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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren
zur Messung von optischen Eigenschaften eines Mediums sowie einen
entsprechenden Mikrofermenter. Diese optischen Eigenschaften können insbesondere
die Trübung,
die Extinktion und die Fluoreszenz des Mediums bei einer oder mehreren Wellenlängen oder
auf vorbestimmten Spektralbereichen umfassen.
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In
zahlreichen Biologielabors und auch in bestimmten Industrien ist
es sehr oft notwendig, Mikroorganismen in flüssigem Medium zu kultivieren
und die Konzentration der Zellen in verschiedenen Stadien der Kultur
zu messen. Diese Quantifizierung kann direkt an Proben, durch Zählen der
Zellen oder durch Messung der Trockenmasse durchgeführt werden.
Diese Verfahren sind zwar sehr genau, doch sind sie auch langwierig
und mühsam,
und es ist leichter, eine indirekte Bewertung der Menge der Zellen
vorzunehmen, indem man zum Beispiel das Verschwinden von Substraten
oder das Auftreten von intrazellulären (NADH usw.) oder extrazellulären Verbindungen
(Alkohole, organische Säuren
usw.) misst. Dennoch beruhen die praktischsten und am meisten verwendeten
Verfahren zur Bewertung der Zellkonzentrationen von Kulturen auf
optischen Eigenschaften derselben.
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Wenn
elektromagnetische Strahlungen auf Materie treffen, wechselwirken
sie mit den Elektronenladungen der Atome: Ein Teil dieser Strahlen
durchdringt die Materie ohne Richtungsänderung (Transmissionsstrahlung),
und der andere Teil wird in alle Richtungen des Raums gestreut,
wobei sich jedes beleuchtete Teilchen wie eine Lichtquelle verhält. Die
Menge des Lichts, das von den im flüssigen Medium vorhandenen Teilchen
gestreut wird, wächst
mit der Anzahl und Größe dieser
Teilchen; außerdem
wurde gezeigt, dass die Streuung des Lichts, wenn die Teilchen Mikroorganismen
sind, nicht homogen in alle Richtun gen des Raums erfolgt, sondern
hauptsächlich
in einer Richtung in der Nähe
der Richtung des einfallenden Lichtbündels.
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Aufgrund
dieser Streuungsphänomene
haben die Flüssigkulturen
von Mikroorganismen ein trübes Aussehen,
dessen Dichte mit der Zellkonzentration wächst. Die Vorrichtungen, die
es erlauben, diese Trübung zu
quantifizieren (Turbidimeter), messen die Trübung dieser Kulturen.
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Bei
den existierenden Turbidimetern unterscheidet man Vorrichtungen
zur diskontinuierlichen Messung, mit denen man wiederholt das von
einem flüssigen
Medium durchgelassene und/oder reflektierte Licht misst, und Vorrichtungen
zur mitlaufenden Messung, bei denen mit einem Aufzeichnungssystem
verbundene Sonden zur Trübungsmessung
in das Innere eines flüssigen
Mediums eingeführt
werden.
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Die
Vorrichtungen zur diskontinuierlichen Messung, wie Nephelometer,
Colorimeter, Spektrophotometer und gemischte Turbidimeter, erlauben
größtenteils
keine Messung von hohen Trübungen.
Tatsächlich
erstreckt sich ihr Messbereich gewöhnlich nicht weiter als bis
1000 NTU (nephelometric turbidity units) und ist meistens noch viel
mehr eingeschränkt.
Es ist also notwendig, Proben zu verdünnen, was die Fehlerrisiken und
den vom Experimentator zu leistenden Arbeitsaufwand erhöht. Außerdem ist
die Probenahme selbst bereits sehr lästig, da sie die Anwesenheit
eines Experimentators in regelmäßigen Abständen während der
gesamten Dauer einer Kultur erfordert. Bestimmte gemischte Turbidimeter
sind ausgelegt, einen größeren Trübungsbereich
abzudecken, aber dies sind kostspielige Vorrichtungen.
