit APA wie oben angegeben beobachtet. Zusammen mit diesem Experiment wurde ein Experiment durchgeführt, bei welchem Ratten-Knochenmark-Kulturen mit BaP und Resveratrol (10^–6 M) behandelt wurden.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 12 und 13 dargestellt. Die BaP-Behandlung führte zu einer erhöhten Hemmung von Alkalinphosphatase mit steigender BaP-Konzentration. Wenn Resveratrol mit BaP zu den Kulturen hinzugefügt wird, bewirkte das nicht nur eine Umkehrung der Hemmungswirkung von BaP, sondern steigerte die Alkalinphosphatase-Aktivität über die Aktivität der Kontrolle hinaus (12). Für BaP wurde gezeigt, daß es in einer Verringerung in Minerallevels resultiert, da die BaP-Konzentration mit so viel wie 90% Hemmung bei 10^–8M gesteigert wurde. Resveratrol und BaP zusammen ergeben eine vollständige Umkehrung der BaP-Wirkungen bei 10^–8 M mit einer teilweisen Umkehrung bei höheren Konzentrationen von BaP (13).
Mit den Ergebnissen der oben aufgeführten Experimente scheinen Aryl-Kohlenwasserstoff Rezeptorliganden (AhR) eine grundlegende, hemmende Wirkung auf osteogenische Zellteilung zu haben und auf die mineralisierte Knochenbildung in einer Anzahl verschiedener Systeme. Bemerkenswerterweise werden diese negativen Effekte entweder teilweise oder vollständig von Resveratrol umgekehrt, je nach relativer Dosis entweder des verwendeten Mittels oder den Modellsystemen die für die Tests verwendet wurden. Die Wirkungen von Resveratrol sind in hohem Maße konsistent mit einem Rezeptor vermittelten Phenomen. Die Tatsache, daß diese Wirkungen bei unterschiedlichen Modellsystemen und selbst mit unterschiedlichen Arten gezeigt werden konnten, stützt die Annahme, daß diese Wirkungen auch bei menschlichen Modellsystemen sowohl in vitro, als auch in vivo reproduziert werden können.

Claims

Verwendung einer Verbindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der Periodontalerkrankung bei einem Patienten, wobei die Verbindung eine therapeutisch wirksame Menge an Resveratrol in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei besagtes Medikament eine Form hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe Spülung, Gel, Paste, Puder und Gummi.
Die Verwendung nach Anspruch 2, wobei besagtes Medikament eine Form hat, die ausgewählt ist aus der Gruppe Spülung, Gel, Paste, Puder und Kaugummi, wobei beagtes Resveratrol gemahlenes Resveratrol enthält.
Die Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei besagtes Medikament die Form einer Spülung hat.
Die Verwendung nach einem der vorgehenden Ansprüche, wobei besagtes Medikament zur Verabreichung in Form einer Paste oder eines Gels geeignet ist.
Die Verwendung nach den Ansprüchen 2, 3, oder 5, wobei besagtes Medikament die Form einer Paste oder Gels annimmt, wobei es eine Resveratrol-Dosis von etwa 1–20 mg/g enthält.
Die Verwendung nach den Ansprüchen 1,2 oder 3, wobei besagtes Medikament die Form eines Gummis annimmt, wobei es eine Resveratrol-Dosis von wenigstens 0.2 mg/Stange Kaugummi enthält.
Die Verwendung nach einem der vorgehenden Ansprüche, wobei besagtes Medikament wenigstens einen weiteren aktiven Bestandteil enthält.
Die Verwendung nach Anspruch 6, wobei besagter aktiver Bestandteil ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fluor-Verbindungen, Anti-Karies-Mitteln, Anti-Bakteriellen-Mitteln, Anti-Belag-Mitteln, entzündungshemmenden Mitteln, Mundgeruch verhindernden Mitteln und Fleckenentfernern.
Die Verwendung nach einem der vorgehenden Ansprüche, wobei besagtes Medikament eine Resveratrol-Dosis von etwa 0,001–5 g/Liter enthält.
Eine Periodontalerkrankung verhindernde Verbindung enthaltend Resveratrol und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und wenigstens einen zusätzlichen aktiven Bestandteil, wobei besagter aktiver Bestandteil ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fluor-Verbindungen, Anti-Karies-Mitteln, Anti-Bakteriellen-Mitteln, Anti-Belag-Mitteln, entzündungshemmenden Mitteln, Mundgeruch verhindernden Mitteln und Fleckenentfernern.
Eine Periodontalerkrankung verhindernde Verbindung nach Anspruch 11, in Form einer topischen Formel, die für die Verabreichung im Mundraum geeignet ist.
