DE69908376T2

DE69908376T2 - Verfahren zur herstellung normaler glykopeptide

Info

Publication number: DE69908376T2
Application number: DE69908376T
Authority: DE
Inventors: Shin-Ichiro Nishimura
Original assignee: NISHIMURA SHIN ICHIRO; Nishimura Shin-Ichiro Sapporo; Hokkaido Electric Power Co Inc
Current assignee: Nishimura Shin-Ichiro Sapporo Hokkaido Jp; Hokkaido Electric Power Co Inc
Priority date: 1998-08-10
Filing date: 1999-08-06
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2019-08-07
Also published as: EP1106626B1; WO2000009546A1; DE69908376D1; US6602982B1; EP1106626A1; EP1106626A4

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung bezieht sich sowohl auf ein Verfahren zum leichten Herstellen von Glykopeptiden, die zu wissenschaftlichen Untersuchungen, Arzneimitteln und Nahrungsmitteln brauchbar sind, als auch auf ein Verfahren zur Herstellung von Polymeren davon. Genauer bezieht sie sich auf ein neues Verfahren zum Herstellen stereoselektiver Glukopeptid-Monomerer und ihrer Polykondensationsprodukte: sequentielle Glykopeptide.
STAND DER TECHNIK
Kürzlich wurde über viele neue Befunde bezüglich der Rolle der Glykosylierung innerhalb des Biokörpers berichtet und die Forschungstechnologie bei der Glykosylierungsbiologie, Glykosylierungstechnik und dergleichen wird auf dem Arzneimittel- und Nahrungsmittelgebiet breit angewendet. Es ist insbesondere gefunden worden, daß komplexe Glykoside, insbesondere Glykoproteine, Glykopeptide, bei denen Glykosylierungsketten an Proteine binden, eng an der Zellerkennung, -differenzierung, -befruchtung, -seneszenz, -krebsentstehung oder dergleichen innerhalb des Biokörpers beteiligt sind. Unter diesen Umständen haben viele Forscher versucht, eine Glykosylierungskette mit natürlicher Struktur oder neue Glykosylierungsprodukte zu synthetisieren. Die Glykosylierung weist jedoch viele Verzweigungspunkte auf und weist auch verschiedene Bindungsformen der Monosaccharide in jeder Einheit davon auf. Demgemäß ist es sehr schwierig, Glykosylierungen oder Glykopeptide zu erhalten, die eine hochkontrollierte Struktur aufweisen.
Bei dem herkömmlichen Verfahren zum Herstellen von Glykopeptiden durch Verwenden eines fluorierten Glykosids mit einer Schutzgruppe vom Acyltyp als Glykosiddonor und sein Kuppeln mit einem Peptid (Tsuda et al., Chem. Comm. 2779 (1996)) besteht die Möglichkeit des Auftretens einer Glykosylierungsspaltung oder Racemisierung der Peptide.
Die WO97/15585 offenbart ein neues Fructosederivat, das das Binden von Selectin an Sialyl-Le^x hemmt, und lehrt, daß ein bestimmtes Glykopeptid, das eine langkettige Alkylgruppe aufweist, eine starke Hemmwirkung auf das Binden von Selectin an Sialyl-Le^x zeigt.
Die bekannten Verfahren zur Synthese von Glykopeptiden werden alle durch sequentielles Verlängern der Ketten von Aminosäuren, zum Beispiel einem Verfahren zum Verlängern von Peptidketten unter Verwenden einer Festphase (Nakahara et al., Carbohydr. Res., 292, 71–81 (1996)) oder einem Verfahren zum Verlängern der Peptidkette in einer flüssigen Phase (Kuntz et al., Ang. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 618–621 (1997)), durchgeführt. Das Verfahren der sequentiellen Kettenverlängerung ist darin von Nachteil, daß das Verfahren zum Schützen und Entschützen in mehreren Stufen wiederholt werden muß. Es weist weiterhin darin einen Mangel auf, daß die Mehrstufenreaktion auch mehrere Reinigungsprozeduren erfordert und ferner zu einem viel größeren Materialverlust führt.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens zum Herstellen von Glykopeptiden durch ein sehr einfaches Verfahren. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens zum Herstellen sequentieller Glykopeptide durch Polykondensieren eines Glykopeptidmonomers.
Die Erfinder haben gefunden, daß die gewünschten Glykopeptide leicht durch Verwenden eines fluorierten Glykosids eines Monosaccharids oder eines Oligosaccharids, bei dem die Hydroxygruppen durch eine Schutzgruppe des Ethertyps geschützt sind, und Kuppeln des fluorierten Glykosids mit einer Aminosäure oder einem Peptidderivat und danach zugleich Entschützen der Glykopeptide durch Hydrierung hergestellt werden können und weiter, daß sequentielle Glykopeptide leicht durch Unterziehen der auf diese Weise erhaltenen Glykopeptide einer Polykondensation in Gegenwart eines Peptidkondensationsmittels erhalten werden können und vollendeten damit die vorliegende Erfindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Kurve, die die Gefrierpunktserniedrigungsaktivität von natürlichem AFGP und des Polymers der vorliegenden Erfindung darstellt.
BESTE AUSFÜHRUNGSWEISE DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen eines Glykopeptids der Formel (III) bereit:
worin R^1' -OH oder eine geschützte Aminogruppe ist; R^2' und R^3' -OR^7' sind (R^7' ist eine Hydroxygruppe oder ein Saccharidrest); R^4' -CH₂OR^8' (R^8' ist ein Wasserstoffatom oder ein Saccharidrest) oder -CH₃ ist; R^5' ein Wasserstoffatom ist und R⁷, R⁸ und R⁹ wie nachstehend definiert sind,
das das Kuppeln eines fluorierten Glykosids eines Monosaccharids oder eines Oligosaccharids der Formel (I):
worin R¹ -OR⁶ (R⁶ ist ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxyschutzgruppe) oder eine Aminogruppenvorstufe ist; R² und R³ -OR⁷ sind (R⁷ ist ein Wasserstoffatom, eine Hydroxyschutzgruppe oder ein Saccharidrest), R⁴ -CH₂OR⁸ (R⁸ ist ein Wasserstoffatom, eine Hydroxyschutzgruppe oder ein Saccharidrest) oder -CH₃ ist und R⁵ ein Wasserstoffatom ist,
mit einer Aminosäure oder einem Peptid unter Ergeben einer Verbindung der Formel (II):
worin R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ wie vorstehend definiert sind und R⁷ und R⁸ eine Einfachbindung, ein Aminosäurerest oder ein eine Vielzahl Aminosäuren umfassender Peptidrest sind, R⁹ ein Wasserstoffatom oder eine Niederalkylgruppe ist, R¹⁰ eine Aminoschutzgruppe ist und R¹¹ eine Carboxyschutzgruppe ist,
gegebenenfalls vom Umwandeln der Aminogruppenvorstufe in eine geschützte Aminogruppe und anschließend das Entschützen durch Hydrierung umfaßt.
Wenn das als Ausgangsmaterial in den vorstehenden Verfahren verwendete fluorierte Glykosid eines Monosaccharids oder eines Oligosaccharids der Formel (I) eine Acylgruppe als Schutzgruppe für eine Hydroxygruppe enthält, besteht die Möglichkeit des Auftretens einer Entglykosylierung oder einer Aminosäureracemisierung während des Entschützungsschritts nach der Kupplung mit einer Aminosäure oder einem Peptid. Demgemäß ist es wichtig, die Hydroxygruppe durch eine Schutzgruppe des Ethertyps wie etwa eine Benzylgruppe, eine p-Methoxybenzylgruppe oder eine Tritylgruppe zu schützen.
