DE69833852T2 - Einzelner zymomonas mobilis stamm zur fermentation von xylose und arabinose - Google Patents
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Description
- Gebiet der Erfindung:
- Diese Erfindung betrifft einen rekombinanten Zymomonas mobilis-Biokatalysator, der geeignet ist, Xylose und Arabinose, zusammen mit Glukose, in Ethanol umzusetzen.
- Es handelt sich dabei um einen neuen, einzelnen Zymomonas mobilis-Biokatalysator, der geeignet ist, sowohl Xylose, als auch Arabinose, zusammen mit Glukose, in Ethanol umzusetzen. Sieben Gene (Xylose-Isomerase, Xylulokinase, L-Arabinose-Isomerase, L-Ribulokinase-5-P 4-Epimerase, Transketolase und Transaldolase), welche die Enzyme kodieren, die zum Umsetzen von Xylose und Arabinose in bekannte Zwischenprodukte des zentralen Glykolysewegs (anders engl. orig.: glycolic pathway) von Zymomonas erforderlich sind, wurden gleichzeitig unter der Steuerung starker, ihre Expression regulierende Promotoren in Zymomonas eingebracht, auch unter Anwesenheit von Glukose. Der neu erzeugte Stamm kann auf entweder Xylose, Arabinose oder Glukose als einzige Kohlenstoffquellen anwachsen und diese zu Ethanol fermentieren und fermentiert bei 30°C ohne pH-Kontrolle ein Gemisch aus 1% Glukose, 2% Xylose und 2% Arabinose zu Ethanol mit ungefähr 90% der theoretischen Ausbeute.
- Hintergrund:
- Zellulosehaltige Biomasse ist ein bevorzugter Rohstoff für die Treibstoffethanolherstellung, da sie sowohl leicht erhältlich als auch preiswerter ist als Getreide oder Zuckerrohr. Dennoch müssen beträchtliche Hürden überwunden werden, bevor ein typischer zellulosehaltiger Rohstoff effektiv als Substrat für die fermentative Herstellung von Ethanol verwendet werden kann. Der typische Rohstoff ist zusammengesetzt aus etwa 35%–45% Zellulose, 30–40% Hemizellulose, 15% Lignin und 10% an anderen Komponenten. Die Zellulosefraktion umfasst Polymere des Hexose-Zuckers Glukose. Die Hemizellulosefraktion umfasst vorwiegend Pentose-Zucker und im Wesentlichen Xylose.
- Während Mikroorganismen, die die Glukosekomponente in Zellulose effizient fermentieren, bekannt sind, hat sich die Umwandlung der Xylose in der Hemizellulosefraktion in Ethanol als schwierig erwiesen und bleibt eine der ökonomischen Engpässe im Umwandlungsschema von Biomasse in Ethanol. Die schnelle und wirksame Verwertung der Xylosekomponente in zellulosehaltiger Biomasse ist bei der Entwicklung eines wirtschaftlichen Verfahrens wünschenswert.
- Zymomonas mobilis ist ein Bakterium, das als ein natürliches, fermentatives Agens bei der Produktion von alkoholischen Getränken wie Pulque und Palmweinen, die aus Pflanzensäften hergestellt werden, verwendet wird. Vergleichende Effizienzstudien haben nahegelegt, dass Zymomonas mobilis aufgrund seiner 5–10% höheren Ausbeute und seiner, verglichen mit traditionellen Hefefermentierungen, bis zu 5-fach höheren Produktivität zu einem wichtigen industriellen Ethanol-produzierenden Mikroorganismus werden wird. Aufgrund seines potenziellen Nutzens wurden in den US-Patenten Nr. 4,731,329, 4,812,410, 4,816,399 sowie 4,876,196 mehrere Verfahren offenbart, die auf der Verwendung von Zymomonas für die Herstellung industriellen Ethanols aus Glukose-basierten Rohstoffen beruhen.
