DE69833061T2 - Aktivierte Peptide und deren Konjugate - Google Patents

Aktivierte Peptide und deren Konjugate Download PDF

Info

Publication number
DE69833061T2
DE69833061T2 DE69833061T DE69833061T DE69833061T2 DE 69833061 T2 DE69833061 T2 DE 69833061T2 DE 69833061 T DE69833061 T DE 69833061T DE 69833061 T DE69833061 T DE 69833061T DE 69833061 T2 DE69833061 T2 DE 69833061T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
peptide
group
acid
amino
hydroxy groups
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69833061T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69833061D1 (de
Inventor
Michael E. Mansfield Annunziato
Paul S. West Newton Palumbo
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Original Assignee
Dade Behring Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dade Behring Inc filed Critical Dade Behring Inc
Application granted granted Critical
Publication of DE69833061D1 publication Critical patent/DE69833061D1/de
Publication of DE69833061T2 publication Critical patent/DE69833061T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf besondere Peptide, die mit einer Maleinimidstruktur konjugiert sind.
  • Zahlreiche Assays zum Nachweis und zur Bestimmung von Proteinen, z.B. Antikörpern, in biologischen Flüssigkeiten wurden entwickelt. Eine Klasse, die Immunoassays, die sich zu einem unschätzbaren Werkzeug in der Diagnostik entwickelt haben, beruht auf dem Prinzip der spezifischen Bindung von Antikörpern an Haptenen und/oder Antigenen. In einem typischen Immunoassay werden eine Testprobe, die einen interessierenden Analyten enthält, und einen Antikörper, an den der Analyt spezifisch bindet, miteinander inkubiert und dann gewaschen, um freien und gebundenen Analyten voneinander zu trennen. Ein enzymmarkierter Antikörper, der den resultierenden Komplex erkennt, wird hinzugefügt, es wird inkubiert und gewaschen, und schließlich wird Substrat, ein Enzymnachweissystem, hinzugefügt, und der markierte Komplex wird nachgewiesen und bestimmt.
  • Konjugate von Peptiden, die spezifisch für Antikörper sind, werden in Immunoassays mit Vorteil verwendet. WO 93/22677 und M.E. Annunziato et al., Bioconjugate Chemistry 4, 5. 212–218 (1993), beschreiben ausschließlich Konjugate, die Peptide umfassen, welche über ihre internen Aminogruppen mit einer Maleinimid-Struktureinheit konjugiert sind. Das Maleinimid in den Konjugaten bindet jedoch unspezifisch an verschiedene Gruppen der Peptide. Konjugate von Peptidanaloga von viralen Proteinen, d.h. Segmente der Proteine, die die Epitopsequenz tragen, zum Beispiel von den humanen Immunschwächeviren (HIV), und markierten Enzymen, die über eine Maleinimid-Struktureinheit damit verknüpft sind, wurden als besonders vorteilhaft beim Nachweis und der Bestimmung von Antikörpern gegen HIV beschrieben. Siehe US-Patent 5,294,536, erteilt an Paul S. Palumbo am 15. März 1994 (536er Patent), WO 93/09252, DE-A-4405810 und WO 93/03376. Die Konjugate von aktivierten Peptiden, die nach den im 536er Patent beschriebenen Verfahren hergestellt werden, sind nicht homogen, da die aktivierten Peptide von der terminalen Aminogruppe und/oder den internen Amino- und Hydroxygruppen des Peptidanalogons abgeleitet sind. Eine Wechselwirkung der internen Amino- und/oder Hydroxygruppen des Peptidanalogons und des Vernetzungsmittels neben derjenigen der terminalen Aminogruppe reduziert die Wirksamkeit der epitopischen Zentren des Peptidanalogons, wodurch die Empfindlichkeit des Assays zum Nachweis und zur Bestimmung von spezifisch bindenden Antikörpern reduziert wird. Zum Beispiel reduziert die Wechselwirkung der Aminogruppe der Lysin-Untereinheit und/oder der Amino- und Hydroxy-Untereinheiten der Serin-Untereinheit des Epitopsegments des Peptidanalogons des Virus HIV und des Vernetzers die Empfindlichkeit des Immunoassays in Bezug auf den Nachweis oder die Bestimmung von Antikörpern gegen HIV, und je größer die Wechselwirkung der internen Amino- und/oder Hydroxygruppe relativ zur terminalen Aminogruppe, desto geringer die Empfindlichkeit des Assays. Die Verfahren zur Herstellung von aktivierten Peptiden 3 und Konjugaten 5, die in dem oben genannten 536er Patent, WO 93/22677 und in Bioconjugate Chemistry 4, S. 212–218 (1993), beschrieben sind, beinhalten die Kondensation eines Isocyanatomaleinimids 1