Eine Periodontalerkrankung verhindernde Verbindung nach Anspruch 12, in einer Form, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Spülung, Gel, Paste, Spray, Puder und Kaugummi.
Eine Periodontalerkrankung verhindernde Verbindung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, in Form einer Spülung oder eines Sprays enthaltend eine Resveratrol-Dosis von etwa 0.001–5 g/Liter.
Eine Periodontalerkrankung verhindernde Verbindung nach einem der Ansprüche 11 bis 14 in Form einer Paste oder Gel enthaltend eine Resveratrol-Dosis von etwa 1–20 mg/g.
Eine Periodontalerkrankung verhindernde Verbindung nach einem der Ansprüche 11 bis 15 in Form eines Kaugummis enthaltend eine Resveratrol-Dosis von wenigstens 0,2 mg/Stange Kaugummmi.
Eine Verbindung zur Verwendung bei der Behandlung von Knochenschwund und/oder Zahnwurzelschwund welche mit Aryl-Kohlenwasserstoff-Kontakt induzierter Periodontalerkrankung verbunden ist, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge an Resveratrol, einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und wenigstens einen zusätzlichen aktiven Bestandteil, wobei besagter aktiver Bestandteil ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Fluor-Verbindungen, Anti-Karies-Mitteln, Anti-Bakteriellen-Mitteln, Anti-Belag-Mitteln, entzündungshemmenden Mitteln, Mundgeruch verhindernden Mitteln und Fleckenentfernern.
Eine Verbindung zur Verwendung bei der Behandlung von Knochenschwund und/oder Zahnbefestigungsschwund welcher mit Peridontalerkrankung verbunden ist, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge an Resveratrol, einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und wenigstens einen zusätzlichen aktiven Bestandteil, wobei besagter aktiver Bestandteil ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Fluor-Verbindungen, Anti-Karies-Mitteln, Anti-Bakteriellen-Mitteln, Anti-Belag-Mitteln, entzündungshemmenden Mitteln, Mundgeruch verhindernden Mitteln und Fleckenentfernern.
Eine Verbindung nach Anspruch 17 oder 18, wobei besagte Periodontalerkrankung die Raucher-induzierte Periodontalerkrankung umfasst.
Eine Verbindung zur Verwendung bei der Vorbeugung von Periodontalerkrankung bei Rauchern, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge an Resveratrol und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und wenigstens einen zusätzlichen aktiven Bestandteil, wobei besagter aktiver Bestandteil ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Fluor-Verbindungen, Anti-Karies-Mitteln, Anti-Bakteriellen-Mitteln, Anti-Belag-Mitteln, entzündungshemmenden Mitteln, Mundgeruch verhindernden Mitteln und Fleckenentfernern.
Eine Verbindung nach einem der Ansprüche 17 bis 20 in Form einer topischen Formel, die für die Verabreichung im Mundraum geeignet ist.
Eine Verbindung nach Anspruch 21, in einer Form, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Spülung, Gel, Paste, Spray, Puder und Kaugummi.
Eine Verbindung nach Anspruch 22, wobei dort, wo die Verbindung in der Form vorliegt, die aus der Gruppe bestehend aus Gel, Paste, Puder oder Kaugummi ausgewählt ist, besagtes Resveratrol gemahlenes Resveratrol enthält.
Eine Verbindung nach einem der Ansprüche 17 bis 23, in Form einer Spülung oder eines Sprays enthaltend eine Resveratrol-Dosis von etwa 0,001–5 g/Liter.
Eine Verbindung nach einem der Ansprüche 17 bis 23, in der Form einer Paste oder Gel enthaltend eine Resveratrol-Dosis von etwa 1–20 mg/g.
Eine Verbindung nach einem der Ansprüche 17 bis 23, in der Form eines Kaugummis, enthaltend eine Resveratrol-Dosis von wenigstens 0,2 mg/Stange Kaugummi.
Eine Verbindung nach einem der Ansprüche 17 bis 26 in der Form einer Spülung, eines Kaugummis oder einer Lutschtablette und weiterhin enthaltend eine Resveratrol – Dosis von etwa 1 Milligramm.
Verwendung von Resveratrol bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Periodontalerkrankung bei Personen die einem hohen Level an Aryl-Kohlenwasserstoffen ausgesetzt sind.
Verwendung von Resveratrol zur Herstellung eines Medikaments zur Vermeidung von Knochen oder Zahnbefestigungsschwund, der mit Peridontalerkrankung bei Rauchern verbunden ist.
Verwendung von Resveratrol bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Periodontalerkrankung.