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Bei
den mitlaufenden Turbidimetern, deren Messbereiche ziemlich groß sein können, ist
von Nachteil, dass sie wegen der Abmessung der ins Innere der Kulturen
eingeführten
Sonden große
Kulturvolumina (ungefähr
1 Liter) benötigen,
was ihre Verwendung in Fermentern einschränkt. Außerdem werden die Kulturen
in Fermentern im Allgemeinen belüftet
und gerührt,
was dazu führt, dass
zahlreiche Blasen die Trübungsmessungen
stark stören.
Diese Vorrichtungen sind außerdem
ungünstig
wegen ihrer hohen Kosten.
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Die
Internationale Patentanmeldung WO 92/13482 offenbart eine Vorrichtung
und ein Verfahren zur Messung eines Blutparameters. Die Vorrichtung
umfasst eine Quelle von rotem Licht und eine Quelle von infrarotem
Licht, die Licht auf eine Blutprobe richten, und einen Detektor,
der das von den beiden Quellen stammende und vom Blut zurückgeworfene
Licht empfängt.
Für jede
der beiden Quellen wird eine optische Rückkopplungsschleife verwendet,
so dass die Intensität
des vom Detektor empfangenen Lichts für einen Wertebereich des Blutparameters
ungefähr
konstant ist, was eine genaue Steuerung der Lichtquellen erlaubt.
Referenzkurven erlauben, von den für die beiden Quellen jeweils
erhaltenen Rückkopplungssignalen
zwei Blutparameter abzuleiten.
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Ein
Nachteil dieser Technik besteht darin, dass sie insbesondere durch
die Emissionskapazitäten
der Lichtquellen beschränkt
ist und es so nur erlaubt, einen eingeschränkten Messbereich mit ausreichender
Empfindlichkeit abzudecken. Außerdem
erfordert die Gewinnung jedes Ergebnisses eine Stabilisierungsverzögerung,
was die Schnelligkeit der Messungen beeinträchtigt. Eine Reihenanalyse
einer großen
Zahl von Proben oder Messungen mit heterogenen und/oder durch eine
Zirkulation von Gasblasen gestörten
Medien erweisen sich somit als sehr schwierig oder sogar ausgeschlossen.
Außerdem
besteht die Gefahr, dass bei der Auswertung der Rückkopplungssignale
aufgrund der Drift von kapazitiven Werten Ungenauigkeiten entstehen.
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Das
Patent
US 4,447,150 betrifft
eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Messung von Bluteigenschaften
und -parametern, die verwendet werden, um das Blutsauerstoff-Sättigungsniveau
zu messen. Die offenbarte Vorrichtung umfasst zwei Lichtquellen,
die jeweils bei zwei verschiedenen Wellenlängen emittieren, und einen
Detektor, der das von den beiden Quellen stammende und von Blut
zurückgeworfene
Licht misst. Das vom Blut reflektierte oder durchgelassene Licht
wird mittels einer optischen Rückkopplungsschleife
auf einem konstanten Niveau gehalten. Außerdem ergibt das Verhältnis von
zwei Spannun gen, die jeweils dem gemessenen Licht entsprechen, das
von den beiden Quellen stammt, den Prozentsatz der Blutsauerstoff-Sättigung.
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Diese
Technik hat ebenfalls den Nachteil, dass sie keinen großen Messbereich
erlaubt, sowie die anderen Nachteile, die für das Dokument WO 92/13482
genannt wurden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Messvorrichtung und ein Messverfahren,
die nicht die vorstehenden Nachteile aufweisen und es somit insbesondere
erlauben, Messungen in unterschiedlichen Wertebereichen durchzuführen, wobei
gleichzeitig eine gute Empfindlichkeit erhalten bleibt.