    Figure 00020001
    wobei X eine Spacergruppe ist, mit einem Peptid, das eine terminale Aminogruppe der Formel 2 RNH2 2 aufweist, wobei R der Rest des Peptids ist, unter Bildung eines aktivierten Peptids 3
    Figure 00030001
    wobei R und X wie oben definiert sind, das dann mit einem thiolierten Enzym der Formel 4 R1SH 4kondensiert wird, wobei R1 der Rest eines Enzyms ist, so dass ein Konjugat der Formel 5
    Figure 00030002
    entsteht, wobei X, R und R1 wie oben definiert sind. Der entscheidende Schritt bei dem Verfahren, die Reaktion des Vernetzers 1 mit einem Peptid 2, das durch die Anwesenheit einer terminalen Aminogruppe und von internen Amino- und/oder Hydroxygruppen gekennzeichnet ist, liefert ein aktiviertes Peptid 3, das von der terminalen Aminogruppe abgeleitet ist, sowie aktivierte Peptide, die von den internen Amino- und/oder Hydroxygruppen des Peptids abgeleitet sind, und Kombinationen davon. Es hat sich jetzt gezeigt, dass bei der Durchführung der Reaktion des Isocyanatomaleinimids 1 mit einem Peptid 2 als Salz einer starken Protonensäure das aktivierte Peptid im Wesentlichen frei von aktivierten Pepti den, die von internen Amino- und/oder Hydroxygruppen abgeleitet sind, z.B. von Serin oder Lysin, gebildet wird, d.h. die Reaktion findet fast ausschließlich an der terminalen Aminogruppe des Peptids 2 statt, wobei regiospezifisch ein aktiviertes Peptid 3 entsteht, bei dem das Epitopsegment des Peptids 2 im Wesentlichen intakt ist.
  • Es hat sich jetzt ebenfalls gezeigt, dass die Integrität des bindenden Bereichs des aktivierten Peptids 3 im Konjugat 5 aufrechterhalten wird und dass die Verwendung des im Wesentlichen homogenen Konjugats 5 der Erfindung in einem Immunoassay zu einer merklichen Verbesserung der Empfindlichkeit des Assays führt.
  • Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Verbindungen der Formel
    Figure 00040001
    wobei X eine C1- bis C10-Alkylengruppe, eine aromatische carbocyclische Gruppe oder eine gesättigte carbocyclische Gruppe ist und R der Rest eines regiospezifischen Peptids ist, das eine terminate Aminogruppe sowie (i) freie und interne Aminogruppen, (ii) freie und interne Hydroxygruppen oder (iii) freie und interne Amino- und Hydroxygruppen aufweist, wobei die Verbindung im Wesentlichen frei von aktivierten Peptiden ist, die interne Aminogruppen, Hydroxygruppen oder Amino- und Hydroxygruppen, die an das Kohlenstoffatom der Amid-Carbonylgruppe gebunden sind, umfassen; wobei R1 weiterhin der Rest eines Enzyms ist, das durch die Anwesenheit einer Thiolgruppe gekennzeichnet ist, über die es an die 3-Position der Maleinimid-Struktureinheit gebunden ist, wobei die Verbindung im Wesentlichen homogen ist, wobei das Peptid ein Salz einer Protonensäure ist.
  • Die obigen Verbindungen stellen Konjugate von aktivierten Peptiden der Formel 5
    Figure 00050001
    dar, wobei X eine C1- bis C10-Alkylengruppe, eine aromatische carbocyclische Gruppe oder eine gesättigte carbocyclische Gruppe ist, R der Rest eines regiospezifischen Peptids ist, das eine terminale primäre Aminogruppe sowie freie interne Hydroxy- und/oder Aminogruppen aufweist, und R1 der Rest eines Enzyms ist, das eine freie Thiolgruppe aufweist. Diese Verbindungen/Konjugate sind für den Nachweis und die Bestimmung von Antikörpern in interessierenden Proben geeignet, welche mit humanen Immunschwächeviren in Zusammenhang stehen. Diese Verbindungen/Konjugate können aus aktivierten Peptiden 3
    Figure 00050002
    wobei R und X wie oben definiert sind, hergestellt werden.
  • Bevorzugte Verbindungen/Konjugate von aktivierten Peptiden 5 sind solche, bei denen X eine aromatische Struktureinheit ist; am meisten bevorzugt sind Verbindungen/Konjugate, bei denen X Phenyl ist und R der Rest eines Peptidanalogons ist, das eine terminale Aminogruppe aufweist und aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden besteht:
    Figure 00060001
  • In der gesamten Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen bezieht sich der Ausdruck "Alkylen" auf einen geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoff mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Beispiele für Alkyfengruppen sind Methylen
