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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Gebiete der Zellbiologie
und der Diagnose neoplastischer Erkrankungen. Insbesondere betrifft
diese Erfindung eine neue extrazelluläre Serinprotease, die Tumor
Antigen Derived Gene-14 (TADG-19)
genannt wird.
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Beschreibung
des Standes der Technik
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Extrazelluläre Proteasen
hängen
direkt mit dem Tumorwachstum, der Ablösung von Tumorzellen bzw. Migration
von Tumorzellen und der Invasion von Zielorganen zusammen. Einzelne
Klassen von Proteasen sind (1) an dem Abbau des den anfänglichen
Tumorbereich umgebenden Stromas, (2) am Abbau der Zelladhäsionsmoleküle, was
die Dissoziation von Tumorzellen erlaubt, und (3) an der Invasion der
Basismembran beim metastatischen Wachstum und der Aktivierung von
sowohl Tumorwachstumsfaktoren als auch angiogenen Faktoren sowie
anderen Vorgängen
beteiligt.
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Der
Stand der Technik ist dahingehend unzureichend, dass wirksame Screeningtechniken
zur Identifizierung von Proteasen, die beim Karzinom überexprimiert
werden, fehlen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen im Fachgebiet seit
langem bestehenden Bedarf.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung offenbart ein Screeningsystem zur Identifizierung
von bei Karzinomen überexprimierten
Proteasen durch Untersuchung von PCR-Produkten, die aus Tumoren
im frühen
Stadium, metastatischen Tumoren und normalem Ovarienepithel amplifiziert
werden.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird eine ein TADG-14-Protein codierende DNA bereitgestellt,
die aus der Gruppe, bestehend aus (a) isolierter DNA, die ein TADG-14-Protein
codiert, (b) isolierter DNA, die mit der vorstehenden isolierten
DNA von (a) hybridisiert und die ein TADG-14-Protein codiert, und
(c) isolierter DNA, die sich von den vorstehenden isolierten DNAs von
(a) und (b) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes in der
Codon-Sequenz unterscheidet
und die ein TADG-14-Protein codiert, ausgewählt ist.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor bereitgestellt, der zur
Expression der DNA der vorliegenden Erfindung befähigt, zur
Expression in einer rekombinanten Zellen angepasst ist und für die Expression
der DNA in der Zelle erforderliche Regulationselemente umfasst.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle bereitgestellt,
die mit dem Vektor der vorliegenden Erfindung transfiziert ist,
wobei der Vektor ein TADG-14-Protein exprimiert.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis der Expression
einer TADG-14-mRNA bereitgestellt, das die Schritte (a) In-Kontakt-Bringen
von mRNA, die aus der Zelle erhalten wurde, mit der markierten Hybridisierungssonde
und (b) Detektieren der Hybridisierung der Sonde mit der mRNA umfasst.
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Andere
und weitere Gesichtspunkte, Merkmale und Vorteile der vorliegenden
Erfindung werden anhand der nachfolgenden Beschreibung der derzeit bevorzugten
Ausführungsformen
der Erfindung, die zum Zwecke der Offenbarung angegeben sind, ersichtlich.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Damit
der Gegenstand, in welchem die vorstehend genannten Merkmale, Vorteile
und Ziele der Erfindung sowie andere, die ersichtlich werden, enthalten
sind, bereitgestellt und im Einzelnen verstanden werden kann, werden
genauere Beschreibungen der vorstehend kurz zusammengefassten Erfindung mit
Bezug auf bestimmte Ausführungsformen
davon, die in den beigefügten
Zeichnungen veranschaulicht werden, bereitgestellt. Diese Zeichnungen
bilden einen Teil der Spezifikation. Es wird jedoch darauf aufmerksam
gemacht, dass die beigefügten
Zeichnungen bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung veranschaulichen und daher nicht als den Schutzbereich
einschränkend
anzusehen sind.
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1 zeigt
einen Vergleich von PCR-Produkten, die von normaler und Karzinom-cDNA abgeleitet sind,
nach Färbung
in einem Agarosegel. Es lagen zwei getrennte Banden (Spur 2) beim
Primerpaar Sense-His-Antisense-Asp (AS1) vor und es wurden multiple
Banden mit etwa 500 Basenpaaren in der Karzinomspur beim Primerpaar
Sense-His-Antisense-Ser (AS2) (Spur 4) beobachtet.
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2 zeigt
einen Vergleich der Aminosäuresequenzen
katalytischer Domänen
von TADG-14.
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3 zeigt
die Überexpression
von TADG-14 in Ovarkarzinomen.
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4 zeigt
die TADG-14-Expression in Tumoren und Zelllinien.
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5 zeigt
Blots der TADG-14-Expression in fötalen, adulten und Ovarkarzinomgeweben.
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6 zeigt
die vollständige
Sequenz des TADG-14-Transkripts, einschließlich des offenen Leserasters
und üblicher
Domänen.
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7 zeigt die Homologie zwischen TADG-14
und Neuropsin der Maus. Es ergab sich eine Identität von ungefähr 76% im
offenen Leseraster und eine geringe Homologie außerhalb des offenen Leserasters.
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8 zeigt
die Aminosäurehomologie
zwischen TADG-19 und Neuropsin der Maus.
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9 zeigt die Northern-Blot-Analyse. (9A) Boten-RNA wurde aus interessierenden Geweben
isoliert und der Northern-Hybridisierung unter Verwendung eines
zufällig
markierten, für TADG14
spezifischen RT-PCR-Produkts mit 230 Bp unterworfen. Der Blot wurde
gestrippt und mit einer Sonde für β-Tubulin
hybridisiert. (9B, 9C, 9D) Northern Blots mit verschiedenen Geweben (Clontech)
wurden mit den gleichen TADG14- und β-Globulin-spezifischen RT-PCR-Produkten hybridisiert.
Die TADG14-mRNA wurde als Transkript mit 1,4 kB in Tumoren detektiert,
und sie wurde in keinem der untersuchten normalen Geweben nachgewiesen.
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10 zeigt die cDNA und abgeleitete Aminosäuresequenz
von TADG14 und einen Vergleich der vorhergesagten TADG14-Sequenz
mit bekannten Proteasen. Die cDNA-Sequenz von TADG14 ist zusammen mit
der abgeleiteten Sequenz von 260 Aminosäuren gezeigt, die unter Verwendung
des Ein-Buchstaben-Codes für
jeden Rest dargestellt ist. Innerhalb der cDNA stellen unterstrichene
Teile die Kozak-Konsensussequenz
zur Translationsinitiation bzw. das Polyadenylierungssignal dar.
Die TADG14-Proteinsequenz enthält
eine Sekretionssignalsequenz nahe dem Aminoterminus (grün schraffiert).
Die kritischen Reste der katalytischen Triade sind durch gelbe Schattierung
angezeigt, während eine
potentielle Glycosylierungsstelle durch violette Schattierung markiert
ist. Das Stopp-Codon ist durch das Symbol (*) dargestellt. Unter
Verwendung des Programms GCG PILEUP (REF) wurde die Aminosäuresequenz
von TADG14 mit humanem glandulärem
Kallikrein (hHk2, Zugriffs-Nr. P06870), humanem PSA (hPSA, Zugriffs-Nr.
P07288), Neuropsin der Maus (mNeur, Zugriffs-Nr. D30785) und humaner Protease
M (hProM, Zugriffs-Nr. U62801) verglichen. In mindestens drei der
fünf Sequenzen
identische Aminosäurereste
sind grün
schattiert. Gelb schattierte Reste stellen Aminosäuren dar,
die bei mindestens drei Sequenzen ähnlich sind. Die Positionen
der Reste der katalytischen Triade sind markiert.
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11 zeigt die quantitative TADG14-PCR. Es
sind typische Resultate eines quantitativen TADG14-PCR-Experiments
gezeigt (11A). Die Reaktionsprodukte
wurden auf einem 2% Agarose-TAE-Gel elektrophoretisch getrennt und
mit Ethidiumbromid gefärbt.
In dieser Figur ist die Bande mit 954 Bp das β-Tubulin-Produkt und die Bande
mit 230 Bp das TADG14-Produkt. Die radiomarkierten PCR-Produkte
wurden quantifiziert (11B).
Gemäß der Bestimmung
durch den Student's-t-Test waren die TADG14-mRNA-Expressionsspiegel
in LMP-Tumoren (*, P = 0,05) und Karzinomen (P < 0,0001) im Vergleich zu in normalen
Ovarien festgestellten Spiegeln deutlich erhöht. Einzelne Fälle sind in
einer Punktwolke dargestellt. Dies zeigt die Heterogenität der TADG14-Expression
in diesen Tumorproben.
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12 zeigt
einen Western-Blot. Es wurden polyklonale Antikörper durch Immunisierung von
Kaninchen mit einem von drei mit Polylysin verknüpften Mehrfachantigenpeptiden,
die anhand der abgeleiteten Aminosäuresequenz von TADG14 erzeugt
wurden, hergestellt. Diese Sequenzen sind KYTRVRLGDHSLQ (T14-1),
GHECQPHSQPWQ (T14-2) und LDWIKKIIGSKG (T14-3). (A) Für die Western-Blot-Analyse
wurden ungefähr
20 g MDA-MB-435S- und HeLa-Zell-Lysate auf einem 15% SDS-PAGE-Gel
aufgetrennt und auf PVDF bei 100 V für 40 Minuten bei 4°C elektrogeblottet.
Der Blot wurde über
Nacht in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS),
pH 7,8, enthaltend 0,2% fettfreie Milch, blockiert. Der Primärantikörper wurde
zu der Membran bei einer Verdünnung
von 1:100 in 0,2% Milch/TBS gegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur
inkubiert. Der Blot wurde gewaschen und mit einer 1:3000-Verdünnung mit
alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege- und Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Bio-Rad)
für eine
Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der Blot wurde gewaschen und
mit einem Chemilumineszenzsubstrat (Bio-Rad) inkubiert, bevor er
für 10
Sekunden zur Visualisierung auf einen Röntgenfilm aufgelegt wurde.
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13 zeigt
Immunhistochemieexperimente. Die Färbung erfolgte mit dem TADG19-1-Antikörper bei
normalen Ovarien, zwei serösen
Karzinomen, Schleimhautkarzinom, endometriosem Karzinom und klarem
Zellkarzinom der Ovarien (A, B, C, D, E bzw. F). Bei normalen Ovarien
wurde keine Färbung
beobachtet. Das in B gezeigte seröse Karzinom weist
TADG19 am stärksten
mit der Oberfläche
des Tumors assoziiert auf, während
im serösen
Tumor in C TADG19 in granulärer Form
in einem ersichtlichen Sekretionsweg zu finden ist. Im Schleimhautkarzinom
scheint TADG14 entlang der invasiven Front des Tumors am höchsten exprimiert
zu werden. TADG14 wird in das Lumen der glandulären Struktur sezerniert, die
durch das endometrioide Karzinom in E gebildet
wird. Das in der Teilfigur F gefärbte klare
Zellkarzinom zeigt eine diffuse Färbung über sämtliche Tumorzellen.