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Die
Vorrichtung und das Verfahren der Erfindung können auch eine große Schnelligkeit
der Messung und eine gute Genauigkeit bieten.
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Ziel
der Erfindung ist insbesondere eine Vorrichtung zur Messung der
Trübung,
die mit Genauigkeit die Trübung
von Mikrobenkulturen in einem großen Wertebereich messen kann,
zuverlässig
und leicht zu verwenden ist und leicht an Mikrofermenter angepasst
werden kann und geringe Abmessungen haben und billig sein kann.
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Ziel
der Erfindung ist auch eine Vorrichtung zur Messung der Extinktion
und eine Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenz, die in der Lage
sind, mit denselben oben genannten Vorteilen die molekulare Extinktion und/oder
die Fluoreszenz eines Mediums zu messen, und allgemeiner gesagt
betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Messung von einer oder
mehreren optischen Eigenschaften eines flüssigen oder festen Mediums.
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Die
Erfindung betrifft eine solche Messvorrichtung, die vorteilhafterweise
automatisiert ist und es so erlaubt, Experimente mit langer Dauer
ohne Eingreifen eines Experimentators durchzuführen.
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Ziel
der Erfindung ist auch eine solche Messvorrichtung, die an zusammengeschaltete
Mikrofermenter angepasst werden kann und es ermöglicht, gleichzeitige Messungen
für die
verschiedenen Mikrofermenter durchzuführen.
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Die
Erfindung betrifft auch einen Mikrofermenter, der mit einer Messvorrichtung
mit den vorstehenden Eigenschaften ausgestattet ist.
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Ziel
der Erfindung ist insbesondere ein Mikrofermenter mit einfachen
und zuverlässigen
Zuführungssystemen
für Kulturmedium
und Gas, der vor jeder äußeren Kontamination
geschützt
ist und Kulturen mit kleinen Volumen aufnehmen kann. Außerdem schützt das
System die Außenwelt
vor Kontaminationen durch die Kultur selbst.
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Die
Erfindung betrifft auch einen Mikrofermenter mit automatischen Probeentnahmen
für verschiedene vorbestimmte
Stadien der Trübung,
der Extinktion und/oder der Fluoreszenz und einen Mikrofermenter
mit automatischer Verdünnung
für cyclische
Kulturen.
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Ziel
der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Messung von optischen Eigenschaften,
zu denen insbesondere die Trübung,
die Extinktion und die Fluoreszenz gehören können und die Messungen auf
einem großen
Wertebereich mit großer
Genauigkeit, guter Zuverlässigkeit
und guter Reproduzierbarkeit ermöglichen.
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Die
Erfindung betrifft Bereiche der Mikrobiologie und der Biotechnologie
und allgemeiner jede Messung von trüben Verbindungen, zum Beispiel
zur Analyse und Behandlung von Wasser, landwirtschaftlichen oder
industriellen Abwässern
oder Schadstoffen (Trübungsmessung).
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Sie
betrifft auch in-vivo- oder in-vitro-Fluoreszenzmessungen und genauer
gesagt Konzentrationsmessungen von intra- oder extrazellulären fluoreszierenden
Verbindungen.
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Zu
diesem Zweck betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Messung
wenigstens einer optischen Eigenschaft eines Mediums, umfassend:
- – eine
Lichtquelle zur Emission eines Lichtbündels mit variabler Intensität auf und
in das Medium;
- – Nachweiseinrichtungen
zur Messung der Intensität
des vom flüssigen
Medium zurückgeworfenen
Lichtbündels;
- – Steuereinrichtungen
für die
Intensität
des von der Quelle emittierten Lichtbündels;
- – Speichereinrichtungen
zum Speichern eines Wertes, der eine nominelle Intensität des zurückgeworfenen Lichtbündels darstellt;
- – eine
Regeleinrichtung, die mit den Steuereinrichtungen, den Nachweiseinrichtungen
und den Speichereinrichtungen verbunden ist und die so auf die Steuereinrichtungen
einwirkt, dass die gemessene Intensität des zurückgeworfenen Lichtbündels gleich
der nominellen Intensität
ist; und
- – Leseeinrichtungen
für die
Intensität
des emittierten Lichtbündels
bei der nominellen Intensität
des zurückgeworfenen
Lichtbündels,
wobei die Intensität
des emittierten Lichtbündels
und die nominelle Intensität
des zurückgeworfenen
Lichtbündels
repräsentativ
für die
wenigstens eine optische Eigenschaft des Mediums sind.