    Figure 00070001
  • Der Ausdruck "α-Aminosäure" bezieht sich auf eine Verbindung, die durch die Anwesenheit einer Carbonsäuregruppe und einer an dasselbe Kohlenstoffatom gebundenen α-Aminogruppe gekennzeichnet ist
    Figure 00070002
  • Beispiele für Aminosäuren sind Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Proline (oder Hydroxyprolin), Phenylalanin, Tryptophan, Methionin, Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin, Glutamin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin und Histidin.
  • Der Ausdruck "Peptid" bezieht sich auf Polymere von zwei oder mehr Aminosäuren, die über die Carboxylgruppe einer Aminosäure und die Aminogruppe einer anderen unter Eliminierung von Wasser kovalent miteinander verknüpft sind. Beispiele für Peptide sind diejenigen, die hier im Sequenzprotokoll zusammengestellt sind.
  • Der Ausdruck "Protein" bezieht sich auf ein Makromolekül aus einer oder mehreren Ketten von Aminosäuren, die über Peptidbindungen
    Figure 00070003
    kovalent aneinander gebunden sind. Zu den Proteinen gehören Enzyme, Antikörper, Antigene, Peptide und dergleichen.
  • Der Ausdruck "Hapten" bezieht sich auf eine niedermolekulare Verbindung, die spezifisch mit einem Antikörper reagiert, aber keine Antikörperproduktion stimuliert, es sei denn, sie ist mit einem Trägerprotein komplexiert.
  • Der Ausdruck "Antigen" bezieht sich auf eine Substanz oder Spezies (gewöhnlich ein Protein), die die direkte Produktion von Antikörpern induziert.
  • Der Ausdruck "Spacergruppe" bezieht sich auf eine Struktureinheit, die die Isocyanato- und Maleinimidgruppen miteinander verbrückt und die Protein- und thiolierte Enzym-Struktureinheit eines Konjugats miteinander verknüpft. Beispiele für Spacergruppen sind Alkylen (wie oben definiert), aromatische Carbocyclen, wie Phenyl oder Naphthyl, das gegebenenfalls eine Alkylengruppe für die Bindung an die Maleinimid-Struktureinheit sowie Dimethylamino-, Methoxy-, Ethoxy-, Methyl-, Ethyl-, Sulfonamido-, Sulfonsäuresubstituenten aufweist, und Gesättigte Carbocyclen, wie Cyclohexyl, Cyclohexylalkyl, Cyclopentyl, Cyclopentylalkyl, Cycloheptyl, Cycloheptylalkyl.
  • Der Ausdruck "regiospezifisch" bezieht sich auf einen Vorgang, bei dem ein spezifisches Struktur- oder Stellungsisomer gebildet wird und andere mögliche Isomere im Wesentlichen ausgeschlossen sind.
  • Der Ausdruck "Rest", wenn er auf Peptide angewendet wird, bezieht sich auf die Struktureinheit, die an deren terminale Aminogruppe gebunden ist, zum Beispiel die terminale Aminogruppe der terminalen Glycin-Struktureinheit der hier gezeigten Sequenz von Aminosäuren:
    Figure 00080001
  • Der Ausdruck "Rest", wenn er auf ein Enzym mit einer freien Thiolgruppe angewendet wird, bezieht sich auf die Struktureinheit, die an seine Thiolgruppe gebunden ist, zum Beispiel bei spezifischen Enzymen, wie β-D-Galactosidase, Peroxidase, Glucose-Oxidase und Alkalische Phosphatase, bei denen eine Thiolgruppe eingeführt wurde.
  • Die N-terminal aktivierten Peptide 3 werden hergestellt durch In-Kontakt-Bringen eines Isocyanatomaleinimids 1 mit einem Peptid 2 als Salz einer starken Protonensäure, das im Rest freie Amino- und/oder Hydroxygruppen aufweist, die zur Wechselwirkung mit der Isocyanato-Struktureinheit des Vernetzers 1 befähigt sind, in einem geeigneten Lösungsmittel unter Bedingungen, bei denen die terminale Aminogruppe regioselektiv mit der Isocyanato-Struktureinheit des Vernetzers 1 reagiert, ohne dass eine wesentliche Wechselwirkung der internen Amino- und/oder Hydroxygruppen mit der Isocyanato-Struktureinheit erfolgt. Zu den starken Protonensäuren gehören Halogenwasserstoffsäuren, wie Bromwasserstoffsäure und Chlorwasserstoffsäure. Zu diesen Säuren gehören auch Halogenessigsäuren, zum Beispiel Trichloressig- und Trifluoressigsäure. Halogenessigsäuren sind bevorzugt. Trifluoressigsäure ist am meisten bevorzugt.
  • Eine Vielzahl von Peptiden 2, die eine terminale Amino-Struktureinheit enthalten, sind kommerziell erhältlich, viele als Salze von Trifluoressigsäure. In dem Fall, dass das Peptid 2 nicht als Trifluoressigsäuresalz verfügbar ist, können Halogenwasserstoffsäure- und Halogenessigsäuresalze nach herkömmlichen Verfahren hergestellt werden.