Andererseits werden diese fluorierten Glykoside (I) eines Monosaccharids oder Disaccharids durch eine Glykosidierungsreaktion zwischen einem Monosaccharid und einem Monosaccharid oder zwischen einem Monosaccharid und einem Oligisaccharid (mit einer aus 1 bis 10 Saccharidresten bestehenden Glykosylierungskette), gefolgt von deren Fluorierung hergestellt. Um die Glykosidierungsreaktion stereospezifisch ablaufen zu lassen, werden die Hydroxygruppen in dem Saccharidrest üblicherweise durch eine Schutzgruppe des Acyltyps wie etwa eine Acetylgruppe, eine Benzoylgruppe usw. geschützt. Wie vorstehend angeführt ist es jedoch nicht bevorzugt, eine derartige, eine Schutzgruppe des Acyltyps enthaltende Verbindung einer Kupplung direkt mit einer Aminosäure oder einem Peptid zu unterziehen und es ist demzufolge notwendig, die Schutzgruppe des Acyltyps gegen eine Schutzgruppe des Ethertyps auszutauschen.
Der Austausch einer Schutzgruppe kann durch ein herkömmliches Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel wird ein Monosaccharid oder ein Oligosaccharid mit einer Schutzgruppe des Acyltyps mit Alkali wie etwa einem Alkalimetallalkoxid (z. B. Natriummethoxid) zum Entfernen der Schutzgruppe des Acyltyps und danach Verethern der Hydroxygruppen in dem sich daraus ergebenden Produkt durch ein aromatisches Halogenid wie etwa Benzylchlorid, Benzylbromid, p-Methoxybenzylchlorid oder p-Methoxybenzylbromid in Gegenwart eines Alkalimetallhydrids (z. B. Natriumhydrid, Kaliumhydrid) behandelt.
Die fluorierten Ausgangsglykoside werden leicht durch ein bekanntes Verfahren (s. D. Picq und D. Anker, Carbohydrate Research, Bd. 166, 5. 309, 1987) hergestellt. Zum Beispiel wird ein Monosaccharid oder Oligosaccharid mit geschützten funktionellen Gruppen wie etwa Hydroxygruppen mit Triethylamin – 3 Fluorwasserstoff in Gegenwart einer Base (z. B. Trimethylamin, Triethylamin, Triethanolamin, Pyridin) in einem inerten Lösungsmittel (z. B. Acetonitril) bei Raumtemperatur, vorzugsweise bei 40–50°C umgesetzt, wodurch die gewünschte Fluoridverbindung leicht erhalten wird. Die Verbindung kann zur Kupplung mit einer Aminosäure oder einem Peptid verwendet werden, nachdem sie gegebenenfalls einem vorstehend angeführten Schutzgruppenaustausch unterzogen wurde.
Die Kupplungsreaktion des fluorierten Glykosids eines Monosaccharids oder Oligosaccharids der Formel (I) mit einer Aminosäure oder einem Peptid kann durch ein Verfahren von Suzuki et al. (Tetrahedron Lett., 30, 4853 (1989)) durchgeführt werden. Das heißt, das fluorierte Glykosid eines Monosaccharids oder eines Oligosaccharids wird mit einer Aminosäure oder einem Peptid unter Rühren in Gegenwart eines Metallocenchlorids und Silberoxid in einem organischen Lösungsmittel (z. B. Methylenchlorid) unter einer Stickstoffgasatmosphäre umgesetzt.
Die Aminoschutzgruppe für R¹⁰ in der Formel (II) schließt alle Aminoschutzgruppen ein, die üblicherweise bei der Peptidsynthese verwendet werden, vorzugsweise sogenannte Z-Gruppenderivate wie etwa Benzyloxycarbonyl, p-Chlorben zyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl. Die Carboxyschutzgruppe für R¹¹ schließt alle Carboxyschutzgruppen, die üblicherweise bei der Peptidsynthese verwendet werden, vorzugsweise Benzylderivate wie etwa Benzyl, p-Chlorbenzyl und p-Methoxybenzyl ein. Insbesondere wenn ein Z-Gruppenderivat für R¹⁰ und ein Benzylderivat für R¹¹ verwendet werden, können beide Aminoschutzgruppen und die Carboxyschutzgruppe gleichzeitig durch Halogenierung wie hierin nachstehend erläutert entfernt werden, was von Vorteil ist.
Die in der vorstehenden Kupplungsreaktion erhaltene Verbindung der Formel (III), worin R¹ eine Aminogruppenvorstufe ist (z. B. eine Azidgruppe), kann durch ein herkömmliches Verfahren in die entsprechende Verbindung umgewandelt werden, bei der R¹ eine Aminogruppe ist. Zum Beispiel wird eine Verbindung (II), worin R¹ eine Azidgruppe ist, mit Thioessigsäure in Gegenwart einer Base (z. B. Pyridin) bei Raumtemperatur oder unter Erhitzen unter Ergeben der entsprechenden Verbindung behandelt, bei der R¹ eine Acetylaminogruppe ist. Das Produkt wird anschließend durch ein herkömmliches Verfahren zum Entfernen der Schutzgruppe des Ethertyps an den Hydroxygruppen unter Ergeben eines Glykopeptids der Formel (III) hydriert. Die bei der vorstehenden Umwandlung erhaltene Verbindung wird in Gegenwart eines Reduktionskatalysators wie etwa Palladiumkohlen in einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. Dimethylformamid, Methanol, Ethanol, Wasser, eine wäßrige Essigsäurelösung) unter Ergeben des gewünschten Glykopeptids (III) hydriert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das vorstehend erhaltene Glykopeptid der Formel (III) anschließend einer Polykondensationsreaktion unter Ergeben eines sequentiellen Glykopeptids der Formel (IV) unterzogen:
worin R^1', R^2', R^3', R^4', R^5', R⁷, R⁸ und R⁹ wie vorstehend definiert sind und n eine ganze Zahl von 2 bis 20 ist.
Die Polykondensationsreaktion eines Glykopeptids wird zum Beispiel durch ein Verfahren unter Verwenden einer organischen Phosphorverbindung wie etwa Diphenylphosphorylazid (DPPA), Diethylphosphorylcyanidat, Azidotris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorphosphat oder ein Verfahren unter Verwenden eines Kondensationsmittels des Chinolintyps wie etwa N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin (EEDQ), 1-Isobutyl-2-isobutyl-l,2-dihydrochinolin durchgeführt.
Die vorstehende Polykondensation eines Glykopeptids kann durch ein herkömmliches Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel wird im Falle des Verwendens einer organischen Phosphorverbindung das Glykopeptid der Formel (III) mit der vorstehenden organischen Phosphorverbindung in Gegenwart einer Base (z. B. Triethylamin, Trimethylamin) in einem organischen Lösungsmittel (z. B. N,N-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid) unter Ergeben des gewünschten sequentiellen Glykopeptids (IV) behandelt.
Das Verfahren unter Verwenden eines Kondensationsmittels des Chinolintyps kann durch Lösen des Glykopeptids der Formel (III) in einem organischen Lösungsmittel (z. B. Methanol, Ethanol) und Hinzufügen des vorstehenden Kondensationsmittels des Chinolintyps und anschließend Umsetzen des Gemisches bei Raumtemperatur bis einer erhöhten Temperatur durchgeführt werden.
