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Bereich der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft die Kristallisation
von Molekülen,
und insbesondere Tabletts, die zum Testen einer großen Anzahl
an Kristallisationsbedingungen geeignet sind.
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Hintergrund der Erfindung
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Makromolekulare Röntgenstrahl-Kristallographie
ist ein wichtiges Werkzeug in der modernen Arzneimittelerforschung
und Molekularbiologie. Mit Hilfe von Röntgenstrahlkristallografietechniken
können
die dreidimensionalen Strukturen biologischer Makromoleküle, wie
zum Beispiel Proteine, Nucleinsäuren
und deren verschiedene Komplexe, praktisch mit atomarer Auflösung aus
Röntgendiffraktionsdaten
bestimmt werden.
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Einer der ersten und wichtigsten
Schritte bei der Bestimmung von Kristallstrukturen eines Zielmakromoleküls mit Hilfe
von Röntgenstrahlen
ist die Züchtung
großer,
gut beugender Kristalle des Makromoleküls. Da die Techniken zum Sammeln
und Analysieren von Röntgendiffraktionsdaten
immer schneller und mehr automatisiert wurden, ist das Kristallwachstum
zu einem Geschwindigkeit begrenzenden Schritt im Prozess der Strukturbestimmung
geworden.
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Dampfdiffusion ist, die für die Kristallisation bei
der modernen makromolekularen Röntgenkristallographie
am häufigsten
eingesetzte Technik. Bei dieser Technik wird ein kleines Volumen
der Makromolekülprobe
mit einem ungefähr
gleichen Volumen einer Kristallisationslösung vermischt. Der dabei entstehende
Flüssigkeitstropfen
(der das Makromolekül und
die verdünnte
Kristallisationslösung
enthält)
wird in einer Kammer mit einem viel größeren Behältervolumen der Kristallisationslösung versiegelt.
Der Tropfen wird vom Behälter
der Kristallisationslösung
getrennt gehalten, indem der Tropfen entweder von einem Glasabdeckstreifen
hängt,
oder indem der Tropfen über
dem Pegel der Lösung
im Behälter
auf ein Podest gesetzt wird. Mit der Zeit äquilibrieren der Kristallisationstropfen
und die Behälterlösungen über eine
Dampfdiffusion flüchtiger
chemischer Arten. Dabei werden übersättigende
Konzentrationen des Makromoleküls
erzielt, was zu einer Kristallisation der Makromolekülprobe im
Tropfen führt.
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Der Vorgang des Züchtens biologischer Makromolekülkristalle
bleibt jedoch ein höchst
empirischer Vorgang. Die makromolekulare Kristallisation hängt von
einer Reihe von experimentellen Parametern ab, zu denen unter anderem
gehören:
der pH-Wert, die Temperatur, die Konzentration der Salze im Kristallisationstropfen,
die Konzentration des zu kristallisierenden Makromoleküls, sowie
die Konzentration des Ausfällungsmittels
(von denen es hunderte gibt). Insbesondere ist auch weiterhin die
Wahl der Bedingung der gelösten
Stoffe, in denen Kristalle gezüchtet
werden, ein Gegenstand empirischer Bestimmung. Das Testen zahlreicher
Kombinationen von Variablen, welche das Kristallwachstum beeinflussen,
mittels der Durchführung
tausender von Kristallisationsversuchen führt möglicherweise zu den optimalen
Bedingungen für
das Kristallwachstum. Aus diesem Grunde ist die Fähigkeit,
auf rasche und einfache Weise viele Kristallisationsversuche erzeugen
zu können,
sehr wichtig bei der Bestimmung der idealen Bedingungen für die Kristallisation.
Es besteht daher ein Bedarf an einer Vorrichtung, die ein wirkungsvolles
Testen zahlreicher Kombinationen von Parametern ermöglicht,
welche das Kristallwachstum beeinflussen. US-A-5130105 offenbart
ein Kristallisationstablett, welches aus Einheiten besteht, in denen
eine Tropfenkammer in Gaskontakt mit einem Behälter steht.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Gemäß dem zuvor Gesagten schafft
die vorliegende Erfindung eine Kristallisationseinheit mit einem
zentralen Behälter,
der in Gaskommunikation mit einer Vielzahl an Tropfenkammern steht.