  • Zu den geeigneten Lösungsmitteln gehören dipolar aprotische Lösungsmittel, zum Beispiel Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Hexamethylphosphoramid oder Dimethylsulfoxid. Dimethylformamid ist das bevorzugte Lösungsmittel.
  • Die Reaktion einer terminalen Aminogruppe eines Peptids 2 mit einem Vernetzer 1 wird bei einer Temperatur durchgeführt, die mit der Stabilität der Reaktanten verträglich ist und die im Allgemeinen anhand der Stabilität des Peptids 2 bestimmt wird. Typischerweise wird die Reaktion bei 30°C durchgeführt.
  • Die relativen Mengen des Peptids 2 und des Vernetzers 1 sind nicht entscheidend. Mit einem etwa dreifachen Überschuss des Vernetzers 1 zum Peptid 2 werden gute Ausbeuten des aktivierten Peptids 3 erhalten.
  • Die Reaktion eines Peptids 2 und eines Vernetzers 1 wird mit herkömmlichen Verfahren aufgearbeitet, und das Produkt wird mit bekannten chromatographischen Techniken gereinigt, zum Beispiel Umkehrphasen-HPLC (HPLC = high performance liquid chromatography).
  • Das aktivierte Peptid 2 wurde durch verschiedene spektrale Techniken, zum Beispiel Massenspektrometrie, analysiert, und die Regiospezifität der Reaktion des Vernetzers 1 mit der N-terminalen Aminogruppe des Peptids 2 wurde durch Abbau mit Aminopeptidase und Trypsin in Kombination mit massenspektrometrischen Analysen festgestellt. Siehe zum Beispiel K. Arar et al., Tetrahedron Letters, 34, 8087 (1993), Lit. 15, und B. Keil in The Enzymes, P.D. Boyer (Hrsg.), Vol. III, Academic Press, New York, NY, 1971, Kapitel 8, wegen einer Diskussion dieser Verfahren zur Bestimmung der Reaktionsstelle eines Peptid, das mehrere Amino- und/oder Hydroxygruppen aufweist, mit einem Vernetzer, wie einem Isocyanatomaleinimid 1.
  • Die Ausbeuten an dem aktivierten Peptid 3, das durch die Reaktion eines Isocyanatomaleinimids 1 mit einem Peptid 2 hergestellt wird, sind gleichmäßig hoch, wobei die anhand von chromatographischen Techniken bestimmten Rohausbeuten in den Bereich von etwa 49 bis etwa 91% fallen und die isolierbaren Ausbeuten in den Bereich von etwa 47 bis etwa 60% fallen.
  • Die Reinheit der aktivierten Peptide 3, der Kondensationsprodukte von Isocyanatomaleinimiden 1 und N-terminalen Peptiden 2, wurde durch Umkehrphasen-HPLC (HPLC = high performance liquid chromatography) festgestellt.
  • Die Verbindungen/Konjugate 5 der vorliegenden Erfindung sind für ELISA (enzyme-linked immunoassays) zum Nachweis und zur Bestimmung von Proteinen, z.B. Antikörpern, insbesondere Antikörpern gegen humane Immunschwächeviren in einem ELISA-Modul des OPUS®-Systems, geeignet. Siehe H.J. Crowley und M.A. Bandin in The Immunoassay Handbook, D. Wild (Hrsg.), Stockton Press, New York, NY, 1994, Seite 197. In einem solchen Assay werden zum Beispiel ein interessierender Analyt in einer biologischen Probe, z.B. ein Antikörper, und das Konjugat miteinander inkubiert, auf einen Antikörper-Abfangträger aufgetragen, mit einem Substrat gewaschen, inkubiert und nachgewiesen. Insbesondere werden die interessierende Probe, die einen Antikörper gegen einen humanen Immunschwächevirus enthält, und das Konjugat eines Peptids, das von einem Glycoprotein eines humanen Immunschwächevirus abgeleitet ist, miteinander inkubiert, auf eine Matrix eines Fusionsproteins aufgetragen, mit Methylumbelliferylphosphat gewaschen, inkubiert, und die Menge des Konjugats, das an den peptidspezifischen Antikörper gebunden ist, wird durch Fluorimetrie nachgewiesen und bestimmt.
  • Enzyme, die eine Thiolgruppe enthalten, wie β-D-Galactosidase, und solche, die keine enthalten, wie Peroxidase, Glucose-Oxidase und Alkalische Phosphatase, in die ein Thiol eingeführt werden kann, können in Konjugation mit aktivierten Peptiden eingesetzt werden.
  • Die Peptid-Ausgangsmaterialien sind aus kommerziellen Quellen erhältlich.
  • Die Erfindung wird nun in Bezug auf spezielle bevorzugte Ausführungsformen anhand von Beispielen näher beschrieben.
  • Beispiel 1
  • N-Terminale Aktivierung des Peptids BC202 (SEq ID Nr. 2) mit p-Maleinimidbenzolisocyanat