- Obwohl Zymomonas, ausgehend von Glukose-basierten Rohstoffen, ein wichtiger Treibstoffethanol-produzierender Mikroorganismus werden wird, ist die Reichweite seiner Substratverwertung auf die Fermentation von Glukose, Sukrose und Fruktose beschränkt und er als solcher natürlicherweise nicht für die Fermentation der Xylosekomponente in zellulosehaltigen Rohstoffen geeignet. Zymomonas enthält den Entner-Douderoff-Weg, der es ihm erlaubt, Glukose sehr effizient zu Ethanol als dem einzigen Fermentationsprodukt zu fermentieren. Zymomonas ist jedoch naturgemäß nicht in der Lage, die Xylose in zellulosehaltiger Biomasse zu fermentieren, da ihm die wesentlichen Pentose-Stoffwechselwege fehlen. Folglich besteht die Möglichkeit zur genetischen Manipulation dieses Organismus für die Fermentation von Xylose zu Ethanol.
- Um die Ethanolproduktion durch Fermentation zu steigern, wurden Versuche genetischer Manipulation durchgeführt, indem Gene einer Spezies auf eine andere übertragen wurden. Siehe hierzu beispielsweise die US-Patente Nr. 5,000,000 und 5,028,539. Genklonierung und Expression verschiedener Enzyme, einschließlich Enzyme zum Anlegen eines neuen Stoffwechselweges, sind ebenso bekannt. Siehe hierzu beispielsweise die US-Patente Nr. 5,272,073, 5,041,378, 5,168,056 und 5,226,475. Allerdings hat keine dieser Entdeckungen den fermentierbaren Substratbereich eines Mikroorganismus, welcher zuvor nicht in der Lage war, Xylose zu Ethanol zu fermentieren, erfolgreich erweitert.
- Frühere Versuche, einen Xylosestoffwechselweg von anderen Xanthomonaden oder Klebsiellen in Zymomonas einzubringen, waren nicht erfolgreich und die rekombinanten Stämme waren unfähig, auf Xylose als der einzigen Kohlenstoffquelle zu wachsen (Feldmann et al., 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 354–361; Liu et al., 1988, J. Biotechnol. 7: 61–77).
- Der Wildtyp-Z. mobilis fermentiert nur Glukose, Sukrose und Fruktose und ist nicht in der Lage, Pentosen wie D-Xylose und L-Arabinose zu verwerten. Enzymatische Analysen zeigten, dass es Z. mobilis an denjenigen funktionsfähigen Pentose-Stoffwechselwegen fehlt, die erforderlich sind, um D-Xylose und L-Arabinose zu fermentieren. Wir haben durch Einbringen und Exprimieren von vier Genen, welche die D-Xylose-assimilierenden Enzyme, Xylose-Isomerase und Xylulokinase, sowie die Enzyme des Pentose-Phosphat-Weges, Transaldolase und Transketolase, kodieren, den Xylose-fermentierenden Z. mobilis entwickelt (Picataggio et al.,
US 5,514,583 ). Durch Einbringen der Gene, die Xylose-Isomerase und Xylulokinase kodieren, kann Xylose in Xylulose-5-P umgesetzt werden. Durch Einbringen zweier weiterer Gene, welche die Enzyme des Pentose-Phosphat-Wegs kodieren, umfassend Transaldolase und Transketolase, kann Xylulose-5-P im Weiteren in diejenigen Schlüsselzwischenprodukte umgesetzt werden, die den Pentosemetabolismus mit dem glykolytischen Entner-Douderoff-Weg und infolgedessen mit der Ethanolherstellung verbinden. Unabhängig davon haben wir durch Einbringen von fünf Genen, welche die L-Arabinose-assimilierenden Enzyme, L-Arabinose-Isomerase, L-Ribulokinase und L-Ribulose-5-Phosphat-4-Epimerase sowie die Enzyme des Pentose-Phosphat-Wegs, Transaldolase und Transketolase kodieren, den Arabinose-fermentierenden Z. mobilis entwickelt (US 08/421,996). Durch Einbringen der Gene, die L-Arabinose-Isomerase, L-Ribulokinase und L-Ribulose-5-Phosphat-4-Epimerase kodieren, kann Arabinose in Xylulose-5-P umgewandelt werden. Gleichermaßen kann durch Einbringen der Gene, welche die Enzyme des Pentose-Phosphat-Wegs, nämlich Transaldolase und Transketolase, kodieren, Xylulose-5-P im Weiteren in diejenigen Schüsselzwischenprodukte umgesetzt werden, die den Pentosemetabolismus mit dem glykolytischen Entner-Douderoff-Weg und infolgedessen mit der Ethanolherstellung verbinden. - EP-A-0 737 742 betrifft Mikroorganismen, die naturgemäß keine Pentosezucker fermentieren und die genetisch dahingehend verändert wurden, dass sie Pentosezucker fermentieren, um Ethanol herzustellen, sowie Fermentationsverfahren, welche diese verwenden. Beispiele schließen Zymomonas mobilis ein, welche mit Kombinationen von E. coli-Genen für Xylose-Isomerase, Xylulokinase, Transaldolase, Transketolase, L-Arabinose-Isomerase, L-Ribulokinase und L-Ribulose-5-Phosphat 4-Epimerase transformiert wurden. Die Expression der hinzugefügten Gene erfolgte unter der Steuerung von Zymomonas mobilis-Promotoren. Diese Mikroorganismen sind nützlich zum Fermentieren von Pentosen und Glukose, die durch Hydrolyse aus Hemizellulose und Zellulose gewonnen werden, um Ethanol herzustellen.