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BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG IM EINZELNEN
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Vorliegend
bezieht sich der Ausdruck „cDNA" auf die DNA-Kopie
des mRNA-Transkripts
eines Gens.
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Vorliegend
bedeutet der Ausdruck „abgeleitete
Aminosäuresequenz" die durch Ablesen
der Triplet-Sequenz der Nukleotidbasen in der cDNA bestimmte Aminosäuresequenz.
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Vorliegend
bezieht sich der Ausdruck „Screening
einer Bibliothek" auf
den Prozess der Verwendung einer markierten Sonde, um zu prüfen, ob unter
den geeigneten Bedingungen eine zu der Sonde komplementäre Sequenz
in einer bestimmten DNA-Bibliothek
vorliegt. Außerdem
könnte
das „Screenen
einer Bibliothek" auch
mittels PCR durchgeführt
werden.
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Vorliegend
bezieht sich der Ausdruck „PCR" auf die Polymerase-Kettenreaktion,
die Gegenstand der U.S.-Patente Nr. 4,683,195 und 4,632,202 von Mullis
ist, sowie andere derzeit im Stand der Technik bekannte Verbesserungen.
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Die
TADG-14-cDNA ist 1343 Basenpaare lang (SEQ ID NO: 6) und codiert
für ein
Protein mit 260 Aminosäuren
(SEQ ID NO: 7). Die Verfügbarkeit des
TADG-14-Gens eröffnet
den Weg für
eine Anzahl von Untersuchungen, die zu verschiedenen Anwendungen
führen
können.
Liegt beispielsweise das TADG-19-Gen einer spezifischen menschlichen
genetischen Erkrankung zugrunde, kann die cDNA als Basis für einen
diagnostischen Prognosetest dienen.
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Erfindungsgemäß können übliche molekularbiologische,
mikrobiologische und rekombinante DNA-Techniken, die einem Fachmann
bekannt sind, eingesetzt werden. Derartige Techniken sind in der Literatur
vollständig
beschrieben. Siehe beispielsweise Maniatis, Fritsch & Sambrook, „Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (1982); „DNA Cloning: A Practical
Approach", Bände I und
II (D.N. Glover Hrsg. 1985); „Oligonucletide
Synthesis" (M.J.
Gait Hrsg. 1989); „Nucleic
Acid Hybridization" [B.D.
Hames & S.J.
Higgins Hrsg. (1985)]; „Transcription
and Translation" [B.D.
Hames & S. J.
Higgins Hrsg. (1984)]; „Animal
Cell Culture" [R.I.
Freshney, Hrsg. (1986)]; „Immobilized
Cells and Enzymes" [IRL
Press (1986)]; B. Perbal „A
Practical Guide to Molecular Cloning" (1984).
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Falls
vorliegend verwendet, sind daher die folgenden Ausdrücke wie
nachstehend angegeben definiert.
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Die
vorliegend beschriebene Aminosäure liegt
vorzugsweise in der isomeren „L"-Form vor. Es können jedoch Reste in der isomeren „D"-Form beliebige L-Aminosäurereste
ersetzen, solange die erwünschte
funktionelle Eigenschaft der Immunglobulinbindung im Polypeptid
erhalten bleibt. NH2 bezieht sich auf die
am Aminoterminus eines Polypeptids befindliche Aminogruppe. COOH
bezieht sich auf die am Carboxyterminus eines Polypeptids vorhandene Carboxygruppe.
Zur Einhaltung der Polypeptid-Standardnomenklatur werden die Abkürzungen
für Aminosäuren gemäß J. Biol.
Chem., 243: 3552-59 (1969) verwendet.
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Es
wird darauf hingewiesen, dass sämtliche Aminosäurerestsequenzen
vorliegend durch Formeln dargestellt werden, deren Schreibweise
von Links nach Rechts in der üblichen
Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus vorliegt. Des Weiteren
wird darauf hingewiesen, dass ein Bindestrich am Anfang oder Ende
einer Aminosäurerestsequenz eine
Peptidbindung zu einer weiteren Sequenz mit einer oder mehreren
Aminosäureresten
anzeigt. Die vorstehende Tabelle ist dargestellt, um die Drei-Buchstaben-
und Ein-Buchstaben-Bezeichnungen gegenüberzustellen, die vorliegend
abwechselnd erscheinen können.
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Ein „Replicon" ist ein beliebiges
genetisches Element (z. B. Plasmid, Chromosom, Virus), das als autonome
Einheit bei der DNA-Replikation in vivo wirkt, d. h. zur Replikation
unter der eigenen Kontrolle befähigt
ist.
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Ein „Vektor" ist ein Replicon
wie ein Plasmid, Phage oder Cosmid, mit dem ein weiteres DNA-Segment
verknüpft
werden kann, so dass die Replikation des verknüpften Segments bewirkt wird.
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Ein „DNA-Molekül" bezeichnet die polymere Form
von Desoxyribonukleotiden (Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin)
entweder in der einzelsträngigen
Form oder als doppelsträngige
Helix. Dieser Ausdruck bezieht sich ausschließlich auf die Primär- und Sekundärstruktur
des Moleküls
und schränkt
es nicht auf eine beliebige bestimmte tertiäre Form ein. Somit schließt dieser
Ausdruck doppelsträngige DNA,
die unter anderem in linearen DNA-Molekülen (z. B. Restriktionsfragmenten),
Viren, Plasmiden und Chromosomen zu finden ist, ein. Bei der vorliegenden
Diskussion der Struktur wird gemäß der üblichen Konvention
nur die Sequenz in der 5'- nach 3'-Richtung entlang
des nicht-transkribierten DNA-Strangs (d. h. der Strang mit einer
zur mRNA homologen Sequenz) angegeben.
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Ein „Replikationsursprung" bezieht sich auf diejenigen
DNA-Sequenzen, die an der DNA-Synthese beteiligt sind.
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Eine „codierende
DNA-Sequenz" ist
eine doppelsträngige
DNA-Sequenz, die transkribiert wird und in ein Polypeptid in vivo
translatiert wird, wenn sie der Steuerung durch geeignete Regulationssequenzen
unterliegt. Die Grenzen der codierenden Sequenz werden durch ein
Startcodon am 5'-(Amino-)Terminus
und ein Translationsstoppcodon am 3'-(Carboxyl-)Terminus bestimmt. Eine
codierende Sequenz kann prokaryotische Sequenzen, cDNA aus eukaryotischer
mRNA, genomische DNA-Sequenzen aus eukaryotischer (z. B. Säuger-) DNA
und sogar synthetische DNA-Sequenzen einschließen, ist aber nicht darauf
beschränkt.
Ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz
befindet sich üblicherweise
in 3' zur codierenden
Sequenz.
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Sequenzen
zur Kontrolle der Transkription und Translation sind DNA-Regulationssequenzen wie
Promotoren, Enhancer bzw. Verstärker,
Polyadenylierungssignale, Terminatoren und ähnliche, welche die Expression
einer codierenden Sequenz in einer Wirtszelle gewährleisten.
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Eine „Promotorsequenz" ist eine DNA-Regulationsregion,
die zur Bindung von RNA-Polymerase in
einer Zelle und Initiation der Transkription einer stromabwärts (in
3'-Richtung) befindlichen
codierenden Sequenz befähigt
ist. Zum Zwecke der Definition der vorliegenden Erfindung wird die
Promotorsequenz an ihrem 3'-Terminus durch die
Transkriptionsinitiationsstelle begrenzt, und sie erstreckt sich stromaufwärts (in
5'-Richtung) über die
minimale Anzahl von Basen oder Elementen, die zur Initiation von Transkriptionsspiegeln,
die über
den Hintergrund detektierbar sind, erforderlich sind. Innerhalb
der Promotorsequenz sind eine Transkriptionsinitiationsstelle sowie
Proteinbindungsdomänen
(Konsensussequenzen) vorhanden, die für die Bindung von RNA-Polymerase
verantwortlich sind. Eukaryotische Promotoren enthalten oft aber
nicht immer „TATA"-Boxen und „CAT"-Boxen. Prokaryotische Promotoren enthalten
Shine-Dalgarno-Sequenzen zusätzlich
zu den -10- und -35-Konsensussequenzen.
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Eine „Expressionskontrollsequenz" ist eine DNA-Sequenz,
welche die Transkription und Translation einer anderen DNA-Sequenz
kontrolliert und reguliert. Eine codierende Sequenz befindet sich „unter der
Kontrolle" von Transkriptions-
und Translationskontrollsequenzen in einer Zelle, wenn die RNA-Polymerase
die codierende Sequenz in mRNA transkribiert, welche dann in das
Protein, das durch die codierende Sequenz codiert wird, translatiert
wird.
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Es
kann eine „Signalsequenz" nahe der codierenden
Sequenz vorliegen. Diese Sequenz codiert, N-terminal zum Polypeptid,
ein Signalpeptid, welches der Wirtszelle mitteilt, dass das Polypeptid zur
Zelloberfläche
dirigiert wird oder das Polypeptid in das Medium sezerniert wird,
und dieses Signalpeptid wird von der Wirtszelle abgespalten, bevor
das Protein die Zelle verlässt.
Signalsequenzen können mit
verschiedenen prokaryotischen oder eukaryotischen Proteinen assoziiert
vorliegen.
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Der
Ausdruck „Oligonukleotid", wie vorliegend
in Bezug auf die Sonde der vorliegenden Erfindung verwendet, ist
als ein Molekül
aus zwei oder mehreren Ribonukleotiden, vorzugsweise mehr als drei,
definiert. Seine genaue Größe hängt von
vielen Faktoren ab, die wiederum von der endgültigen Funktion und Verwendung
des Oligonukleotids abhängen.
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Der
Ausdruck „Primer", wie vorliegend
verwendet, bezieht sich auf ein Oligonukleotid, ob natürlich auftretend,
wie in einem gereinigten Restriktionsverdau, oder synthetisch produziert,
das dazu befähigt
ist, als Syntheseinitiationspunkt zu dienen, wenn es Bedingungen
unterworfen wird, durch welche die Synthese eines Primerextensionsprodukts,
das zu einem Nukleinsäurestrang
komplementär
ist, induziert wird, d. h. in Gegenwart von Nukleotiden und einem induzierenden
Mittel wie einer DNA-Polymerase und einer geeigneten Temperatur
und geeignetem pH. Der Primer kann entweder einzelsträngig oder
doppelsträngig
sein und muss ausreichend lang sein, um die Synthese des erwünschten
Extensionsprodukts in Gegenwart des induzierenden Mittels zu starten. Die
genaue Länge
des Primers hängt
von vielen Faktoren, einschließlich
Temperatur, Quelle des Primers und Verwendung des Verfahrens, ab.