  • Das synthetische Peptid BC202 (SEQ ID Nr. 2), das aus 36 Aminosäuren mit einer internen Disulfidschleife besteht, ist vom HIV-2-Genom abgeleitet und ist ein Teil des Hüllproteins gp36. Ein N-terminales Arginin, internes Lysin und Serin und ein C-terminales Serin sind potentielle Stellen für eine Aktivierung mit p-Maleinimidbenzolisocyanat (PMBI). In diesem Beispiel wurden 7,1 mg des Trifluoressigsäuresalzes von BC202 in 1,42 ml trockenem Dimethylformamid gelöst. Zu der Lösung wurde ein dreifacher molarer Überschuss (1,09 mg) an p-Maleinimidbenzolisocyanat in 0,109 ml Dimethylformamid hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min lang bei 30°C inkubiert, 5 min lang bei 30°C mit 4,59 ml entionisiertem Wasser inkubiert und zentrifugiert. Der Niederschlag wurde aufgefangen, und die Mutterlauge wurde durch Umkehrphasen-HPLC mit einem linearen Gradienten von 30% bis 35% Acetonitril in 0,06% Trifluoressigsäure während 30 min gereinigt. Die Fließgeschwindigkeit betrug 4,7 ml/min, und die Trennung wurde bei 220 nm und 280 nm überwacht. Die geeigneten Fraktionen wurden aufgefangen und eingedampft. Der Rückstand wurde getrocknet, was das aktivierte Peptid als Pulver ergab; HPLC-Ausbeute 94%, isolierte Ausbeute 60%.
  • Das aktivierte Peptid wurde durch Massenspektrometrie, Abbau mit Aminopeptidase, Abbau mit Trypsin in Kombination mit Massenspektrometrie, Rücktitration mit Mercaptoethanol und Reaktion mit 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) analysiert und für funktionelle Tests in einem HIV-2-Assay mit Alkalischer Phosphatase konjugiert.
  • Die Reaktions- und Trennbedingungen für die Herstellung des aktivierten Peptids der Erfindung, das nach Verfahren hergestellt wird, die den im Beispiel beschriebenen im Wesentlichen ähnlich sind, und die Ausbeuten der so erhaltenen Produkte sind in der Tabelle zusammengefasst.
  • Tabelle
    Figure 00130001
    • (%) stellt die isolierten Ausbeuten nach dem Vereinigen und Trocknen dar. Jeder Wert ist ein Mittelwert aus zwei Durchläufen.
  • * Quelle
    • D-23-N (SEQ ID Nr. 7), Neosystems S.A., Strasbourg, Frankreich;
    • D-24-N (SEQ ID Nr. 3), Neosystems S.A., Strasbourg, Frankreich;
    • N-23-N (SEQ ID Nr. 4), Neosystems S.A., Strasbourg, Frankreich;
    • BC80 (SEQ ID Nr. 1), BioChem Immunosystems Inc., Montreal, Kanada;
    • BCH132 (SEQ ID Nr. 9), BioChem Immunosystems Inc., Montreal, Kanada;
    • BCH408 (SEQ ID Nr. 6), BioChem Immunosystems Inc., Montreal, Kanada;
    • BCH178 (SEQ ID Nr. 8), BioChem Immunosystems Inc., Montreal, Kanada;
    • BC202 (SEQ ID Nr. 2), BioChem Immunosystems Inc., Montreal, Kanada; und
    • BCH87 (SEQ ID Nr. 5), BioChem Immunosystems Inc., Montreal, Kanada.
  • ** Chromatographie-Eluent
    • 30% B – eine Lösung von 30 Vol.-% einer Lösung von 0,06 Vol.-% Trifluoressigsäure in Acetonitril und 70 Vol.-% einer Lösung von 0,06 Vol.-% Trifluoressigsäure in entionisiertem Wasser.
    • 15% B – eine Lösung von 15 Vol.-% einer Lösung von 0,06 Vol.-% Trifluoressigsäure in Acetonitril und 85 Vol.-% einer Lösung von 0,06 Vol.-% Trifluoressigsäure in entionisiertem Wasser.
    • 25% B – eine Lösung von 25 Vol.-% einer Lösung von 0,06 Vol.-% Trifluoressigsäure in Acetonitril und 75 Vol.-% einer Lösung von 0,06 Vol.-% Trifluoressigsäure in entionisiertem Wasser.
    • 32% B – eine Lösung von 32 Vol.-% einer Lösung von 0,06 Vol.-% Trifluoressigsäure in Acetonitril und 68 Vol.-% einer Lösung von 0,06 Vol.-% Trifluoressigsäure in entionisiertem Wasser.
    • 35% B – eine Lösung von 35 Vol.-% einer Lösung von 0,06 Vol.-% Trifluoressigsäure in Acetonitril und 65 Vol.-% einer Lösung von 0,06 Vol.-% Trifluoressigsäure in entionisiertem Wasser.
    • 37% B – eine Lösung von 37 Vol.-% einer Lösung von 0,06 Vol.-% Trifluoressigsäure in Acetonitril und 63 Vol.-% einer Lösung von 0,06 Vol.-% Trifluoressigsäure in entionisiertem Wasser.
    • 40% B – eine Lösung von 40 Vol.-% einer Lösung von 0,06 Vol.-% Trifluoressigsäure in Acetonitril und 60 Vol.-% einer Lösung von 0,06 Vol.-% Trifluoressigsäure in entionisiertem Wasser.
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00150001
  • Figure 00160001
  • Figure 00170001
  • Figure 00180001
  • Figure 00190001
  • Figure 00200001

