DE69828832T2

DE69828832T2 - Verfahren zur Reinigung von synthetischen Oligonukleotiden

Info

Publication number: DE69828832T2
Application number: DE69828832T
Authority: DE
Inventors: M. Paraweswara Brea Reddy; Firdous Brea Farooqui
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1997-03-12
Filing date: 1998-03-11
Publication date: 2005-07-07
Anticipated expiration: 2018-03-12
Also published as: EP0866072A1; DE69828832D1; CA2230296A1; EP0866072B1; US5770723A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Reagenzien zum Synthetisieren und Reinigen von Oligonukleotiden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Reagenzien und Verfahren zum Reinigen synthetischer Oligonukleotide unter Verwendung von Umkehrphasen-Reinigungstechnologien.
Während des letzten Jahrzehnts ist die Verfügbarkeit von Oligonukleotiden für Molekularbiologen und Zellbiologen immer wichtiger geworden. Um den wachsenden Bedarf für Oligonukleotide zu decken, hat sich die Technologie synthetischer Oligonukleotide entwickelt. Diese Technologie umfasst neue Nukleotidderivate, die in einer bausteinartigen Weise zur Bildung synthetischer Oligonukleotide und mit ihrer Synthese zusammenhängender Reagenzien reagieren können.
Ein gebräuchliches Syntheseverfahren umfasst das aufeinander folgende Hinzufügen von Nukleotidderivaten an eine wachsende Oligonukleotidkette, die an einer Endgruppe an einen festen Träger gebunden ist. Sobald die gewünschte Oligonukleotidsequenz hergestellt worden ist, umfasst das Syntheseverfahren typischerweise das Entschützen von vorher geschützten aktiven Aminogruppen und das Abspalten des Oligonukleotids von dem festen Träger. Bis vor kurzem war das gebräuchlichste Entschützungs- und Abspaltungsreagenz Ammoniumhydroxid. Während Ammoniumhydroxid-Abspaltungs- und Entschützungsreaktionen gute Ausbeuten mit wenigen Nebenreaktionen liefern, ist die Kinetik dieser Reaktionen sehr langsam und erfordert etwa 4 Stunden zum Entschützen und Abspalten von neu synthetisierten Oligonukleotiden. Um diesen unerwünschten langsamen Verarbeitungsschritt nach der Synthese zu beseitigen, wurden neue Entschützungs- und Abspaltungsreagenzien entwickelt. Insbesondere haben Methylamin-enthaltende Reagenzien die Zeit für das Entschützen und das Abspalten drastisch verringert.
Das Schützen von Oligonukleotiden und ihre anschließende Abspaltung von festen Trägern und das Entschützen mit Alkylaminreagenzien sind in der WO 95/14029 beschrieben. Ein besonders bevorzugtes Reagenz umfasst Methylamin und t-Butylamin. Die solubilisierten, entschützten Oligomere wurden anschließend unter Verwendung eines Sep Pak-DNA-Reinigungskits, bei dem ein Ammoniumacetatpuffer verwendet worden ist, gereinigt, wobei die Produkte unter Verwendung von Methanol in entionisiertem Wasser eluiert wurden.
Die Synthese von Oligonukleotiden ist auch in der WO 95/24413 beschrieben. Die Abspaltungs- und Entschützungsreagenzien, die für die trägergebundenen Oligonukleotide verwendet werden, umfassten MeNH₃/NH₄OH. Das abgespaltene und entschützte Produkt wurde anschließend mittels HPLC unter Verwendung eines Ammoniumacetatpuffers gereinigt.
Reagenzien zum Abspalten und Entschützen unsolubilisierter und geschützter synthetischer Oligonukleotide sind in der US-A-5,518,651 beschrieben. Reagenzgemische (MeNH₃/NH₄OH) werden zum Abspalten eines trägergebundenen Oligonukleotids oder dessen Entschützung beansprucht. Ein darin beschriebenes bevorzugtes Reagenz umfasst t-Butylamin als Mittel zur Unterdrückung einer Transaminierung. Es wird die Reinigung solubilisierter entschützter Oligomere mit einem Sep Pak-DNA-Reinigungskit beschrieben.
Ein Nachteil, der mit Methylamin-enthaltenden Abspaltungs- und Entschützungsreagenzien verbunden ist, ist die offensichtliche Verminderung der Ausbeute an Oligonukleotiden, die unter Verwendung von Umkehrphasen-Techniken gereinigt worden sind. In einem typischen Umkehrphasen-Reinigungsverfahren umfasst die Reinigung von Oligonukleotiden das Beladen des Oligonukleotids auf eine Umkehrphasen-Patrone und das Eluieren des gereinigten Oligonukleotids. Funktionelle Gruppen, gewöhnlich lipophile Tritylgruppen an den Oligonukleotiden, gehen eine hydrophobe Wechselwirkung mit der Umkehrphasen-Patrone ein. Die Effizienz der Umkehrphasen-Patronenreinigung hängt zum Teil von der Stärke dieser hydrophoben Wechselwirkungen ab. Wenn Methylamin-enthaltende Entschützungs- und Abspaltungsreagenzien verwendet werden, stört das Methylamin in der Lösung des synthetisierten Oligonukleotids, wenn diese durch die Umkehrphasen-Reinigungspatrone hindurchtritt, die hydrophobe Wechselwirkung des Oligonukleotids mit der Umkehrphasen-Reinigungspatrone in einem größeren Maß als in dem Fall, bei dem das stärker hydrophile Ammoniumhydroxid die einzige Komponente des Entschützungs- und Abspaltungsreagenzes ist. Die verminderte hydrophobe Wechselwirkung des Oligonukleotids mit der Umkehrphasen-Patrone führt zu einer geringen Rückgewinnung der synthetisierten Oligonukleotide in den Eluenten der Patrone.