Die Kristallisationseinheit umfasst einen zentralen Behälter, der
mit mindestens einer Tropfenkammer über einen Diffusionskanal verbunden
ist. Bevorzugterweise ist der zentrale Behälter über vier Diffusionskanäle mit vier
Tropfenkammern verbunden, welche in einer Kreuzform rund um den
zentralen Behälter
herum angeordnet sind. Jede Tropfenkammer umfasst vorzugsweise eine
nach innen vorstehende Schulter, die in der Lage ist, einen abnehmbaren
Abdeckstreifen zu halten, an dem ein Lösungstropfen, der die zu kristallisierende
Substanz enthält,
hängen
kann. Die Kristallisationseinheit umfasst gegebenenfalls auch einen
abnehmbaren Abdeckstreifen, bei dem es sich vorzugsweise um einen
abnehmbaren Abdeckstreifen mit Laschen handelt, der über mindestens
einem Abschnitt des zentralen Behälters angeordnet werden kann.
Die Laschen halten den abnehmbaren Abdeckstreifen über dem
zentralen Behälter.
Der abnehmbare Abdeckstreifen, der über dem zentralen Behälter angeordnet
werden kann, weist gegebenenfalls mindestens eine Fadenkreuzplatte
auf. Gegebenenfalls enthält
der zentrale Behälter
eine Unterteilung, welche vorzugsweise vertikal innerhalb des zentralen
Behälters
angeordnet ist und den zentralen Behälter in mindestens zwei Abschnitte
unterteilt.
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Vorzugsweise sind zahlreiche Kristallisationseinheiten
in Form eines Kristallisationstabletts angeordnet.
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Eine erste bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung schafft eine Kristallisationsschale mit
einer rechteckigen Anordnung von Kristallisationseinheiten. Jede
Kristallisationseinheit umfasst einen zentralen Lösungsbehälter und
vier Tropfenkammern, die in Kreuzform rund um den zentralen Behälter herum
angeordnet sind. Jede Tropfenkammer ist durch einen Diffusionskanal
mit dem zentralen Behälter
verbunden. Der zentrale Behälter,
die Tropfenkammern und die Diffusionskanäle öffnen sich jeweils zur oberen
Fläche
der Kristallisationsschale hin. Jede Tropfenkammer weist auch eine Schulter
auf, die in der Lage ist, einen Abdeckstreifen zu halten, von dem
ein Lösungstropfen,
der die zu kristallisierende Substanz enthält, hängen kann. Ein Deckel kann
wahlweise über
die gesamte Kristallisationsschale gegeben werden.
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Im Betrieb wird eine Lösung in
den zentralen Behälter
gegeben, und ein Tropfen der Lösung,
die mindestens eine gelöste
Substanz, welche kristallisiert werden soll, enthält, wird
auf den Boden einer jeden Tropfenkammer gegeben. Alternativ dazu
kann ein Tropfen einer Lösung,
welche mindestens eine gelöste
Substanz, welche zu kristallisieren ist, enthält, auf einen Abdeckstreifen
gegeben werden, der umgedreht und in eine Tropfenkammer eingeführt und
dort von der Schulter gehalten wird, die sich rund um den inneren
Umfang der Tropfenkammer erstreckt. In dieser Konfiguration hängt der
Tropfen vom Abdeckstreifen in die Tropfenkammer hinein. Weiters
kann ein Tropfen der Lösung,
die mindestens eine gelöste
Substanz, die zu kristallisieren ist, enthält, auf einen Abdeckstreifen
gegeben werden, der in eine Tropfenkammer eingeführt wird, ohne dass der Abdeckstreifen
umgedreht wird, um eine sitzende Tropfenkristallisation zu erzielen.