Claims (5)

  1. Verbindung der Formel
    Figure 00210001
    wobei X eine C1- bis C10-Alkylengruppe, eine aromatische carbocyclische Gruppe oder eine gesättigte carbocyclische Gruppe ist und R der Rest eines regiospezifischen Peptids ist, das eine terminale Aminogruppe sowie (i) freie und interne Aminogruppen, (ii) freie und interne Hydroxygruppen oder (iii) freie und interne Amino- und Hydroxygruppen aufweist, wobei die Verbindung im Wesentlichen frei von aktivierten Peptiden ist, die interne Aminogruppen, Hydroxygruppen oder Amino- und Hydroxygruppen, die an das Kohlenstoffatom der Amid-Carbonylgruppe gebunden sind, umfassen; wobei R1 weiterhin der Rest eines Enzyms ist, das durch die Anwesenheit einer Thiolgruppe gekennzeichnet ist, über die es an die 3-Position der Maleinimid-Struktureinheit gebunden ist, wobei die Verbindung im Wesentlichen homogen ist, wobei das Peptid ein Salz einer Protonensäure ist.
  2. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei das Enzym thioliert ist.
  3. Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei die Protonensäure eine Halogenwasserstoff- oder Halogenessigsäure ist.
  4. Verbindung gemäß Anspruch 3, wobei es sich bei der Halogenwasserstoffsäure um Bromwasserstoff- oder Chlorwasserstoffsäure handelt.
  5. Verbindung gemäß Anspruch 3, wobei es sich bei der Halogenessigsäure um Trichloressig- oder Trifluoressigsäure handelt.
DE69833061T 1997-04-07 1998-04-02 Aktivierte Peptide und deren Konjugate Expired - Lifetime DE69833061T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US833546 1997-04-07
US08/833,546 US5977299A (en) 1997-04-07 1997-04-07 Activated peptides and conjugates