Demgemäß besteht ein Bedarf zur Bereitstellung von Verfahren zum Herstellen gereinigter synthetischer Oligonukleotide mit hohen Ausbeuten unter Verwendung von Umkehrphasen-Reinigungstechnologien. Es besteht auch ein Bedarf für Oligonukleotid-Entschützungs- und -Abspaltungsreagenzien, die eine schnelle Entschützungs- und Abspaltungskinetik aufweisen und zusätzlich hohe Ausbeuten gereinigter Oligonukleotide liefern, wenn sie in Verbindung mit Umkehrphasen-Reinigungstechniken verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung erfüllt die vorstehend beschriebenen Bedürfnisse durch die Bereitstellung von Verfahren und Reagenzien, die dann, wenn sie in Oligonukleotid-Syntheseverfahren eingesetzt werden, zur schnellen Erzeugung und einer hohen Ausbeute gereinigter Oligonukleotide beitragen. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Reagenzien beruhen auf der Erkenntnis, dass dann, wenn schnelle, Methylamin-enthaltende Entschützungs- und Abspaltungsreagenzien in einer Kombination mit Umkehrphasen-Oligonukleotidreinigungstechniken eingesetzt werden, die Gegenwart bestimmter Salze die Ausbeute an gereinigtem Oligonukleotid signifikant erhöht.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit, die das Hinzufügen von Natriumchlorid und/oder Ammoniumacetat zu einem synthetisierten Oligonukleotid umfassen, das mit einem Methylamin-enthaltenden Abspaltungs- und Entschützungsreagenz behandelt worden ist. Das Natriumchlorid und/oder Ammoniumacetat wird bzw. werden der Oligonukleotidlösung vor der Reinigung des Oligonukleotids unter Verwendung von Umkehrphasen-Technologien hinzugefügt. Vorzugsweise ist das synthetisierte Oligonukleotid an einer Endgruppe an einen festen Träger gebunden und weist geschützte exocyclische Amino-Funktionalitäten auf, so dass der Behandlungsschritt zu einem Entschützen der geschützten Aminofunktionalitäten und einem Abspalten des synthetischen Oligonukleotids von dem festen Träger führt. Das Hinzufügen von Natriumchlorid und/oder Ammoniumacetat vor dem Reinigungsschritt verbessert die Rückgewinnung eines gereinigten synthetischen Oligonukleotids von einer Umkehrphasen-Reinigungspatrone signifikant.
Der zusätzliche Schritt des Hinzufügens von Natriumchlorid und/oder Ammoniumacetat zu dem behandelten Oligonukleotid wird vermieden und ein einziges Reagenz kann sowohl für das Behandeln als auch für das Reinigen eines synthetischen Oligonukleotids mit einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform verwendet werden, bei der das synthetisierte Oligonukleotid mit einem Methylamin- und Natriumchlorid- und/oder Ammoniumacetat-enthaltenden Abspaltungs- und Entschützungsreagenz behandelt wird. Die Gegenwart von Natriumchlorid in dem Behandlungsschritt weist jedoch den Effekt auf, dass es die Entschützungs- und Abspaltungskinetik verlangsamt. Demgemäß ist eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsform ein Verfahren zum Herstellen eines gereinigten synthetisierten Oligonukleotids, welches das Behandeln synthetisierter Oligonukleotide mit einer Zusammensetzung aus Methylamin und Ammoniumacetat, das Beladen des entschützten und abgespaltenen Oligonukleotids auf eine Umkehrphasen-Reinigungspatrone, das Eluieren des Oligonukleotids von der Umkehrphasen-Patrone und das Rückgewinnen des gereinigten synthetischen Oligonukleotids aus dem Eluat der Umkehrphasen-Reinigungspatrone umfasst.
