ES2256957T3 - Serina-proteasa extracelular. - Google Patents
Serina-proteasa extracelular.Info
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Abstract
ADN que codifica una proteína del Gen Derivado de Antígeno Tumoral 14 (TADG-14), en la que dicha proteína comparte al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID No. 7, y en el que dicho ADN se selecciona del grupo que consiste en: (a)ADN aislado que codifica una proteína del Gen Derivado de Antígeno Tumoral 14 (TADG-14); (b)ADN aislado que se hibrida en condiciones de alta rigurosidad con el ADN aislado del punto (a) anterior y que codifica una proteína del Gen Derivado de Antígeno Tumoral 14 (TADG-14); y (c)ADN aislado que difiere de los ADNs aislados de los puntos (a) y (b) anteriores en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético, y que codifica una proteína del Gen Derivado de Antígeno Tumoral 14 (TADG-14).
Description
Serina-proteasa extracelular.
La presente invención se refiere en general a los
campos de la biología celular y el diagnóstico de la enfermedad
neoplásica. Más específicamente, esta invención se refiere a una
serina-proteasa extracelular novedosa denominada
Gen Derivado de Antígeno Tumoral 14 (TADG-14, del
inglés "Tumor Antigen Derived Gene-14").
Las proteasas extracelulares se han asociado
directamente con el crecimiento tumoral, el desprendimiento de
células tumorales y la invasión de órganos diana. Las clases
individuales de proteasas están implicadas, pero sin limitarse a
ello en (1) la digestión del estroma que rodea el área tumoral
inicial; (2) la digestión de las moléculas de adhesión celular para
permitir la disociación de células tumorales; y (3) la invasión de
la membrana basal para el crecimiento metastásico y la activación
tanto de factores de crecimiento tumorales como de factores
angiogénicos.
La técnica precedente es deficiente en la falta
de medios eficaces de escrutinio para identificar proteasas
sobreexpresadas en carcinoma. La presente invención satisface esta
necesidad duradera en la técnica.
La presente invención describe un sistema de
escrutinio para identificar proteasas sobreexpresadas en carcinoma
examinando los productos de PCR amplificados a partir de tumores en
etapas precoces, tumores metastásicos, y epitelio ovárico
normal.
En una realización de la presente invención, se
proporciona un ADN que codifica una proteína TADG-14
seleccionada del grupo que consiste en: (a) ADN aislado que
codifica una proteína TADG-14; (b) ADN aislado que
se hibrida con el ADN aislado del punto (a) anterior y que codifica
una proteína TADG-14; y (c) ADN aislado que difiere
de los ADNs aislados de los puntos (a) y (b) anteriores en la
secuencia de codones debido a la degeneración del código genético,
y que codifica una proteína TADG-14.
En otra realización de la presente invención, se
proporciona un vector capaz de expresar el ADN de la presente
invención adaptado para la expresión en una célula recombinante y
elementos reguladores necesarios para la expresión del ADN en la
célula.
En otra realización más de la presente invención,
se proporciona una célula hospedante transfectada con el vector de
la presente invención, expresando dicho vector una proteína
TADG-14.
En aún otra realización más de la presente
invención, se proporciona un método para detectar la expresión de
un mARN de TADG-14, que comprende los pasos de: (a)
poner en contacto el mARN obtenido de la célula con la sonda de
hibridación marcada; y (b) detectar la hibridación de la sonda con
el mARN.
Otros aspectos adicionales, características, y
ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de
la siguiente descripción de las realizaciones actualmente preferidas
de la invención que se dan a efectos descriptivos.
Así es como las características, ventajas y
objetos de la invención anteriormente enumerados, así como otros
que quedarán claros, se consiguen y pueden entenderse en detalle,
descripciones más particulares de la invención brevemente resumida
anteriormente pueden tenerse por referencia a ciertas realizaciones
de la misma que se ilustran en los dibujos que acompañan. Estos
dibujos forman una parte de la memoria. Debe observarse, sin
embargo, que los dibujos que acompañan ilustran realizaciones
preferidas de la invención y, por tanto, no deben considerarse
limitantes en su alcance.
La Figura 1 muestra una comparación de los
productos de PCR derivados de cADN normal y de carcinoma, como se
muestra por tinción en un gel de agarosa. Dos bandas diferenciadas
(carril 2) estaban presentes en el par de cebadores
sentido-His-antisentido Asp (AS1), y
se observan bandas múltiples de aproximadamente 500 pares de bases
en el carril del carcinoma para los pares de cebadores
sentido-His antisentido-Ser (AS2)
(carril 4).
La Figura 2 muestra una comparación de la
secuencia de aminoácidos de los dominios catalíticos de
TADG-14.
La Figura 3 muestra la sobreexpresión de
TADG-14 en carcinomas de ovario.
La Figura 4 muestra la expresión de
TADG-14 en tumores y líneas celulares.
\newpage
La Figura 5 muestra las transferencias de la
expresión de TADG-14 en tejidos fetales, adultos y
de carcinomas de ovario.
La Figura 6 muestra la secuencia completa del
producto de transcripción TADG-14 incluyendo el
marco de lectura abierto y los dominios comunes.
La Figura 7 muestra la homología de
TADG-14 con la neuropsina de ratón. Había
aproximadamente un 76% de identidad para el marco de lectura
abierto y baja homología fuera del marco de lectura abierto.
La Figura 8 muestra la homología de los
aminoácidos de TADG-14 con la neuropsina de
ratón.
La Figura 9 muestra el análisis de transferencia
Northern. (Figura 9A) Se aisló ARN mensajero de los tejidos de
interés y se sometió a hibridación Northern usando un producto de
RT-PCR específico para TADG-14 de
230 pb marcado al azar. La transferencia se desnudó y se trató con
una sonda para \beta-tubulina. (Figura 9B, Figura
9C, Figura 9D) Se trataron transferencias Northern de tejidos
múltiples (Clontech) con las mismas sondas de productos de
RT-PCR específicos para TADG-14 y
\beta-tubulina. El mARN de TADG-14
se detectó como un producto de transcripción de 1,4 kb en tumores y
no se detectó en ningún tejido normal estudiado.
La Figura 10 muestra el cADN y las secuencias de
aminoácidos deducidas de TADG-14 y la comparación
de la secuencia predicha de TADG-14 con proteasas
conocidas. La secuencia del cADN de TADG-14 se
muestra con su secuencia de 260 aminoácidos deducida representada
por el código de una letra para cada resto. En el cADN, las
posiciones subrayadas representan la secuencia consenso de Kozak de
inicio de la traducción y la señal de poliadenilación,
respectivamente. La secuencia proteica de TADG-14
contiene una secuencia señal de secreción cerca de su extremo amino
terminal (sombreada en verde). Los restos críticos de la triada
catalítica están identificados por un sombreado amarillo, mientras
que un sitio potencial de glicosilación está marcado con sombreado
morado. El codón de terminación está representado por el símbolo
(*). Usando el programa GCG PILEUP (REF), se comparó la secuencia
de aminoácidos de TADG-14 con la calicreína
glandular humana (hHk2, entrada # P06870), PSA humana (hPSA,
entrada # P07288), neuropsina de ratón (mNeur, entrada # D30785) y
Proteasa M humana (hProM, entrada # U62801). Los restos de
aminoácidos que son idénticos en al menos tres de las cinco
secuencias están sombreados en verde. Aquellos restos sombreados en
amarillo representan aminoácidos que son similares entre al menos
tres secuencias. Las posiciones de los restos de la triada
catalítica están marcadas.
La Figura 11 muestra la PCR cuantitativa de
TADG-14. Se muestran los resultados típicos de un
experimento de PCR cuantitativa de TADG-14 (Figura
11A). Los productos de reacción se sometieron a electroforesis a
través de un gel de agarosa al 2% en TAE y se tiñeron con bromuro
de etidio. En esta figura, la banda de 454 pb representa el
producto de \beta-tobulina y la banda de 230 pb
representa el producto de TADG-14. Los productos de
PCR radiomarcados se cuantificaron. (Figura 11B) Tal como se
determinó por el test t de Student, los niveles de expresión de
mARN de TADG-14 estaban significativamente elevados
en tumores LMP (*, P = 0,05) y carcinomas (P < 0,0001)
comparados con los niveles encontrados en ovario normal. Los casos
individuales están representados en una gráfica de dispersión. Esto
es indicativo de la heterogeneidad de la expresión de
TADG-14 entre estas muestras tumorales.
La Figura 12 muestra una transferencia Western.
Se generaron anticuerpos policlonales por inmunización de conejos
con uno de los tres péptidos antigénicos múltiples unidos a
poli-lisina derivados de la secuencia de
aminoácidos deducida de TADG-14. Estas secuencias
son KYTVRLGDHSLQ (T14-1), GHECQPHSQPWQ
(T14-2), Y LDWIKKIIGSKG (T14-3).
(A) Para el análisis de transferencia Western, se separaron
aproximadamente 20 g de lisados de células
MDA-MB-435S y HeLa en un gel de
SDS-PAGE al 15% y se electrotransfirieron a PVDF a
100 V durante 40 minutos a 4ºC. La transferencia se bloqueó durante
la noche en solución salina tamponada con Tris (TBS), pH 7,8 que
contenía leche desnatada al 0,2%. Se añadió el anticuerpo primario a
la membrana a una dilución de 1:100 en leche al 0,2% en TBS y se
incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. La transferencia se
lavó y se incubó con una dilución 1:3000 de anticuerpo IgG de cabra
anti-conejo conjugado a fosfatasa alcalina
(Bio-Rad) durante una hora a temperatura ambiente.