Beispielsweise enthält
der Oligonukleotidprimer bei diagnos tischen Anwendungen in Abhängigkeit
von der Komplexität der
Zielsequenz 15 bis 25 oder mehr Nukleotide, obwohl er weniger Nukleotide
enthalten kann.
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Die
vorliegenden Primer sind derart gewählt, dass sie zu verschiedenen
Strängen
einer bestimmten Ziel-DNA-Sequenz „im Wesentlichen" komplementär sind.
Dies bedeutet, dass die Primer ausreichend komplementär sein müssen, um
mit ihren jeweiligen Strängen
zu hybridisieren. Daher braucht die Primersequenz nicht die exakte
Sequenz der Matrize widerzuspiegeln. Beispielsweise kann ein nichtkomplementäres Nukleotidfragment
an das 5'-Ende des
Primers angefügt
werden, wobei der Rest der Primersequenz zu dem Strang komplementär ist. In einer
anderen Ausführungsform
können
nicht-komplementäre
Basen oder längere
Sequenzen mit der Maßgabe
in den Primer eingefügt
werden, dass die Primersequenz eine ausreichende Komplementarität mit der
Sequenz aufweist oder damit hybridisiert und dadurch die Matrize
für die
Synthese des Extensionsprodukts bildet.
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Vorliegend
beziehen sich die Ausdrücke „Restriktionsendonukleasen" und „Restriktionsenzyme" auf Enzyme, von
denen jedes doppelsträngige
DNA in oder nahe bei einer spezifischen Nukleotidsequenz schneidet.
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Eine
Zelle wurde mit exogener oder heterologer DNA „transformiert", wenn derartige
DNA in die Zelle eingeführt
wurde. Die transformierende DNA kann in das Genom der Zelle integriert
(damit kovalent verknüpft)
werden oder auch nicht. In Prokaryoten, Hefen und Säugerzellen
wird die transformierende DNA beispielsweise auf einem episomalen
Element wie einem Plasmid gehalten. Bei eukaryotischen Zellen ist
eine stabil transformierte Zelle eine solche, in welcher die transformierende
DNA in ein Chromosom integriert wurde, so dass sie an die Tochterzellen
durch die Chromosomenreplikation vererbt wird. Diese Stabilität wird durch
die Befähigung
der eukaryotischen Zellen zur Erzeugung von Zelllinien oder Klonen,
die eine Population von Tochterzellen enthalten, welche die transformierende DNA
aufweisen, demonstriert. Ein „Klon" ist eine Zellpopulation,
die sich von einer einzelnen Zelle oder Vorfahr durch Mitose ableitet.
Eine „Zelllinie" ist ein Klon einer
primären
Zelle, die in vitro zu einem stabilen Wachstum für viele Generationen befähigt ist.
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Zwei
DNA-Sequenzen sind „im
Wesentlichen homolog",
wenn mindestens etwa 75 (vorzugsweise mindestens etwa 80% und am
meisten bevorzugt mindestens etwa 90 oder 95%) der Nukleotide über die
definierte Länge
der DNA-Sequenzen übereinstimmen.
Sequenzen, die im Wesentlichen homolog sind, können durch Vergleich der Sequenzen
unter Verwendung von in Sequenzdatenbanken erhältlicher Standardsoft ware oder
in einem Sothern-Hybridisierungsexperiment unter beispielsweise
stringenten Bedingungen, wie sie für das jeweilige System definiert
sind, identifiziert werden. Die Definition geeigneter Hybridisierungsbedingungen
ist einem Fachmann bekannt. Siehe beispielsweise Maniatis et al.,
supra; DNA Cloning, Bände
I & II, supra;
Nucleic Acid Hybridization, supra.
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Eine „heterologe" Region des DNA-Konstrukts
ist ein identifizierbares DNA-Segment
innerhalb eines größeren DNA-Moleküls, das
in der Natur nicht in Assoziation mit dem größeren Molekül zu finden ist. So wird, wenn
die heterologe Region ein Säugergen
codiert, das in üblicher
Weise durch DNA flankiert, welche die genomische Säuger-DNA
im Genom des Quellorganismus nicht flankiert. In einem anderen Beispiel
ist die codierende Sequenz ein Konstrukt, in welchem die codierende
Sequenz selbst in der Natur nicht vorkommt (z. B. eine cDNA, bei
der die genomische codierende Sequenz Introns enthält, oder
synthetische Sequenzen mit vom nativen Gen abweichenden Codons).
Allelvariationen oder natürlicherweise
auftretende Mutationsereignisse ergeben keine wie vorliegend definierte
heterologe DNA-Region.
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Die üblicherweise
für diese
Untersuchungen verwendeten Markierungen sind radioaktive Elemente,
Enzyme, Chemikalien, die fluoreszieren, wenn sie ultraviolettem
Licht ausgesetzt werden, und andere. Es sind eine Anzahl von fluoreszierenden
Stoffen bekannt und können
als Markierungen verwendet werden. Diese schließen beispielsweise Fluorescein, Rhodamin,
Auramin, Texas-Rot, AMCA-Blau und Lucifer-Gelb ein. Ein bestimmtes Detektionsmaterial
ist ein Anti-Kaninchen-Antikörper,
der in Ziegen hergestellt wird, und mit Fluorescein über ein
Isothiocyanat konjugiert ist.
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Proteine
können
auch mit einem radioaktiven Element oder mit einem Enzym markiert
werden. Die radioaktive Markierung kann durch beliebige der derzeit
verfügbaren
Zählverfahren
nachgewiesen werden. Das bevorzugte Isotop kann aus 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I und 186Re ausgewählt werden.
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Enzymmarkierungen
sind in ähnlicher
Weise geeignet und können
durch beliebige der gegenwärtig
verwendeten kolorimetrischen, spektrophotometrischen, fluorospektrophotometrischen,
amperometrischen oder gasometrischen Techniken nachgewiesen werden.
Das Enzym ist mit dem ausgewählten Partikel
bzw. Teilchen durch Reaktion mit Verbrückungsmolekülen wie Carbodiimiden, Diisocyanaten, Glutaraldehyd
und ähnlichen
konjugiert. Viele Enzyme, die in diesen Verfahren verwendet werden
können,
sind bekannt und können
eingesetzt werden. Die bevorzugten sind Peroxidase, β-Glucuronidase, β-Glucosidase, β-D-Galactosidase,
Urease, Glucoseoxidase plus Peroxidase und alkalische Phosphatase.
Es wird beispielhaft auf die U.S.-Patentnummern 3,654,090, 3,850,752
und 4,016,043 hinsichtlich ihrer Offenbarung verschiedener Markierungsstoffe
und -verfahren Bezug genommen.
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Ein
bestimmtes Testsystem, das im Fachgebiet entwickelt und verwendet
wurde, ist als Rezeptortest bekannt. In einem Rezeptortest wird
das zu testende Material in geeigneter Weise markiert, und dann
werden bestimmte Testzellkolonien mit einer Menge der Markierung
beimpft, wonach Bindungsuntersuchungen durchgeführt werden, um das Ausmaß zu bestimmen,
bis zu welchem das markierte Material an die Zellrezeptoren bindet.
Auf diese Weise können
Unterschiede in den Affinitäten
zwischen den Materialien festgestellt werden.
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Ein
im Fachgebiet geeigneter Test ist als „Cis/Trans"-Test bekannt. Kurz beschrieben, verwendet
dieser Test zwei genetische Konstrukte, wobei eines typischerweise
ein Plasmid ist, das einen bestimmten interessierenden Rezeptor
kontinuierlich exprimiert, wenn es in eine geeignete Zelllinie transfiziert
wird, und das zweite ein Plasmid ist, das einen Reporter wie Luciferase
unter Kontrolle eines Rezeptor/Liganden-Komplexes exprimiert. Falls
es beispielsweise erwünscht
ist, eine Verbindung als Ligand eines bestimmten Rezeptors zu bewerten,
wäre eines
der Plasmide ein Konstrukt, das in der Expression des Rezeptors
in der gewählten
Zelllinie resultiert, während
das zweite Plasmid das Luciferasegen verknüpft mit einem Promotor aufweisen
würde,
in welches das Reaktionselement auf den jeweiligen Rezeptor eingefügt ist.
Falls die zu testende Verbindung ein Agonist des Rezeptors ist,
bildet der Ligand einen Komplex mit dem Rezeptor, und der resultierende
Komplex bindet das Reaktionselement und initiiert die Transkription
des Luciferasegens. Dann wird die resultierende Chemilumineszenz
photometrisch gemessen, und es werden Dosis-Antwort-Kurven erhalten
und mit denjenigen von bekannten Liganden verglichen. Das vorstehende
Protokoll wird im Einzelnen im U.S.-Patent Nr. 9,981,784 beschrieben.
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Wie
vorliegend verwendet, bedeutet der Ausdruck „Wirt" nicht nur Prokaryoten sondern auch Eukaryoten
wie Hefe-, Pflanzen- und Tierzellen. Ein rekombinantes DNA-Molekül oder Gen,
das ein humanes TADG-14-Protein der vorliegenden Erfindung codiert,
kann zur Transformation eines Wirts unter Verwendung beliebiger
einem Fachmann bekannter üblicher
Techniken verwendet werden. Für
die Zwecke der prokaryotischen Transformation ist die Verwendung
eine Vektors, der die codierenden Sequenzen für das Gen, welches ein humanes TAGD-14-Protein
der vorliegenden Erfindung codiert, enthält, besonders bevorzugt.
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Prokaryotische
Wirte können
E. coli, S. tymphimurium, Serratia marcescens und Bacillus subtilis einschließen. Eukaryotische
Wirte schließen
Hefen wie Pichia pastoris, Säugerzellen
und Insektenzellen ein.
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Im
Allgemeinen werden Expressionsvektoren, die Promotorsequenzen enthalten,
welche die wirksame Transkription des eingefügten DNA-Fragments erleichtern,
zusammen mit dem Wirt verwendet. Der Expressionsvektor enthält typischerweise
einen Replikationsursprung, einen oder mehrere Promotor(en), ein
oder mehrere Terminator(en) sowie spezifische Gene, die zur Bereitstellung
einer phänotypischen
Selektion in transformierten Zellen befähigt sind. Die transformierten
Wirte können
gemäß im Fachgebiet
bekannter Mittel fermentiert und kultiviert werden, um ein optimales
Zellwachstum zu erreichen.
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Die
Erfindung umfasst eine im Wesentlichen reine DNA, die für ein TADG-14-Protein codiert,
wobei ein Strang dieser DNA bei hoher Stringenz mit einer Sonde
hybridisiert, die eine Sequenz mit mindestens 15 aufeinanderfolgenden
Nukleotiden von (SEQ ID NO: 6) enthält. Das durch die DNA dieser
Erfindung codierte Protein kann mindestens 80% Sequenzidentität (vorzugsweise
85%, mehr bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt 95%) mit den in 6 angegebenen
Aminosäuren
(SEQ ID NO: 7) aufweisen. Mehr bevorzugt schließt die DNA die codierende Sequenz
der Nukleotide von 6 (SEQ ID NO: 6) oder eine degenerative
Variante einer derartigen Sequenz ein.