Die erfindungsgemäßen Entschützungs- und Abspaltungsreagenzien umfassen Zusammensetzungen aus Methylamin und einem Additiv aus Ammoniumacetat und/oder Natriumchlorid. Das Methylamin ist vorzugsweise eine Lösung von etwa 40 Gew.-% Methylamin in Wasser und das Additiv ist vorzugsweise etwa 0,5 M in Wasser. In bevorzugten Ausführungsformen enthält die Entschützungs- und Abspaltungsreagenzzusammensetzung etwa 40 Gew.-% wässriges Methylamin und etwa 0,5 M Ammoniumacetat in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 9. Eine mehr bevorzugte Ausführungsform des Entschützungs- und Abspaltungsreagenzes ist etwa 40 Gew.-% Methylamin und etwa 0,5 M Ammoniumacetat in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 3. Eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsform ist ein Reagenz mit etwa 40 Gew.-% Methylamin und etwa 0,5 M Ammoniumacetat in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 3.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und Reagenzien können in vorteilhafter Weise in einer Kombination mit bekannten Syntheseverfahren zur Bereitstellung eines entschützten, abgespaltenen und gereinigten synthetischen Oligonukleotids in hohen Ausbeuten verwendet werden.
Die vorstehenden Merkmale und zusätzliche Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden detaillierten Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen.
Die 1 zeigt HPLC-Diagramme, welche die Entschützungskinetik eines 21mer-Oligonukleotids zeigen, das nach erfindungsgemäßen Ausführungsformen behandelt worden ist.
Die 2 zeigt Kapillarelektrophorese-Diagramme für ein 21mer-Oligonukleotid, das nach erfindungsgemäßen Ausführungsformen gereinigt worden ist.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien bereit, die zur Synthese von Oligonukleotiden geeignet sind. Wenn die vorliegende Erfindung im Zusammenhang mit der Abspaltung und/oder dem Entschützen synthetisierter Oligonukleotide in Kombination mit Umkehrphasen-Reinigungstechniken verwendet wird, stellt die vorliegende Erfindung eine schnelle Entschützungs- und Abspaltungskinetik und gereinigte synthetische Oligonukleotide mit hoher Ausbeute bereit. Insbesondere wird die vorliegende Erfindung während Oligonukleotid-Syntheseverfahren durchgeführt, die das Synthetisieren eines Oligonukleotids mit bekannten Standard-Syntheseverfahren umfassen, einschließlich unter anderem den bekannten Phosphoramidit-Syntheseverfahren. Es ist bekannt, dass in solchen Verfahren nach dem Zugeben des letzten Nukleotids während des aufeinander folgenden Hinzufügens von Nukleotiden zu einer wachsenden Oligonukleotidkette ein Entschützen geschützter exocyclischer Amine an den Oligonukleotiden durchgeführt wird. In Verfahren, bei denen die Synthese mit der an einen festen Träger gebundenen Oligonukleotidkette durchgeführt wird, wird der Entschützungsschritt mit dem gleichen Reagenz und gleichzeitig mit einem Abspaltungsschritt durchgeführt, bei dem das vervollständigte Oligonukleotid von dem festen Träger abgespalten wird. Nach den Entschützungs- und Abspaltungsvorgängen folgt nach diesen Verfahren typischerweise ein Reinigungsschritt. In den meisten Verfahren umfasst der Reinigungsschritt das Eluieren des synthetisierten, entschützten und abgespaltenen Oligonukleotids in dem Entschützungs- und Abspaltungsreagenz durch eine Umkehrphasen-Reinigungspatrone.
Die vorliegende Erfindung stellt verbesserte Verfahren und Reagenzien zum Entschützen, Abspalten und Reinigen synthetisierter Oligonukleotide bereit. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen in vorteilhafter Weise entschützte und abgespaltene Oligonukleotide in sehr schnellen Entschützungs- und Abspaltungsreaktionen bereit. Als zusätzliches Merkmal stellen die erfindungsgemäßen Reagenzien ein gereinigtes Oligonukleotid in einer hohen Ausbeute bereit.
Insbesondere und in einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung das Hinzufügen einer Zusammensetzung, die ein Additiv umfasst, zu einem behandelten synthetischen Oligonukleotid vor der Reinigung unter Verwendung von Umkehrphasen-Techniken bereit. Das Oligonukleotid wurde vorzugsweise mit einem Methylamin-enthaltenden Entschützungs- und Abspaltungsreagenz behandelt, das eine sehr schnelle Entschützungs- und Abspaltungskinetik aufweist. Das Additiv kann Ammoniumacetat und/oder Natriumchlorid sein und das synthetische Oligonukleotid weist vorzugsweise exocyclische Aminogruppen auf, die in an sich bekannter Weise mit einer Aminoschutzgruppe geschützt sind. Vorzugsweise ist das Oligonukleotid am 3'- oder 5'-Ende an einen festen Träger gebunden. In Oligonukleotid-Syntheseverfahren, die ferner einen Reinigungsschritt umfassen, wird ein solcher Schritt durch Beladen des abgespaltenen und entschützten Oligonukleotids in der wässrigen Lösung aus Methylamin und Additiv auf eine Reinigungssäule durchgeführt. Vorzugsweise ist die Reinigungssäule eine Umkehrphasen-Patrone. Dem Fachmann sind die vielen verschiedenen Umkehrphasen-Patronen und deren Verwendung bekannt. Geeignete Patronen umfassen die C₈-C₁₈-Patrone, die von Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien; Glen Research, Sterling, Virginia, oder Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, Kalifornien, erhältlich ist. Nach dem Beladen des abgespaltenen und entschützten Oligonukleotids auf die Chromatographiepatrone wird das Eluieren des Oligonukleotids von der Säule unter Verwendung eines wässrig-organischen Lösungsmittelsystems wie z. B. einer Kombination aus Acetonitril und Wasser erreicht. Nachdem die Lösung des abgespaltenen und entschützten Oligonukleotids von der Säule eluiert worden ist, wird eine Rückgewinnung des gereinigten Oligonukleotids durch einfaches Verdampfen des Lösungsmittels zur Trockne erreicht. Die Rückgewinnung des resultierenden gereinigten Oligonukleotids ist bezüglich herkömmlicher Reinigungsverfahren verbessert.