In der Beschreibung bedeutet Monosaccharid natürliche Monosaccharide (z. B. D-Glucose, D-Galactose, D-Mannose, L-Fucose) und Oligosaccharid bedeutet aus 2 bis 10 vorstehenden Monosacchariden bestehende Verbindungen. Der durch R⁶, R⁷, R⁸, R^6', R^7' und R^8' in den Formeln (I) bis (IV) dargestellte Saccharidrest bedeutet einen D-Glucose-, D-Galactose-, N-Acetylglucosamin- oder N-Acetylgalactosaminrest, d. h. α-D-Glucopyranosyl, (3-D-Glucopyranosyl, α-D-Galactopyranosyl, (3-D-Galactopyranosyl, 2-Acetylamino-2-desoxy-1-β-Dglucopyranosyl, 2-Acetylamino-2-desoxy-1-β-D-galactopyranosyl, und die funktionellen Gruppen wie etwa eine Aminogruppe und/oder eine Carboxygruppe die ser Saccharidreste sind vorzugsweise durch herkömmliche Aminoschutzgruppen (z. B. Acetylgruppe, Phthaloylgruppe) und herkömmliche Carboxyschutzgruppen (z. B. Methyl, Ethyl, Benzyl) geschützt. Diese Schutzgruppen werden auch durch herkömmliche Verfahren ähnlich wie andere Schutzgruppen im letzten Schritt entfernt.
BEISPIELE
Das Verfahrender vorliegenden Erfindung wird durch Bezugsbeispiele und Beispiele genauer veranschaulicht, sollte jedoch nicht als darauf beschränkt aufgefaßt werden.
Bezugsbeispiel 1
Synthese von O-(2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl-(1 → 3)-2-azido-4,6-O-benzyliden-2-desoxy-l-β-D-galactopyranosylfluorid
(i) Synthese von 2,3,6-Tri-O-acetyl-β-D-galactal:
Vollständig acetylierte D-Galactose (50 g, 128 mMol) wird in Dichlormethan (150 ml) gelöst und Acetanhydrid (10 ml) wird hinzugefügt. Das Gemisch wird auf Eistemperatur abgekühlt und es wird tropfenweise 30% HBr-Essigsäure (82 ml, 320 mMol) unter Belichten zugefügt. Das Reaktionsgemisch wird allmählich auf Raumtemperatur erwärmt und 2,5 Stunden umgesetzt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist wird dem Reaktionsgemisch Eiswasser (10 ml) zugefügt und das Gemisch wird mit Chloroform extrahiert. Die organische Schicht wird mit Wasser, gesättigter, wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Ergeben der 1-Bromverbindung eingeengt.
In einem Gemisch aus Essigsäure (80 ml) und Wasser (120 ml) werden Natriumacetat (105 g, 1,28 Mol), Kupfersulfat (CuSO₄·5H₂O; 8,0 g, 32 mMol) und Zink (83,7 g, 1,28 Mol) gelöst und der Lösung wird tropfenweise eine Lösung der vorstehend erhaltenen 1-Bromverbindung in Essigsäure (80 ml) bei Eistemperatur zugefügt. Das Reaktionsgemisch wird allmählich auf Raumtemperatur erwärmt und 12 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und mit Chloroform extrahiert. Die organische Schicht wird mit Wasser, gesättigter, wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und Kochsalzlösung gewaschen, über wasser freiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Ergeben von 2,3,6-Tri-Oacetyl-β-D-galactal (34,8 g, quantitative Menge) eingeengt.
(ii) Synthese von 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-galactopyranosylnitrat:
Das vorstehend erhaltene 2,3,6-Tri-O-acetyl-β-D-galactal (12,5 g, 4,6 mMol) wird in Acetonitril (150 ml) gelöst und Cer(IV)-ammoniumnitrat (Ce(IV)(NO₃)₆(NH₄)₂; 50 g, 9,2 mMol) wird hinzugefügt und das Gemisch wird auf –20°C gekühlt und es wird Natriumnitrit (4,2 g, 6,4 mMol) zugefügt. Das Reaktionssystem wird allmählich auf Raumtemperatur erwärmt und 12 Stunden umgesetzt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, wird dem Reaktionsgemisch Eiswasser zugefügt und das Gemisch wird mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wird mit Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, eingeengt und durch Kieselgel-Säulenchromatographie (Toluol : Ethylacetat = 10 : 1) unter Ergeben von 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranosylnitrat (11,6 g, 68%) aufgetrennt.
(iii) Synthese von 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranosylfluorid:
Vorstehend in (ii) erhaltenes 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-(3-D-galactopyranosylnitrat (6,2 g, 16,5 mMol) wird in Acetonitril (30 ml) gelöst und es wird Triethylamin (1,5 ml) und Triethylamin – 3HF (6,6 ml, 41,2 mMol) hinzugefügt und das Reaktionssystem wird mit Stickstoffgas gespült. Das Gemisch wird 18 Stunden bei 40–50°C umgesetzt und eingeengt und anschließend mit Chloroform extrahiert. Die organische Schicht wird mit Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, eingeengt und durch Kieselgel-Säulenchromatographie (Toluol : Ethylacetat = 4 : 1) unter Ergeben von 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranosylfluorid (3,2 g, 58%) aufgetrennt. Die entsprechende Verbindung mit freiem Hydroxy in 1-Stellung (1,3 g, 3,92 mMol), die bei der vorstehenden Reaktion als Nebenprodukt erhalten wird, wird in Tetrahydrofuran (15 ml) gelöst und das Reaktionssystem wird mit Stickstoffgas gespült. Nach dem Kühlen des Gemisches auf –20°C wird dem Gemisch Diethylaminoschwefeltrifluorid (DAST; 0,62 ml, 4,7 mMol) zugefügt und es wird 10 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, wird das Gemisch erneut auf –20°C gekühlt und Methanol (3 ml) wird hinzugefügt und das Gemisch wird eingeengt und mit Chloroform extrahiert. Die organische Schicht wird mit wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, eingeengt und durch Kieselgel-Säulenchromatographie (Toluol : Ethylacetat = 15 : 1) unter Ergeben desselben Produkts wie vorstehend (1,0 g, 88%) aufgetrennt. Die Gesamtausbeute der gewünschten Fluoridverbindung aus der Nitratausgangsverbindung beträgt in diesem Schritt 4,2 g (76%).
(iv) Synthese von 2-Azido-4,6-O-benzyliden-2-desoxy-β-D-galactopyranosylfluorid:
Das in vorstehend (iii) erhaltene 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranosylfluorid (1,74 g, 5,22 mMol) wird in wasserfreiem Methanol (20 ml) gelöst und es wird Natriummethylat (27 mg, 0,52 mMol) hinzugefügt und das Gemisch wird bei Raumtemperatur umgesetzt. Eine Stunde danach wird das Reaktionssystem mit einem Kationenaustauschharz (DOWEX 50-8X) auf pH = 7 eingestellt. Nach dem Filtrieren des Kationenaustauschharzes wird das Filtrat eingeengt. Der konzentrierte Sirup wird in Dimethylformamid (20 ml) gelöst und es werden Benzaldehyddimethylacetal (1,57 ml, 10,4 mMol) und Camphersulfonsäure (606 mg, 2,61 mMol) hinzugefügt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 50°C umgesetzt, während das erzeugte Methanol durch einen Verdampfer aus dem Reaktionssystem entfernt wird. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, wird die Reaktion durch Zufügen von Triethylamin (1,8 ml, 13 mMol) zu dem Reaktionssystem abgebrochen. Nach dem Einengen des Reaktionsgemisches wird das Produkt durch Kieselgel-Säulenchromatographie (Hexan : Ethylacetat = 4 : 1 bis 1 : 3 – 0,5% Triethylamin) unter Ergeben von 2-Azido-4,6-O-benzyliden-2-desoxy-β-Dgalactopyranosylfluorid (1,51 g, 98%) aufgetrennt.