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Die
Sonde, mit der die erfindungsgemäße DNA hybridisiert,
besteht vorzugsweise aus einer Sequenz von mindestens 20 aufeinanderfolgenden
Nukleotiden, mehr bevorzugt 40 Nukleotiden, noch mehr bevorzugt
50 Nukleotiden und am meisten bevorzugt 100 Nukleotiden oder mehr
(bis zu 100%) der codierenden Sequenz der in 6 angegebenen Nukleotide
(SEQ ID NO: 6) oder dem Komplement davon. Eine derartige Sonde ist
zum Nachweis der Expression von TADG-14 in einer humanen Zelle durch
ein Verfahren geeignet, das die Schritte (a) In-Kontakt-Bringen
von aus der Zelle erhaltener mRNA mit der markierten Hybridisierungssonde
und (b) Detektieren der Hybridisierung der Sonde mit der mRNA einschließt.
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Diese
Erfindung schließt
auch eine im Wesentlichen reine DNA ein, die eine Sequenz von mindestens
15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden (vorzugsweise 20, mehr bevorzugt
30, noch mehr bevorzugt 50 und am meisten bevorzugt sämtliche)
der Region von Nukleotid 1 bis 1343 der in 6 gezeigten Nukleotide
(SEQ ID NO: 6) enthält.
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„Hohe Stringenz" bedeutet DNA-Hybridisierungs-
und Waschbedingungen, die durch eine hohe Temperatur und geringe
Salzkonzentration, z. B. Waschbedingungen bei 65°C bei einer Salzkonzentration
von ungefähr
0,1 x SSC, oder dem funktionellen Äquivalent davon, gekennzeichnet
sind. Beispielsweise können
Bedingungen hoher Stringenz eine Hybridisierung bei etwa 42°C in Gegenwart
von etwa 50% Formamid, einem ersten Waschschritt bei etwa 65°C mit etwa
2 x SSC, enthaltend 1 SDS, gefolgt von einem zweiten Waschschritt
bei etwa 65°C mit
etwa 0,1 x SSC, einschließen.
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„Im Wesentlichen
reine DNA" bedeutet
DNA, die aufgrund einer Reinigung (teilweiser oder vollständiger Aufreinigung)
von einigen oder allen Molekülen
in diesem Milieu oder aufgrund der Veränderung von Sequenzen, welche
die beanspruchte DNA flankieren, nicht Teil eines Milieus ist, in
welchem die DNA natürlicherweise
auftritt. Der Ausdruck schließt daher
beispielsweise eine rekombinante DNA, die in einen Vektor, in ein
autonom replizierendes Plasmid oder Virus, oder in die genomische
DNA eines Prokaryoten oder Eukaryoten eingefügt ist, oder die als getrenntes
Molekül
(z. B. eine cDNA oder ein genomisches oder cDNA-Fragment, die/das
durch Polymerasekettenreaktion (PCR) oder Restriktionsendonukleaseverdau)
unabhängig
von anderen Sequenzen existiert, ein. Er schließt ebenfalls eine rekombinante DNA
ein, die Teil eines Hybridgens ist, das eine zusätzliche Polypeptidsequenz,
z. B. ein Fusionsprotein, codiert. Ebenfalls eingeschlossen ist
eine rekombinante DNA, die einen Teil der in 6 gezeigten Nukleotide
(SEQ ID NO: 6) einschließt,
die eine alternative Spleißvariante
von TADG-14 codiert.
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Die
DNA kann mindestens etwa 70% Sequenzidentität mit der codierenden Sequenz
der in 6 angegebenen Nukleotide (SEQ ID NO: 6), vorzugsweise
mindestens 75 (z. B. mindestens 80%) und am meisten bevorzugt mindestens
90% aufweisen. Die Identität
zwischen zwei Sequenzen ist eine unmittelbare Funktion der Anzahl
von übereinstimmenden
oder identischen Positionen. Wenn eine Unterposition in beiden der
zwei Sequenzen von der gleichen monomeren Untereinheit besetzt wird,
z. B. falls eine gegebene Position in beiden DNA-Molekülen durch
Adenin besetzt wird, sind diese an dieser Position identisch. Falls
beispielsweise sieben Positionen in einer Sequenz mit einer Länge von
10 Nukleotiden mit den entsprechenden Positionen in einer zweiten
Sequenz mit 10 Nukleotiden identisch sind, weisen diese zwei Sequenzen
eine Sequenzidentität von
70% auf. Die Länge
von Vergleichssequenzen beträgt
im Allgemeinen mindestens 50 Nukleotide, vorzugsweise mindestens
60 Nukleotide, mehr bevorzugt mindestens 75 Nukleotide und am meisten bevorzugt
100 Nukleotide. Die Sequenzidentität wird typischerweise unter
Verwen dung einer Sequenzanalyse-Software (z. B. Sequence Analysis
Software Package der Genetics Computer Group, University of Wisconsin
Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53605)
gemessen.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst einen Vektor, der eine DNA-Sequenz
enthält,
die ein humanes TADG-14-Protein codiert, und wobei der Vektor zur
Replikation in einem Wirt befähigt
ist, umfassend in funktionsfähiger
Verknüpfung:
a) einen Replikationsursprung, b) einen Promotor und c) eine für das Protein
codierende DNA-Sequenz. Vorzugsweise enthält der erfindungsgemäße Vektor
einen Teil der in SEQ ID NO: 6 gezeigten DNA-Sequenz. Ein „Vektor" kann als ein replizierbares
Nukleinsäurekonstrukt,
z. B. ein Plasmid oder eine virale Nukleinsäure, definiert werden. Vektoren
können
zur Amplifikation und/oder Expression einer Nukleinsäure, die
das TADG-14-Protein codiert, verwendet werden. Ein Expressionsvektor
ist ein replizierbares Konstrukt, in welchem eine ein Polypeptid
codierende Nukleinsäuresequenz
in funktionsfähiger
Weise mit geeigneten Kontrollsequenzen verknüpft ist, die zur Bewirkung der
Expression des Polypeptids in einer Zelle befähigt sind. Der Bedarf nach
derartigen Kontrollsequenzen hängt
von der gewählten
Zelle und dem ausgewählten
Transformationsverfahren ab. Allgemein schließen Kontrollsequenzen einen
Transkriptionspromotor und/oder -verstärker bzw. -enhancer, geeignete
mRNA-Ribosomen-Bindungsstellen und Sequenzen, welche die Termination
von Transkription und Translation steuern, ein. Es können einem
Fachmann bekannte Verfahren zur Konstruktion von Expressionsvektoren,
die geeignete transkriptionelle und translationelle Kontrollsignale
enthalten, verwendet werden. Siehe beispielsweise die in Sambrook
et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Aufl.),
Cold Spring Harbor Press, N.Y., beschriebenen Techniken. Ein Gen
und seine Transkriptionskontrollsequenzen sind als „in funktionsfähiger Weise verknüpft" definiert, wenn
die Transkriptionskontrollsequenzen in wirksamer Weise die Transkription
des Gens steuern. Vektoren der Erfindung schließen Plasmidvektoren und virale
Vektoren ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Bevorzugte virale Vektoren der
Erfindung sind diejenigen, die von Retroviren, Adenoviren, Adeno-assoziierten
Viren, SV40-Virus oder Herpesviren abgeleitet sind.
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Ein „im Wesentlichen
reines Protein" bedeutet
ein Protein, das mindestens von einigen von denjenigen Komponenten
getrennt wurde, welche es natürlicherweise
begleiten. Typischerweise ist das Protein im Wesentlichen rein,
wenn es zu mindestens 60 Gew.-% frei von den Proteinen und anderen
natürlicherweise
auftretenden organischen Molekülen,
mit denen es natürlicherweise
in vivo assoziiert ist, frei ist. Vorzugsweise beträgt die Reinheit
der Präparation
mindestens 75%, mehr bevorzugt mindestens 90% und am meisten bevorzugt
99%, bezogen auf das Gewicht. Ein im Wesentlichen reines TADG-14-Protein
kann beispielsweise durch Extraktion aus einer natürlichen
Quelle, durch Expression einer rekombinanten Nukleinsäure, die
ein TADG-14-Polypeptid codiert, oder durch chemische Synthese des
Proteins erhalten werden. Die Reinheit kann durch ein beliebiges
geeignetes Verfahren, z. B. Säulenchromatographie,
wie Immunaffinitätschromatographie
unter Verwendung eines für
TADG-14 spezifischen Antikörpers,
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
oder HPLC-Analyse bestimmt werden. Ein Protein ist im Wesentlichen
frei von natürlicherweise
damit assoziierten Komponenten, wenn es von mindestens einigen dieser
Verunreinigungen, die es in seinem natürlichen Zustand begleiten,
getrennt ist. Somit ist ein Protein, das chemisch synthetisiert
wird oder in einem zellulären
System produziert wird, das sich von der Zelle unterscheidet, aus
dem es natürlicherweise
stammt, definitionsgemäß im Wesentlichen
frei von seinen natürlicherweise
assoziierten Komponenten. Demgemäß schließen im Wesentlichen
reine Proteine eukaryotische Proteine ein, die in E. coli oder anderen
Prokaryoten oder beliebigen anderen Organismen, in welchen sie natürlicherweise nicht
auftreten, synthetisiert sind, ein.
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Zusätzlich zu
im Wesentlichen vollständigen Proteinen
schließt
die Erfindung auch Fragmente (z. B. antigene Fragmente) des TADG-14-Proteins
(SEQ ID NO: 7) ein. Wie vorliegend verwendet, enthält ein „Fragment", angewendet auf
ein Polypeptid, üblicherweise
mindestens 10 Reste, typischerweise mindestens 20 Reste und vorzugsweise
mindestens 30 (z. B. 50) Reste, jedoch weniger als die vollständige, intakte
Sequenz. Fragmente des TADG-14-Proteins können durch einem Fachmann bekannte
Verfahren, z. B. durch enzymatischen Verdau des natürlicherweise
auftretenden oder rekombinanten TADG-14-Proteins, durch rekombinante
DNA-Techniken unter
Verwendung eines Expressionsvektors, der ein definiertes Fragment
von TADG-14 codiert, oder durch chemische Synthese erzeugt werden.
Die Befähigung
eines Kandidatenfragments zur Ausübung einer charakteristischen
Eigenschaft von TADG-14 (z. B. Bindung an einen für TADG-14
spezifischen Antikörper)
kann durch vorliegend beschriebene Verfahren festgestellt werden.