Nachdem ein Tropf in einige oder alle Tropfenkammern gegeben wurde, kann
der obere Abschnitt der Kristallisationseinheit, der sich zur oberen
Fläche
der Schale hin öffnet,
verschlossen werden, und zwar vorzugsweise mit einem durchsichtigen
Klebeband. Ein Deckel kann gegebenenfalls über die gesamte Kristallisationsschale
gegeben werden. Mit der Zeit äquilibrieren
der Lösungstropfen
in der Tropfenkammer und die Lösung
im zentralen Behälter
durch Dampfdiffusion der flüchtigen
chemischen Arten durch den Diffusionskanal. Zur Kristallisation
kommt es, wenn eine übersättigte Lösung der
zu kristallisierenden Substanz erzielt wird. Somit können in
jeder Kristallisationseinheit mit vier Tropfenkammern bis zu vier
unterschiedliche Kristallisationsparameter gleichzeitig getestet
werden, wobei sichergestellt ist, dass sich jeder der vier Kristallisationstropfen
in exakt der selben Dampfdiffusionsumgebung befindet. Weiters kann
die Dampfdiffusion in einer beliebigen der vier Tropfenkammern durch
Ablage eines Dampf undurchlässigen
Materials, wie zum Beispiel Rohvaseline, in jenem Diffusionskanal
beendet werden, welcher den Behälter
mit der Tropfenkammer verbindet, ohne dass der Fortschritt der Dampfdiffusion
bei den anderen Tropfenkammern dadurch beeinträchtigt wird.
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Zusätzlich dazu kann ein Abdeckstreifen
mit vorzugsweise mindestens einer Lasche über jede Kristallisationseinheit
gegeben werden. Ein Lösungstropfen,
der mindestens eine zu kristallisierende gelöste Substanz enthält, wird
auf den Abdeckstreifen gegeben, welcher danach über dem zentralen Behälter angeordnet
wird, so dass der Lösungstropfen
vom Abdeckstreifen herab in den zentralen Behälter hängt. Die Laschen werden in
die Diffusionskanäle gesetzt
und halten den Abdeckstreifen über
der Kristallisationseinheit. Der Abdeckstreifen kann gegebenenfalls
mindestens eine Fadenkreuzplatte umfassen.
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Eine zweite bevorzugte Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung ist mit der ersten bevorzugten Ausführungsform
identisch, jedoch bis auf die Tatsache, dass der zentrale Behälter von
mindestens einer Unterteilung, welche sich vertikal vom Boden des
Behälters
erstreckt, in vier gleiche Abschnitte unterteilt wird. Jeder der
vier Behälterabschnitte
ist durch einen Diffusionskanal mit einer Tropfenkammer verbunden.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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Die zuvor erwähnten Aspekte sowie zahlreiche
damit verbundene Vorteile dieser Erfindung werden noch leichter
erkennbar, da diese durch die folgende detaillierte Beschreibung
unter Bezugnahme auf die angeschlossenen Zeichnungen besser verständlich wird,
in denen:
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1 eine
dreidimensionale Ansicht der ersten bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist, in der zahlreiche Kristallisationseinheiten
in Form eines rechteckigen Kristallisationstabletts angeordnet sind.
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2 eine
Ansicht der oberen Fläche
der ersten bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist, in der zahlreiche Kristallisationseinheiten
in Form eines rechteckigen Kristallisationstabletts angeordnet sind.
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3 eine
Querschnittsansicht einer Kristallisationseinheit der ersten bevorzugten
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist.
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4 eine
Ansicht eines Abdeckstreifens mit Laschen ist, der zusammen mit
der ersten bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
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5 eine
Ansicht der oberen Fläche
einer Kristallisationseinheit der ersten bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist, welche einen darauf befindlichen
Abdeckstreifen mit Laschen zeigt.
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6 eine
dreidimensionale Ansicht einer Kristallisationseinheit der zweiten
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist, welche die Unterteilungen zeigt,
die sich vertikal im zentralen Behälter erstrecken.
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7 eine
dreidimensionale Ansicht der zweiten bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist, in der die Kristallisationseinheiten in
Form einer rechteckigen Kristallisationstabletts angeordnet sind.