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69833061D1 DE69833061D1 (de) 2006-03-30
DE69833061T2 true DE69833061T2 (de) 2006-08-31

Family

ID=25264718

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69833061T Expired - Lifetime DE69833061T2 (de) 1997-04-07 1998-04-02 Aktivierte Peptide und deren Konjugate
DE69816241T Expired - Lifetime DE69816241T2 (de) 1997-04-07 1998-04-02 Aktivierte peptide und konjugate

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69816241T Expired - Lifetime DE69816241T2 (de) 1997-04-07 1998-04-02 Aktivierte peptide und konjugate

Country Status (6)

Country Link
US (2) US5977299A (de)
EP (2) EP0920443B1 (de)
JP (1) JP4120846B2 (de)
DE (2) DE69833061T2 (de)
ES (2) ES2202829T3 (de)
WO (1) WO1998045318A1 (de)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999062945A2 (en) * 1998-06-05 1999-12-09 Peptide Solutions, Inc. Peptide antigens for detection of hiv, hcv and other microbial infections
US6210908B1 (en) * 1998-11-11 2001-04-03 Dade Behring Marburg Gmbh Activated peptides and conjugates
WO2001063299A1 (en) * 2000-02-23 2001-08-30 Besst-Test Aps METHOD FOR CORRELATING BLOOD COAGULATION ACTIVITY WITH MARKERS IN BODY FLUIDS, e.g. URINE
US6913890B2 (en) * 2002-12-18 2005-07-05 Palo Alto Research Center Incorporated Process for preparing albumin protein conjugated oligonucleotide probes
US9332802B2 (en) 2011-12-30 2016-05-10 Ticona Llc Molded polymer articles for use in low temperatures having a low rigidity factor
EP2647666A1 (de) 2012-04-05 2013-10-09 Ticona GmbH Tribologisch modifiziertes Polyoxymethylen
WO2013169351A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Ticona Llc Polymer composition and articles for use in low temperature environments that are wear resistant
WO2014015111A1 (en) 2012-07-18 2014-01-23 Ticona Llc Wear resistant thermoplastic copolyester elastomer
JP6905515B2 (ja) 2015-09-30 2021-07-21 セラニーズ・セールス・ジャーマニー・ゲーエムベーハー 低摩擦できしり音のないアセンブリ

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5066782A (en) * 1986-01-22 1991-11-19 Institut Pasteur Retrovirus capable of causing AIDS, means and method for detecting it in vitro
US5574132A (en) * 1991-04-05 1996-11-12 Biochem Immunosystems Inc. Peptides and mixtures thereof for detecting antibodies to hepatitis C virus (HCV)
NZ243636A (en) * 1991-07-29 1993-06-25 Iaf Biochem Int Immunoassay and kit for simultaneously detecting antibodies to hiv-1, hiv-2, htlv-1 and htlv-11
WO1993009252A1 (en) * 1991-11-04 1993-05-13 Baxter Diagnostics Inc. Synthetic peptides corresponding to portions of hiv-2 virus and methods of using in an improved assay
US5294536A (en) * 1992-04-23 1994-03-15 Pb Diagnostic Systems, Inc. Conjugates
DE4405810A1 (de) * 1994-02-23 1995-08-24 Behringwerke Ag Von einem Retrovirus aus der HIV-Gruppe abgeleitete Peptide und deren Verwendung