Wenn das geschützte Oligonukleotid zusätzlich zu den geschützten exocyclischen Aminogruppen geschützte Funktionalitäten enthält, wie z. B. geschützte Hydroxylgruppen, umfasst die vorliegende Erfindung vorzugsweise ferner das Entschützen der geschützten Hydroxyfunktionalität nach dem Beladen des abgespaltenen und entschützten Oligonukleotids auf die Umkehrphasen-Patrone und vor dem Eluieren des Oligonukleotids von der Umkehrphasen-Patrone. Wenn beispielsweise das 5'-OH mit DMT oder einer anderen bekannten Gruppe geschützt ist, wird das OH durch Entschützen der säurelabilen Gruppe mit einer geeigneten Säure freigesetzt. Wenn DMT die Schutzgruppe ist, findet in der Umkehrphasen-Patrone vor dem Eluieren durch Detritylieren mit einer wässrigen Trifluoressigsäurelösung eine Detritylierung statt.
In bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen enthält die Methylamin-enthaltende Zusammensetzung zum Behandeln des synthetisierten Oligonukleotids ferner Ammoniumhydroxid. Ammoniumhydroxid ist als 29 Gew.-%ige wässrige Lösung von Aldrich Chemical Company erhältlich. Wenn in der Zusammensetzung zur Behandlung des Oligonukleotids Ammoniumhydroxid vorliegt, ist ein Volumenverhältnis von Ammoniumhydroxid zu dem 40 Gew.-%igen wässrigen Methylamin (das ebenfalls von Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin, erhältlich ist) von 1 : 1 bevorzugt. Diese Ammoniumhydroxid- und Methylaminzusammensetzung, die als AMA bezeichnet wird, stellt ein schnelles Abspalten und Entschützen der synthetisierten Oligonukleotide bereit. Erfindungsgemäß führt das Hinzufügen bestimmter Salze vor der Reinigung unter Verwendung einer Umkehrphasen-Patrone zu hohen Ausbeuten des gereinigten synthetischen Oligonukleotids.
Die hinzugefügten Salze können fest sein oder es kann sich um wässrige Lösungen von Natriumchlorid und/oder Ammoniumacetat handeln. In bestimmten Ausführungsformen werden 0,5 M-Lösungen von Natriumchlorid und/oder Ammoniumacetat mit der Lösung des behandelten Oligonukleotids derart vereinigt, dass das Volumenverhältnis von Methylamin oder AMA in der Lösung des behandelten Oligonukleotids und der zugesetzten wässrigen Salzlösung bei etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 9 liegt. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis von Methylamin oder AMA zu Natriumchlorid oder Ammoniumacetat etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 3. Insbesondere be trägt das Verhältnis von Methylamin oder AMA zu Natriumchlorid oder Ammoniumacetat etwa 1 : 3.
In einem anderen Aspekt der Erfindung ist es vorteilhaft, zur Behandlung und Reinigung synthetisierter Oligonukleotide ein einziges Reagenz zu verwenden. Auf diese Weise wird der Schritt des Hinzufügens von Salzen zu dem behandelten synthetisierten Oligonukleotid vor der Reinigung in einer Umkehrphasen-Patrone ausgeschlossen. In dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das synthetisierte Oligonukleotid mit einer Zusammensetzung aus Methylamin oder AMA behandelt, die Natriumchlorid oder Ammoniumacetat enthält.
Es wurde jedoch gefunden, dass das Hinzufügen von Natriumchlorid zu der Zusammensetzung zur Behandlung des synthetisierten Oligonukleotids die Entschützungskinetik des Behandlungsschritts verlangsamte. Demgemäß besteht eine bevorzugte Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung darin, synthetisierte Oligonukleotide mit einer Zusammensetzung zu behandeln, die Methylamin oder AMA und ein Ammoniumacetat-umfassendes Additiv umfasst.
In dieser bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist die Entschützungs- und Abspaltungsreaktion schnell und erfordert nur etwa 5 min bei 65°C und wird typischerweise durch In-Kontakt-Bringen eines festen Trägers, der das geschützte und gebundene Oligonukleotid enthält, mit einer wässrigen Lösung aus etwa 40 Gew.-% Methylamin (oder etwa 1 : 1 40 Gew.-%iges Methylamin : 29 Gew.-%iges Ammoniumhydroxid) und einem Additiv durchgeführt, das Ammoniumacetat umfasst. Nach der Behandlung mit Methylamin oder AMA und der Ammoniumacetatlösung werden die exocyclischen Aminogruppen entschützt und das Oligonukleotid wird von dem festen Träger abgespalten.