- BOTHAST R. J. et al.: "FERMENTATION OF L-ARABINOSE, D-XYLOSE AND D-GLUCOSE BY ETHANOLOGENIC RECOMBINANT KLEBSIELLA OXYTOCA STRAIN P2" BIOTECHNOLOGY LETTERS, KEW, SURREY, GB, Bd. 16, Nr. 4. 1. April 1994 (1994-04-01), Seiten 401–406, XP000651597, ISSN: 0141-5492, offenbart eine Evaluierung des rekombinanten Klebsiella oxytoca-Stammes P2, der für seine Fähigkeit, Arabinose, Xylose und Glukose, alleine und in Gemischen, in pH-kontrollierten Batch-Fermentationen zu fermentieren, Gene der Pyruvat-Dekarboxylase und Alkoholdehydrogenase von Zymomonas mobilis trug. Dieser Organismus produziert 0,34–0,43 g Ethanol/g Zucker bei pH 6,0 und 30°C auf 8%-igem Zuckersubstrat und zeigte Präferenz für Glukose. Die Zuckerverwertung war Glukose > Arabinose > Xylose, und die Ethanolproduktion war Xylose > Glukose > Arabinose.
- Offenbarung der Erfindung
- Die vorliegende Erfindung stellt einen einzelnen Zymomonas mobilis-Biokatalysator bereit, der in der Lage ist, sowohl Xylose als auch Arabinose, zusammen mit Glukose, in Ethanol umzusetzen. Sieben Gene (Xylose-Isomerase, Xylulokinase, L-Arabinose-Isomerase, L-Ribulokinase, L-Ribulose-5-P-4-Epimerase, Transketolase und Transaldolase), welche die Enzyme kodieren, die zum Umsetzen von Xylose und Arabinose in bekannte Zwischenprodukte des zentralen Glykolysewegs von Zymomonas erforderlich sind, wurden gleichzeitig unter der Steuerung starker, ihre Expression regulierende Promotoren in Zymomonas eingebracht, auch unter Anwesenheit von Glukose. Der neu erzeugte Stamm kann auf entweder Xylose, Arabinose oder Glukose als einzige Kohlenstoffquellen anwachsen und diese zu Ethanol fermentieren und fermentiert bei 30°C ohne pH-Kontrolle ein Gemisch aus 1% Glukose, 2% Xylose und 2% Arabinose zu Ethanol mit ungefähr 90% der theoretischen Ausbeute.
- Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, durch Einbringen und Exprimieren der Gene von sowohl Xylose-assimilierenden Enzymen, Xylose-Isomerase und Xylulokinase, sowie L-Arabinose-assimilierenden Enzymen, L-Arabinose-Isomerase, L-Ribulokinase und L-Ribulose-5-Phosphat-4-Epimerase, sowie von Enzymen des Pentose-Phosphat-Wegs, Transaldolase und Transketolase in Z. mobilis, diesem zu ermöglichen, sowohl Xylose als auch Arabinose zu fermentieren. Die klonierten Gene können auf einer beliebigen Anzahl von Vektoren bereitgestellt werden, sind aber vorzugsweise in einem einzelnen Plasmidvektor enthalten. Noch bevorzugter sind die Gene in das Wirtsgenom integriert.
- Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Kulturen von Mikroorganismen mit den vorstehend beschriebenen Fähigkeiten. Die Kulturen können biotechnologisch rein sein oder mit anderen Stämmen verschiedener Organismen oder einem Gemisch von Substraten versetzt sein, die beim Verstoffwechseln der Substrate in Ethanol behilflich sind.
- Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines neu erzeugten Stammes, der auf entweder Xylose, Arabinose oder Glukose als einzige Kohlenstoffquellen wachsen und diese zu Ethanol fermentieren kann.
- Ein zusätzlicher Aspekt der Erfindung besteht darin, einen neuen Zymomonas-Stamm bereitzustellen, der für diese Lignozellulose-haltigen Rohstoffe nützlich sein wird, welche signifikante Mengen beider Pentosezuckern enthalten (wie Switchgras, Weizenstroh, Maiskolben, Getreidefasern und Malztreber).
- Kurze Beschreibung der Figuren:
-
1 zeigt ein Schema eines Verfahrens, dass es Z. mobilis durch Einbringen und Exprimieren der Gene von sowohl Xylose-assimilierenden Enzymen, Xylose-Isomerase und Xylulokinase, sowie L-Arabinose-assimilierenden Enzymen, L-Arabinose-Isomerase, L-Ribulokinase und L-Ribulose-5-Phosphat-4-Epimerase, als auch von den Enzymen des Pentose-Phosphat-Wegs, Transaldolase und Transketolase, in Z. mobilis erlaubt, sowohl Xylose als auch Arabinose zu fermentieren. -
2 zeigt die Plasmidkarten von pZB301, pZB401, pZB402 und pZB403. -
3 zeigt Ethanolausbeuten unter Verwendung eines Kontroll-Zymomonas mobilis und dem vorliegenden rekombinanten Stamm beim Wachsen auf bestimmten Zuckern oder einem Gemisch aus bestimmten Zuckern als Kohlenstoffquelle. - Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
- Die Erfindung betrifft die Bereitstellung von Plasmiden aller sieben Gene, Xylose-Isomerase, Xylulokinase, L-Arabinose-Isomerase, L-Ribulokinase, L-Ribulose-5-Phosphat-4-Epimerase, Transaldolase und Transketolase unter der Steuerung starker, konstitutiver Z. mobilis-Promotoren, die eine hohe Expression aller Gene erlauben, sowie von transformierten Z. mobilis. Dabei werden Xylose-Isomerase und Xylulokinase durch den Z. mobilis-Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAP)-Promotor in einem Pgap-xylA xylB-Operon reguliert; L-Arabinose-Isomerase, L-Ribulokinase sowie L-Ribulose-5-Phosphat-4-Epimerase werden ebenso durch den Z. mobilis-GAP-Promotor in einem Pgap-xylA xylB-Operon reguliert; Transaldolase und Transketolase werden durch den Z. mobilis-Enolase (ENO)-Promotor in einem Peno-tal/tkt-Operon kontrolliert.