Gereinigtes TADG-14 oder antigene Fragmente von TADG-14 können zur
Erzeugung neuer Antikörper
oder zum Testen existierender Antikörper (z. B. als Positivkontrollen
in einem diagnostischen Test) durch Verwendung von einem Fachmann
bekannten Standardprotokollen verwendet werden. In der vorliegenden
Erfindung sind polyklonale Antiseren eingeschlossen, die unter Verwendung
von TADG-14 oder einem Fragment von TADG-14 als Immunogen beispielsweise
in Kaninchen erzeugt werden. Es werden Standardprotokolle zur Herstellung
monoklonaler und polyklonaler Antikörper, die einem Fachmann bekannt sind,
verwendet. Die durch dieses Verfahren hergestellten monoklonalen
Antikörper
können
hinsichtlich ihrer Befähigung
zur Identifizierung rekombinanter TADG-14-cDNA-Klone und zu deren
Unterscheidung von bekannten cDNA-Klonen gescreent werden.
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Des
Weiteren sind in dieser Erfindung TADG-14-Proteine eingeschlossen,
die mindestens teilweise von Teilen der SEQ ID NO: 7 codiert werden,
z. B. Produkte der alternativen mRNA-Spleißung oder alternativer Proteinprozessierungsereignisse,
oder in welchen ein Abschnitt der TADG-19-Sequenz deletiert wurde.
Das Fragment oder das intakte TADG-14-Polypeptid kann mit einem anderen
Polypeptide, das z. B. als Markierung, Ligand oder Mittel zur Erhöhung der
Antigenizität
dient, kovalent verknüpft
werden.
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Die
Erfindung schließt
auch einen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper ein, der spezifisch an
TADG-19 bindet. Die Erfindung schließt nicht nur einen intakten
monoklonalen Antikörper,
sondern auch ein immunologisch wirksames Antikörperfragment, z. B. ein Fab-
oder (Fab)2-Fragment, ein künstliches
Einzelketten-FV-Molekül oder ein
chimeres Molekül,
z. B. einen Antikörpers,
der die Bindungsspezifität
eines Antikörper,
z. B. aus der Maus, und die verbleibenden Teile eines anderen Antikörpers, z. B.
aus Mensch, enthält,
ein.
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In
einer Ausführungsform
kann der Antikörper
oder ein Fragment davon mit einem Toxin oder mit einer detektierbaren
Markierung, z. B. einer radioaktiven Markierung, einer nicht-radioaktiven
Isotop-Markierung, Fluoreszenzmarkierung, Chemilumineszenzmarkierung,
paramagnetischen Markierung, Enzymmarkierung oder kolorimetrischen
Markierung, verknüpft
sein. Beispiele geeigneter Toxine schließen das Diphtherietoxin, Pseudomonas
Exotoxin A, Ricin und das Choleratoxin ein. Beispiele geeigneter
Enzymmarkierungen schließen
Malathydrogenase, Staphylococcusnuklease, Delta-5-Steroid-Isomerase, Alkoholdehydrogenase,
alpha-Glycerinphosphatdehydrogenase,
Triosephosphatisomerase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase,
Glucoseoxidase, beta-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase,
Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase, Acetylcholinesterase
usw. ein. Beispiele geeigneter Radioisotopmarkierungen schließen 3H, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C usw. ein.
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Paramagnetische
Isotope zum Zwecke der In-vivo-Diagnose können gemäß den Verfahren der vorliegenden
Erfindung ebenfalls verwendet werden. Es gibt viele Beispiele von
Elementen, die für
die magnetische Resonanzbildgebung geeignet sind. Hinsichtlich Diskussionen
der magnetischen In-vivo-Resonanzbildgebung siehe beispielsweise
Schaefer et al., (1989) JACC 14, 472-480, Shreve et al., (1986) Magn.
Reson. Med. 3, 336-340, Wolf, G.L., (1984) Physiol. Chem. Phys.
Med. NMR 16, 93-95, Wesbey et al., (1984) Physiol. Chem. Phys. Med.
NMR 16, 145-155, Runge et al. (1984) Invest. Radiol., 19, 408-915.
Beispiele geeigneter Fluoreszenzmarkierungen schließen eine
Fluoresceinmarkierung, eine Isothiocyalatmarkierung, eine Rhodaminmarkierung, eine
Phycoerythrinmarkierung, eine Phycocyaninmarkierung, eine Allophycocyaninmarkierung,
eine Ophthaldehydmarkierung, eine Fluorescaminmarkierung usw. ein.
Beispiele von Chemilumineszenzmarkierungen schließen eine
Luminalmarkierung, eine Isoluminalmarkierung, eine Markierung mit
einem aromatischen Acridiniumester, eine Imidazolmarkierung, eine
Acridiniumsalzmarkierung, eine Oxalatestermarkierung, eine Luciferinmarkierung,
eine Luciferasemarkierung, eine Aequorinmarkierung usw. ein.
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Ein
Fachmann kennt weitere geeignete Markierungen, die gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können.
Die Bindung dieser Markierungen an Antikörper oder Fragmenten davon kann
unter Verwendung von Standardtechniken, die einem Fachmann bekannt
sind, erreicht werden. Typische Techniken sind von Kennedy et al.,
(1976) in Clin. Chim. Acta 70, 1-31, und von Schurs et al., (1977)
in Clin., Chim. Acta 81, 1-40, beschrieben. In Letzterem erwähnte Kopplungstechniken
sind das Glutaraldehydverfahren, das Periodatverfahren, das Dimaleinimidverfahren,
das m-Maleimidobenzyl-N-hydroxysuccinimidester-Verfahren.
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Die
Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis des TADG-14-Proteins
in einer biologischen Probe bereit, welches die Schritte des In-Kontakt-Bringens
der Probe mit dem markierten Antikörper, z. B. einem für TADG-14
spezifischen radioaktiv markierten Antikörper, und Bestimmen, ob der
Antikörper
an eine Komponente der Probe bindet, einschließt.
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Wie
vorliegend beschrieben, stellt die Erfindung eine Anzahl diagnostischer
Vorteile und Verwendungen bereit. Beispielsweise ist das TADG-14-Protein
für die
Diagnose von Krebs in verschiedenen Geweben geeignet, da dieses
Protein in hoch proliferativen Zellen fehlt. Antikörper (oder
Antigen bindende Fragmente davon), die an ein für TADG-14 spezifisches Epitop
binden, sind in einem Verfahren zum Nachweis des TADG-19-Proteins
in einer biologischen Probe zur Diagnose einer cancerogenen oder
neoplastischen Transformation geeignet. Dieses Verfahren schließt die Schritte
des Gewinnens einer biologischen Probe (z. B. Zellen, Blut, Gewebe
usw.) aus einem Patienten mit Verdacht auf Krebs, In-Kontakt-Bringen der Probe
mit einem markierten Antikörper
(z. B. einem radioaktiv markiertem Antikörper), der für TADG-14
spezifisch ist, und Detektieren des TADG-14-Proteins unter Verwendung von Standardimmuntesttechniken,
wie einem ELISA, ein. Die Antikörperbindung
an die biologische Probe zeigt an, dass die Probe eine Komponente
enthält, die
spezifisch an ein Epitop in TADG-14 bindet.
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In ähnlicher
Weise kann ein Northern-Blot-Standardtest verwendet werden, um die
relativen Mengen von TADG-14-mRNA in einer Zelle oder einem Gewebe,
die/das von einem Patienten mit Verdacht auf Krebs erhalten wird,
gemäß üblichen
Northern-Hybridisierungstechniken,
die einem Fachmann bekannt sind, zu bestimmen. Dieser Northern-Test
verwendet eine Hybrisierungssonde, z. B. radiomarkierte TADG-14-cDNA, die entweder
die vollständige
einzelsträngige
DNA mit einer zur SEQ ID NO: 6 (6) komplementären Sequenz
oder ein Fragment dieser DNA-Sequenz mit einer Länge von mindestens 20 (vorzugsweise
mindestens 30, mehr bevorzugt mindestens 50, am meisten bevorzugt mindestens
100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden) enthält. Die DNA-Hybridisierungssonde
kann durch beliebige der vielen verschiedenen, einem Fachmann bekannten
Verfahren markiert werden.
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Antikörper gegen
das TADG-14-Protein können
in einem Immuntest zur Bestimmung erhöhter TADG-14-Proteinexpressionsspiegel
in Geweben mit Verdacht auf neoplastische Transformation verwendet
werden. Die gleichen Verwendungen können mit Northern-Blot-Tests
und -Analysen erreicht werden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine DNA, die ein TADG-14-Protein
codiert, ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus (a) isolierter DNA, die ein TADG-14-Protein codiert,
(b) isolierter DNA, die mit vorstehender isolierter DNA von (a)
hybridisiert und die ein TADG-14-Protein codiert, und (c) isolierter DNA,
die sich von den vorstehenden isolierten DNAs von (a) und (b) aufgrund
der Degeneration des genetischen Codes in der codierenden Sequenz
unterscheidet, und die ein TADG-14-Protein codiert. Vorzugsweise
weist die DNA die in SEQ ID NO: 6 gezeigte Sequenz auf. Mehr bevorzugt
codiert die DNA ein TADG-14-Protein mit der Aminosäuresequenz, die
in SEQ ID NO: 7 gezeigt ist.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls einen Vektor, der zur Expression
der DNA der vorliegenden Erfindung, angepasst zur Expression in
einer rekombinanten Zelle, befähigt
ist und für
die Expression der DNA in der Zelle erforderliche Regulationselemente
aufweist. Vorzugsweise enthält
der Vektor DNA, die für
ein TADG-19-Protein mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:
7 gezeigt ist, codiert.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, die mit dem
vorliegend beschriebenen Vektor transfiziert ist, wobei der Vektor
ein TADG-14-Protein exprimiert. Repräsentative Wirtszellen schließen Bakterienzellen,
Säugerzellen
und Insektenzellen ein.
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Die
vorliegenden Erfindung betrifft auch ein isoliertes und gereinigtes
TADG-14-Protein,
das von einer DNA codiert wird, das aus der Gruppe, bestehend aus
(a) isolierter DNA, die ein TADG-19-Protein codiert, (b) isolierter
DNA, die mit der vorstehenden isolierten DNA von (a) hybridisiert
und die ein TADG-14-Protein codiert, und (c) isolierter DNA, die sich
von den vorstehenden isolierten DNAs von (a) und (b) aufgrund der
Degeneration des genetischen Codes in der codierenden Sequenz unterscheidet und
die ein TADG-14-Protein codiert, ausgewählt ist. Vorzugsweise weist
das isolierte und gereinigte TADG-14-Protein nach Anspruch 9 die
in SEQ ID NO: 7 gezeigte Aminosäuresequenz
auf.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis der
Expression des Proteins nach Anspruch 1, umfassend die Schritte:
(a) In-Kontakt-Bringen von mRNA, die aus der Zelle erhalten wurde,
mit der markierten Hybridisierungssonde und (b) Detektieren der
Hybridisierung der Sonde mit der mRNA.
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Die
nachfolgenden Beispiele sind zum Zwecke der Veranschaulichung verschiedener
Ausführungsformen
der Erfindung angegeben und schränken
die vorliegende Erfindung in keiner Weise ein.