Gemäß der vorstehenden Beschreibung umfassen die erfindungsgemäßen Reagenzien Zusammensetzungen aus wässrigem Methylamin und mindestens einem Additiv, das aus Ammoniumacetat und Natriumchlorid ausgewählt ist. In bevorzugten Ausführungsformen enthält die Lösung etwa 40 Gew.-% Methylamin in Wasser und etwa 0,5 M Ammoniumacetat oder 0,5 Natriumchlorid in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 3. Zusätzlich zu Methylamin können erfindungsgemäße Reagenzien ein Ammoniumhydroxid-Abspaltungs- und -Entschützungsreagenz enthalten. Erfindungsgemäße Ausführungsformen, die Ammoniumhydroxid enthalten, sind typischerweise Lösungen, die etwa 1 : 1 Methylamin : Ammoniumhydroxid und etwa 0,5 M Ammoniumacetat oder 0,5 Natriumchlorid in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 1 bis 1 : 9 enthalten. Bevorzugte Ausführungsformen enthalten Volumenverhältnisse von Methylamin oder AMA zu Ammoniumacetat oder Natriumchlorid von etwa 1 : 1 bis 1 : 3, wobei 1 : 3 das am meisten bevorzugte Verhältnis ist. Es sollte beachtet werden, dass die Konzentrationen der Komponentenlösungen, die in irgendeiner der vorstehenden Ausführungsformen verwendet werden, variiert werden können, so lange die relativen Mengen der Komponenten in der resultierenden Reagenzlösung gleich sind.
Die folgenden Beispiele, die nicht beschränkend aufzufassen sind, beschreiben die hier erläuterten Reagenzien und Verfahren ausführlicher und ermöglichen ein besseres Verständnis derselben.
Beispiel 1. Synthese von Oligonukleotiden
Oligonukleotide wurden auf einem ABI 394 DNA-Synthesizer mit einem Festphasenverfahren synthetisiert (Oligonucleotide Synthesis, a practical approach, herausgegeben von M. J. Gait, IRL Press, 1984). Die Synthese wurde in einem 0,2 μmol-Maßstab unter Verwendung von festen CPG-Trägern durchgeführt, die ein 3'-Nukleosid enthielten. Es wurden 5'-DMT A^bz, C^ac und G^ibu und T-Phosphoramidite verwendet und diese wurden während der Kupplungsreaktion mit Tetrazol aktiviert. Zur Oxidation wurde wässriges Iod und zum Maskieren der nicht umgesetzten 5'-Hydroxylgruppen wurde Essigsäureanhydrid mit N-Methylimidazol verwendet. Die DMT-Gruppe blieb nach dem Abschluss der Synthese mit dem festen Träger an dem Oligonukleotid für Reinigungszwecke zurück. Wenn die gewünschte Länge des Oligonukleotids erreicht worden war, wurde es abgespalten und entschützt, wie es im Beispiel 2 beschrieben ist.
Die folgenden Sequenzen wurden synthetisiert:
Beispiel 2. Abspaltung und Entschützung von Oligonukleotiden
Die gemäß Beispiel 1 auf festen Trägern synthetisierten Oligonukleotide wurden entweder mit konzentriertem NH₄OH (700 μl) für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder mit AMA (Ammoniumhydroxid/Methylamin 1 : 1 (700 μl) oder Methylamin (700 μl) für 5 min bei Raumtemperatur abgespalten (M. P. Reddy et al., Tetrahedron Letters, 1994, 35, 4311–4314). Das abgespaltene Oligonukleotid wurde in einem Fläschchen aufgenommen, das verschlossen wurde, und dann bei 65°C 3 Stunden zum Entschützen mit NH₄OH oder 5 min zum Entschüt zen mit AMA oder Methylamin erhitzt. Das abgespaltene und entschützte Oligonukleotid wurde gemäß Beispiel 3 gereinigt.
Beispiel 3. Reinigung von Oligonukleotiden unter Verwendung von Umkehrphasen-Patronen
Eine Umkehrphasen-Patrone (von ABI, Foster City, Kalifornien, Glen Research, Sterling, Virginia oder Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, Kalifornien erhalten) wurde mit einer 10 ml-Polypropylenspritze verbunden. Alle Anschlüsse wurden abgedichtet. Alle Lösungen wurden durch die an der Patrone montierte Spritze geschickt. Die Spritze wurde vor dem Entfernen des Kolbens von der Patrone entfernt und die Spritze wurde vor der nächsten Zugabe wieder eingesetzt. Die Patronen wurden mit einer Laborklammer immobilisiert. Es wurden die folgenden Schritte durchgeführt:

1. 5 ml Acetonitril wurden durch die Patrone laufen gelassen und verworfen.
2. 5 ml 2 M TEAA (Triethylammoniumacetat-Puffer) wurden durch die Patrone laufen gelassen und verworfen.