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Detaillierte Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsform
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Die vorliegende Erfindung sieht eine
Kristallisationseinheit mit einem zentralen Behälter vor, der in Gaskommunikation
mit zahlreichen Tropfenkammern steht. Jede Tropfenkammer weist eine
Schulter auf, die sich rund um den Umfang der Innenfläche der
Tropfenkammer erstreckt und die in der Lage ist, einen Abdeckstreifen
zu tragen. Jede Tropfenkammer ist direkt oder indirekt durch einen
Diffusionskanal mit dem zentralen Behälter verbunden. Der zentrale
Behälter
einer Kristallisationseinheit kann durch eine oder mehrere vertikale
Unterteilungen in eine Vielzahl von Abschnitten unterteilt sein.
Jeder Abschnitt ist direkt oder indirekt durch einen Diffusionskanal
mit einer Tropfenkammer verbunden. Vorzugsweise sind zahlreiche
Kristallisationseinheiten gemeinsam in Form einer Kristallisationstabletts
angeordnet. Der zentrale Behälter,
die Tropfenkammer(n) und der/die Diffusionskanal/-kanäle einer
jeden Kristallisationseinheit öffnen
sich jeweils zur oberen Fläche
des Kristallisationstabletts hin. Ein Abdeckstreifen mit Laschen
kann über
eine Kristallisationseinheit gegeben werden, wobei die Zungen in
den Diffusionskanälen
sitzen.
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Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden,
um jede beliebige kristallisierbare Substanz zu kristallisieren,
aber die vorliegende Erfindung ist besonders hilfreich beim Kristallisieren
biologischer Makromoleküle,
wie zum Beispiel Proteinen und Nucleinsäuren. Insbesondere ist die
vorliegende Erfindung im Bereich der strukturbasierten Schaffung
von Arzneimitteln von Nutzen. Der große Nutzen der Röntgenkristallographie
bei der strukturbasierten Schaffung von Arzneimitteln besteht in
der Erforschung der Bindearten neuartiger, pharmakologisch aktiver
Verbindungen, das heißt
in der Erforschung der Struktur des Komplexes, der gebildet wird,
wenn ein Arzneimittel an den Rezeptor bindet, durch welchen das
Arzneimittel seine biologische(n) Wirkungen) entfaltet. Diese dreidimensionale
Strukturinformation wird verwendet, um die Strukturplanung neuartiger Arzneimittel
zu optimieren, welche auf wirkungsvollere und/oder selektivere Weise
an einen Zielrezeptor binden, und um die nächste Generation davon abgeleiteter
Verbindungen zu erzeugen. Die Kristallisierbarkeit eines Zielrezeptors
reagiert empfindlich auf die Bindung von Liganden. Unterschiedliche
Ligandenkomplexe eines bestimmten Zielrezeptors können unter
unterschiedlichen Bedingungen kristallisieren, oder Rezeptor-Liganden-Komplexe können unter
denselben Bedingungen, aber mit unterschiedlichen Kristallformen,
kristallisieren. Es ist daher wichtig, auf rasche und wirkungsvolle
Weise zahlreiche Kombinationen von Faktoren testen zu können, welche
die Kristallisation eines Rezeptors und seines/seiner Liganden beeinträchtigen
können.
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Unter Bezugnahme auf 1 bis 5 handelt es
sich bei der ersten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung um ein Kristallisationstablett 10, welches einen
Körper 12 mit
einer oberen Fläche 14,
einer unteren Fläche 16,
einem ersten Ende 18, einem zweiten Ende 20, einer
ersten Seite 22 und einer zweiten Seite 24 umfasst. Der Körper 12 definiert
eine Vielzahl an Kristallisationseinheiten 26. Jede Kristallisationseinheit 26 enthält einen
zentralen Behälter 28,
vier Diffusionskanäle 30 und
vier Tropfenkammern 32. Jede Tropfenkammer 32 ist über einen
Diffusionskanal 30 mit dem zentralen Behälter 28 verbunden.
Wie deutlicher in 3 dargestellt,
umfasst der zentrale Behälter 28 eine
untere Fläche 34, einen
oberen Abschnitt 36 und einen unteren Abschnitt 38,
und besitzt eine im allgemeinen zylindrische Form. Der obere Abschnitt 36 des
zentralen Behälters 28 öffnet sich
zur oberen Fläche 14 des
Körpers 12 hin.