La transferencia se lavó y se incubó con un sustrato
quimiluminiscente (Bio-Rad) antes de una exposición
de 10 segundos a una película de rayos X para la visualización.
La Figura 13 muestra la inmunohistoquímica. La
tinción fue con el anticuerpo de TADG-14 para ovario
normal, dos carcinomas serosos, carcinoma mucinoso, carcinoma de
endometrio y carcinoma de células claras de ovario (A, B, C, D, E y
F, respectivamente). No se observó tinción en ovario normal. El
carcinoma seroso que se muestra en la figura B tiene
TADG-14 más fuertemente asociado con la superficie
del tumor, mientras que en el tumor seroso en la figura C,
TADG-14 se encuentra en forma granular en una vía de
secreción evidente. En el carcinoma mucinoso,
TADG-14 resulta expresarse más elevadamente a lo
largo del frente invasivo del tumor. TADG-14 es
secretada al lumen de la estructura glandular formada por el
carcinoma de endometrio en la figura E. El carcinoma de células
claras teñido en el panel F muestra una tinción difusa por todas las
células tumorales.
Tal como se usa en la presente invención, el
término "cADN" se referirá a la copia de ADN del producto de
transcripción de tipo mARN de un gen.
\newpage
Tal como se usa en la presente invención, el
término "secuencia de aminoácidos derivada" significará la
secuencia de aminoácidos determinada leyendo la secuencia de
tripletes de las bases nucleotídicas en el cADN.
Tal como se usa en la presente invención, el
término "escrutar una genoteca" se referirá al procedimiento
de usar una sonda marcada para comprobar si, en las condiciones
apropiadas, hay presente una secuencia complementaria a la sonda en
una genoteca de ADN particular. Adicionalmente, "escrutar una
genoteca" podría realizarse por PCR.
Tal como se usa en la presente invención, el
término "PCR" se refiere a la reacción en cadena de la
polimerasa que es el tema de las Patentes de los EE.UU. Nos.
4.683.195 y 4.683.202 otorgadas a Mullis, así como otras mejoras
actualmente conocidas en la técnica.
El cADN de TADG-14 tiene 1343
pares de bases de longitud (SEC ID No. 6) y codifica una proteína
de 260 aminoácidos (SEC ID No. 7). La disponibilidad del gen
TADG-14 abre el camino para varios estudios que
pueden conducir a varias aplicaciones. Por ejemplo, el gen
TADG-14 subyace a una enfermedad genética humana
específica, el cADN puede ser la base para un ensayo de predicción
de diagnóstico.
Conforme a la presente invención pueden emplearse
técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y ADN
recombinante comprendidas en el conocimiento de la técnica. Tales
técnicas están explicadas totalmente en la bibliografía. Véanse, p.
ej., Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual" (1982); "DNA Cloning: A Practical
Approach", Volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985);
"Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gail ed. 1984); "Nucleic
Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)];
"Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed. (1986)];
"Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press (1986)]; B. Perbal,
"A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
Por tanto, si aparecen en la presente invención,
los siguientes términos tendrán las definiciones expuestas más
abajo.
Se prefiere que los aminoácidos descritos en la
presente invención estén en la forma isómera "L". Sin embargo,
cualquier resto de L-aminoácido puede sustituirse
por restos en la forma isómera "D", siempre que el polipéptido
retenga la propiedad funcional deseada de unión a inmunoglobulina.
NH_{2} se refiere al grupo amino libre presente en el extremo
amino-terminal de un polipéptido. COOH se refiere al
grupo carboxi libre presente en el extremo
carboxi-terminal de un polipéptido. De acuerdo con
la nomenclatura estándar de polipéptidos, J. Biol. Chem.,
243:3552-59 (1969), pueden usarse abreviaturas para
los aminoácidos.
Debe observarse que todas la secuencias de restos
de aminoácidos están representadas en la presente invención por
fórmulas cuya orientación de izquierda a derecha está en la
dirección convencional de extremo amino-terminal a
extremo carboxi-terminal. Además, debe observarse
que un trazo al comienzo o al final de una secuencia de restos de
aminoácidos indica un enlace peptídico con una secuencia adicional
de uno o más restos de aminoácidos. La Tabla anterior se presenta
para correlacionar las denominaciones de tres letras y una letra
que pueden aparecer alternativamente en la presente invención.
Un "replicón" es cualquier elemento genético
(p. ej., plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad
autónoma de replicación de ADN in vivo; esto es, capaz de
replicarse bajo su propio control.
Un "vector" es un replicón, tal como un
plásmido, fago o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ADN
para provocar la replicación del segmento unido.
Una "molécula de ADN" se refiere a la forma
polimérica de los desoxirribonucleótidos (adenina, guanina, timina
o citosina) bien en su forma monocatenaria o una hélice de cadena
doble. Este término se refiere sólo a la estructura primaria o
secundaria de la molécula, y no la limita a formas terciarias
particulares cualesquiera. Por lo tanto, este término incluye el
ADN de cadena doble encontrado, entre otros, en moléculas de ADN
lineal (p. ej., fragmentos de restricción), virus, plásmidos, y
cromosomas. Se habla de la estructura en la presente invención
según la convención normal de dar sólo la secuencia en la dirección
5' a 3' a lo largo de la cadena no transcrita del ADN (esto es, la
cadena que tiene la secuencia homóloga al mARN).
Un "origen de replicación" se refiere a
aquellas secuencias de ADN que participan en la síntesis de
ADN.
Una "secuencia codificadora" de ADN es una
secuencia de ADN de cadena doble que se transcribe y traduce en un
polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de
secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia
codificadora están determinados por un codón de iniciación en el
extremo 5’ (amino) terminal y un codón de terminación de la
traducción en el extremo 3’ (carboxilo) terminal. Una secuencia
codificadora puede incluir, pero sin limitarse a ellas, secuencias
procarióticas, cADN de mARN eucariótico, secuencias de ADN genómico
de ADN eucariótico (p. ej., de mamífero) e incluso secuencias de ADN
sintéticas. Normalmente habrá una señal de poliadenilación y una
secuencia de terminación de la transcripción situadas 3’ con
respecto a la secuencia codificadora.
Las secuencias de control transcripcionales y
traduccionales son secuencias reguladoras de ADN, tales como
promotores, intensificadores, señales de poliadenilación,
terminadores, y similares, que aseguran la expresión de una
secuencia codificadora en una célula hospedante.
Una "secuencia promotora" es una región
reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula
e iniciar la transcripción de una secuencia codificadora aguas abajo
(dirección 3’). A los efectos de definir la presente invención, la
secuencia promotora se une en su extremo 3’ terminal por el sitio de
inicio de la transcripción y se extiende aguas arriba (dirección
5’) para incluir el mínimo número de bases o elementos necesarios
para iniciar la transcripción en niveles detectables por encima del
ruido de fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un
sitio de inicio de la transcripción, así como dominios de unión a
proteína (secuencias consenso) responsables de la unión a la ARN
polimerasa. Los promotores eucarióticos contienen a menudo, pero no
siempre, cajas "TATA" y cajas "CAT". Los promotores
procarióticos contienen secuencias de
Shine-Dalgarno además de las secuencias consenso -10
y -35.
Una "secuencia de control de la expresión"
es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y
traducción de otra secuencia de ADN. Una secuencia codificadora está
"bajo control" de secuencias de control de la transcripción y
traducción en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la
secuencia codificadora a mARN, que es traducida seguidamente a la
proteína codificada por la secuencia codificadora.
Cerca de la secuencia codificadora puede
incluirse una "secuencia señal". Esta secuencia codifica un
péptido señal, en posición N-terminal con respecto
al polipéptido, que se comunica con la célula hospedante para
dirigir el polipéptido a la superficie celular o secretar el
polipéptido al medio, y este péptido señal es cortado por la célula
hospedante antes de que la proteína abandone la célula. Pueden
encontrarse secuencias señal asociadas con una variedad de
proteínas nativas para procariotas y eucariotas.
El término "oligonucleótido", tal como se
usa en la presente en referencia a la sonda de la presente
invención, se define como una molécula que se compone de dos o más
ribonucleótidos, preferiblemente más de tres. Su tamaño exacto
dependerá de muchos factores que, a su vez, dependen de la función y
uso finales del oligonucleótido.
El término "cebador" tal como se usa en la
presente invención se refiere a un oligonucleótido, bien existente
en la naturaleza, como en un producto de digestión por enzimas de
restricción purificado, o producido sintéticamente, que es capaz de
actuar como un punto de inicio de la síntesis cuando se coloca bajo
las condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de
amplificación por cebador que es complementario a una cadena de
ácido nucleico, esto es, en presencia de nucleótidos y un agente
inductor tal como una ADN polimerasa y a una temperatura y pH
adecuados. El cebador puede ser bien monocatenario o de cadena doble
y debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis del
producto de amplificación deseado en presencia del agente inductor.
La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores,
incluyendo la temperatura, el origen del cebador y el uso del
método. Por ejemplo, para aplicaciones diagnósticas, dependiendo de
la complejidad de la secuencia diana, el oligonucleótido cebador
contiene típicamente de 15 a 25 o más nucleótidos, aunque puede
contener menos nucleótidos.
Los cebadores en la presente invención se
seleccionan para ser "sustancialmente" complementarios a
cadenas diferentes de una secuencia de ADN diana en particular. Esto
significa que los cebadores deben ser suficientemente
complementarios para hibridarse con sus cadenas respectivas. Por
tanto, la secuencia del cebador no necesita ser el reflejo de la
secuencia exacta del molde. Por ejemplo, puede unirse un fragmento
de oligonucleótidos no complementario al extremo 5’ del cebador,
siendo el resto de la secuencia del cebador complementario a la
cadena. Alternativamente, pueden intercalarse bases no
complementarias o secuencias más largas en el cebador, siempre que
la secuencia del cebador tenga una complementariedad suficiente con
la secuencia o se hibride con ella y forme así el molde para la
síntesis del producto de amplificación.