(v) Synthese von 2-Azido-4,6-di-tert-butylsilylendiyl-2-desoxy-β-D-galactopyranosilylfluorid:
In vorstehend (iv) erhaltenes 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-azido-2-desoxy-β-D-galactopyranosylfluorid (1,92 mg, 5,79 mMol) wird in wasserfreiem Methanol (15 ml) gelöst und es wird Natriummethylat (31 mg, 0,58 mMol) hinzugefügt und das Gemisch wird bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach einer Stunde wird das Reak tionsgemisch mit einem Kationenaustauschharz (DOWEX 50-8X) auf pH = 7 eingestellt. Das Kationenaustauschharz wird durch Filtration entfernt und das Filtrat wird eingeengt. Der konzentrierte Sirup wird in Pyridin (20 ml) gelöst und es werden 1-Nydroxybenzotriazol (160 mg, 0,07 mMol) und Di-tert-butyldichlorsilan (1,34 ml, 0,4 mMol) hinzugefügt und das Reaktionssystem wird mit Stickstoffgas gespült und 13 Stunden bei 80–90°C umgesetzt. Man läßt das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen und engt ein. Das sich daraus Ergebende wird mit Chloroform extrahiert und die organische Schicht wird mit 1 N Schwefelsäure, wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und Kochsalzlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, eingeengt und anschließend durch Kieselgel-Säulenchromatographie (Toluol : Ethylacetat = 15 1) unter Ergeben von 2-Azido-4,6-di-tert-butylsilylendiyl-2-desoxy-β-D-galactopyranosilylfluorid (1,52 g, 76%) aufgetrennt.
(vi) Synthese von 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyltrichloracetimidat:
Vollständig acetylierte D-Galactose (20 g, 51,2 mMol) wird in Tetrahydrofuran (150 ml) gelöst und Benzylamin (9,5 ml, 87,1 mMol) wird hinzugefügt und das Gemisch wird 12 Stunden umgesetzt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, wird das Reaktionsgemisch eingeengt und mit Chloroform extrahiert. Die organische Schicht wird mit 1N Schwefelsäure, wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, eingeengt und durch Kieselgel-Säulenchromatographie (Toluol Ethylacetat = 5 : 1) aufgetrennt und anschließend eingeengt. Die Verbindung mit einer freien 1-Hydroxygruppe wird in Dichlormethan (100 ml) gelöst und das Gemisch wird auf –10°C gekühlt und es werden Trichloracetonitril (24,7 ml, 246 mMol) und 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undeca-7-en (3,83 ml, 25,6 mMol) hinzugefügt. Das Gemisch wird bei Eistemperatur eine Stunde umgesetzt und bei 15°C eingeengt. Das Reaktionsgemisch wird durch Kieselgel-Säulenchromatographie (Toluol : Ethylacetat = 5 : 1 – 0,5% Triethylamin) unter Ergeben von 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyltrichloracetimidat (17,5 g, 70%) aufgetrennt.
(vii) Synthese von O-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1 → 3)-2-azido-4,6-O-benzyliden-2-desoxy-β-D-galactopyranosylfluorid:
In vorstehend (vi) erhaltenes 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyltrichloracetimidat (2,36 g, 4,8 mMol) und in vorstehend (iv) erhaltenes 2-Azido-4,6-O-benzyliden-2-desoxy-β-D-galactopyranosylfluorid (1,18 g, 4,0 mMol) werden in Dichlormethan (15 ml) gelöst und es wird Molekularsieb (1,0 g) hinzugefügt und das Reaktionssystem wird mit Stickstoffgas gespült. Nach dem Kühlen des Reaktionsgemisches auf –15°C wird eine Lösung von mit Dichlormethan (0,5 ml) verdünntem Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (77 μl, 0,40 mMol). Das Gemisch wird unter Halten bei –15°C zwei Stunden umgesetzt und anschließend wird die Reaktion durch Zufügen von Triethylamin (1 ml) abgebrochen. Das Reaktionsgemisch wird filtriert, eingeengt und durch Kieselgel-Säulenchromatographie (Toluol : Ethylacetat = 5 : 1 – 0,5% Triethylamin unter Ergeben von O-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1 → 3)-2-azido-4,6-O-benzyliden-2-desoxy-β-D-galactopyranosylfluorid (2,17 g, 87%) aufgetrennt.
¹H-NMR δ (CDCl₃): 5.57 (s, 1H, 0Ph-CH), 5.07 (dd, 1H, J = 52.5, 7.5 Hz, H-1), 4.80 (d, 1H, J = 7.9 Hr, H-1')
(viii) Synthese von O-(2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1 → 3)-2-azido-4,6-O-benzyliden-2-desoxy-β-D-galactopyranosylfluorid:
In vorstehend (vii) erhaltenes O-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl(1 → 3)-2-azido-4,6-O-benzyliden-2-desoxy-1-β-D-galactopyranosylfluorid (1,3 g, 2,08 mMol) wird in wasserfreiem Methanol (20 ml) gelöst und Natriummethylat (10 mg, 0,2 mMol) wird hinzugefügt und das Gemisch wird bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach einer Stunde wird das Reaktionssystem mit einem Kationenaustauschharz (DOWEX 50-X8) auf pH = 7 eingestellt. Das Kationenaustauschharz wird durch Filtration entfernt und das Filtrat wird eingeengt. Der konzentrierte Sirup wird in N,N-Dimethylformamid (20 ml) gelöst und auf –20°C gekühlt. Dem Gemisch wird Natriumhydroxid (60%) (552 mg, 16 mMol) zugefügt und das Gemisch wird 15 Minuten gerührt und es wird Benzylbromid (4,9 ml, 40 mMol) hinzugefügt. Das Reaktionssystem wird allmählich auf Raumtemperatur erwärmt und 3 Stunden umgesetzt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist wird dem Gemisch Eiswasser (10 ml) zugefügt und das Gemisch wird mit Chloroform extrahiert. Die organische Schicht wird mit 5%iger wäßriger Citronensäurelösung und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das sich daraus Ergebende wird filtriert, eingeengt und durch Kieselgel-Säulenchromatographie (mobile Phase: Hexan : Ethylacetat = 5 : 1, Triethylamin 0,5%) unter Ergeben der gewünschten Verbindung (1,2 g, 71%) aufgetrennt.