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Wie ebenfalls in 3 deutlicher dargestellt, besitzt die
Tropfenkammer 32 eine im allgemeinen becherförmige Form,
wenn man sie im Querschnitt betrachtet, und sie umfasst eine flache
untere Fläche 40 und
einen oberen Abschnitt 42. Der obere Abschnitt 42 der
Tropfenkammer 32 öffnet
sich zur oberen Fläche 14 des
Körpers 12 hin.
Der innere Umfang der Tropfenkammer 32 begrenzt eine Schulter 44,
die in der Lage ist, einen Abdeckstreifen 46 zu halten. Der
Abdeckstreifen 46 ist vorzugsweise rund und kann aus einem
optisch transparenten, steifen Material, wie zum Beispiel Glas oder
geklärtem
Polypropylen, hergestellt sein. Der Abdeckstreifen 46 besitzt vorzugsweise
eine Dicke von etwa 1 mm bis etwa 2 mm. Ein Diffusionskanal 30 erstreckt
sich vom oberen Abschnitt 36 des zentralen Behälters 28 zum oberen
Abschnitt 42 einer jeden Tropfenkammer 32. Die
Diffusionskanäle 30 besitzen
im allgemeinen eine trapezförmige
Form, wenn man sie im Querschnitt betrachtet, und sie öffnen sich
zur oberen Fläche 14 des
Körpers 12 hin.
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Im Betrieb wird eine flüssige Lösung in
den zentralen Behälter 28 gegeben,
und ein Tropfen einer Lösung,
welche die zu kristallisierende Substanz enthält, wird auf eine untere Fläche 40 der
Tropfenkammer 32 gegeben. Alternativ dazu kann eine Kristallisation
eines hängenden
Tropfens erzielt werden, indem ein Tropfen einer Lösung, welche
die zu kristallisierende Substanz enthält, auf den Abdeckstreifen 46 gegeben
wird, der in die Tropfenkammer 32 eingeführt wird,
wo er von der Schulter 44 gehalten wird. Der Lösungstropfen,
der die zu kristallisierende Substanz enthält, wird auf diese Weise vom
Abdeckstreifen 46 schwebend gehalten und hängt in die
Tropfenkammer 32 hinein. Nachdem ein Tropfen der Lösung, welcher
die zu kristallisierende Substanz enthält, in eine oder mehrere Tropfenkammern 32 gegeben wurde,
können
die Tropfenkammern 32 durch Auftragen eines Dichtmittels,
bei dem es sich vorzugsweise um ein transparentes Klebeband handelt,
quer über den
oberen Abschnitt 42 der Tropfenkammer 32, der sich
zur oberen Fläche 14 des
Körpers 12 hin öffnet, verschlossen
werden. Vorzugsweise werden alle Tropfenkammern 32 innerhalb
der Kristallisationseinheit 26 gemeinsam mit einem einzigen
Stück des transparenten
Klebebandes verschlossen, welches auf die obere Fläche 14 des
Körpers 12 aufgebracht wird,
so dass dadurch die Kristallisationseinheit 26 verschlossen
wird. Wenn, wie in 1 und 2 dargestellt, zahlreiche
Kristallisationseinheiten 26 in Form eines Kristallisationstabletts 10 angeordnet
sind, kann jede Kristallisationseinheit 26 unabhängig von den
anderen Kristallisationseinheiten 26 verschlossen werden,
oder es können
alle Kristallisationseinheiten 26 gemeinsam verschlossen
werden. Gegebenenfalls kann ein Deckel 48 auf die obere
Fläche 14 des
Körpers 12 gegeben
werden.
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Nachdem die Kristallisationseinheit 26 verschlossen
wurde, äquilibrieren
der Lösungsmitteltropfen,
der die zu kristallisierende Substanz enthält, und die Lösung, die
sich innerhalb des zentralen Behälters 28 befindet,
durch Dampfdiffusion der flüchtigen
chemischen Arten, die sich zwischen der Tropfenkammer 32 und
dem zentralen Behälter 28 durch
den Diffusionskanal 30 bewegen. Jeder der Tropfen in den
vier Tropfenkammern 32 einer Kristallisationseinheit 26 wird
in exakt der selben Dampfdiffusionsumgebung gehalten, sofern die
flüchtige
Lösung
frei durch die Diffusionskanäle 30 in
jede einzelne Tropfenkammer 32 diffundieren kann. Zur Kristallisation
kommt es, wenn eine übersättigte Lösung der zu
kristallisierenden Substanz gebildet wird.