Tal como se usan en la presente invención, los
términos "endonucleasas de restricción" y "enzimas de
restricción" se refieren a enzimas, cada una de las cuales corta
el ADN de cadena doble en o cerca de una secuencia de nucleótidos
específica.
Una célula se ha "transformado" con ADN
exógeno o heterólogo cuando se ha introducido tal ADN dentro de la
célula. El ADN transformante puede o no integrarse (unirse
covalentemente) en el genoma de la célula. En células
procarióticas, de levadura y de mamífero, por ejemplo, el ADN
transformante puede mantenerse en un elemento episomal tal como un
plásmido. Con respecto a las células eucarióticas, una célula
transformada de manera estable es una en la que el ADN
transformante se ha integrado en un cromosoma de tal forma que es
heredado por células hijas a través de la replicación cromosómica.
Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula
eucariótica de establecer líneas celulares o clones que se componen
de una población de células hijas que contienen el ADN
transformante. Un "clon" es una población de células derivada
de una única célula o ancestro por mitosis. Una "línea
celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de un
crecimiento estable in vitro por muchas generaciones.
Dos secuencias de ADN son "sustancialmente
homólogas" cuando al menos aproximadamente un 75%
(preferiblemente al menos aproximadamente un 80%, y, lo más
preferido, al menos aproximadamente un 90% o 95%) de los nucleótidos
coinciden en la longitud definida de las secuencias de ADN. Las
secuencias que son sustancialmente homólogas pueden identificarse
comparando las secuencias usando software estándar disponible en los
bancos de datos de secuencias, o en un experimento de hibridación
Southern en, por ejemplo, condiciones rigurosas como se definen
para ese sistema en particular. Definir las condiciones de
hibridación apropiadas está comprendido dentro del conocimiento de
la técnica. Véanse, por ejemplo, Maniatis et al., ut
supra; DNA Cloning, Vols. I & II, ut supra; Nucleic
Acid Hybridization, ut supra.
Una región "heteróloga" de la construcción
de ADN es un segmento identificable de ADN dentro de una molécula
de ADN mayor que no se encuentra en asociación con la molécula mayor
en la naturaleza. Por lo tanto, cuando la región heteróloga
codifica un gen de un mamífero, el gen estará normalmente flanqueado
por ADN que no flanquea el ADN genómico del mamífero en el genoma
del organismo de origen. En otro ejemplo, la secuencia codificadora
es una construcción donde la secuencia codificadora no se encuentra
en la naturaleza por sí misma (p. ej., un cADN donde la secuencia
codificadora genómica contiene intrones, o secuencias sintéticas
que tienen codones diferentes al gen nativo). Las variaciones
alélicas o sucesos mutacionales existentes en la naturaleza no dan
lugar a una región heteróloga tal como se define en la presente
invención.
Los marcadores más comúnmente empleados para
estos estudios son elementos radiactivos, enzimas, productos
químicos que fluorecen cuando se exponen a la luz ultravioleta, y
otros. Se conocen varios materiales fluorescentes y pueden usarse
como marcadores. Éstos incluyen, por ejemplo, fluoresceína,
rodamina, auramina, Rojo Texas, azul AMCA y Amarillo Lucifer. Un
material de detección particular es anticuerpo
anti-conejo preparado en cabras y conjugado con
fluoresceína a través de un isotiocianato.
Las proteínas pueden marcarse también con un
elemento radiactivo o con una enzima. El marcador radiactivo puede
detectarse por cualquiera de los procedimientos de recuento
actualmente disponibles. El isótopo preferido puede seleccionarse
entre ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, ^{36}Cl, ^{51}Cr,
^{57}Co, ^{58}Co, ^{59}Fe, ^{90}Y, ^{125}I, ^{131}I, y
^{186}Re.
Los marcadores enzimáticos son asimismo útiles, y
pueden detectarse por cualquiera de las técnicas colorimétricas,
espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas, amperométricas o
gasométricas utilizadas actualmente. La enzima se conjuga con la
partícula seleccionada por reacción con moléculas formadoras de
puentes tales como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehído y
similares. Se conocen muchas enzimas que pueden usarse en estos
procedimientos y pueden utilizarse. Las preferidas son peroxidasa,
\beta-glucoronidasa,
\beta-D-glucosidasa,
\beta-D-galactosidasa, ureasa,
glucosa oxidasa más peroxidasa y fosfatasa alcalina. Se hace
referencia a las Patentes de los EE.UU. Nos. 3.654.090, 3.850.752 y
4.016.043 a modo de ejemplo por su descripción de material y
métodos de marcaje alternativos.
Un sistema de ensayo particular desarrollado y
utilizado en la técnica se conoce como ensayo de receptor. En un
ensayo de receptor, el material a ensayar se marca apropiadamente y
seguidamente se inoculan ciertas colonias de ensayo celulares con
una cantidad de ambos marcadores, tras lo cual se llevan a cabo
estudios de unión para determinar la medida en la que el material
marcado se une a los receptores celulares. De esta forma, pueden
establecerse diferencias en afinidad entre materiales.
Un ensayo útil en la técnica se conoce como
ensayo "cis/trans". Brevemente, este ensayo emplea dos
construcciones genéticas, una de las cuales es típicamente un
plásmido que expresa continuamente un receptor particular de
interés cuando se usa para transfectar una línea celular apropiada,
y el segundo de los cuales es un plásmido que expresa un informador
tal como luciferasa, bajo el control de un complejo
receptor/ligando. Por lo tanto, por ejemplo, si se desea evaluar un
compuesto como ligando para un receptor en particular, uno de los
plásmidos sería una construcción que dé cómo resultado la expresión
del receptor en la línea celular elegida, mientras que el segundo
plásmido poseería un promotor unido al gen de la luciferasa en el
que se inserta el elemento de respuesta al receptor particular. Si
el compuesto a ensayar es un agonista para el receptor, el ligando
formará un complejo con el receptor, y el complejo resultante se
unirá al elemento de respuesta e iniciará la transcripción del gen
de la luciferasa. La quimiluminiscencia resultante se mide a
continuación fotométricamente, y se obtienen curvas de respuesta a
dosis y se comparan con las de ligandos conocidos. El protocolo
precedente se describe en detalle en la Patente de los EE.UU. No.
4.981.784.
Tal como se usa en la presente invención, el
término "hospedante" se considera que incluye no sólo
procariotas, sino también eucariotas tales como células de
levaduras, plantas y animales. Una molécula de ADN o gen
recombinante que codifica una proteína TADG-14
humana de la presente invención puede usarse para transformar un
hospedante usando cualquiera de las técnicas comúnmente conocidas
por aquellos que poseen una experiencia normal en la técnica. Se
prefiere especialmente el uso de un vector que contiene secuencias
codificadoras del gen que codifica una proteína
TADG-14 humana de la presente invención a los
efectos de la transformación de procariotas.
Los hospedantes procarióticos pueden incluir
E. coli, S. tymphimurium, Serratia marcescens
y Bacillus subtilis. Los hospedantes eucarióticos incluyen
levaduras tales como, Pichia pastoris, células de mamíferos
y células de insectos.
En general, se usan vectores de expresión que
contienen secuencias promotoras que facilitan la transcripción
eficiente del fragmento de ADN insertado en conexión con el
hospedante. El vector de expresión contiene típicamente un origen
de replicación, promotor(es), terminador(es), así como
genes específicos que son capaces de proporcionar selección
fenotípica en las células transformadas. Los hospedantes
transformados pueden fermentarse y cultivarse según medios
conocidos en la técnica para conseguir un crecimiento celular
óptimo.
La invención incluye un ADN sustancialmente puro
que codifica una proteína TADG-14, una cadena del
cual ADN se hibridará en condiciones de alta rigurosidad con una
sonda que contenga una secuencia de al menos 15 nucleótidos
consecutivos de la (SEC ID No. 6). La proteína codificada por el ADN
de esta invención puede compartir al menos un 80% de identidad de
secuencia (preferiblemente un 85%, más preferiblemente un 90% y, lo
más preferido, un 95%) con los aminoácidos relacionados en la Figura
6 (SEC ID No. 7). Más preferiblemente, el ADN incluye la secuencia
codificadora de los nucleótidos de la Figura 6 (SEC ID No. 6), o una
variante degenerada de tal secuencia.
La sonda con la que el ADN de la invención se
hibrida consiste preferiblemente en una secuencia de al menos 20
nucleótidos consecutivos, más preferiblemente 40 nucleótidos, aun
más preferiblemente 50 nucleótidos, y, lo más preferido, 100
nucleótidos o más (hasta el 100%) de la secuencia codificadora de
los nucleótidos relacionados en la Figura 6 (SEC ID No. 6) la
complementaria de la misma. Tal sonda es útil para detectar la
expresión de TADG-14 en una célula humana por un
método que incluye los pasos de (a) poner en contacto el mARN
obtenido de la célula con la sonda de hibridación marcada; y (b)
detectar la hibridación de la sonda con el mARN.
Esta invención incluye también un ADN
sustancialmente puro que contiene una secuencia de al menos 15
nucleótidos consecutivos (preferiblemente 20, más preferiblemente
30, aun más preferiblemente 50, y, lo más preferido, todos) de la
región de los nucleótidos 1 a 1343 de los nucleótidos relacionados
en la Figura 6 (SEC ID No. 6).