3. Die Ammoniaklösung (700 μl), die das Oligonukleotid enthielt, wurde mit einem gleichen Volumen Wasser (700 μl) verdünnt oder das AMA (700 μl) oder die Methylaminlösung (700 μl), die das Oligonukleotid enthielt, wurde mit der dreifachen Menge an 0,5 M NaCl (2,1 ml) oder 0,5 M Ammoniumacetatlösung (2,1 ml) verdünnt. Die verdünnte Lösung wurde mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 Tropfen pro Sekunde durch die Patrone laufen gelassen und das Eluat wurde gesammelt.
4. Das Eluat wurde ein zweites Mal durch die Patrone laufen gelassen.
5. 5 ml verdünntes Ammoniumhydroxid (1 : 9-Verdünnung von konzentriertem Ammoniumhydroxid in entionisiertem Wasser) wurden durch die Patrone laufen gelassen und verworfen, worauf 10 ml Wasser durchlaufen gelassen wurden.
6. Die Spritze wurde mit 5 ml 3%igem TFA (Trifluoressigsäure) in Wasser gefüllt und ein Teil wurde durchlaufen gelassen und verworfen, um eine Detritylierung zu bewirken. Die restliche Säure wurde 5 min in der Patrone stehengelassen und dann wurde der Rest durchgespült und verworfen.
7. 10 ml Wasser wurden durchlaufen gelassen und verworfen.
8. Das gereinigte, detritylierte Oligonukleotid wurde durch tropfenweises Durchlaufenlassen von 1,5 ml 20%iges Acetonitril durch die Patrone eluiert und gesammelt. Das gereinigte Oligonukleotid wurde durch Eindampfen zur Trockne gewonnen.

Die Effizienz der Umkehrphasen-Patronenreinigung wird durch die Daten in der Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1. Umkehrphasen-Patronenreinigung von Oligonukleotiden

AMA: Ammoniumhydroxid : Methylamin (1 : 1)

Das Ammoniumhydroxid ist eine 29%ige wässrige Lösung. Das Methylamin ist eine 40%ige wässrige Lösung. Beide sind von Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI, erhältlich.
Beispiel 4. Entschützungskinetik
Die im Beispiel 1 synthetisierten 21mer-Oligonukleotide wurden entweder mit AMA (1 : 1), das 0,5 M NaCl (700 μl) enthielt, oder mit AMA (1 : 1), das 0,5 M Ammoniumacetat enthielt, abgespalten und entschützt. Die Oligonukleotide wurden 5 min bei Raumtemperatur abgespalten und 5 min bei 65°C entschützt. Die Oligonukleotidlösungen wurden eingedampft und mit Phosphodiesterase und alkalischer Phosphatase 1 Stunde bei Raumtemperatur abgebaut und mittels Umkehrphasen-HPLC analysiert. Die Bedingungen für die HPLC waren: C₁₈-Microsorb-Säule (Rainin), 5 μm-Teilchen, 4,6 mm × 25 cm; die Flasche A enthielt 0,1 M Ammoniumacetat, pH 6,9; die Flasche B enthielt Acetonitril in HPLC-Qualität; Flussrate 1 ml/min, 0 bis 20 min Gradient bis 15% B, 20 bis 25 min Gradient bis 25% B, 25 bis 27 min Gradient bis 50% B, 27 bis 30 min Gradient bis 50% B und 30 bis 35 min Gradient bis 0% B. Die HPLC-Diagramme sind in der 1 gezeigt.
Die 1(a) zeigt die Entschützungskinetik eines 21mer-Oligonukleotids, das mit einer Lösung von AMA und 0,5 NaCl abgespalten und entschützt worden ist. Verbleibendes G^ibu zeigt, dass die Entschützung langsamer war, als dies erwünscht ist. Die 1(b) zeigt die Entschützungskinetik eines 21mer-Oligonukleotids, das gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform mit einer Lösung von AMA und 0,5 M Ammoniumacetat abgespalten und entschützt worden ist.
Beispiel 5. Analyse eines Oligonukleotids mittels Kapillarelektrophorese
Die gereinigten Oligonukleotide wurden mittels Kapillarelektrophorese auf einem P/ACE 5000-Gerät von Beckman Instruments, Inc., analysiert. Die Kapillargelsäule (U100P-Harnstoft-Gelsäule) wurde von Beckman Instruments, Inc., erhalten. Diese Kapillargelsäule wurde beladen und auf eine Länge von 37 cm geschnitten. Der Tris-Borat, 7 M-Harnstoffpuffer (ebenfalls von Beckman Instruments, Inc., erhalten) wurde gemäß den Anweisungen eingesetzt. Die Extinktionen der Oligonukleotide lagen abhängig von der Qualität und der Länge der Oligonukleotide im Bereich von 1 bis 2 OD/_260
nm/ml. Die Injektion fand bei 10 kV für 3 s statt, während die Trennung abhängig von der Länge des Oligonukleotids bei 11 kV 30 bis 45 min stattfand. Die Kapillarelektrophoresediagramme sind in der 2 gezeigt.