Also Published As

Publication number Publication date
ES2254820T3 (es) 2006-06-16
US6593453B2 (en) 2003-07-15
EP1336616B1 (de) 2006-01-04
EP1336616A1 (de) 2003-08-20
DE69833061D1 (de) 2006-03-30
EP0920443A1 (de) 1999-06-09
US5977299A (en) 1999-11-02
ES2202829T3 (es) 2004-04-01
WO1998045318A1 (en) 1998-10-15
JP4120846B2 (ja) 2008-07-16
JP2000515169A (ja) 2000-11-14
EP0920443B1 (de) 2003-07-09
US20030004320A1 (en) 2003-01-02
DE69816241T2 (de) 2004-04-15
DE69816241D1 (de) 2003-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0720614B1 (de) Metallkomplexe mit geladenem linker
Kroon et al. Identification of sites of degradation in a therapeutic monoclonal antibody by peptide mapping
Ressler et al. The Isoglutamine Isomer of Oxytocin: Its Synthesis and Comparison with Oxytocin1
CH652411A5 (de) Verfahren zur herstellung eines human-interferon-antikoerpers, danach hergestellte antikoerper und ihre verwendung.
DE69833061T2 (de) Aktivierte Peptide und deren Konjugate
JPH04500361A (ja) アミノ―またはアミドアルキルマレイミド、アミドアルキルマレイミドとペプチドまたはタンパク質との複合体またはヘテロ二官能性複合体の製法
DE60113445T2 (de) Substanzen mit verzweigten linkermolekülen
AU662627B2 (en) Novel compounds and conjugates
DE10111224B4 (de) Analoge der Ecstasy-Klasse sowie Verwendung derselben beim Nachweis von Verbindungen der Ecstasy-Klasse
DE102005051976B4 (de) Kit für hoch-sensitive Nachweisassays
JPH11505804A (ja) Ｉ型コラーゲンの架橋結合されたｎ−テロペプチドの合成ペプチド同族体
Hofstetter et al. A labeling, detection, and purification system based on 4-hydroxyazobenzene-2-carboxylic acid: An extension of the avidin–biotin system
US4608252A (en) Chloramphenicol derivatives antigens and antibodies
JP2960257B2 (ja) ビオチン導入試薬およびそれを用いる合成ペプチド精製法
US5340718A (en) Method for assaying a human muscular dystrophy protein
DE69627942T2 (de) Polypeptide und Reagenzien zur Messung von Komponenten eines Lebenskörpers durch deren Gebrauch
Johnson et al. Site-specific fluorescein-labeled cobra alpha-toxin. Biochemical and spectroscopic characterization.
US6210908B1 (en) Activated peptides and conjugates
US20030186847A1 (en) Insulin derivatives and synthesis thereof
US4489157A (en) Chloramphenicol derivatives
DE3417413A1 (de) Dicarbonsaeure-monohydrazid-derivate, ihre herstellung und ihre verwendung als kopplungskomponenten
Pandurangi et al. Chemistry of Bifunctional Photoprobes: 4. Synthesis of the Chromogenic, Cleavable, Water Soluble, and Heterobifunctional Sulfosuccinimidyl (N-methylamino Perfluoroaryl Azido Benzamido)-ethyl-1, 3′-Dithiopropionate: An Efficient Protein Cross-Linking Agent
Imai et al. Photoaffinity heterobifunctional crosslinking reagents based on azide-substituted salicylates
WO2000012554A1 (fr) Procede de synthese d'une chimiokine marquee, chimiokine marquee et trousse d'analyse
DE19534988A1 (de) Verfahren zur Herstellung und Anwendung synthetischer, biotinylierter Peptide

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: SIEMENS HEALTHCARE DIAGNOSTICS INC., DEERFIELD, US

8328 Change in the person/name/address of the agent

Representative=s name: PLATE SCHWEITZER ZOUNEK PATENTANWAELTE, 65203 WIES