Por "alta rigurosidad" se entiende la
hibridación de ADN y condiciones de lavado caracterizadas por la
alta temperatura y la baja concentración salina, p. ej., condiciones
de lavado a 65ºC a una concentración salina de aproximadamente 0,1
x SSC, o el equivalente funcional de la misma. Por ejemplo, las
condiciones de alta rigurosidad pueden incluir la hibridación a
aproximadamente 42ºC en presencia de formamida aproximadamente al
50%; un primer lavado a aproximadamente 65ºC con aproximadamente 2 x
SSC que contiene SDS al 1%; y a continuación se realiza un segundo
lavado a aproximadamente 65ºC con aproximadamente 0,1 x SSC.
Por "ADN sustancialmente puro" se entiende
ADN que no es parte de un medio en el que el ADN existe en la
naturaleza, en virtud de la separación (purificación parcial o
total) de algunas o todas de las moléculas de ese medio, o en
virtud de la alteración de las secuencias que flanquean el ADN
reivindicado. El término por tanto incluye, por ejemplo un ADN
recombinante que se incorpora a un vector, a un plásmido o virus que
se replica de manera autónoma, o al ADN genómico de un procariota o
eucariota; o que existe como una molécula separada (p. ej., un cADN
o un fragmento genómico o de cADN producido por la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) o digestión con endonucleasas de
restricción) independiente de otras secuencias. Incluye también un
ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica una
secuencia polipeptídica adicional, p. ej., una proteína de fusión.
También se incluye un ADN recombinante que incluye una porción de
los nucleótidos relacionados en la Figura 6 (SEC ID No. 6) que
codifica una variante de corte y empalme alternativa de
TADG-14.
El ADN puede tener al menos aproximadamente un
70% de identidad de secuencia con la secuencia codificadora de los
nucleótidos relacionados en la Figura 6 (SEC ID No. 6),
preferiblemente al menos un 75% (p. ej., al menos un 80%); y, lo
más preferido, al menos un 90%. La identidad entre dos secuencias es
una función directa del número de posiciones coincidentes o
idénticas. Cuando la posición de una subunidad en ambas secuencias
está ocupada por la misma subunidad monomérica, p. ej., si una
posición dada está ocupada por una adenina en cada una de las dos
moléculas de ADN, entonces son idénticas en esa posición. Por
ejemplo, si 7 posiciones en una secuencia de 10 nucleótidos de
longitud son idénticas a las posiciones correspondientes en una
segunda secuencia de 10 nucleótidos, entonces las dos secuencias
tienen un 70% de identidad de secuencia. La longitud de las
secuencias de comparación será generalmente al menos de 50
nucleótidos, preferiblemente al menos 60 nucleótidos, más
preferiblemente al menos 75 nucleótidos, y, lo más preferido, 100
nucleótidos. La identidad de secuencia se mide típicamente usando
software de análisis de secuencia (p. ej., Sequence Analysis
Software Package of the Genetics Computer Group, University of
Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI
53705).
La presente invención comprende un vector que
comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína
TADG-14 humana y dicho vector es capaz de replicarse
en un hospedante que comprende, unidos de forma operable: a) un
origen de replicación; b) un promotor; y c) una secuencia de ADN que
codifica dicha proteína. Preferiblemente, el vector de la presente
invención contiene una porción de la secuencia de ADN que se muestra
en la SEC ID No. 6. Un "vector" puede definirse como una
construcción de ácido nucleico replicable, p. ej., un plásmido o
ácido nucleico viral. Pueden usarse vectores para amplificar y/o
expresar el ácido nucleico que codifica la proteína
TADG-14. Un vector de expresión es una construcción
replicable en la que una secuencia de ácido nucleico que codifica
un polipéptido está unido de forma operable a secuencias de control
adecuadas capaces de efectuar la expresión del polipéptido en una
célula. La necesidad de tales secuencias de control variará
dependiendo de la célula seleccionada y del método de transformación
elegido. Generalmente, las secuencias de control incluyen un
promotor transcripcional y/o un intensificador, sitios de unión de
mARN ribosomales adecuados, y secuencias que controlan la
terminación de la transcripción y traducción. Pueden usarse métodos
bien conocidos por aquellos que poseen una experiencia normal en le
técnica para construir los vectores de expresión que contengan las
señales de control transcripcionales y traduccionales apropiadas.
Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et
al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª
Ed.), Cold Spring Harbor Press, NY. Un gen y sus secuencias de
control transcripcionales se definen como que están "unidos de
forma operable" si las secuencias de control transcripcionales
controlan eficazmente la transcripción del gen. Los vectores de la
invención incluyen, pero sin limitarse a ellos, vectores plasmídicos
y vectores virales. Los vectores virales preferidos de la invención
son los derivados de retrovirus, adenovirus, virus
adeno-asociados, virus SV40, o virus del herpes.
Por una "proteína sustancialmente pura" se
entiende una proteína que se ha separado de al menos algunos de los
componentes que la acompañan en la naturaleza. Típicamente, la
proteína está sustancialmente pura cuando está al menos en un 60%,
en peso, libre de las proteínas y otras moléculas orgánicas
existentes en la naturaleza con las que está asociada in
vivo en la naturaleza. Preferiblemente, la pureza de la
preparación es al menos del 75%, más preferiblemente al menos del
90%, y, lo más preferido, al menos del 99%, en peso. Una proteína
TADG-14 sustancialmente pura puede obtenerse, por
ejemplo, por extracción a partir de una fuente natural; por
expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica un
polipéptido TADG-14; o sintetizando químicamente la
proteína. La pureza puede medirse por cualquier método apropiado, p.
ej., cromatografía en columna tal como cromatografía de
inmunoafinidad usando un anticuerpo específico para
TADG-14, electroforesis en gel de poliacrilamida, o
análisis por HPLC. Una proteína está sustancialmente libre de
componentes asociados en la naturaleza cuando se separa de al menos
algunos de esos contaminantes que la acompañan en su estado
natural. Por lo tanto, una proteína que se sintetiza químicamente o
se produce en un sistema celular diferente de la célula de la que
es originaria en la naturaleza estará, por definición,
sustancialmente libre de sus componentes asociados en la
naturaleza. Por consiguiente, las proteínas sustancialmente puras
incluyen proteínas eucarióticas sintetizadas en E. coli,
otros procariotas o cualquier otro organismo en el que no existan
en la naturaleza.
Además de las proteínas sustancialmente
completas, la invención incluye también fragmentos (p. ej.,
fragmentos antigénicos) de la proteína TADG-14 (SEC
ID No. 7). Tal como se usa en la presente invención,
"fragmento", aplicado a un polipéptido, tendrá normalmente al
menos 10 restos, más típicamente al menos 20 restos, y
preferiblemente al menos 30 (p. ej., 50 ) restos de longitud, pero
menos que la secuencia completa intacta. Los fragmentos de la
proteína TADG-14 pueden generarse por métodos
conocidos por aquellos que poseen una experiencia normal en le
técnica, p. ej., por digestión enzimática de la proteína
TADG-14 existente en la naturaleza o recombinante,
por técnicas de ADN recombinante usando un vector de expresión que
codifica un fragmento definido de TADG-14, o por
síntesis química. La capacidad de un fragmento candidato para
presentar una característica de TADG-14 (p. ej., la
unión a un anticuerpo específico para TADG-14) puede
ensayarse por métodos descritos en la presente invención. La
TADG-14 purificada o fragmentos antigénicos de
TADG-14 pueden usarse para generar nuevos
anticuerpos o para ensayar anticuerpos existentes (p. ej., como
controles positivos en un ensayo de diagnóstico) empleando
protocolos estándar conocidos por los expertos en la técnica. En
esta invención se incluyen los antisueros policlonales generados
usando TADG-14 o un fragmento de
TADG-14 como el inmunógeno en, por ejemplo, conejos.
Se emplean protocolos estándar para la producción de anticuerpos
monoclonales y policlonales conocidos por los expertos en esta
técnica. Los anticuerpos monoclonales generados por este
procedimiento pueden escrutarse en relación con su capacidad para
identificar clones de cADN de TADG-14 recombinantes,
y para distinguirlos de clones de cADN conocidos.
Adicionalmente se incluyen en esta invención
proteínas TADG-14 que son codificadas al menos en
parte por porciones de la SEC ID No. 7, p. ej., productos de corte
y empalme de mARN alternativos o sucesos del procesamiento proteico
alternativos, o en las cuales se ha suprimido una sección de la
secuencia de TADG-14. El fragmento, o el
polipéptido TADG-14 intacto, puede unirse
covalentemente a otro polipéptido, p. ej., que actúa como un
marcador, un ligando o un medio para aumentar la antigenicidad.
La invención incluye también un anticuerpo
policlonal o monoclonal que se une específicamente a
TADG-14. La invención abarca no sólo un anticuerpo
monoclonal intacto, sino también un fragmento de anticuerpo
inmunológicamente activo, p. ej., un fragmento Fab o
(Fab)_{2}; una molécula Fv monocatenaria creada por
ingeniería genética; o una molécula quimérica, p. ej., un anticuerpo
que contiene la especificidad de unión de un anticuerpo, p. ej., de
origen murino, y las porciones restantes de otro anticuerpo, p. ej.,
de origen humano.
En una realización, el anticuerpo, o un fragmento
del mismo, puede unirse a una toxina o a un marcador detectable, p.
ej., un marcador radiactivo, marcador isotópico no radiactivo,
marcador fluorescente, marcador quimiluminiscente, marcador
paramagnético, marcador enzimático, o marcador colorimétrico.
Ejemplos de toxinas adecuadas incluyen la toxina de la difteria,
exotoxina A de Pseudomonas, ricina, y toxina del cólera.