- Beispiel I
- Auswahl geeigneter Z. mobilis-Wirte für Transformation und Expression von Arabinose- und Xylose-verwertenden Genen
- Während der Wildtyp-Stamm von Z. mobilis 39676, transformiert mit pZB4L, welches die Gene für vier Xylose-metabolisierende Enzyme trägt, den Xyl+-Phänotyp erwarb, vermittelte die Transformation von pZB206 in den Wildtyp-Z. mobilis 39676 die Fähigkeit, auf L-Arabinose-haltigen Medien zu wachsen, nicht. Es war offensichtlich, dass beim Konstruieren des Arabinose-fermentierenden Z. mobilis 39676 (pZB206)-Stammes auf der chromosomalen DNA (ein) Mutationsereignis(se) aufgetreten ist (sind), das (die) zusätzlich zum Exprimieren der Ara-Gene in Z. mobilis erforderlich ist (sind), um Ara+ zu verleihen. Entsprechend wurden Anstrengungen unternommen, um pZB206 vom Stamm 39676 (pZB206) zu reinigen und durch Kultivieren des Stammes in einem nicht-selektiven Medium (d. h. ohne Tetracyclin (Tc)) bei 37°C für etwa 20 Generationen einen geeigneten Wirtsstamm zu erhalten. Die vom Plasmid befreiten Zellen wurden bestätigt durch Testen ihrer Tc-Sensitivität und ihres Xyl–-Phänotyps durch Replica-Plattierung sowie durch ein Mini-Screening des Plasmids. Der von pZB206 gereinigte Stamm wurde als Z. mobilis 206C bezeichnet. Die Transformation dieses Stammes mit entweder pZB206 (Arabinose-Plasmid) (Seriennummer 08/421,996), pZB4 (Xylose-Plasmid) (Picataggio et al.,
US 5,514,583 ) oder pZB4L (Xylose-Plasmid) verlieh den entsprechenden Transformanten jeweils andere Ara+- und Xyl+-Phänotypen. Diese Ergebnisse zeigten, dass Z. mobilis 206C (eine) Mutation(en) aufwies, der/die zu Ara+-Phenotypen beitrug(en). Entsprechend wurde Z. mobilis 206C als der sowohl Arabinose- als auch Xylose-verwertende Gene exprimierende Wirt ausgewählt. - Beispiel II
- Expression von Xylose- und Arabinose-verwertenden Genen in Z. mobilis 206C
- Es wurden Plasmide konstruiert, die alle sieben Gene enthielten, nämlich Xylose-Isomerase, Xylulokinase, L-Arabinose-Isomerase, L-Ribulokinase, L-Ribulose-5-Phosphat-4-Epimerase, Transaldolase und Transketolase, jeweils unter der Steuerung starker konstitutiver Z. mobilis-Promotoren, die eine starke Expression sämtlicher Gene erlaubten, und Z. mobilis wurde transformiert. Dabei sind Xylose-Isomerase und Xylulokinase durch den Z. mobilis-Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogensae (GAP)-Promotor in einen Pgap-xylA xylB-Operon kontrolliert; L-Arabinose-Isomerase, L-Ribulokinase sowie L-Ribulose-5-Phosphat-4-Epimerase sind ebenso durch den Z. mobilis-GAP-Promotor in einem Pgap-xylA xylB-Operon kontrolliert; Transaldolase und Transketolase sind durch den Z. mobilis-Enolase (ENO)-Promotor in einem Peno-tal/tkt-Operon kontrolliert.
- Beispiel III
- Entwicklung eines einzelnen Stammes mit der Fähigkeit sowohl Xylose als auch Arabinose zu fermentieren
- Um einen einzelnen Stamm zu entwickeln, der die Fähigkeit besitzt, sowohl Xylose als auch Arabinose zu fermentieren, wurde ein einzelnes Plasmid konstruiert, das Xylose- und Arabinose-verwertende Gene enthielt, welche Xylose-Isomerase, Xylulokinase, L-Arabinose-Isomerase, L-Ribulokinase, L-Ribulose-5-Phosphat-4-Epimerase, Transaldolase sowie Transketolase einschließen. Das Xylose-Plasmid pZB4 wurde mit NotI partiell verdaut, gefolgt durch Ligation mit einem Gel-gereinigten 4,4 kb NotI-Fragment, welches das Pgap-araBAD-Operon aus pZB206 enthielt. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli B/r araA- zu elektroporieren, und die Zellen wurden auf MacConkey-Platten, die L-Arabinose und Tc enthielten, ausplattiert.