Die 2(a) ist das Kapillarelektrophoresediagramm für das rohe 21mer-Oligonukleotid. Die 2(b) ist das Diagramm für das 21mer-Oligonukleotid, das mit einer Lösung aus Ammoniumhydroxid und Wasser (1 : 1) nach der Umkehrphasen-Patronenreinigung abgespalten und entschützt worden ist. Die 2(c) ist das Diagramm für das 21mer-Oligonukleotid, das mit einer Lösung aus AMA und 0,5 M Ammoniumacetat (1 : 3) nach der Umkehrphasen-Patronenreinigung abgespalten und entschützt worden ist. Diese Figuren zeigen, dass die AMA- und Ammoniumacetatlösung bei der Reinigung des Oligonukleotids so gut wie Ammoniumhydroxid war, dass jedoch die Entschützungs- und Abspaltungszeit verglichen mit 4 Stunden mit 10 min signifikant kürzer war.
Obwohl die vorliegende Erfindung bezüglich spezieller Beispiele beschrieben worden ist, sind diese Beispiele im Hinblick auf die Reagenzien und Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht beschränkend aufzufassen. Dem Fachmann ist klar, dass die vorliegende Erfindung nicht auf dasjenige beschränkt ist, was hier gezeigt und beschrieben worden ist, sondern dass die vorliegende Erfindung aufgrund der beigefügten Patentansprüche bestimmt ist.

Claims

Verfahren zum Herstellen eines gereinigten synthetisierten Oligonukleotids, wobei das Verfahren die Schritte des Bereitstellens eines synthetisierten Oligonukleotids, wobei das Oligonukleotid an einen festen Träger gebunden ist und geschützte exocyclische Amino-Funktionalitäten aufweist, des Behandelns des synthetisierten Oligonukleotids mit einer Methylamin umfassenden Zusammensetzung, des Hinzufügens einer Zusammensetzung, die ein Additiv, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Natriumchlorid und Ammoniumacetat, umfaßt, zu dem behandelten synthetisierten Oligonukleotid, des Beladens des behandelten synthetisierten Oligonukleotids und des Additivs auf eine Umkehrphasen-Reinigungspatrone, des Eluierens des behandelten synthetisierten Oligonukleotids von der Umkehrphasen-Reinigungspatrone und des Rückgewinnens des gereinigten synthetisierten Oligonukleotids aus dem Eluat der Umkehrphasen-Reinigungspatrone umfaßt.
Verfahren zum Herstellen eines gereinigten synthetisierten Oligonukleotids, wobei das Verfahren die Schritte des Bereitstellens eines synthetisierten Oligonukleotids, wobei das Oligonukleotid an einen festen Träger gebunden ist und geschützte exocyclische Amino-Funktionalitäten aufweist, des Behandelns des synthetisierten Oligonukleotids mit einer Zusammensetzung, die Methylamin und ein Additiv, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Natriumchlorid und Ammoniumacetat, umfaßt, des Beladens des behandelten synthetisierten Oligonukleotids auf eine Umkehrphasen-Reinigungspatrone, des Eluierens des behandelten synthetisierten Oligonukleotids von der Umkehrphasen-Reinigungspatrone und des Rückgewinnens des gereinigten synthetisierten Oligonukleotids aus dem Eluat der Umkehrphasen-Reinigungspatrone umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das synthetisierte Oligonukleotid geschützte Hydroxy-Funktionalitäten aufweist.
Verfahren nach Anspruch 3, welches vor dem Eluieren des behandelten synthetisierten Oligonukleotids von der Umkehrphasen-Reinigungspatrone ferner den Schritt des Entschützens der geschützten Hydroxy-Funktionalitäten einschließt.
Verfahren zum Entschützen und Abspalten von Oligonukleotiden, wobei das Verfahren das Behandeln eines synthetisierten Oligonukleotids mit einer Zu sammensetzung, umfassend Methylamin und ein Additiv, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ammoniumacetat und Natriumchlorid, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das synthetisierte Oligonukleotid an einen festen Träger gebunden ist und der Behandlungsschritt das Abspalten des synthetisierten Oligonukleotids von dem festen Träger verursacht.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das synthetisierte Oligonukleotid geschützte exocyclische Amino-Funktionalitäten enthält und der Behandlungsschritt in einem Entschützen der geschützten exocyclischen Amino-Funktionalitäten resultiert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 oder Anspruch 5, wobei das Methylamin etwa 40 Gew.-% Methylamin in Wasser ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Additiv (a) etwa 0,5 M Natriumchlorid ist und die etwa 40 Gew.-% Methylamin und die etwa 0,5 M Natriumchlorid in dem behandelten synthetisierten Oligonukleotid in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 9 vorhanden sind oder (b) etwa 0,5 M Ammoniumacetat ist und die etwa 40 Gew.-% Methylamin und die etwa 0,5 M Ammoniumacetat in der Zusammensetzung oder dem behandelten Oligonukleotid in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 9 vorhanden sind.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die etwa 40 Gew.-% Methylamin und das Additiv, welches (a) etwa 0,5 M Natriumchlorid oder (b) etwa 0,5 M Ammoniumacetat ist, in dem behandelten synthetisierten Oligonukleotid oder der Zu sammensetzung in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 3 vorhanden sind.