Ejemplos de marcadores enzimáticos adecuados incluyen malato
hidrogenasa, nucleasa de estafilococos,
delta-5-esteroide isomerasa,
alcohol deshidrogenasa,
alfa-glicerol-fosfato
deshidrogenasa, triosa-fosfato isomerasa,
peroxidasa, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa,
beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa,
glucosa-6-fosfato, deshidrogenasa,
glucoamilasa, acetilcolinesterasa, etc. Ejemplos de marcadores
radioisotópicos adecuados incluyen ^{3}H, ^{125}I, ^{131}I,
^{32}P, ^{35}S, ^{14}C, etc.
Pueden usarse también isótopos paramagnéticos a
los efectos del diagnóstico in vivo según los métodos de
esta invención. Existen numerosos ejemplos de elementos que son
útiles en la formación de imágenes por resonancia magnética. Para
las discusiones sobre formación de imágenes por resonancia magnética
nuclear in vivo véanse, por ejemplo, Schaefer et al.,
(1989) JACC 14, 472-80; Shreve et al.,
(1986) Magn. Reson. Med. 3, 336-40; Wolf, G.
L., (1984) Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16,
93-5; Wesbey et al., (1984) Physiol.
Chem. Phys. Med. NMR 16, 145-55; Runge et
al., (1984) Invest. Radiol. 19, 408-15.
Ejemplos de marcadores fluorescentes adecuados incluyen un marcador
de fluoresceína, un marcador de isotiocianato, un marcador de
rodamina, un marcador de ficoeritrina, un marcador de ficocianina,
un marcador de aloficocianina, un marcador de oftaldehído, un
marcador de fluorescamina, etc. Ejemplos de marcadores
quimiluminiscentes adecuados incluyen un marcador de luminal, un
marcador de isoluminal, un marcador de éster de acridinio aromático,
un marcador de imidazol, un marcador de sal de acridinio, un
marcador de éster de oxalato, un marcador de luciferina, un
marcador de luciferasa, un marcador de acuorina, etc.
Aquellos que poseen una experiencia normal en la
técnica sabrán de otros marcadores adecuados que pueden emplearse
conforme a la presente invención. La unión de estos marcadores a
anticuerpos o sus fragmentos puede realizarse usando técnicas
estándar comúnmente conocidas por aquellos que poseen una
experiencia normal en la técnica. La técnicas típicas se describen
en Kennedy et al., (1976) Clin. Chim. Acta 70,
1-31; y Schurs et al., (1977) Clin. Chim.
Acta 81, 1-40. Las técnicas de acoplamiento
mencionadas en estas últimas referencias son el método del
glutaraldehído, el método del peryodato, el método de la
dimaleimida, el método del éster de
m-maleimidobencil-N-hidroxisuccinimida.
También está dentro de la invención un método
para detectar la proteína TADG-14 en una muestra
biológica, que incluye los pasos de poner en contacto la muestra
con el anticuerpo marcado, p. ej., un anticuerpo marcado
radiactivamente específico para TADG-14, y
determinar si el anticuerpo se une a un componente de la
muestra.
Tal como se describe en la presente, la invención
proporciona varias ventajas de diagnóstico y usos. Por ejemplo, la
proteína TADG-14 es útil en el diagnóstico de cáncer
en diferentes tejidos, ya que esta proteína está ausente en células
altamente proliferativas. Los anticuerpos (o fragmentos de los
mismos que se unan al antígeno) que se unen a un epítope específico
para TADG-14, son útiles en un método para detectar
la proteína TADG-14 en una muestra biológica para
el diagnóstico de transformación cancerosa o neoplásica. Este método
incluye los pasos de obtener una muestra biológica (p. ej.,
células, sangre, tejido, etc.) de un paciente bajo sospecha de
tener cáncer, poner en contacto la muestra con un anticuerpo marcado
(p. ej., anticuerpo marcado radiactivamente) específico para
TADG-14, y detectar la proteína
TADG-14 usando técnicas estándar de inmunoensayo
tales como un ELISA. La unión del anticuerpo a la muestra
bio-
lógica indica que la muestra contiene un componente que se une específicamente a un epítope dentro de TADG-14.
lógica indica que la muestra contiene un componente que se une específicamente a un epítope dentro de TADG-14.
De manera similar, puede usarse un ensayo de
transferencia Northern estándar para determinar las cantidades
relativas de mARN de TADG-14 en un célula o tejido
obtenido de un paciente bajo sospecha de tener cáncer, conforme a
técnicas de hibridación Northern convencionales conocidas por
aquellas personas de experiencia normal en la técnica. Este ensayo
Northern usa una sonda de hibridación, p. ej., cADN de
TADG-14 radiomarcado, que contiene el ADN
monocatenario completo que tiene una secuencia complementaria a la
SEC ID No. 6 (Figura 6), o bien un fragmento de esa secuencia de
ADN de al menos 20 (preferiblemente al menos 30, más preferiblemente
al menos 50 y, lo más preferido, al menos 100) nucleótidos
consecutivos de longitud. La sonda de hibridación de ADN puede
marcarse por cualquiera de los muchos métodos diferentes conocidos
por los expertos en esta técnica.
Los anticuerpos para la proteína
TADG-14 pueden usarse en un inmunoensayo para
detectar un aumento en los niveles de expresión de la proteína
TADG-14 en tejidos bajo sospecha de transformación
neoplásica. Estos mismos usos pueden conseguirse con ensayos y
análisis de transferencia Northern.
La presente invención está dirigida a ADN que
codifica una proteína TADG-14 seleccionada del grupo
que consiste en: (a) ADN aislado que codifica una proteína
TADG-14; (b) ADN aislado que se hibrida con el ADN
aislado del punto (a) anterior y que codifica una proteína
TADG-14; y (c) ADN aislado que difiere de los ADNs
aislados de los puntos (a) y (b) anteriores en la secuencia de
codones debido a la degeneración del código genético, y que
codifica una proteína TADG-14. Preferiblemente, el
ADN tiene la secuencia que se muestra en la SEC ID No. 6. Más
preferiblemente, el ADN codifica una proteína
TADG-14 que tiene la secuencia de aminoácidos que
se muestra en la SEC ID No. 7.
La presente invención está dirigida también a un
vector capaz de expresar el ADN de la presente invención adaptado
para la expresión en una célula recombinante y elementos reguladores
necesarios para la expresión del ADN en la célula. Preferiblemente,
el vector contiene el ADN que codifica una proteína
TADG-14 que tiene la secuencia de aminoácidos que
se muestra en la SEC ID No. 7.
La presente invención está dirigida también a una
célula hospedante transfectada con el vector descrito en la
presente, expresando dicho vector una proteína
TADG-14. Células hospedantes representativas
incluyen células bacterianas, células de mamífero y células de
insecto.
La presente invención está dirigida también a una
proteína TADG-14 aislada y purificada codificada
por el ADN seleccionado del grupo que consiste en: (a) ADN aislado
que codifica una proteína TADG-14; (b) ADN aislado
que se hibrida con el ADN aislado del punto (a) anterior y que
codifica una proteína TADG-14; y (c) ADN aislado
que difiere de los ADNs aislados de los puntos (a) y (b) anteriores
en la secuencia de codones debido a la degeneración del código
genético, y que codifica una proteína TADG-14.
Preferiblemente, la proteína TADG-14 aislada y
purificada de la reivindicación 9 tiene la secuencia de aminoácidos
que se muestra en la SEC ID No. 7.
La presente invención está dirigida también a un
método para detectar la expresión de la proteína de la
reivindicación 1, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto
el mARN obtenido de la célula con la sonda de hibridación marcada;
y (b) detectar la hibridación de la sonda con el mARN.
Los siguientes ejemplos se dan a los efectos de
ilustrar varias realizaciones de la invención y no se pretende que
limiten la presente invención en modo alguno.
Ejemplo
1
Tras realizar al paciente una histerectomía,
salpingooforectomía bilateral, o retirada quirúrgica de tejido
neoplásico, se recupera el espécimen y se coloca en hielo. El
espécimen se llevó seguidamente al patólogo interno para el
aislamiento e identificación de muestras de tejidos específicos.
Finalmente, la muestra se congeló en nitrógeno líquido, se registró
en el archivo del laboratorio y se almacenó a -80ºC. Se obtuvieron
con frecuencia especímenes adicionales de la Red Cooperativa de
Tejidos Humanos (CHTN, del inglés "Cooperative Human Tissue
Network"). Estas muestras fueron preparadas por la CHTN y
enviadas a nosotros en hielo seco. Tras su llegada, estos
especímenes se registraron en el archivo del laboratorio y se
almacenaron a -80ºC.
Ejemplo
2
El aislamiento del ARN mensajero (mARN) se
realizó según las instrucciones del fabricante usando el estuche
("kit") de aislamiento de mARN Mini RiboSepTM Ultra adquirido
en Becton Dickinson (cat. # 30034). Éste era un sistema de
aislamiento de mARN basado en la cromatografía en oligo(dT).
La cantidad de mARN recuperada se cuantificó por espectrofotometría
UV.
El ADN complementario (cADN) de la primera cadena
se sintetizó usando 5,0 mg de mARN y hexámeros aleatorios, o bien
cebadores de oligo(dT) según el protocolo del fabricante
utilizando un "kit" de síntesis de la primera cadena obtenido
en Clontech (cat. # K1402-1). La pureza del cADN se
evaluó por PCR usando cebadores específicos para el gen p53. Estos
cebadores abarcan un intrón de tal forma que el cADN puro puede
distinguirse del cADN que está contaminado con ADN genómico.