¹H-NMR δ (CDCl₃): 5.50 (s, 1H, Ph-CH), 5.15 (dd, 1H, J = 52.6, 7.5 Hz, H-1), 4.68 (d, 1H, J = 7.6 Hr, H-1'), 4.31–4.26 (m, 2H, H-4, H-6a), 4.01–3.84 (m, 4H, H-2, H-2', H-4', H-6b), 3.61–3.48 (m, 5H, H-3, H-3', H-5', H-6a, H-6b'), 3.39 (s, 1H, H-5)
Bezugsbeispiel 2
Synthese von O-(2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1 → 3)-2-azido-4,6-di-O-benzyl-2-desoxy-β-D-galactopyranosylfluorid
Im vorstehenden Bezugsbeispiel 1-(vii) erhaltenes O-(2,3,4,5-Tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl-(1 → 3)-2-azido-4,6-O-benzyliden-2-desoxy-β-D-galactopyranosylfluorid (474 mg, 0,758 mMol) wird in wasserfreiem Methanol (10 ml) gelöst und die Lösung wird auf Eistemperatur gekühlt und es wird Natriummethylat (8 mg, 0,152 mMol) hinzugefügt und das Gemisch wird bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach einer Stunde wird das Reaktionsgemisch mit einem Kationenaustauschharz (DOWEX 50-X8) auf pH = 7 eingestellt. Das Kationenaustauschharz wird durch Filtration entfernt und das Filtrat wird eingeengt. Das eingeengte Produkt wird erneut in Methanol (15 ml) gelöst und es wird Camphersulfonsäure (55 mg, 0,237 mMol) hinzugefügt und das Gemisch wird 2 Stunden bei 37°C umgesetzt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, wird dem Gemisch Triethylamin (0,31 ml, 3,03 mMol) zugesetzt und das Gemisch wird eingeengt. Der eingeengte Sirup wird in Dimethylformamid (15 ml) gelöst und auf –20°C gekühlt. Dem Gemisch wird Natriumhydrid (60%) (364 mg, 9,10 mMol) zugesetzt und das Gemisch wird 15 Minuten gerührt und es wird Benzylbromid (1,62 ml, 13,6 mMol) hinzugefügt. Das Reaktionssystem wird allmählich auf Raumtemperatur erwärmt und anschließend 12 Stunden umgesetzt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist wird dem Reaktionsgemisch Eis zugefügt und das Gemisch wird eingeengt und mit Chloroform extrahiert. Die organische Schicht wird mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, eingeengt und anschließend durch Kieselgel-Säulenchromatographie (Hexan : Ethylacetat = 5 : 1) unter Ergeben der gewünschten Verbindung (486 mg, 77%) aufgetrennt.
¹H-NMR(CDCl₃): 5.10 (dd, 1H, J = 52.5, 7.3 Hz, H-1), 4.65 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1'), 3.95–3.83 (m, 4H, H-2, H-2', H-4, H-4'), 3.63–3.43 (m, 8H, H-3, H-3', H-5, H-5', H-6a, H-6b, H-6a', H-6b').
Bezugsbeispiel 3
Synthese von O-(2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1 → 3)-2-azido-4,6-di-tert-butylsilylendiyl-2-desoxy-β-D-galactopyranosylfluorid:
Im vorstehenden Bezugsbeispiel 1-(vi) erhaltenes 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-Dgalactopyranosyltrichloracetimidat (403 mg, 0,82 mMol) und im vorstehenden Bezugsbeispiel 1-(v) erhaltenes 2-Azido-4,6-di-tert-butylsilylendiyl-2-desoxy-β-D-galactopyranosilylfluorid (237 g, 0,68 mMol) werden in Dichlormethan (3 ml) gelöst und es wird Molekularsieb (200 mg) hinzugefügt und das Reaktionssystem wird mit Stickstoffgas gespült. Nach dem Kühlen des Reaktionsgemisches auf –20°C wird eine mit Dichlormethan (0,5 ml) verdünnte Lösung von Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (13 μl, 68 μMol). Das Gemisch wird unter Halten bei –20°C zwei Stunden umgesetzt und anschließend wird die Reaktion durch Zufügen von Triethylamin (1 ml) abgebrochen. Das Reaktionsgemisch wird filtriert, eingeengt und durch Kieselgel-Säulenchromatographie (Toluol : Ethylacetat = 10 1 – 0,5% Triethylamin) unter Ergeben der gewünschten Verbindung (397 mg, 86%) aufgetrennt.
¹H-NMR δ (CDCl₃): 5.04 (dd, 1H, J = 54.6, 7.6 Hz, H-1), 4.7b (d, 1 H, J = 7,8 Hr, H-1'), 1.04 (d, 18H, t-Bu × 2)
Bezugsbeispiel 4
Synthese von Benzyloxycarbonyl-L-alanin-L-threonin-L-alaninbenzylester:
H-L-Alaninbenzylester-toluolsulfonat (2,71 g, 8,48 mMol) wird in Chloroform (20 ml) gelöst und das Gemisch wird auf Eistemperatur gekühlt. Es wird Triethylamin (1,2 ml, 8,48 mMol) zum Neutralisieren des Salzes hinzugefügt und das Gemisch wird unter Ergeben von N-L-Alaninbenzylester eingeengt. Getrennt wird t-Butoxycarbonylthreonin (1,69 g, 7,71 mMol) in Benzol (10 ml) gelöst und es wird EEDQ (N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-l,2-dihydrochinolin) (2,10 g, 8,48 mMol) hinzugefügt und das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dem Gemisch wird eine Lösung des vorstehend erhaltenen N-L-Alaninbenzylesters in Benzol (10 ml) zugefügt. Das Gemisch wird 12 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt, eingeengt und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wird mit 5%iger Citronensäure, wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter Ergeben von t-Butoxycarbonyl-L-threonin(OH)-L-alaninbenzylester (2,51 g, 86%) eingeengt. Dieses Produkt (3,3 g, 8,67 mMol) wird in 4N HCl-Dioxan (50 ml, 0,2 Mol) gelöst und das Gemisch wird eine Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt und eingeengt. Das sich daraus ergebende wird in Ethanol (30 ml) gelöst und es wird Triethylamin (1,3 ml, 9,53 mMol) zum Neutralisieren des Salzes hinzugefügt und das Gemisch wird unter Ergeben von H-L-Threonin(OH)-L-alaninbenzylester eingeengt.
Getrennt wird Benzyloxycarbonyl-L-alanin (2,03 g, 9,1 mMol) in einem Ethanol-Dimethylformamid-Gemisch (1 : 1) (30 ml) gelöst und es wird EEDQ (2,47 g, 9,9 mMol) hinzugefügt und das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dem Gemisch wird eine Lösung des vorstehend erhaltenen H-L-Threonin(OH)-L-alaninbenzylesters in Ethanol (15 ml) zugefügt. Das Gemisch wird 12 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt und eingeengt. Das eingeengte Gemisch wird in einer kleinen Menge Ethanol gelöst und es werden Ether und n-Hexan zum Kristallisieren des Produkts zugefügt. Die Kristalle werden durch Filtration abgetrennt und mit 1N Salzsäure, wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und Kochsalzlösung unter Ergeben der gewünschten Verbindung (3,6 g, 85%) gewaschen.