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die etwa 40 Gew.-% Methylamin und das Additiv, (a) etwa 0,5 M Natriumchlorid oder (b) etwa 0,5 M Ammoniumacetat, in dem behandelten synthetisierten Oligonukleotid in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 3 vorhanden sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 oder 5, wobei die Zusammensetzung zum Behandeln des synthetisierten Oligonukleotids ferner Ammoniumhydroxid einschließt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Ammoniumhydroxid etwa 29 Gew.-% Ammoniumhydroxid in Wasser ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Methylamin etwa 40 Gew.-% Methylamin in Wasser ist und die etwa 29 Gew.-% Ammoniumhydroxid und die etwa 40 Gew.-% Methylamin in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 1 vorhanden sind.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Additiv (a) etwa 0,5 M Natriumchlorid oder (b) etwa 0,5 M Ammoniumacetat ist und das etwa 1 : 1 Verhältnis von etwa 29 Gew.-% Ammoniumhydroxid zu etwa 40 Gew.-% Methylamin und das Additiv in dem behandelten synthetisierten Oligonukleotid in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 9 vorhanden sind.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das etwa 1 : 1 Verhältnis von etwa 29 Gew.-% Ammoniumhydroxid zu etwa 40 Gew.-% Methylamin und das Additiv in dem behandelten synthetisierten Oligonukleotid in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 3 vorhanden sind.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das etwa 1 : 1 Verhältnis von etwa 29 Gew.-% Ammoniumhydroxid zu etwa 40 Gew.-% Methylamin und das Additiv in dem behandelten synthetisierten Oligonukleotid in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 3 vorhanden sind.
Reagens zum Abspalten und Entschützen von Oligonukleotiden, umfassend Methylamin und ein Additiv, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ammoniumacetat und Natriumchlorid, wobei das Methylamin etwa 40 Gew.-% Methylamin in Wasser ist.
Reagens nach Anspruch 18, wobei das Additiv etwa 0,5 M Ammoniumacetat ist und das etwa 40 Gew.-% Methylamin und das etwa 0,5 M Ammoniumacetat in dem Reagens in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 9 vorhanden sind.
Reagens nach Anspruch 19, wobei das etwa 40 Gew.-% Methylamin und das etwa 0,5 M Ammoniumacetat in dem Reagens in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 3 vorhanden sind.
Reagens nach Anspruch 20, wobei das etwa 40 Gew.-% Methylamin und das etwa 0,5 M Ammoniumacetat in dem Reagens in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 3 vorhanden sind.
Reagens nach Anspruch 18, ferner umfassend Ammoniumhydroxid.
Reagens nach Anspruch 22, wobei das Ammoniumhydroxid etwa 29 Gew.-% Ammoniumhydroxid in Wasser ist.
Reagens nach Anspruch 23, wobei das Methylamin etwa 40 Gew.-% Methylamin in Wasser ist und das etwa 29 Gew.-% Ammoniumhydroxid und das etwa 40 Gew.-% Methylamin in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 1 vorhanden sind.
Reagens nach Anspruch 24, wobei das Additiv etwa 0,5 M Ammoniumacetat ist und das etwa 1 : 1 Verhältnis von etwa 29 Gew.-% Ammoniumhydroxid zu etwa 40 Gew.-% Methylamin und das etwa 0,5 M Ammoniumacetat in dem Reagens in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 9 vorhanden sind.
Reagens nach Anspruch 25, wobei das etwa 1 : 1 Verhältnis von etwa 29 Gew.-% Ammoniumhydroxid zu etwa 40 Gew.-% Methylamin und das etwa 0,5 M Ammoniumacetat in dem Reagens in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 3 vorhanden sind.
Reagens nach Anspruch 26, wobei das etwa 1 : 1 Verhältnis von etwa 29 Gew.-% Ammoniumhydroxid zu etwa 40 Gew.-% Methylamin und das etwa 0,5 M Ammoniumacetat in dem Reagens in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 3 vorhanden sind.
Verfahren zum Herstellen eines gereinigten synthetisierten Oligonukleotids, wobei das Verfahren das Behandeln eines geschützten Oligonukleotids mit einer Methylamin umfassenden Zusammensetzung und das Eluieren des behandelten synthetisierten Oligonukleotids von einer Umkehrphasen-Reinigungspatrone umfaßt, gekennzeichnet durch das Hinzufügen einer Zusammensetzung, die ein Additiv, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Natriumchlorid und Ammoniumacetat, umfaßt, zu dem behandelten synthetisierten Oligonukleotid vor dem Eluieren des behandelten synthetisierten Oligonukleotids von der Umkehrphasen-Reinigungspatrone.
Verfahren zum Synthetisieren eines Oligonukleotids, wobei das Verfahren das Behandeln eines geschützten Oligonukleotids mit einer Methylamin umfassenden Zusammensetzung umfaßt, gekennzeichnet durch das Behandeln des geschützten Oligonukleotids mit einer Zusammensetzung, die Methylamin und ein Additiv, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ammoniumacetat und Natriumchlorid, umfaßt.