Ejemplo
3
Las reacciones se llevaron a cabo como sigue: se
usó el cADN de la primera cadena generado a partir de 50 ng de mARN
como molde en presencia de MgCl_{2} 1,0 mM, dNTPs 0,2 mM, 0,025 U
de polimerasa Taq por ml de reacción, y tampón suministrado
con la enzima 1x. Además, se añadieron cebadores a la reacción de
PCR. Se usaron cebadores degenerados que amplifican una variedad de
cADNs a una concentración final de 2,0 mM cada uno, mientras que
los cebadores que amplifican cADNs específicos se añadieron a una
concentración final de 0,2 mM cada uno.
Tras la desnaturalización inicial a 95ºC durante
3 minutos, se llevaron a cabo 30 ciclos de PCR en un termociclador
Perkin Elmer Gene Amp 2400. Cada ciclo consistía en 30 segundos de
desnaturalización a 95ºC, 30 segundos de reasociación con el
cebador a la temperatura* de reasociación apropiada, y 30 segundos
de amplificación a 72ºC. El ciclo final se amplió a 72ºC durante 7
minutos. Para asegurarse de que la reacción transcurrió con éxito,
una fracción de la mezcla se someterá a electroforesis a través de
un gel de agarosa al 2% en TAE teñido con bromuro de etidio
(concentración final 1 mg/ml). La temperatura de reasociación
variaba según los cebadores que se utilizaban en la reacción de
PCR. Para las reacciones que implicaban cebadores degenerados, se
usó una temperatura de reasociación de 48ºC. La temperatura de
reasociación apropiada para los cebadores específicos para
TADG-14 y \beta-tubulina era de
62ºC.
Ejemplo
4
Los productos de PCR purificados se ligaron en el
plásmido vector T de Promega y los productos de ligación se usaron
para transformar células competentes JM109 según las instrucciones
del fabricante (Promega cat. # A3610). Las colonias positivas se
cultivaron para su amplificación, los ADNs plasmídicos se aislaron
por medio del sistema de purificación de ADN WizardTM Minipreps
(Promega cat. # A7500), y los plásmidos se digirieron con las
enzimas de restricción ApaI y SacI para determinar el tamaño del
inserto. Los plásmidos con insertos del tamaño(s)
visualizado(s) en el gel de electroforesis de los productos
de PCR descrito previamente se secuenciaron.
Ejemplo
5
Utilizando un cebador específico para el plásmido
cerca del sitio de clonación, las reacciones de secuenciación se
llevaron a cabo usando terminadores PRISMTM Ready Reaction Dye
DeoxyTM (Applied Biosystems cat. # 401384) según las instrucciones
del fabricante. Los terminadores con colorante residuales se
eliminaron de la reacción de secuenciación finalizada usando una
columna de centrifugación Centri-sepTM (Princeton
Separation cat. # CS-901). Se disponía de un
sistema de secuenciación de ADN de Applied Biosystems Modelo 373A y
se usó para el análisis de secuencias. Basándose en la secuencia
determinada, se diseñaron y sintetizaron los cebadores que
amplifican específicamente el gen de interés.
Ejemplo
6
Los mARNs (aproximadamente 5 mg) se separaron por
tamaños mediante electroforesis a través de un gel de agarosa al
1,2% y formaldehído al 6,3% en MOPS 0,02 M, acetato de sodio 0,05 M
(pH 7,0) y EDTA 0,001 M. Los mARNs se transfirieron seguidamente a
Hybond-N (Amersham) por capilaridad en SSPE 20x. Los
ARNs se fijaron a la membrana calentando en un horno durante 2
horas a 80ºC. Se adquirieron transferencias Northern de tejidos
múltiples (MTN, del inglés "multiple tissue northern")
adicionales adquiridos en CLONTECH Laboratories Inc. Estas
transferencias incluían la transferencia MTN Humana (cat. #
7760-1), la transferencia MTN II Humana (cat. #
7759-1), la transferencia MTN II Fetal Humana (cat.
# 7756-1), y la transferencia MTN III Cerebral
Humana (cat. # 7750-1). Las sondas apropiadas se
radiomarcaron utilizando el sistema de marcaje génico
Prime-a- disponible en Promega (cat. # U1100). Las
transferencias se trataron con la sonda y se desnudaron según el
protocolo de la solución de hibridación ExpressHyb disponible en
CLONTECH (cat. # 8015-1 ó
8015-2).
Ejemplo
7
La PCR cuantitativa se realizó en una mezcla de
reacción consistente en el cADN derivado de 50 ng de mARN, 5 pmol
de cebadores sentido directo y antisentido para
TADG-14 y el control interno
\beta-tubulina, 0,2 mmol de dNTPs, 0,5 mCi de
[\alpha-32P]dCTP, y 0,625 U de polimerasa
Taq en tampón 1x en un volumen final de 25 ml. Esta mezcla se
sometió a 1 minuto de desnaturalización a 95ºC y a continuación 30
ciclos de desnaturalización durante 30 segundos a 95ºC, 30 segundos
de reasociación a 62ºC, y 1 minuto de amplificación a 72ºC con 7
minutos adicionales de amplificación en el último ciclo. El
producto se sometió a electroforesis a través de un gel de agarosa
al 2% para la separación, el gel se secó a vacío y se
autorradiografió. La radiactividad relativa de cada banda se
determinó mediante un PhosphoImager de Molecular Dynamics.
Ejemplo
8
La presente invención describe el uso de
cebadores dirigidos a áreas conservadas de la clase de las
serina-proteasas para identificar miembros de esa
clase que están sobreexpresados en un carcinoma. Se identificaron y
clonaron varios genes en otros tejidos, pero no previamente
asociados con carcinoma de ovario. La presente invención describe
una proteasa novedosa identificada en carcinoma de ovario. Este gen
se identificó usando cebadores para el área conservada que rodea el
aminoácido histidina del dominio catalítico y el aminoácido serina
del dominio catalítico que está aproximadamente 150 aminoácidos
aguas abajo hacia el extremo carboxilo.
El gen que codifica la
serina-proteasa extracelular novedosa de la presente
invención se identificó entre un grupo de proteasas sobreexpresadas
en carcinoma subclonando y secuenciando los productos de PCR
apropiados. Un ejemplo de tal reacción de PCR se da en la Figura 1.
La subclonación y secuenciación de las bandas individuales de tal
amplificación proporcionaron la base para identificar la proteasa
novedosa de la presente invención.
Ejemplo
9
La secuencia determinada para el dominio
catalítico de TADG-14 se presenta en la Figura 2 y
es consistente con otras serina-proteasas y
contiene específicamente aminoácidos conservados apropiados para el
dominio catalítico de la familia de las
serina-proteasas. Se usaron cebadores específicos
(20mers) derivados de esta secuencia.
Se examinó una serie de cADNs normales y
tumorales para determinar la expresión de la proteína
TADG-14. En una serie de tres normales comparados
con nueve carcinomas usando \beta-tubulina como
control interno para la amplificación por PCR,
TADG-14 estaba significativamente sobreexpresado en
ocho de los nueve carcinomas y no se detectó, o bien se detectó en
un nivel muy bajo en tejido epitelial normal (Figura 3). Esta
evaluación se amplió a un panel estándar de aproximadamente 35
tumores. Usando estos cebadores específicos, la expresión de este
gen se examinó también en ambas líneas celulares tumorales y otros
tejidos tumorales como se muestra en la Figura 4. La expresión de
TADG-14 se observó también en carcinoma de pecho y
carcinoma de colon. No se observó expresión de
TADG-14 en otros tejidos. Por ejemplo,
TADG-14 no estaba presente en niveles detectables
mediante análisis de transferencia Northern en ninguno de los
siguientes tejidos normales: pulmón fetal, corazón fetal, cerebro
fetal, riñón fetal, bazo adulto, timo, próstata, testículo, ovario,
intestino delgado, colon, leucocitos de la sangre periférica,
corazón, placenta, pulmón, hígado, músculo estriado, riñón,
páncreas, amígdalas, núcleo caudado, cuerpo calloso, hipocampo,
cerebro total, núcleo subtalámico y tálamo.
Usando la secuencia específica de
TADG-14 que cubre el dominio completo del sitio
catalítico como sonda para el análisis de transferencia Northern,
se examinaron tres transferencias Northern: una derivada de tejidos
ováricos, tanto normal como de carcinoma; una de tejidos fetales; y
una de tejidos normales adultos. Como se observa en la Figura 5, se
observaron productos de transcripción abundantes de
TADG-14 en carcinomas de ovario. Los productos de
transcripción se observaron en todos los carcinomas, pero en niveles
inferiores en algunos subtipos de cáncer de ovario. Además, no se
observó producto de transcripción a partir de tejido ovárico
normal. Se encontró que el tamaño del producto de transcripción era
de aproximadamente 1,4 kb. De particular interés es el hecho de que
en el tejido fetal examinado que incluía cerebro, pulmón, hígado,
riñón y en múltiples tejidos adultos examinados, ninguna de estas
transferencias mostró expresión del producto de transcripción
TADG-14. La hibridación para las transferencias
fetal y adulta fue la apropiada y se hizo con la misma sonda que
con el tejido ovárico. A raíz de este examen, se confirmó que estas
transferencias contenían otros productos de transcripción de tipo
mARN detectables.
Usando la secuencia base derivada del clon de PCR
completo original correspondiente a los nucleótidos
713-1160 del dominio catalítico como sonda para
escrutar genotecas, se examinó una genoteca de carcinoma de ovario
derivado de células tumorales de ascitis para detectar la presencia
de TADG-14. Se obtuvieron cuatro clones, dos de los
cuales cubrían el producto de transcripción de tipo mARN de 1,4 kb
completo del gen TADG-14. La secuencia de
nucleótidos completa (SEC ID No. 6) se proporciona en la Figura 6
junto con la traducción del marco de lectura abierto (SEC ID No.