¹H-NMR δ (DMSO): 1.02 (d, 3H, J = 6.3 Nz, Thr-γ-H), 1,20 (d, 3H, J = 7.0 Hz, Ala-β-H), 1.28 (d, 3H, J = 7.3 Hz, Ala-β-H), 3.31 (dd, 1H, J = 10.4, 5.0 Hz, Thr-β-H), 3.31 (ddd, 1H, J = 7.2, 7.0, 7 Hz, Ala-α-H), 4.17 (dd, 1H, J = 8.2, 4.0 Hz, Thr-α-H), 4.30 (ddd, 1H, J = 7.2, 7.1, 7.0 Hz, Ala-α-H), 7.31 (m, 10H, Ar)
Beispiel 1
Synthese von L-Alanin-(β-D-galactopyranosyl)-(1 → 3)-2-(acetamid-2-desoxy-l-α-D-galactopyranosyl)-L-threonin-L-alanin:
(i) In Bezugsbeispiel 4 erhaltener Benzyloxycarbonyl-L-alanin-L-threonin-Lalaninbenzylester (1,165 g, 2,4 mMol) wird mit Methylenchlorid (10 ml), Molekularsieb (1,5 9), Zirkonocendichlorid (Cp₂ZrCl₂) (468 mg, 1,6 mMol) und Silberperchlorat (663 mg, 3,2 mMol) gemischt und das Reaktionssystem wird mit Wasserstoffgas gespült und auf –20°C gekühlt und das Gemisch wird 30 Minuten gerührt. Dem Reaktionsgemisch wird eine Lösung des im vorstehenden Bezugsbeispiel 1 erhaltenen O-(2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl-(1 → 3)-2-azido-4,6-O-benzyliden-2-desoxy-1-α-D-galactopyranosylfluorids (654 mg, 0,8 mMol) in Methylenchlorid (5 ml) zugefügt. Nach 6 Stunden Rühren des Gemisches wird das Reaktionsgemisch filtriert und eingeengt. Der sich daraus ergebende Sirup wird in Chloroform (50 ml) gelöst und die organische Schicht wird mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das sich daraus Ergebende wird filtriert, eingeengt und anschließend durch Kieselgel-Säulenchromatographie (mobile Phase: Hexan : Ethylacetat = 3 : 1) unter Ergeben von Benzyloxycarbonyl-L-alanin-(O-(2,3,4,6-tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1 → 3)-(2-azido-4,6-O-benzyliden-2-desoxy-1-α-Dgalactopyranosyl)-L-threonin-L-alaninbenzylester (463 mg, 45%) aufgetrennt.
¹H-NMR δ (CDCl₃): 5.48 (s, 1H, Ph-CH), 5.35 (d, 1H, J = 3.5 Hz, H-1), 4.67 (d, 1 H, J = 7.6 Hz, H-1')
(ii) Benzyloxycarbonyl-L-alanin-(O-(2,3,4,6-tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1 → 3)-(2-azido-4,6-O-benzyliden-2-desoxy-1-α-D-galactopyranosyl)-L-threonin-L-alaninbenzylester (419 mg, 0,326 mMol) wird in Thioessigsäure (4 ml) und Pyridin (2 ml) bei Raumtemperatur 20 Stunden gerührt und danach wird das Reaktionssystem eingeengt. Der sich daraus ergebende Sirup wird durch Kieselgel-Säulenchromatographie (mobile Phase: Toluol : Ethylacetat = 1 : 1 – 0,5 Triethylamin) unter Ergeben von Benzyloxycarbonyl-L-alanin-(O-(2,3,4,6-tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1 → 3)-(2-acetamido-4,6-O-benzyliden-2-desoxy-1-α-D-galactopyranosyl)-L-threonin-L-alaninbenzylester (266 mg, 63%) aufgetrennt.
¹H-NMR δ (CDCl₃): 5.41 (s, 1H, Ph-CH), 5.21 (d, 1H, J = 3.5 Hz, H-1), 4.60 (d, 1H, J = 8.7 Hz, H-1'), 1.97 (s, 3H, CH₃NH)
(iii) Benzyloxycarbonyl-L-alanin-(O-(2,3,4,6-tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1 → 3)-(2-acetamido-4,6-O-benzyliden-2-desoxy-1-α-D-galactopyranosyl)-L-threonin-L-alaninbenzylester (15 mg, 12 μMol) wird in N,N-Dimethylformamid (3 ml), Essigsäure (1 ml) und Wasser (1 ml) gelöst und es wird Palladiumkohle (100 mg) hinzugefügt und das Reaktionssystem wird mit Wasserstoffgas gespült. Nach 3 Stunden Umsetzen bei Raumtemperatur wird die Palladiumkohle entfernt. Das Gemisch wird der Filtration mit G-10 unterzogen und das Filtrat wird unter Ergeben des gewünschten Produkts (7,2 mg, quantitativ) lyophilisiert.
¹H-NMR δ (D₂O): 4.88 (d, 1H, J = 3.7 Hz, H-1), 4.43 (d, 1H, J = 2.1 Hz, Thr-α-H), 4.33 (dd, J = 6.6, 2.1 Hz, Thr-β-H), 4.36 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1'), 4.20 (dd, 1H, J = 11.1, 3.7 Hz, H-2), 4.16 (m, 1H, Ala-α-H), 4.11 (d, 1H, J = 1.7 Hz, H-4), 4.05 (dd, 1H, J = 14.2, 7.1 Hz, Ala-α-H), 3.97 (m, 1H, H-5), 3.94 (m, 1H, H-3), 3.80 (d, 1H, J = 3.2 Hz, H-4'), 3.66 (m, 4H, H-6a, 6b, 6a', 6b', 3.97 (m, 1H, H-5'), 3.53 (m, 1H, H-3'), 3.42 (dd, 1H, J = 9.8, 7.8 Hz, H-2'), 1.91 (s, 3H, CH₃NH), 1.50 (d, 3H, J = 7.0 Hz, Ala-β-II), 1.22 (d, 3H, J = 7.2 Hz, Ala-β-H), 1.20 (d, 3H, J = 6.6 Hz, Thr-γ-H) 13C-NMR δ (D₂O): 105.5 (C-1'), 99.0 (C-1).
Beispiel 2
Synthese von L-Alanin-(β-D-galactopyranosyl)-(1 → 3)-(2-acetamido-2-desoxy-1α-D-galactopyranosyl)-L-threonin-L-alanin:
(i) Zirkonocenchlorid (Cp2ZrCl2) (543 mg, 1,86 mMol) und Silberperchlorat (771 mg, 3,72 mMol) werden in Dichlormethan (10 ml) gelöst und es wird Molekularsieb (1,0 g) hinzugefügt und das Reaktionssystem wird mit Stickstoffgas gespült und 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dem Gemisch wird in Bezugsbeispiel 4 erhaltener Benzyloxycarbonyl-L-alanin-L-threonin-L alaninbenzylester (904 mg, 1,86 mMol) zugefügt und das Reaktionssystem wird auf –40°C gekühlt. Dem Reaktionsgemisch wird eine Lösung von in Bezugsbeispiel 2 erhaltenem O-(2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→3)-2-azido-4,6-di-O-benzyl-2-desoxy-α-D-galactopyranosylfluorid (620 mg, 0,74 mMol) in Dichlormethan (3 ml) zugefügt und das Gemisch wird allmählich auf Raumtemperatur erwärmt und 18 Stunden umgesetzt. Die Reaktion wird durch Hinzufügen von Pyridin (1 ml) abgebrochen und das Gemisch wird mit Chloroform extrahiert. Die organische Schicht wird mit wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingeengt und durch Kieselgel-Säulenchromatographie (Toluol : Ethylacetat = 9 : 1 – 0,5% Triethylamin) unter Ergeben von Benzyloxycarbonyl-L-alanin-(O-(2,3,4,6-tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1 → 3)-(2-azido-4,6-di-O-benzyl-2-desoxy-α-D-galactopyranosyl)-L-threonin-L-alaninbenzylester (333 mg, 33%) aufgetrennt.