- Die Ara+Tcr-Transformanten wurden auf Anwesenheit des korrekten Pgap-araBAD-Operoninserts in pZB4 untersucht. Die DNA-Analyse der Transformanten zeigte, dass das NotI-Insert, welches das Pgap-araBAD-Operon enthielt, upstream vom Pgap-xyl AxylB-Operon im Uhrzeigersinn in die NotI-Schnittstelle inseriert wurde. Das resultierende Plasmid, bezeichnet als pZB301 (
2 ), wurde anschließend verwendet, um Z. mobilis zu elektroporieren. Z. mobilis 206C, transformiert mit pZB301, war in der Lage, in der Anwesenheit von Tc auf Medien zu wachsen, die entweder L-Arabinose oder D-Xylose als einzige Kohlenstoffquelle enthielten. - Beispiel IV
- Präparation eines einzelnen Plasmids, das Xylose- und Arabinose-verwertende Gene enthält und auf dem anderen Xylose-Plasmid pZBL basiert
- Es wurden Anstrengungen unternommen, um ein einzelnes Plasmid zu konstruieren, das Xylose- und Arabinose-verwertende Gene enthält und das auf dem anderen Xylose-Plasmid pZB4L basiert. Auf ähnliche Weise wurde pZB4L mit NotI verdaut, gefolgt von Ligation mit einem Gel-gereinigten 4,4 kb-NotI-Fragment, welches das Pgap-araBAD-Operon von PZB206 enthielt. E. coli HB101 (anstelle von B/r ara A-) wurde mit dem Ligationsgemisch elektroporiert, gefolgt von Selektion auf MacConkey+ara+Tc-Platten. Die Ara+Tcr-Transformanten wurden auf Anwesenheit des korrekten Pgap-araBAD-Operoninserts in pZB4L untersucht. DNA-Analyse ergab drei unterschiedliche Orientierungen des Inserts. Diese Plasmide wurden bezeichnet als pZB401, pZB402 und pZB403 (
2 ) und wurden anschließend verwendet, um Z. mobilis 206C zu elektroporieren. Z. mobilis 206C, transformiert mit pZB401, pZB402 oder pZB403, waren in der Lage, in Anwesenheit von To auf Medien zu wachsen, die entweder L-Arabinose oder D-Xylose enthielten. - Eine enzymatische Analyse bestätigte, dass alle sieben Enzyme, verglichen mit dem den Vektor pZB186 enthaltenden Kontrollstamm, stark exprimiert wurden (Tabelle 1). Tabelle 1. Zusammenfassung der enzymatischen Assays
- 1Zellen wurdwnbei OD600 = 1,2 geerntet.
- 2nd = nicht nachgewiesen
- Fermentation der kombinierten Xylose- und Arabinose-fermentierenden Z. mobilis-Stämme
- Um die Fermentation dieser neu konstruierten kombinierten Xylose- und Arabinose-fermentierenden Z. mobilis-Stämme zu untersuchen, wurden für die Stämme 206C(pZB301), 206C(pZB401), 206C(pZB402) sowie 206C(pZB403) Fermentationen statisch bei 30°C ohne pH-Kontrolle in Flaschen mit 80 ml RM+Tc, welche Gemische von 2% Arabinose + 2% Xylose oder 1% Glukose + 2% Arabinose + 2% Xylose enthielten, durchgeführt.
- In Abwesenheit von Glukose fermentierten alle vier Stämme ein Gemisch aus 2% Xylose und 2% Arabinose bei einer Ethanolausbeute (im Verfahren) von 63–66% in etwa 48 Stunden. Die Ethanolausbeute, basierend auf verbrauchten Zuckern, variierte zwischen 0,45 bis 0,48 g/g. Die niedrige Verfahrensausbeute resultierte aus Rest-Arabinose, die offensichtlich von einem Absinken des pH während der ohne pH-Kontrolle durchgeführten Fermentation herrührte. Obwohl es nicht klar ist, ob sowohl Arabinose als auch Xylose durch das gleiche Zuckertransportsystem in die Zellen transportiert werden, scheint es, dass die Anwesenheit der Arabinose die Xylose-Verwertung und vice versa nicht inhibiert. Die Zucker werden gleichzeitig verwertet. Allerdings ist die Verwertungsrate von Xylose verglichen mit Arabinose wesentlich höher. Ein repräsentatives Fermentationsprofil ist in
3 dargestellt. - In der Anwesenheit von 1% Glukose fermentierten alle vier Stämme ein Gemisch aus 2% Xylose und 2% Arabinose mit einer Ethanolausbeute (Verfahren) von 72–75% in etwa 48 Stunden. Die auf verbrauchten Zuckern basierende Ethanolausbeute variierte zwischen 0,44 und 0,48 g/g. Glukose wird mit höherer Geschwindigkeit als Xylose und Arabinose bevorzugt verwertet. Das Wachstum startete früher und erreichte eine etwa 1,6-2-fach höhere OD für alle Stämme gegenüber Abwesenheit von Glukose. Es scheint offensichtlich, dass der Zusatz von Glukose die Pentose-Verwertung erleichtert und zu höheren Verfahrensausbeuten führt.