7).
En la secuencia de nucleótidos, hay una secuencia
de Kozak típica de las secuencias aguas arriba del sitio de inicio
de la traducción. Hay también una secuencia señal de poliadenilación
y una cola poli-A. El marco de lectura abierto
consiste en una secuencia de 260 aminoácidos (SEC ID No. 7) que
incluye una secuencia señal de secreción en los primeros 25
aminoácidos, confirmando el procesamiento extracelular de la
proteasa. También se indica una descripción clara de la histidina,
el ácido aspártico y la serie de serinas conservados del dominio
catalítico, junto con una serie de aminoácidos conservados en la
familia de las serina-proteasas.
El examen de las bases de datos en relación tanto
con la secuencia de la cola expresada como con los productos de
transcripción completos proporcionó siete genes que tenían una
homología importante con esta serina-proteasa
recién identificada. Un gen se identificó en cerebro de ratón y en
la Figura 7 se proporciona una comparación de la homología de
nucleótidos. En la Figura 8 se proporciona una comparación de la
homología de la secuencia de aminoácidos. El alineamiento de
TADG-14 con neuropsina de ratón (Chen, Z. L. et
al., J. Neuroscience, 1995, vol. 15(7), pp.
5088-97) reveló un 77,2% de similitud y un 72,2% de
identidad a nivel de aminoácidos para estos dos genes. Dado que el
tamaño del producto de transcripción del ratón es de 1,4 kb y que
el gen del ratón contiene 260 aminoácidos y que la homología es
superior al 70%, este gen puede ser un equivalente humano del gen
de la neuropsina de ratón o un miembro de los genes de tipo
neuropsina.
TADG-14 se secreta y expresa
precozmente en el desarrollo tumoral y tiene capacidad invasiva.
TADG-14, por tanto, es un diagnóstico potencial
para cáncer de ovario y otros. TADG-14 puede ser
también una diana para intervenir en la regulación de la
propagación del tumor por inhibición, terapia génica, tecnología de
inactivación con anticuerpos. Además de su utilidad obvia en
carcinoma de ovario y otros carcinomas, incluyendo los datos
preliminares en pecho y próstata, las cualidades de tipo neuropsina
pueden proporcionar una oportunidad para su utilidad en trastornos
neuropatológicos.
Ejemplo
10
Para identificar las
serina-proteasas expresadas, se usaron cebadores de
oligodesoxinucleótidos degenerados diseñados para las secuencias de
aminoácidos conservadas que rodean los restos de His y Ser
invariables de la triada catalítica, en reacciones de PCR con cADN
de tejido ovárico normal, o bien de carcinoma de ovario, como
molde. Los productos de PCR del tamaño adecuado se subclonaron en el
vector T y se secuenciaron. Entre las proteasas ya identificadas
usando este enfoque estratégico, se ha demostrado que, p. ej., la
hepsina y la enzima quimotríptica del stratum corneum (SCCE, del
inglés "stratum corneum chymotryptic enzyme") se expresan en
niveles elevados anormales en el carcinoma de ovario. Las búsquedas
de homología para esta proteasa TADG-14 novedosa
revelaron que uno de los subclones obtenido del carcinoma de ovario
representaba una secuencia novedosa de 406 pares de bases (pb) que
tiene una similitud de secuencia importante con otras proteasas
conocidas, incluyendo la neuropsina de ratón, la calicreína
glandular humana y la PSA humana. Se clonó el cADN completo de esta
secuencia novedosa y se encontró que codificaba una
serina-proteasa de tipo tripsina, denominada
TADG-14. Más importante aún, se encontró que el
producto de transcripción TADG-14 se expresaba en
alto grado en la mayoría de los tumores de ovario, pero no era
expresado por tejido ovárico normal. El alto nivel de expresión de
TADG-14 resulta estar restringido a los tumores, y
esta proteasa resulta ser secretada de una manera que sugeriría un
posible papel en invasión y metástasis. Además, debido a la
naturaleza extracelular de esta enzima, puede ser posible
aprovechar su expresión como una herramienta de diagnóstico para el
cáncer de ovario.
Usando la secuencia de 406 pb novedosa como
sonda, se llevó a cabo un análisis de transferencia Northern para
determinar el tamaño del producto de transcripción y la
especificidad de tejido de su expresión. Se encontró que el mARN de
este clon es de aproximadamente 1,4 kilobases (kb) (Fig. 9A), y que
se expresa fuertemente en carcinomas de ovario pero no en ovario
normal. Más importante aún, se encontró que el producto de
transcripción era indetectable por análisis Northern en 28 tejidos
humanos normales estudiados (Fig. 9B, 9C, 9D, algunos datos no
mostrados). En un ensayo más sensible de 50 tejidos humanos normales
(Clontech), el análisis de hibridación puntual de ARN reveló que
este clon se expresaba muy débilmente en sólo tres de estos 50
tejidos, riñón, pulmón y glándula mamaria (datos no mostrados).
Usando técnicas de hibridación estándar, se
escrutó una genoteca de cADN construida a partir de mARN aislado de
células de ascitis de un paciente con cistadenocarcinoma de ovario.
Se obtuvieron cinco clones, dos de los cuales solapaban y abarcaban
1343 nucleótidos (Fig. 10A). Los últimos dos nucleótidos antes de
la cola poli (A), y la misma cola poli (A) se obtuvieron de la base
de datos EST disponible en NCBI (entrada # AA343629). Los análisis
de transferencia Northern subsiguientes con sondas derivadas de
secuencias cerca del extremo 5' ó 3' de este cADN fueron
consistentes con los resultados previos, sugiriendo que los clones
obtenidos los producía el mismo gen (datos no mostrados). Este cADN
incluye una secuencia consenso de Kozak de inicio de la traducción,
y una señal de poliadenilación. El mARN proporciona un marco de
lectura abierto de 260 aminoácidos, que contiene los restos
necesarios (His^{73}, Asp^{120}, Ser^{212}) en el contexto
apropiado para clasificar esta proteína como una
serina-proteasa de tipo tripsina. Cerca de su
extremo amino, la proteína predicha contiene un tramo de
aminoácidos hidrófobos que puede actuar como una secuencia señal de
secreción. Además, los restos 110 a 112 codifican un sitio potencial
de glicosilación que es común a las
serina-proteasas de la subfamilia de la calicreína,
tal como la PSA. Esta enzima se denominó TADG-14. La
comparación de la secuencia de aminoácidos de
TADG-14 deducida con secuencias de proteasas
conocidas reveló que posee una similitud importante con la
calicreína glandular humana (hHk2), PSA, Proteasa M y neuropsina de
ratón. A nivel de aminoácidos, TADG-14 es idéntica
en un 48% a la Proteasa M, idéntica en un 46% a la hHk2, e idéntica
en un 43% a la PSA. Más interesante aún, la proteasa de ratón
neuropsina y la TADG-14 comparten una identidad del
72% de los aminoácidos. Además de la similitud de la secuencias
proteicas, los mARNs de la neuropsina y de TADG-14
son de tamaño similar (1,4 kb) y estructura con aproximadamente las
mismas cantidades de regiones no traducidas 5' y 3', sugiriendo la
posibilidad de ortología. La neuropsina se clonó originariamente de
hipocampo de ratón y se demostró que se expresaba de manera
diferencial bajo estimulación. Sin embargo, el mARN de
TADG-14 fue indetectable en hipocampo humano por
transferencia Northern (datos no mostrados).
Para caracterizar el alcance y la frecuencia de
expresión del gen TADG-14 en tumores de ovario, se
utilizó la PCR cuantitativa con cADN derivado de ovario normal,
carcinoma de ovario y tumores potenciales de baja malignidad (LMP,
del inglés "low malignant potential") como molde. Esta técnica
ha sido previamente probada y verificada por transferencia Northern
y transferencia Western. Se sintetizaron los cebadores de PCR que
amplifican un producto de 230 pb específico de
TADG-14 y se usaron simultáneamente en reacciones
con cebadores que producen un producto de PCR de 454 pb específico
de la \beta-tubulina. Para la PCR específica de
TADG-14 los cebadores fueron: sentido directo,
5'-ACAGTACGCCTGGGAGACCA-3';
antisentido,
5'-CTGAGACGGTGCAATTCTGG-3'. Los
cebadores de la tubulina fueron como se describe en la ref. 11. Las
reacciones se llevaron a cabo como sigue: el cADN de primera cadena
generado a partir de 50 ng de mARN se usó como molde en presencia de
MgCl_{2} 1,0 mM, dNTPs 0,2 mM, 0,025 U de polimerasa Taq
por ml de reacción, y tampón suministrado con la enzima 1x. Los
cebadores que amplifican cADNs específicos se añaden a una
concentración final de 0,2 mM cada uno. Tras la desnaturalización
inicial a 95ºC durante 3 minutos, se llevaron a cabo 30 ciclos de
PCR en un termociclador Perkin Elmer Gene Amp 2400. Cada ciclo
consistía en 30 segundos de desnaturalización a 95ºC, 30 segundos de
reasociación con el cebador a 62ºC y 30 segundos de amplificación a
72ºC. El ciclo final se amplió a 72ºC durante 7 minutos. Se incluyó
un nucleótido radiomarcado en esta reacción, los productos de PCR se
separaron en un gel de agarosa al 2% y la intensidad de cada banda
se cuantificó mediante un PhosphoImager (Molecular Dynamics). La
Figura 11A muestra un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio
con lo productos de la PCR cuantitativa separados y es
representativo de los resultados típicos observados.