¹H-NMR g (CDCl₃): 5.17 (d, 1H, J = 3.7 Hz, H-1), 4.64 (d, 1H, J = 8.1 Hz, H-1')
(ii) Der vorstehende Benzyloxycarbonyl-L-alanin-(O-(2,3,4,6-tetra-O-benzylβ-D-galactopyranosyl)-(1 → 3)-(2-azido-4,6-di-O-benzyl-2-desoxy-α-D-galactopyranosyl)-L-threonin-L-alaninbenzylester (283 mg, 0,206 mMol) wird in Thioessigsäure (2 ml) gelöst. Der Lösung wird Pyridin (1 ml) zugefügt und das Gemisch wird 20 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt und anschließend unter verringertem Druck eingeengt. Die eingeengte Flüssigkeit wird einer Kieselgel-Säulenchromatographie (Hexan : Ethylacetat = 2 : 3) unter Ergeben von Benzyloxycarbonyl-L-alanin-(O-(2,3,4,6-tetra-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1 → 3)-(2-acetamido-4,6-di-O-benzyl-2-desoxy-α-D-galactopyranosyl)-L-threonin-L-alaninbenzylester (238 mg, 83%) unterzogen.
¹H-NMR δ (CDCl₃): 5.20 (d, 1H, J = 3.5 Hz, H-1), 4.66 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1'), 1.65 (s, 3H, CH₃NH)
(iii) Das vorstehende Produkt wird dem Entschützen auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1-(iii) beschrieben unter Ergeben von L-Alanin-(β-D-galactopyranosyl)(1 → 3)-(2-acetamido-2-desoxy-β-D-galactopyranosyl)-L-threonin-L-alanin unterzogen. Das Produkt wird durch NMR als das Produkt des Beispiels 1 identifiziert.
Beispiel 3
Synthese eines Polymers von 2-Acetamido-2-desoxy-1-α-D-galactopyranosyl-Lserin
2-Acetamido-2-desoxy-1-α-D-galactopyranosyl-L-serin (36 mg, 0,12 mMol) wird in N,N-Dimethylformamid gelöst. Dem Gemisch wird Drylight (100 mg) als Trockenmittel zugesetzt und das Reaktionssystem wird mit Stickstoffgas gespült. Nach 30 Minuten werden dem Gemisch Diphenylphosphorylazid (21 μl, 0,56 mMol) und Triethylamin (37 μl, 0,28 mMol) zugefügt. Das Gemisch wird 3 Tage bei Raumtemperatur umgesetzt, unter verringertem Druck eingeengt und das Produkt wird mit G-25 abgetrennt und unter Ergeben der Titelverbindung (25 mg) lyophilisiert.
Beispiel 4
Synthese eines Polymers von 2-Acetamido-2-desoxy-1-α-D-galactopyranosyl-Lserin:
2-Acetamido-2-desoxy-1-α-D-galactopyranosyl-L-serin (116 mg, 3,76 mMol) wird in Methanol gelöst. Dem Gemisch wird N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-l,2-dihydrochinolin (100 mg, 4,14 mMol) zugefügt und das Gemisch wird einen Tag bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird unter verringertem Druck eingeengt und das Produkt wird mit LH-20 abgetrennt und unter Ergeben der Titelverbindung (70 mg) lyophilisiert.
Beispiel 5
Synthese eines Polymers von L-Alanin-(β-D-galactopyranosyl)-(1 → 3)-(2-acetamido-2-desoxy-1-α-D-galactopyranosyl)-L-threonin-L-alanin:
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 beschrieben hergestelltes L-Alanin-(β-Dgalactopyranosyl)-(1 → 3)-(2-acetamido-2-desoxy-1-α-D-galactopyranosyl)-Lthreonin-L-alanin (21 mg, 33,5 μMol) wird in Dimethylformamid (400 μl) gelöst und das Gemisch wird auf Eistemperatur gekühlt und es wird DPPA (Diphenylphosphonlazid) (9,4 μl, 43,6 μMol), und Triethylamin (6,0 μl, 43,6 μMol) hinzugefügt. Das Reaktionssystem wird allmählich auf Raumtemperatur erwärmt und 3 Tage umgesetzt. Nach dem Umsetzen wird das Reaktionsgemisch mit Ether und Ethanol behandelt. Die sich daraus ergebenden Niederschläge werden in 1 M wäßrigem Ammoniak gelöst und die Lösung wird einen Tag gerührt. Das Gemisch wird erneut mit Ether und Ethanol behandelt und die sich daraus ergebenden Niederschläge werden durch Gelfiltration unter Ergeben des Titelpolymers (18 mg, 86%) gereinigt.
¹H-NMR δ (D₂Q): 4.88 (d, 1H, J = 3.7 Hz, H-1), 4.37–4.12 (m, 7H, Thr-α-H, Thr-β-H, H-1', Ala-α-H × 2, H-2, H-4), 3.97–3.94 (m, 2H, H-5, H-3), 3.80 (d, 1H, J = 2.9 Hz, H-4'), 3.66(m, 4H,·H-6a, 6b, 6a', 6b'), 3.97-3.53 (m, 2H, H-5', H-3'), 3.42 (dd, 1H, J = 9.8, 7.8 Hz, H-2'), 1.92 (s, 3H, CH3NH), 1.33 (m, 9H, -CH₃ × 3) ¹³C-NMR δ (D₂O): 105.5 (C-1'), 99.8 (C-1)
Beispiel 6
Synthese eines Polymers von L-Alanin-(β-D-galactopyranosyl)-(1 → 3)-2-(acetamido-2-desoxy-1-α-D-galactopyranosyl)-L-threonin-L-alanin
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 hergestelltes L-Alanin-(β-D-galactopyranosyl)-(1→3)-2-(acetamid-2-desoxy-1-α-D-galactopyranosyl)-L-threonin-L-alanin (10 mg, 16,0 μMol) wird in einem Gemisch aus Methanol (150 μl) und Dimethylformamid (50 μl) gelöst und es wird EEQD (4,7 mg, 19,1 μMol) hinzugefügt und das Gemisch wird 24 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird mit Ether und Ethanol behandelt und die sich daraus ergebenden Niederschläge werden durch Gelfiltration unter Ergeben des Titelpolymers (8 mg, 80%) gereinigt.
Versuch 1
Das in dem vorstehenden Beispiel 5 erhaltene Polymer (Glykopeptid) weist dieselbe Sequenz wie die des natürlichen Glykopeptids auf, das Antigefrier-Glykoprotein (AFGP) genannt wird, und anschließend wurde die Gefrierpunktserniedrigung des Produkts gemessen und mit der von natürlichem AFGP zum Überprüfen der Ähnlichkeit zwischen beiden verglichen.
Testverfahren
Wäßrige Lösungen des Polymers des Beispiels 5 mit verschiedenen Konzentrationen wurden hergestellt und deren Gefrierpunkt wurde gemessen. Die Gefrierpunktserniedrigung wurde mit einem Lichtmikroskop mit einem Temperaturkontrollgerät gemessen. Zuerst wurde zum Ausschließen eines jeden Fehlers bei der Messung des Gefrierpunkts aufgrund eines Unterkühlens das gesamte System zuvor bei –20°C gefroren und anschließend sorgfältig wieder auf 0°C gebracht, wobei darauf geachtet wurde, den Eiskern nicht völlig aufzulösen. Anschließend wurde das System allmählich abgekühlt, wobei das Wachstum von Eiskristallen beobachtet wurde. Der Gefrierpunkt wurde als der Punkt angenommen, bei dem das Wachstum von Eiskristallen aufhörte und das gesamte System gefroren war. Die Ergebnisse werden in der begleitenden 1 dargestellt. Die 1 schließt auch die in der Literatur (Arthur L. DeVries, Stanley K. Komatsu & Robert E. Feeney, Journal of Biological Chemistry, Bd. 245, S. 2901–2908, 1970) mitgeteilte Gefrierpunktserniedrigung von AFGP natürlichen Ursprungs ein.