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Da jede Tropfenkammer 32 innerhalb
der Kristallisationseinheit 26 durch ihren eigenen Diffusionskanal 30 mit
dem zentralen Behälter 28 verbunden
ist, kann die Dampfdiffusion zwischen dem zentralen Behälter 28 und
einer beliebigen der vier Tropfenkammern 32 innerhalb der
Kristallisationseinheit 26 durch Ablage einer dampfundurchlässigen Substanz
im Diffusionskanal 30 beendet werden, ohne dass dadurch
der Fortschritt der Dampfdiffusion in den anderen Tropfenkammern 32 gestört wird.
Weiters können
Kristalle innerhalb einer Tropfenkammer 32 entfernt oder
manipuliert werden, ohne dadurch Kristalle in den benachbarten Tropfenkammern 32 zu stören.
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Wie in 4 und 5 gezeigt, kann gegebenenfalls
ein Abdeckstreifen 50 mit Laschen, der mindestens eine
Lasche 52 besitzt, auf eine Kristallisationseinheit 26 der
Kristallisationsschale 10 der ersten bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung gegeben werden. Die derzeit bevorzugte Ausführungsform
des Abdeckstreifens 50 mit Laschen besitzt eine im allgemeinen
rechteckige Form sowie vier Laschen 52, wobei je eine Lasche 52 an jeder
Ecke des Abdeckstreifens 50 sitzt. Ein Lösungstropfen,
der mindestens eine zu kristallisierende gelöste Substanz enthält, wird
auf den Abdeckstreifen 50 mit Laschen gegeben, welcher
danach über
dem zentralen Behälter 28 der
Kristallisationseinheit 26 angeordnet wird, so dass der
Lösungstropfen
vom Abdeckstreifen 50 mit Laschen schwebend gehalten wird
und in den zentralen Behälter 28 hängt. Wie
deutlicher in 5 dargestellt,
werden die Laschen 52 in die Diffusionskanäle 30 gesetzt
und halten den Abdeckstreifen 50 mit Laschen über der
Kristallisationseinheit 26. Auf diese Weise werden Kristalle
dadurch gebildet, indem der Lösungstropfen
der zu kristallisierenden Substanz innerhalb des zentralen Behälters 28,
der die Lösung
enthält,
schwebend gehalten wird. Der Abdeckstreifen 50 mit Laschen kann
gegebenenfalls mindestens eine Fadenkreuzplatte 54 zur
Messung der Kristallgröße und/oder
zur Markierung von Abschnitten des Abdeckstreifens 50 mit
Laschen umfassen, in welche jeweils ein Lösungstropfen mit einer zu kristallisierenden
Substanz gegeben werden kann. Die bevorzugte Fadenkreuzplatte 54 enthält mindestens
eine unterteilte Linie 56, vorzugsweise aber ein Paar einander
schneidender, unterteilter Linien 56. Wenngleich die derzeit
bevorzugte Ausführungsform
des Abdeckstreifens 50 mit Laschen eine im allgemeine quadratische
Form aufweist und vier Laschen 52 aufweist, versteht es
sich von selbst, dass der Abdeckstreifen 50 mit Laschen auch
jede beliebige andere Form, wie zum Beispiel eine kreisförmige oder
dreieckförmige
Form, aufweisen kann. In der Tat könnte auch ein im allgemeinen quadratischer
Abdeckstreifen anstelle des Abdeckstreifens 50 mit Laschen
verwendet werden, wobei die Ecken des Quadrats in den vier Diffusionskanälen 30 ruhen.