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BEISPIEL 1
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Gewebegewinnung und -lagerung
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Nach
der Entfernung der Gebärmutter,
bilateraler Salpingo-Oophorektomie oder operativer Entfernung des
neoplastischen Gewebes der Patientin wurde die Prone erfasst und
eisgekühlt.
Die Probe wurde dann dem örtlichen
Pathologen zur Isolierung und Identifizierung spezifischer Gewebeproben übergeben.
Schließlich
wurde die Probe in flüssigem Stickstoff
eingefroren, in die Labordaten aufgenommen und bei –80°C gelagert.
Zusätzliche
Proben wurden regelmäßig vom
Cooperative Human Tissue Network (CHTN) erhalten. Diese Proben wurden
von der CHTN präpariert
und uns auf Eis zugesandt. Nach der Ankunft wurden diese Proben
in die Labordaten aufgenommen und bei –80°C gelagert.
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BEISPIEL 2
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mRNA-Isolierung und cDNA-Synthese
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Die
Isolierung von Boten-RNA (mRNA) wurde unter Verwendung des von Becton
Dickinson (Kat. # 30039) erhaltenen Mini RiboSepTM Ultra mRNA-Isolierungskits
gemäß den Angaben
des Herstellers durchgeführt.
Dieses war ein auf der Oligo(dt)-Chromatographie
beruhendes mRNA-Isolierungssystem. Die gewonnene mRNA-Menge wurde durch
UV-Spektrophotometrie quantifiziert.
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Der
erste Strang der komplementären
DNA (cDNA) wurde unter Verwendung von 5,0 mg mRNA und entweder Zufallshexamer-
oder Oligo(dT)-Primern gemäß dem Protokoll
des Herstellers unter Verwendung eines Erststransynthesekits von
Clontech (Kat. # K1402-1) synthetisiert. Die Reinheit der cDNA wurde
mittels PCR unter Verwendung von für das p53-Gen spezifischen
Primern bewertet. Diese Primer erfassen ein Intron, so dass reine
cDNA von mit genomischer DNA kontaminierter cDNA unterschieden werden
kann.
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BEISPIEL 3
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PCR-Reaktionen
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Die
Reaktionen wurden wie folgt durchgeführt: Erststrang-cDNA, ausgehend
von 50 ng mRNA, wurde als Matrize in Gegenwart von 1,0 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,025 U Taq-Polymerase/ml der
Reaktion und mit dem Enzym geliefertem 1x Puffer verwendet. Außerdem wurden
Primer zu der PCR-Reaktion gegeben. Degenerierte Primer, die verschiedene
cDNAs amplifizieren, wurden jeweils bei einer Endkonzentration von
2,0 mM verwendet, während
spezifische cDNAs amplifizierende Primer jeweils bis auf eine Endkonzentration
von 0,2 mM zugegeben wurden.
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Nach
anfänglicher
Denaturierung bei 95°C für 3 Minuten,
wurden 30 PCR-Zyklen in einem Gene Amp 2400 Thermocycler von Perkin
Elmer durchgeführt.
Jeder Zyklus bestand aus 30 Sekunden Denaturierung bei 95°C, 30 Sekunden
Primer-Anlagerung bei der geeigneten Anlagerungstemperatur* und
30 Sekunden Extension bzw. Verlängerung
bei 72°C.
Im Endzyklus wurde eine Verlängerung
bei 72°C
für 7 Minuten
durchgeführt.
Um sicherzustellen, dass die Reaktion erfolgreich war, wird eine
Fraktion des Gemischs auf einem 2% Agarose/TAE-Gel, gefärbt mit Ethidiumbromid
(Endkonzentration 1 mg/ml), elektrophoretisiert. Die Anlagerungstemperatur
hing von den in der PCR-Reaktion verwendeten Primern ab. Bei Reaktionen
mit degenerierten Primern wurde eine Anlagerungstemperatur von 48°C verwendet. Die
geeignete Anlagerungstemperatur für die TADG14- und β-Tubulin-spezifischen
Primer betrug 62°C.
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BEISPIEL 4
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T-Vektor-Ligation und
Transformationen
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Die
gereinigten PCR-Produkte wurden in das T-Vektorplasmid von Promega
ligiert, und die Ligationsprodukte wurden zur Transformation kompetenter JM109-Zellen
gemäß den Angaben
des Herstellers (Promega Kat. # A3610) verwendet. Positive Kolonien
wurden für
die Amplifikation kultiviert, die Plasmid-DNA wurde mittels des
WizardTM Miniprep DNA-Reinigungssystems (Promega Kat. # A7500) isoliert,
und die Plasmide wurden mit den Restriktionsenzymen ApaI und SacI
zur Bestimmung der Größe des Inserts
verdaut. Plasmide mit Inserts der Größe(n), die bei der vorstehend
beschriebenen Gel-Elektrophorese der PCR-Produkte sichtbar waren,
wurden sequenziert.
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BEISPIEL 5
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DNA-Sequenzierunq
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Unter
Verwendung eines nahe der Klonierungsstelle Plasmid-spezifischen
Primers wurden Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung des PRISMTM
Ready Reaction Dye DeoxyTM Terminators (Applied Biosystems Kat.
# 401384) gemäß den Angaben
des Herstellers durchgeführt. Überschüssige Farbterminatoren
wurden aus der vervollständigten
Sequenzierungsreaktion unter Verwendung einer Centri-sepTM-Zentrifugationssäule (Princeton
Separation Kat. # CS-901) entfernt. Es war ein DNA-Sequenzierungssystem
Modell 373A von Applied Biosystems verfügbar, und es wurde für die Sequenzanalyse
verwendet. Aufgrund der bestimmten Sequenz wurden Primer, die das
interessierende Gen spezifisch amplifizieren, entworfen und synthetisiert.
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BEISPIEL 6
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Northern-Blot-Analyse
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mRNAs
(ungefähr
5 mg) wurden durch Elektrophorese in einem 1,2% Agarose-Gel mit
6,3% Formaldehyd in 0,02 M MOPS, 0,05 M Natriumacetat (pH 7,0) und
0,001 M EDTA nach der Größe getrennt. Die
mRNAs wurden dann durch Kapillarkraft in 20x SSPE auf Hybond-N (Amersham)
geblottet. Die RNAs wurden durch Backen für 2 Stunden bei 80°C auf der
Membran fixiert. Zusätzliche
Northern-Blots multipler Gewebe (MTN)-Blots wurden von CLONTECH
Laboratories, Inc., erhalten. Diese Blots schlossen den humanen
MTN-Blot (Kat. # 7760-1), den humanen MTN-II-Blot, (Kat. # 7759-1),
den humanen fötalen
MTN-II-Blot (Kat. # 7756-1) und den humanes Gehirn MTN-III-Blot
(Kat. # 7750-1) ein. Die geeigneten Sonden wurden unter Verwendung
des von Promega erhältlichen
Prime-a-Gene Markierungssystems (Kat. # U1100) radiomarkiert. Die
Blots wurden hybridisiert und gemäß des ExpressHyb Hybridization
Solution Protokolls, das von CLONTECH (Kat. # 8015-1 oder 8015-2)
erhältlich
ist, gestrippt.
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BEISPIEL 7
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Quantitative PCR
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Es
wurde eine quantitative PCR in einem Reaktionsgemisch, bestehend
aus ausgehend von 50 ng mRNA erhaltener cDNA, 5 pmol Sense- und
Antisense-Primern für
TADG14 und die interne Kontrolle β-Tubulin,
0,2 mmol dNTPs, 0,5 mCi [α-32P]dCTP und
0,625 U Taq-Polymerase in 1x Puffer in einem Endvolumen von 25 ml,
durchgeführt.
Dieses Gemisch wurde einer Denaturierung bei 95°C für 1 Minute unterworfen, gefolgt
von 30 Zyklen Denaturierung für
30 Sekunden bei 95°C,
30 Sekunden Anlagerung bei 62°C
und 1 Minute Verlängerung
bei 72°C mit
zusätzlichen
7 Minuten Verlängerung
im letzten Zyklus. Das Produkt wurde in einem 2b-Agarosegel zur
Auftrennung elektrophoretisiert, das Gel wurde unter Vakuum getrocknet
und autoradiographiert. Die relative Radioaktivität jeder
Bande wurde mit dem PhosphoImager von Molecular Dynamics bestimmt.
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BEISPIEL 8
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung von auf die konservierten
Bereiche der Serinprotease gerichteten Primern zur Identifizierung von
Mitgliedern dieser Klasse, die in Karzinomen überexprimiert werden. Einige
Gene wurden in anderen Geweben identifiziert und kloniert, jedoch
zuvor nicht mit dem Ovarkarzinom in Zusammenhang gebracht. Die vorliegende
Erfindung beschreibt eine neue, im Ovarkarzinom identifizierte Protease.
Dieses Gen wurde unter Verwendung von Primern identifiziert, die
auf den konservierten Bereich gerichtet waren, der die Aminosäure Histidin
in der katalytischen Domäne
und die Aminosäure
Serin in der katalytischen Domäne,
die sich etwa 150 Aminosäuren stromabwärts zum
Carboxylende hin befindet, umgibt.
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Das
die neue extrazelluläre
Serinprotease der vorliegenden Erfindung codierende Gen wurde aus
einer Gruppe von im Karzinom überexprimierter Proteasen
durch Subklonierung und Sequenzierung geeigneter PCR-Produkte identifiziert.
Ein Beispiel einer derartigen PCR-Reaktion ist in der 1 gezeigt.
Die Subklonierung und Sequenzierung einzelner Banden aus einer derartigen
Amplifikation stellte die Grundlage zur Identifizierung der neuen
Protease der vorliegenden Erfindung bereit.
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BEISPIEL 9
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Die
für die
katalytische Domäne
für TADG-14 bestimmte
Sequenz ist in der 2 dargestellt, und sie stimmt
mit anderen Serinproteasen überein
und enthält
spezifische konservierte Aminosäuren,
die für die
katalytische Domäne
der Familie der Serinproteasen charakteristisch sind. Es wurden
spezifische Primer (20mere), die von dieser Sequenz abgeleitet sind,
verwendet.
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Es
wurden eine Reihe normaler und Tumor-cDNAs untersucht, um die Expression
des TADG-14-Proteins zu bestimmen. Bei einer Reihe von neun Karzinomen
im Vergleich zu drei normalen unter Verwendung von β-Tubulin
als interne Kontrolle für
die PCR-Amplifikation war TADG-14 in acht der neun Karzinomen überexprimiert,
und es wurde entweder nicht oder mit einem sehr geringen Gehalt
in normalem epithelialem Gewebe nachgewiesen (3).