Se calculó la proporción del producto de PCR de
TADG-14 frente al de
\beta-tubulina (media \pm SD) para muestras de
tejido normal (0,034 \pm 0,024), que mostraron todas niveles de
expresión relativamente bajos. La sobreexpresión de
TADG-14 se definió como la superación de la media de
la proporción de TADG-14 frente a
\beta-tubulina para muestras normales en más de 2
desviaciones estándar (SD, del inglés "standard deviation").
Se encontró que TADG-14 estaba sobreexpresada en 4
de los 10 tumores LMP (40%), y 20 de los 30 carcinomas de ovario
(67%) estudiados. Para los subtipos histológicos individuales de
tumor, la proporción de la expresión fue 0,110 \pm 0,092 para
tumores LMP serosos, 0,096 \pm 0,142 para tumores LMP mucinosos,
0,457 \pm 0,345 para carcinomas serosos, 0,171 \pm 0,300 para
carcinomas mucinosos, 0,308 \pm 0,144 para carcinomas de células
claras, y 0,485 \pm 0,325 para carcinomas de endometrio. De los
30 carcinomas estudiados, 13 de 17 tumores serosos, 1 de 7 tumores
mucinosos, 3 de 3 tumores de células claras y 3 de 3 tumores de
endometrio sobreexpresaron la TADG-14 (Fig.
11B).
Se sintetizaron péptidos antigénicos múltiples
unidos a poli-lisina inmunogénicos basados en la
secuencia de aminoácidos deducida de TADG-14 y se
usaron para inmunizar conejos para la producción de anticuerpos
policlonales. El antisuero conseguido frente a la secuencia
peptídica LDWIKKIIGSKG se usó en análisis de transferencia Western
para determinar si este anticuerpo reconocería una proteína del
tamaño predicho de 28 kDa. Se usaron proteínas de la línea celular
HeLa derivada de cáncer cervical y la línea celular
MD-MBA-435S derivada de carcinoma
de pecho en este experimento y se encontró que el anticuerpo
reconocía una única proteína de 30 kDa en ambas (Fig. 12A, carriles
3 y 4). Este tamaño está dentro de un intervalo razonable del peso
molecular predicho. Como control negativo, se examinaron lisados
duplicados de HeLa y MD-MB435S con suero
pre-inmune de conejo (Fig. 12 A, carriles 1 y 2).
Más importante aún, este experimento fue reproducible con antisueros
frente a un péptido de una región diferente de
TADG-14, sugiriendo que las células cancerosas
cultivadas producen la proteína TADG-14.
La tinción inmunohistoquímica apoyó los datos
obtenidos por PCR cuantitativa y por transferencia Northern, como
se muestra en la Figura 13. Usando un anticuerpo dirigido a un
péptido de TADG-14, no se observó tinción alguna
con muestras de tejido ovárico normal. Sin embargo, se asoció una
tinción intensa con células tumorales de todos los subtipos
histológicos diversos de carcinoma de ovario examinados. Para el
carcinoma seroso, el antígeno resulta estar asociado con células
tumorales en forma de gránulos. Estas estructuras granulares pueden
ser intermediaras en la ruta que conduce en último término a la
secreción de TADG-14. En las muestras de carcinoma
mucinoso y de células claras, TADG-14 está muy
asociado con las células tumorales. En carcinoma de endometrio, el
antígeno es más frecuente en el lumen glandular formado por las
células tumorales.
La letalidad de las células cancerosas radica en
su capacidad para proliferar anormalmente e invadir tejidos
hospedantes normales. Los tumores malignos emplean proteasas para
proporcionar una variedad de servicios que ayudan en el proceso de
la progresión tumoral, incluyendo la activación de factores de
crecimiento y angiogénicos, y para proporcionar la base para la
invasión y la metástasis. En el procedimiento de estudio de estas
enzimas, se identificó la sobreexpresión de las proteasas
conocidas, hepsina y SCCE. En el presente estudio, se clonó un cADN
que codificaba una serina-proteasa novedosa,
TADG-14. Se encontró que esta proteasa se expresaba
en muy alto grado en el 67% (20/30) de los carcinomas de ovario
estudiados, mientras que era indetectable en tejido ovárico normal.
No se detectó el producto de transcripción TADG-14
en niveles similares al de las muestras tumorales en ninguno de los
50 tejidos humanos normales estudiados. Esto sugiere la posibilidad
de que este gen esté bajo el control de un promotor que donde es
más activo es en tumores de ovario, y puede ser posible aprovechar
esto para medios terapéuticos.
A nivel de los aminoácidos,
TADG-14 se parece más estrechamente a una proteasa
de ratón conocida como neuropsina, que se clonó originariamente de
hipocampo de ratón. La neuropsina se ha implicado en la plasticidad
neuronal, lo que sugiere que TADG-14 puede
perfectamente ser capaz de reestructurar la arquitectura
tridimensional de un tumor, permitiendo el desprendimiento de
células tumorales o la invasión de tejidos hospedantes normales. La
tinción inmunohistoquímica de tumores de ovario reveló que
TADG-14 está muy asociada con células tumorales y
las células cercanas al frente invasivo de las células tumorales.
Por tanto, TADG-14 es una diana importante para la
inhibición de la progresión tumoral.
Más importante aún, la tasa de supervivencia de
cinco años para las pacientes con cáncer de ovario permanece por
debajo del 50% debido a la incapacidad de diagnosticar esta
enfermedad en una etapa precoz. TADG-14 contiene
una secuencia señal de secreción y los datos inmunohistoquímicos
sugieren que TADG-14 se secreta. Además, por
análisis de transferencia Northern y de hibridación puntual de ARN,
se ha visto que TADG-14 es bastante específico de
tumores. Como resultado de esto, puede ser posible diseñar ensayos
basados en la detección de esta proteína para la detección precoz
de cáncer de ovario. Actualmente, el marcador de cáncer de ovario
con mejor disponibilidad es CA125. Sin embargo, debido a los altos
niveles de circulación endógenos de este antígeno, la proporción de
señal frente a ruido limita su utilidad como herramienta de
diagnóstico. Por tanto, TADG-14, debido a su
expresión limitada en otros tejidos, puede resultar ser una
herramienta valiosa para diagnosticar cáncer de ovario,
especialmente el subtipo más frecuente de cistadenocarcinoma
seroso.
Claims (11)
1. ADN que codifica una proteína del Gen Derivado
de Antígeno Tumoral 14 (TADG-14), en la que dicha
proteína comparte al menos un 80% de identidad de secuencia con la
secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID No. 7, y en el
que dicho ADN se selecciona del grupo que consiste en:
- (a)
- ADN aislado que codifica una proteína del Gen Derivado de Antígeno Tumoral 14 (TADG-14);
- (b)
- ADN aislado que se hibrida en condiciones de alta rigurosidad con el ADN aislado del punto (a) anterior y que codifica una proteína del Gen Derivado de Antígeno Tumoral 14 (TADG-14); y
- (c)
- ADN aislado que difiere de los ADNs aislados de los puntos (a) y (b) anteriores en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético, y que codifica una proteína del Gen Derivado de Antígeno Tumoral 14 (TADG-14).
2. El ADN de la reivindicación 1, en el que dicho
ADN tiene la secuencia que se muestra en la SEC ID No. 6.
3. El ADN de la reivindicación 1, en el que dicha
proteína del Gen Derivado de Antígeno Tumoral 14
(TADG-14) tiene la secuencia de aminoácidos que se
muestra en la SEC ID No. 7.
4. Un vector capaz de expresar el ADN de la
reivindicación 1 en una célula recombinante en el que dicho vector
comprende dicho ADN y elementos reguladores necesarios para la
expresión de dicho ADN en una célula.
5. El vector de la reivindicación 4, en el que
dicho ADN codifica una proteína del Gen Derivado de Antígeno
Tumoral 14 (TADG-14) que tiene la secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEC ID No. 7.
6. Un célula hospedante transfectada con el
vector de la reivindicación 4, expresando dicho vector una proteína
del Gen Derivado de Antígeno Tumoral 14
(TADG-14).
7. La célula hospedante de la reivindicación 6,
en la que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en
células bacterianas, células de mamífero, células de planta y
células de insecto.
8. La célula hospedante de la reivindicación 7,
en la que dicha célula bacteriana es E. coli.
9. La proteína del Gen Derivado de Antígeno
Tumoral 14 (TADG-14) aislada y purificada en la que
dicha proteína comparte al menos un 80% de identidad de secuencia
con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID No. 7,
y en la que dicha proteína está codificada por ADN seleccionado del
grupo que consiste en:
- (a)
- ADN aislado que codifica una proteína del Gen Derivado de Antígeno Tumoral 14 (TADG-14);
- (b)
- ADN aislado que se hibrida en condiciones de alta rigurosidad con el ADN aislado del punto (a) anterior y que codifica una proteína del Gen Derivado de Antígeno Tumoral 14 (TADG-14); y
- (c)
- ADN aislado que difiere de los ADNs aislados de los puntos (a) y (b) anteriores en la secuencia de codones debido a la degeneración del código genético, y que codifica una proteína del Gen Derivado de Antígeno Tumoral 14 (TADG-14).
10. La proteína del Gen Derivado de Antígeno
Tumoral 14 (TADG-14) aislada y purificada de la
reivindicación 9 que tiene la secuencia de aminoácidos que se
muestra en la SEC ID No. 7.
11. Un método para detectar la expresión de la
proteína codificada por el ADN de la reivindicación 1, que
comprende los pasos de:
- (a)
- poner en contacto el mARN obtenido de una célula con la sonda de hibridación marcada que comprende todo o parte de un marco de lectura abierto de la SEC ID No. 6; y
- (b)
- detectar la hibridación de dicha sonda con dicho mARN.
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