Claims (11)
- Ein Mikroorganismus der Gattung Zymomonas, der exogene für Xylose-Isomerase, Xylulokinase, L-Arabinose-Isomerase, L-Ribulokinase, L-Ribulose-5-Phosphat-4-Epimerase, Transaldolase und Transketolase kodierende Gene enthält und ferner mindestens einen Promotor umfasst, der von Zymomonas erkannt wird, welcher die Expression mindestens eines der Gene reguliert, wobei der Mikroorganismus fähig ist, auf Arabinose und Xylose als Kohlenstoffquelle zu wachsen und Arabinose und Xylose mit ungefähr 75% der theoretischen Ausbeute zu Ethanol zu fermentieren und wobei der Mikroorganismus ohne diese Gene unfähig ist, auf Arabinose und Xylose zu wachsen oder diese zu Ethanol zu fermentieren.
- Ein Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei die für Xylose-Isomerase, Xylulokinase, Transaldolase und Transketolase kodierenden Gene aus Bakterien gewonnen wurden, die aus der aus Xanthomonas, Klebsiella, E. coli, Rhodobacter, Flavobacterium, Acetobacter, Gluconcobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Salmonella und Pseudomonaden bestehenden Gruppe ausgewählt wurden.
- Ein Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei die Gene in ein Wirtsgenom integriert sind.
- Ein Mikroorganismus gemäß Anspruch 1, wobei die Gene auf einem Vektor enthalten sind.
- Ein Mikroorganismus gemäß Anspruch 4, wobei Xylose-Isomerase und Xylulokinase unter der Steuerung eines auf Glyceraldehyd-3-Phosphat basierenden Dehydrogenase-Promotors in einem von Zymomonas erkannten Pgap-xylA xylB-Operon-Promotor exprimiert werden; L-Arabinose-Isomerase, L-Ribulokinase, L-Ribulose-5-Phosphat-4-Epimerase werden ebenfalls unter der Steuerung des Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase-Promotors in einem von Zymomonas erkannten Pgap-xylA xylB- Operon exprimiert; und Transaldolase und Transketolase werden unter der Steuerung eines Enolase-Promotors in einem von Zymomonas erkannten Peno-tal/tkt-Operon exprimiert.
- Ein Vektor, der für Xylose-Isomerase, Xylulokinase, L-Arabinose-Isomerase, L-Ribulokinase, L-Ribulose-5-Phosphat-4-Epimerase, Transaldolase und Transketolase kodierende Gene und mindestens einen von Zymomonas erkannten Promotor umfasst, der die Expression dieser Gene reguliert.
- Ein Vektor gemäß Anspruch 6, wobei die Enzyme Xylose-Isomerase und Xylulokinase durch einen Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase-Promotor in einem von Zymomonas erkannten Pgap-xylA xylB-Operon reguliert werden.
- Ein Vektor gemäß Anspruch 6, wobei die für L-Arabinose-Isomerase, L-Ribulokinase und L-Ribulose-5-Phosphat--Epimerase kodierenden Gene durch einen Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase-Promotor in einem von Zymomonas erkannten Pgap-xylA xylB-Operon reguliert werden.
- Ein Vektor gemäß Anspruch 6, wobei die für Transaldolase und Transketolase kodierenden Gene durch einen Enolase-Promotor in einem von Zymomonas erkannten Peno-tal/tkt-Operon reguliert werden.
- Ein Mikroorganismus gemäß Anspruch 2, wobei die für Xylose-Isomerase, Xylulokinase, Transaldolase und Transketolase kodierenden Gene aus E. coli gewonnen werden.
- Verwendung des Mikroorganismus der Gattung Zymomonas gemäß Anspruch 1, um Xylose und/oder Arabinose, zusammen mit Glukose, die aus einem zellulosehaltigen Biomasse-Rohmaterial produziert wird, zu Ethanol zu fermentieren.
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