Diese Untersuchung wurde auf eine Standardreihe mit etwa 35 Tumoren
ausgedehnt. Unter Verwendung dieser spezifischen Primer wurde die Expression
dieses Gens auch sowohl in Tumorzelllinien als auch anderen Tumorgeweben,
wie in 9 gezeigt, untersucht. Die
Expression von TADG-14 wurde ebenfalls in Brustkarzinom und Kolonkarzinom beobachtet.
Es wurde keine TADG-14-Expression in anderen Geweben festgestellt.
Beispielsweise wurden keine TADG-14-Spiegel mittels Northern-Blot-Analyse
in irgendeinem der folgenden normalen Gewebe nachgewiesen: fötale Lunge,
fötales Herz,
fötales
Hirn, fötale
Niere, adulte Milz, Thymus, Prostata, Hoden, Ovarien, Dünndarm,
Kolon, Leucozyten aus dem peripheren Blut, Herz, Plazenta, Lunge,
Leber, Skelettmuskel, Niere, Pankreas, Amygdala, caudater Nucleus,
Corpus callosum, Hippocampus, Gesamthirn, subthalamischer Nucleus
und Thalamus.
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Unter
Verwendung der spezifischen Sequenz für TADG-14, welche die gesamte
Domäne des
katalytischen Zentrums umfasst, als Sonde für eine Northern-Blot-Analyse,
wurden drei Northern-Blots untersucht: Einer wurde aus Ovargeweben,
sowohl normal als auch mit Karzinom, einer aus fötalen Geweben und einer aus
adulten normalen Geweben gewonnen. Wie in 5 gezeigt,
wurden große
Mengen des TADG-14- Transkripts
in Ovarkarzinomen festgestellt. Die Transkripte wurden in allen Karzinomen
nachgewiesen, jedoch bei geringeren Gehalten in einigen Ovarkrebs-Subtypen. Des Weiteren
wurde kein Transkript in normalem Ovargewebe festgestellt. Die Transkriptgröße betrug
ungefähr
1,4 kB. Von besonderem Interesse ist die Tatsache, dass im untersuchten
fötalen
Gewebe, einschließlich
Hirn, Lunge, Leber, Niere, und in den verschiedenen untersuchten
adulten Geweben keiner dieser Blots eine Expression des TADG-14-Transkripts
zeigte. Die Hybridisierung bei den fötalen und adulten Blots war
in Ordnung und wurde mit der gleichen Probe wie beim Ovargewebe
durchgeführt.
Nach dieser Untersuchung wurde bestätigt, dass die Blots andere
nachweisbare mRNA-Transkripte enthielten.
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Unter
Verwendung der vom originären
vollständigen
PCR-Klon, entsprechend den Nukleotiden 713-1160 der katalytischen
Domäne,
abgeleiteten Basensequenz als Sonde zum Screening von Bibliotheken
wurde eine von Ascites-Tumorzellen erhaltene Ovarkarzinom-Bibliothek
hinsichtlich des Vorhandenseins von TADG-14 untersucht. Es wurden
vier Klone erhalten, von denen zwei das vollständige mRNA-Transkript von 1,4 kB des TADG-14-Gens
abdeckten. Die vollständige
Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 6) ist in der 6 zusammen
mit der Translation des offenen Leserasters (SEQ ID NO: 7) gezeigt.
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In
der Nukleotidsequenz befindet sich eine Kozak-Sequenz, die für Sequenzen
stromaufwärts von
der Translationsinitiationsstelle typisch sind. Es ist ebenfalls
eine Polyadenylierungs-Signalsequenz und ein Poly-A-Schwanz vorhanden.
Das offene Leseraster besteht aus einer Sequenz von 260 Aminosäuren (SEQ
ID NO: 7), die eine Sekretionssignalsequenz innerhalb der ersten
25 Aminosäuren
einschließt,
was die extrazelluläre
Prozessierung der Protease bestätigt.
Es ist ebenfalls eine eindeutige Skizzierung der konservierten Histidin-,
Asparaginsäure-,
Serin-Reihe der katalytischen Domäne zusammen mit einer Reihe
von in der Serinprotease-Familie konservierten Aminosäuren dargestellt.
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Ein
Datenbankabgleich sowohl hinsichtlich der exprimierten Markierungssequenz
als auch der vollständigen
Transkripte ergab sieben Gene, die eine signifikante Homologie zu
dieser neu identifizierten Serinprotease aufwiesen. Ein Gen wurde
im Maushirn identifiziert, und ein Vergleich der Nukleotidhomologie
ist in der 7 dargestellt. Ein Vergleich
der Aminosäuresequenzhomologie
ist in der 8 gezeigt. Die Gegenüberstellung
von TADG-14 und Neuropsin der Maus (Chen Z.L. et al., J. Neuroscience,
1995, Bd. 15 (7), Seiten 5088-5097) ergab eine Ähnlichekeit von 77,2% und eine
Identität
von 72,2% auf Aminosäureebene
für diese
zwei Gene. In Anbetracht der Größe des Maustranskripts
von 1,4 kB und dass das Maus-Gen 260 Aminosäuren enthält und eine Homologie von größer als
70% besteht, könnte
dieses Gen ein humanes Äquivalent
des Neuropsin-Gens der Maus oder ein Mitglied Neuropsin-ähnlicher
Gene sein.
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TADG-14
wird sezerniert und früh
in der Tumorentwicklung exprimiert und weist eine invasive Kapazität auf. Daher
ist TADG-14 ein potentielles Diagnostikum für Ovar- und andere Krebsarten. TADG-14
kann ebenfalls ein Ziel zur Intervention bei der Regulierung der
Tumorverbreitung durch Inhibition, Gentherapie, Antikörperinaktivierungstechnologie
sein. Zusätzlich
zu seiner offensichtlichen Eignung beim Ovarkarzinom und anderen
Karzinomen, einschließlich
der vorläufigen
Daten in der Brust und der Prostata, können die Neuropsin-ähnlichen
Eigenschaften eine Möglichkeit
hinsichtlich der Verwendbarkeit bei neuropathologischen Störungen eröffnen.
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BEISPIEL 10
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Zur
Identifizierung der exprimierten Serinproteasen wurden degenerierte
Oligodesoxynukleotid-Primer, die für die Amplifikation der konservierten Aminosäuresequenzen,
welche die Invarianten His- und Ser-Reste der katalytischen Triade
umgeben, entworfen, und in PCR-Reaktionen mit cDNA entweder aus
normalem Ovargewebe oder Ovarkarzinom als Matrize verwendet. PCR-Produkte
geeigneter Größe wurden
in den T-Vektor subkloniert und sequenziert. Von den bereits unter
Verwendung dieser Strategie identifizierten Proteasen, z. B. Hepsin
und Stratum-corneumchemotryptisches-Enzym (SCCE) wurde festgestellt,
dass sie mit abnorm hohen Spiegeln in Ovarkarzinomen exprimiert
werden. Homologie-Recherchen nach dieser neuen Protease TADG114
ergaben, dass einer der aus Ovarkarzinom erhaltenen Subklone, eine
neue Sequenz mit 406 Basenpaaren (Bp) darstellte, die eine signifikate
Sequenzähnlichkeit
zu anderen bekannten Proteasen, einschließlich Neuropsin der Maus, humanem
glandulären
Kallikrein und humanem PSA, aufweist. Die vollständige cDNA dieser neuen Sequenz
wurde kloniert, und es wurde festgestellt, dass sie eine Trypsin-ähnliche
Serinprotease, TADG14 genannt, codiert. Bedeutsamerweise wurde festgestellt,
dass das TADG14-Transkript in einer Mehrzahl von Ovartumoren stark
exprimiert wird, jedoch nicht in normalem Ovargewebe exprimiert
ist. Die starke Expression von TADG19 scheint auf Tumore beschränkt zu sein,
und diese Protease scheint in einer Weise sezerniert zu werden,
die eine mögliche
Rolle bei der Invasion und Metastase nahelegt. Darüber hinaus
ist es aufgrund der extrazellulären
Natur dieses Enzyms möglich,
seine Expression als diagnostisches Werkzeug für Ovarkrebs auszunutzen.
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Unter
Verwendung der neuen 406 Bp-Sequenz als Sonde, wurden Northern-Blot-Analysen durchgeführt, um
die Transkriptgröße und Gewebsspezifität seiner
Expression zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass die mRNA dieses
Klons ungefähr 1,4
Kilobasen (kb) (9A) enthält und dass
sie in Ovarkarzinomen, nicht jedoch in normalen Ovarien, stark exprimiert
wird. Bedeutsamerweise wurde festgestellt, dass das Transkript mittels
Northern-Analyse in 28 untersuchten normalen humanen Geweben (9B, 9C, 9D, einige Daten nicht gezeigt) nicht nachweisbar
ist. Im Rahmen eines empfindlicheren Tests mit 50 normalen humanen
Geweben (Clontech) ergab eine RNA-Dot-Blot-Analyse, dass dieser Klon
sehr schwach in nur drei von diesen 50 Geweben, nämlich Niere,
Lunge und Brustdrüse
(Daten nicht gezeigt), exprimiert wird.
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Unter
Verwendung von Standardhybridisierungstechniken wurde eine cDNA-Bibliothek, die ausgehend
von mRNA, welche aus Asciteszellen einer Patientin mit einem ovarialen
Cystadenokarzinom isoliert wurde, konstruiert wurde, gescreent.
Es wurden fünf
Klone erhalten, von denen sich zwei überlappten und 1343 Nukleotide
umspannten (10A). Die letzten zwei
Nukleotide vor dem Poly(A)-Schwanz und der Poly(A)-Schwanz selbst
wurden aus der EST-Datenbank von NCBI (Zugriffs-Nr. AA343629) erhalten. Nachfolgende
Northern-Blot-Analysen mit Proben, die von Sequenzen nahe dem 5'- oder 3'-Ende dieser cDNA
abgeleitet waren, bestätigten
vorhergehende Resultate, die nahelegen, dass die erhaltenen Klone
vom gleichen Gen produziert wurden (Daten nicht gezeigt). Diese cDNA
schließt
eine Kozak-Konsensussequenz
zur Translationsinitiation und ein Polyadenylierungssignal ein.
Die mRNA enthält
ein offenes Leseraster mit 260 Aminosäuren, das die erforderlichen
Reste (His73, Asp120,
Ser212) im geeigneten Kontext enthält, um dieses
Protein der Klasse der Trypsin-ähnlichen Serinproteasen
zuzuordnen. Nahe seinem Aminoterminalen Ende enthält das vorhergesagte
Protein einen Strang hydrophober Aminosäuren, die als Sekretionssignalsequenz
dienen können.
Außerdem
codieren die Reste 110 bis 112 eine potentielle Glycosylierungsstelle,
die bei Serinprotasen der Kallikrein-Unterfamilie, wie PSA, üblich ist.
Dieses Enzym wurde TADG14 genannt. Ein Vergleich der abgeleiteten
TADG14-Aminosäuresequenz
mit Sequenzen bekannter Proteasen ergab, dass es eine deutliche Ähnlichkeit
mit humanem glandulären
Kallikrein (hHk2), PSA, Protease M und Neuropsin der Maus aufweist.