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Das Kristallisationstablett 10 der
ersten bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, welche eine rechteckige Anordnung von
vierundzwanzig Kristallisationseinheiten 26 aufweist, erlaubt
es somit dem Benutzer, gleichzeitig bis zu sechsundneunzig unterschiedliche
Kombinationen von Faktoren zu testen, welche die Kristallisation
beeinflussen. Zusätzlich
kann die Anzahl der Faktoren, die gleichzeitig getestet werden können, verdoppelt werden,
indem ein Kristallisationstropfen in jeden Quadranten eines Abdeckstreifens 50 mit
Laschen gegeben wird, das heißt,
vier Tropfen pro Abdeckstreifen 50 mit Laschen, der über den
zentralen Behälter 28 gegeben
wird. Um derartig groß angelegte Reihenuntersuchungen
noch weiter zu erleichtern, können
Identifizierungshinweise, wie zum Beispiel Zahlen, in die untere
Fläche 40 der
Tropfenkammer 32 und/oder die untere Fläche 34 des zentralen
Behälters 28 eingeätzt oder
auf sonstige Weise angebracht werden, um die Zusammensetzung der
darin enthaltenen Lösungen)
leicht identifizieren zu können.
Zusätzlich
dazu können
die Abmessungen der Identifizierungshinweise, wie zum Beispiel die
Tiefe der eingeätzten
Hinweise, als Referenz verwendet werden, mit deren Hilfe die Größe der sich
entwickelnden Kristalle geschätzt
werden kann.
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Es ist erkennbar, dass, wenngleich
die derzeit bevorzugte Form der Kristallisationseinheit 26 vier
Tropfenkammern 32 besitzt, die rund um einen zentralen
Behälter 28 angeordnet
sind, die Anzahl der Tropfenkammern 32 verändert werden
kann, ebenso wie auch deren geometrische Anordnung rund um den zentralen
Behälter 28.
Somit kann zum Beispiel die Kristallisationseinheit 26 eine
im allgemeinen dreieckförmige
Konfiguration mit einem zentralen Behälter 28 besitzen,
der sich in der Mitte des Dreiecks befindet, und einer Tropfenkammer 32,
die sich auf jedem der drei Scheitel des Dreiecks befindet. Zusätzlich dazu
können
zum Beispiel Tropfenkammern 32 in Serie angeordnet werden.
Somit kann eine erste Tropfenkammer 32 durch einen Diffusionskanal 30 mit
dem zentralen Behälter
verbunden sein, eine zweite Tropfenkammer 32 kann durch
einen Diffusionskanal 30 mit einer ersten Tropfenkammer 32 verbunden
sein, und so weiter, um auf diese Weise eine Serie von verbundenen
Tropfenkammern 32 zu bilden, wobei nur eine einzige Tropfenkammer 32 direkt
mit dem zentralen Behälter 28 verbunden
ist. Die Anzahl der Tropfenkammern 32 in der verbundenen Serie
wäre durch
die Abmessungen des Kristallisationstabletts 10 begrenzt.
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Eine zweite Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist in 6 und 7 dargestellt. Die Teilenummern,
welche sich auf die entsprechenden Teile des Kristallisationstabletts 10 der
ersten bevorzugten Ausführungsform
beziehen, sind mit einem einfachen Anführungsstrich (') gekennzeichnet.
Die zweite bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein Kristallisationstablett 10', das mit dem Kristallisationstablett 10 der
ersten bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung identisch ist, jedoch mit Ausnahme der
Tatsache, dass der zentrale Behälter 28' durch Unterteilungen 60,
die sich vertikal von der unteren Fläche 34' des zentralen Behälters 28' zur oberen
Fläche 14' des Körpers 12' erstrecken,
in vier gleiche Abschnitte 58 unterteilt wird. Jeder Behälterabschnitt 58 ist
durch einen Diffusionskanal 30' mit einer Tropfenkammer 32' verbunden. Der
Abdeckstreifen 50 mit Laschen kann nicht mit dem Kristallisationstablett 10' der zweiten
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
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Zu den Faktoren, welche die Kristallisation beeinflussen,
gehören
unter anderem: die anfängliche
Konzentration der zu kristallisierenden Substanz; die chemische
Struktur der zu kristallisierenden Substanz; die elektrische Ladung
der zu kristallisierenden Substanz und die Verteilung dieser Ladung
innerhalb der zu kristallisierenden Substanz; die Lösung, welche
zum Lösen
der zu kristallisierenden Substanz verwendet wird; die Identität des Ausfällungsmittels,
das mit der zu kristallisierenden Substanz gelöst wird; die Konzentration
des Ausfällungsmittels,
das mit der zu kristallisierenden Substanz gelöst wird; der pH-Wert der Lösung, welche
die zu kristallisierende Substanz enthält; die Frage, ob schwebende
Tropfen oder sitzende Tropfen kristallisiert werden; die Identität und Konzentration
des Salzes, das mit der zu kristallisierenden Substanz gelöst wird;
die Struktur und Konzentration eines niedrigmolekularen Liganden;
die Verwendung homogener oder heterogener Impfkristalle; die Art
des verwendeten Antioxidationsmittels (falls ein solches überhaupt verwendet
wird); Inertgasreinigung und Überlagerung
aus wasserdurchlässigem Öl.