Im Falle der Gefrierpunktserniedrigung in Abhängigkeit vom physiochemischen Faktor der Materialkonzentration aufgrund zum Beispiel von Natriumchlorid wird die Beziehung zwischen der Konzentration und der Gefrierpunktserniedrigung eine Gerade, aber im Falle von AFGP wird die Beziehung eine Kurve. Das Polymer der vorliegenden Erfindung zeigte nahezu dieselbe Gefrierpunktserniedrigungsaktivität wie die in 1 dargestellte von AFGP natürlichen Ursprungs. Außerdem hemmte das Polymer der vorliegenden Erfindung das Wachstum von Eiskristallen.
Aus diesen Versuchsergebnissen kann erwartet werden, daß das Glykopeptid der vorliegenden Erfindung als Antigefriermittel für zu transplantierende Organe usw. brauchbar sein kann und es kann weiter erwartet werden, daß es als Kosmetikum wie etwa als Feuchtemittel brauchbar ist.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein stereoselektives Glykopeptidmonomer leicht durch Kuppeln einer Aminosäure oder eines Peptids mit einem fluorierten Glykosid eines Monosaccharids oder eines Oligosaccharids, bei dem die Hydroxygruppen mit einer Schutzgruppe des Ethertyps geschützt sind, erhalten werden und weiter können durch Polykondensieren des Glykopeptids wirkungsvoll sequentielle Glykopeptide erhalten werden, die als Materialien für wissenschaftliche Untersuchungen und Arzneimittel, zum Beispiel ein antivirales Mittel, ein antiallergisches Mittel, ein Antitumormittel und weiter ein Antigefriermittel für zu transplantierende Organe, ein Feuchtemittel für Kosmetika und als ein Material für Nahrungsmittel brauchbar sind.

Claims

Verfahren zum Herstellen eines Glykopeptids der Formel (III):
worin R^1' -OH oder eine geschützte Aminogruppe ist; R^2' -OR^7' ist, worin R^7' ein Wasserstoffatom oder ein Saccharidrest ist; R^3' -OR^7' ist, worin R^7' ein Wasserstoffatom oder ein Saccharidrest ist; R^4' -CH₂OR^8' ist, worin R^8' ein Wasserstoffatom oder ein Saccharidrest oder -CH₃ ist; R^5' ein Wasserstoffatom ist, R⁷ ein Alaninrest ist; R⁸ ein Alaninrest ist und R⁹ eine Methylgruppe ist, das das Kuppeln eines fluorierten Glykosids eines Monosaccharids oder eines Oligosaccharids der Formel (I):
worin R¹ -OR⁶ (worin R⁶ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxyschutzgruppe des Ethertyps ist) oder eine Aminogruppenvorstufe ist; R² -OR^7'' ist, worin R^7'' ein Wasserstoffatom, eine Hydroxyschutzgruppe des Ethertyps oder ein Saccharidrest ist; R³ -OR^7'' ist, worin R^7'' ein Wasserstoffatom, eine Hydroxyschutzgruppe des Ethertyps oder ein Saccharidrest ist; R⁴ -CH₂OR^8'' (worin R^8'' ein Wasserstoffatom, eine Hydroxyschutzgruppe des Ethertyps oder ein Saccharidrest ist) oder -CH₃ ist und R⁵ ein Wasserstoffatom ist, mit einem Benzylester von L-Alanyl-L-threonyl-L-alanin oder einem Derivat davon unter Ergeben einer Verbindung der Formel (II):
worin R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁷, R⁸ und R⁹ dasselbe wie vorstehend definiert sind, R¹⁰ eine Aminoschutzgruppe ist und R¹¹ eine Carboxyschutzgruppe ist, gegebenenfalls vom Umwandeln der Aminogruppenvorstufe in eine geschützte Aminogruppe und anschließend das Entschützen durch Hydrierung umfaßt.
Verfahren zum Herstellen eines sequentiellen Glykopeptids der Formel (IV):
worin R^1', R^2', R^3', R^4', R^5', R⁷, R⁸ und R9 dasselbe wie nachstehend definiert sind und n eine ganze Zahl von 2 bis 20 ist, das das Unterziehen einer Verbindung der Formel (III), bei der alle Hydroxygruppen in der Saccharidstruktureinheit frei sind:
worin R^1' -OH oder eine geschützte Aminogruppe ist; R^2' und R^3' -OR^7' sind (worin R^7' ein Wasserstoffatom oder ein Saccharidrest ist); R^4' -CH₂OR^8' (worin R^8' ein Wasserstoffatom oder ein Saccharidrest ist) oder -CH₃ ist; R^5' ein Wasserstoffatom ist, R⁷ ein Alaninrest ist; R⁸ ein Alaninrest ist und R⁹ eine Methylgruppe ist, einer Polykondensationsreaktion des Glykopeptids in Gegenwart einer organischen Phosphorverbindung oder eines Peptidkondensationsmittels vom Chinolintyp umfaßt.
Verfahren zum Herstellen eines sequentiellen Glykopeptids der Formel (IV):
worin R^1' -OH oder eine geschützte Aminogruppe ist; R^2' und R^3' -OR^7' sind (worin R^7' ein Wasserstoffatom oder ein Saccharidrest ist); R^4' -CH₂OR^8' (worin R^8' ein Wasserstoffatom oder ein Saccharidrest ist) oder -CH₃ ist; R^5' ein Wasserstoffatom ist, R⁷ ein Alaninrest ist; R⁸ ein Alaninrest ist; R⁹ eine Methylgruppe ist und n eine ganze Zahl von 2 bis 20 ist, das (a) das Umsetzen eines fluorierten Glykosids eines Monosaccharids oder eines Oligosaccharids der Formel (I):
worin R¹ -OR⁶ (worin R⁶ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxyschutzgruppe des Ethertyps ist) oder eine Aminogruppenvorstufe ist; R² und R³ -OR^7'' sind (worin R^7'' ein Wasserstoffatom, eine Hydroxyschutzgruppe des Ethertyps oder ein Saccharidrest ist); R⁴ -CH₂OR^8'' (worin R^8'' ein Wasserstoffatom, eine Hydroxyschutzgruppe des Ethertyps oder ein Saccharidrest ist) oder -CH₃ ist und R⁵ ein Wasserstoffatom ist, mit einem Benzylester von L-Alanyl-L-threonyl-L-alanin oder einem Derivat davon unter Ergeben einer Verbindung der Formel (II):
worin R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁷, R⁸ und R9 dasselbe wie vorstehend definiert sind, R¹⁰ eine Aminoschutzgruppe ist und R¹¹ eine Carboxyschutzgruppe ist; (b) gegebenenfalls das Umwandeln der Aminogruppenvorstufe R¹ in eine geschützte Aminogruppe, (c) Hydrieren der Verbindung der Formel (II) unter Ergeben des Glykopeptids der Formel (III):
worin R^1', R^2', R^3', R^4', R^5', R⁷, R⁸ und R9 dasselbe wie vorstehend definiert sind, und (d) das Unterziehen einer Mehrzahl Glykopeptide der Formel (III) einer Polykondensationsreaktion in Gegenwart einer organischen Phosphorverbindung oder eines Kondensationsmittels des Chinolintyps umfaßt.