Auf Aminosäureebene
ist TADG14 zu 48% mit der Protease M identisch, zu 46% mit hHk2
identisch und zu 43% mit PSA identisch. Interessanterweise zeigen
die Maus-Protease Neuropsin und TADG14 eine Aminosäureidentität von 72%.
Zusätzlich
zur Ähnlichkeit
der Proteinsequenzen weisen die Neuropsin- und TADG14-mRNAs eine ähnliche
Größe (1,4
kB) und Struktur mit ungefähr
der gleichen Menge an 5'-
und 3'-nicht-translatierten
Bereichen auf, was nahelegt, dass die Sequenzen mögli cherweise
ortholog sind. Neuropsin wurde ursprünglich aus dem Hippocampus
der Maus kloniert, und es wurde gezeigt, dass es bei Stimulation
differentiell exprimiert wird. Die TADG14-mRNA war jedoch im Northern-Blot
im humanen Hippocampus nicht nachweisbar.
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Um
das Ausmaß und
die Häufigkeit
der Expression des TADG14-Gens in Ovarialtumoren zu bestimmen, wurde
die quantitative PCR mit cDNA aus normalen Ovarien, Ovarkarzinom
und Tumoren mit schwachem malignem Potential (LMP) als Matrize verwendet.
Diese Technik wurde zuvor durch Northern-Blot und Western-Blot authentifiziert
und verifiziert. Es wurden PCR-Primer, die ein für TADG14 spezifisches Produkt
von 230 Bp amplifizieren, synthetisiert, und gleichzeitig in Reaktionen
mit Primern, die ein für β-Tubulin
spezifisches PCR-Produkt mit 459 Bp erzeugen, verwendet. Bei der
TADG14-spezifischen PCR würden
die folgenden Primer verwendet: Sense, 5'-ACAGTACGCCTGGGAGACCA-3'; Antisense, 5'-CTGAGACGGTGCAATTCTGG-3'. Die Tubulin-Primer
waren wie in der Referenz 11 beschrieben. Die Reaktionen wurden
wie folgt durchgeführt:
Ausgehend von 50 ng mRNA erzeugte Erststrang-cDNA wurde als Matrize
in Gegenwart von 1,0 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs,
0,025 U Taq-Polymerase/ml
Reaktion und mit dem Enzym geliefertem 1x Puffer verwendet. Primer
zur Amplifikation spezifischer cDNAs wurden in einer Endkonzentration
von jeweils 0,2 mM zugegeben. Nach anfänglicher Denaturierung bei
95°C für 3 Minuten
wurden 30 PCR-Zyklen in einem Gene Amp 2400 Thermo-Cycler von Perkin
Elmer durchgeführt.
Jeder Zyklus bestand aus 30 Sekunden Denaturierung bei 95°C, 30 Sekunden Primer-Anlagerung
bei 62°C
und 30 Sekunden Verlängerung
bei 72°C.
Im letzten Zyklus wurde bei 72°C für 7 Minuten
verlängert.
Die Reaktionen enthielten ein radiomarkiertes Nukleotid, die PCR-Produkte wurden
auf einem 2%-Agarose-Gel
aufgetrennt und die Intensität
jeder Bande wurde mit einem PhosphoImager (Molecular Dynamics) quantifiziert.
Die 11A zeigt ein mit Ethidiumbromid
gefärbtes
Agarose-Gel mit den aufgetrennten quantitativen PCR-Produkten, und
es ist für
die typischerweise erhaltenen Resultate repräsentativ.
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Das
Verhältnis
des TADG14-PCR-Produkts zu demjenigen von β-Tubulin (Mittelwert ± SD) wurde für normale
Ovarproben berechnet (0,034 ± 0,024), die
sämtlich
vergleichsweise geringe Expressionsspiegel zeigten. Die TADG14-Überexpression
lag definitionsgemäß vor, wenn
sie den Mittelwert des Verhältnisses
von TADG14 zu β-Tubulin bei normalen Proben
um mehr als zwei Standardabweichungen (SD) überstieg. Es wurde festgestellt,
dass TADG14 in 4 von 10 LMP-Tumoren (40 %) und 20 von 30 untersuchten
Ovarkarzinomen (67 %) überexprimiert wurde.
Bei einzelnen histologischen Tumorsubtypen betrug das Expressionsverhältnis 0,110 ± 0,092
bei serösen
LMP-Tumoren, 0,096 ± 0,142
bei Schleimhaut-LMP-Tumoren, 0,457 ± 0,345 bei serösen Karzinomen,
0,171 ± 0,300
bei Schleimhautkarzinomen, 0,308 ± 0,149 bei klaren Zellkarzinomen
und 0,485 ± 0,325
bei endometrioiden Karzinomen. Von den 30 untersuchten Karzinomen überexprimierten
TADG14 13 von 17 serösen
Tumoren, 1 von 7 Schleimhauttumoren, 3 von 3 klaren Zelltumoren
und 3 von 3 endometrioiden Tumoren (11B).
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Es
wurden auf Basis der abgeleiteten Aminosäuresequenz von TADG14 immunogene
Polylysin-verknüpfte
Multiantigen-Peptide synthetisiert und zur Immunisierung von Kaninchen
zur Herstellung polyklonaler Antikörper verwendet. Das gegen die Peptidsequenz
LDWIKKIIGSKG erzeugte Antiserum wurde in einer Western-Blot-Analyse verwendet,
um zu bestimmen, ob dieser Antikörper
ein Protein mit der vorhergesagten Größe von 28 kDa erkennt. Proteine
aus der Gebärmutterhalskrebszelllinie
HeLa und der Brustkarzinomzelllinie MD-MBA-4355 wurden in diesem
Experiment verwendet, und es wurde festgestellt, dass der Antikörper in
beiden ein einzelnes 30-kDa-Protein erkennt (12A,
Spuren 3 und 4). Diese Größe liegt
innerhalb des üblichen
Bereichs des vorhergesagten Molekulargewichts. Als Negativkontrolle
wurden HeLa- und MD-MB435S-Lysate zweifach mit Kaninchen-Präimmunserum
untersucht (12A, Spuren 1 und 2).
Bedeutsamerweise war dieses Experiment mit Antiseren gegen ein Peptid aus
einer anderen Region von TADG19 reproduzierbar, was nahelegt, dass
kultivierte Krebszellen das TADG14-Protein herstellen.
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Eine
immunhistochemische Färbung
stützte die
mittels quantitativer PCR und Northern-Blot erhaltenen Daten, wie
in der 13 gezeigt wird. Unter Verwendung
eines gegen ein TADG14-Peptid gerichteten Antikörpers wurde keine Färbung bei
normalen ovarialen Gewebsproben beobachtet. Es ergab sich jedoch
eine intensive Färbung
bei Tumorzellen aller der verschiedenen untersuchten histologischen Ovarkarzinom-Subtypen.
Bei serösen
Karzinomen scheint das Antigen mit den Tumorzellen in Form von Granulae
assoziiert zu sein. Diese granulären
Strukturen können
Intermediate im Stoffwechselweg darstellen, der schließlich zur
Sekretion von TADG14 führt.
In Schleimhaut- und klaren Zellkarzinomproben ist TADG14 stark mit
den Tumorzellen assoziiert. Im endometrioiden Karzinom herrscht
das Antigen im von den Tumorzellen gebildenden glandulären Lumen
vor.
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Die
Lethalität
der Krebszellen beruht auf ihrer Befähigung, abnorm zu proliferieren
und in normale Wirtsgewebe einzuwandern. Maligne Veränderungen
bedienen sich Proteasen, um eine Vielzahl von Mechanismen bereitzustellen,
die den Prozess der Tumorprogression, einschließlich der Aktivierung von Wachstums-
und angiogenen Faktoren, zu unterstützen und so die Grundlage für die Invasion
und Metastase zu legen. Im Verlauf der Untersuchungen dieser Enzyme
wurde die Überexpression
der bekannten Proteasen Hepsin und SCCE festgestellt. In der vorliegenden
Arbeit wurde eine cDNA kloniert, die eine neue Serinprotease, TADG14,
codiert. Es wurde festgestellt, dass diese Protease in 67 % (20/30)
der untersuchten Ovarkarzinomen sehr stark exprimiert wird, während sie
in normalem Ovargewebe nicht nachweisbar war. Es wurden keine Spiegel des
TADG14-Transkripts in irgendeinem der 50 normalen humanen Gewebe,
die untersucht wurden, festgestellt, die ähnlich denjenigen in den Tumorproben
waren. Dies legt die Möglichkeit
nahe, dass dieses Gen von einem Promotor kontrolliert wird, der
in Ovartumoren am aktivsten ist, und es ist möglich, diese Tatsache therapeutisch
auszunutzen.
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Auf
der Aminosäureebene ähnelt TADG14 am
deutlichsten einer als Neuropsin bekannten Maus-Protease, die ursprünglich aus
dem Hippocampus der Maus kloniert wurde. Neuropsin wurde mit der
neuronalen Plastizität
in Zusammenhang gebracht, was nahelegt, dass TADG14 möglicherweise zur
Restrukturierung der dreidimensionalen Architektur eines Tumors
befähigt
ist und es die Ablösung
von Tumorzellen oder die Invasion normaler Wirtsgewebe erlaubt.
Die immunhistochemische Färbung
von Ovartumoren ergab, dass TADG14 stark mit Tumorzellen und Zellen
nahe der invasiven Fronten der Tumorzellen assoziiert ist. Daher
ist TADG14 ein wichtiges Ziel zur Inhibition der Tumorprogression.
-
Bedeutsamerweise
bleibt die Fünfjahres-Überlebensrate
bei Patientinnen mit Ovarkrebs unterhalb von 50 %, da man nicht
in der Lage ist, diese Erkrankung in einem frühen Stadium zu diagnostizieren.
TADG14 enthält
eine Sekretionssignalsequenz, und immunhistochemische Daten legen
nahe, dass TADG14 sezerniert wird. Des Weiteren scheint TADG14 anhand
von Northern-Blot- und RNA-Dot-Blot-Analysen eher tumorspezifisch
zu sein. Aufgrund dessen erscheint es möglich, auf dem Nachweis dieses
Proteins beruhende Tests zur frühen
Detektion von Ovarkrebs zu entwerfen. Derzeit ist der beste verfügbare Ovarkrebs-Tumormarker CA125.
Aufgrund der hohen endogenen Kreislaufspiegel dieses Antigens beschränkt das
Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis
jedoch dessen Verwendbarkeit als diagnostisches Werkzeug. Daher könnte sich
erweisen, dass TADG14 aufgrund seiner eingeschränkten Expression in anderen
Geweben ein wertvolles Werkzeug zur Diagnose von Ovarkrebs, insbesondere
des am meisten vorherrschenden serösen Cystadenokarzinom-Subtyps, ist.