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Somit können beispielsweise, wenn es
sich bei der zu kristallisierenden Substanz um ein Protein handelt,
das an einen Oligopeptidliganden bindet, identische Lösungen,
welche das Protein enthalten, und der Oligopeptidligand in jede
Tropfenkammer 32 des Kristallisationstabletts 10 der
ersten bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung gegeben werden, außer dass die Aminosäuresequenz des
Oligopeptidliganden in jeder Tropfenkammer 32 anders ist.
Auf diese Weise kann die Auswirkung der Aminosäuresequenz des Oligopeptidliganden
auf die Kristallisation des Proteinligandenkomplexes beurteilt werden.
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Zusätzlich dazu kann beispielsweise
jede Tropfenkammer 32' einer
jeden Kristallisationseinheit 26' des Kristallisationstabletts 10' der zweiten
bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung einen Tropfen der Lösung der zu kristallisierenden Substanz
enthalten, der identisch ist mit dem Tropfen der Lösung in
jeder anderen Tropfenkammer 32', außer dass keiner der Tropfen
den gleichen pH-Wert besitzt. Der pH-Wert des Behälters der
Lösung
in jedem Abschnitt 58 des zentralen Behälters wäre der selbe wie der pH-Wert
des Tropfens der Lösung
der zu kristallisierenden Substanz in der Tropfenkammer 32', mit der jeder
einzelne Abschnitt 58 des zentralen Behälters verbunden ist. Auf diese
Weise können
die Auswirkungen des pH-Wertes auf die Kristallisation der zu erforschenden
Substanz beurteilt werden.
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Anstatt vier unterschiedliche Proben
einer zu kristallisierenden Substanz in jeder Tropfenkammer 32 einer
Kristallisationseinheit 26 abzulegen, kann weiters jedes
dampfdiffundierende Reaktionsmittel, wie zum Beispiel Dithiothreitol
oder β-Mercaptoethanol,
in einer oder mehreren Tropfenkammern 32 abgelegt werden,
um den Kristallisationsprozess in anderen Tropfenkammern 32 innerhalb
der selben Kristallisationseinheit 26 weiter zu steuern
und zu modulieren.
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Die Kristallisationstabletts 10 und 10' können aus
jedem geeigneten Material hergestellt werden, vorzugsweise jedoch
aus einem durchsichtigen Kunststoffmaterial, so dass das Kristallwachstum
unter einem Mikroskop betrachtet werden kann. Weiters sollte es
sich bei dem Material, aus dem die Kristallisationstabletts 10 und 10' hergestellt
werden, vorzugsweise um ein niedrigbenetzbares Material mit einem
relativ hohen Kontaktwinkel in Bezug auf Wasser handeln, so dass
die Lösung
der zu kristallisierenden Substanz dazu neigt, separate Tropfen
zu bilden, wenn sie in Kontakt mit den Kristallisationstabletts 10 und 10' gebracht wird.
Bevorzugterweise werden die Kristallisationstabletts 10 und 10' aus einem durchsichtigen
Polypropylenpolymer mit der Bezeichnung OpticulTM hergestellt,
das in O'Leary,
R.K. (1997) Becton Dickinson Technical Bulletin 411, 1–3, beschrieben
ist.
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Wenngleich die bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung illustriert und beschrieben wurde, versteht es sich
doch von selbst, dass verschiedene Änderungen daran gemacht werden
können,
ohne dadurch vom Umfang der Erfindung abzuweichen.