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Gemäß der Erfindung
umfasst die Messvorrichtung Einrichtungen zur Einstellung der nominellen
Intensität,
die mit den Leseeinrichtungen und Speichereinrichtungen verbunden
sind und dazu dienen, die nominelle Intensität so einzustellen, dass die
stabilisierte Intensität
des emittierten Lichtbündels
in einem vorbestimmten Bereich liegt.
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Die
nominelle Intensität
des zurückgeworfenen
Lichtbündels
ist einstellbar. Auf diese Weise ist es möglich, die Messvorrichtung
an einen gegebenen Wertebereich der Trübung, der Extinktion oder der
Fluoreszenz anzupassen. Die Wahl der nominellen Intensität resultiert
aus einem Kompromiss. Sie muss die größtmögliche sein, so dass die Intensität des emittierten
Lichtbündels
stark mit der Trübung,
der Extinktion und/oder der Fluoreszenz variiert, was der Vorrichtung
eine sehr gute Messgenauigkeit verleiht. Dagegen muss die nominelle
Intensität
ausreichend schwach sein, um den gesamten gewünschten Bereich abdecken zu
können,
ohne dass die Intensität
des emittierten Lichtbündels
eine maximale Emissionsschwelle der Quelle überschreitet, die ihre Sättigung
und/oder Verschlechterung verursachen würde.
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Diese
Vorrichtung kann so Messungen in unterschiedlichen Wertebereichen
ermöglichen,
von den schwächsten
bis zu den höchsten,
wobei zugleich eine optimale Empfindlichkeit aufrechterhalten wird.
Im Stand der Technik ist der Messbereich dagegen starr und mit der
verwendeten Referenzspannung verbunden.
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Insbesondere
ermöglicht
die Vorrichtung Messungen der Trübung über einen
großen
Bereich von optischen Dichten mit einer guten Genauigkeit. So erhält man ohne
Schwierigkeit einen Bereich, der sich von 45 bis über 17 000
NTU erstreckt, was bei einer Suspension der Hefe Saccharomyces cerevisiae
Werten von 0,2 bzw. mehr als 75 Einheiten der optischen Dichte (OD)
bei 600 nm mit einem Fehler von ungefähr 2% entspricht. Diese Vorrichtung
bietet auch eine gute Zuverlässigkeit
und eine gute Reproduzierbarkeit der Messungen, was einer geringen
Streuung der Werte entspricht. Für
verschiedene Organismen können
Korrespondenzkurven zwischen Trübungen
und Zellkonzentrationen leicht erstellt werden.
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Außerdem kann
die Messvorrichtung gemäß der Erfindung
mit geringen Produktionskosten hergestellt werden, da sie sich auf
die Verwendung weniger billiger elektronischer Bauteile stützen kann.
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Die
Speichereinrichtungen dienen vorteilhafterweise zum Speichern einer
Sättigungsintensität, und die
Steuereinrichtungen regeln die nominelle Intensität auf einen
kleineren Wert, da die stabilisierte Intensität des emittierten Lichtbündels größer ist
als die Sättigungsintensität.
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Die
Werte, die von der nominellen Intensität angenommen werden können, sind
vorteilhafterweise vorbestimmt.
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So
wird die Einstellung der nominellen Intensität automatisiert, was es insbesondere
erlaubt, die Trübung
eines sich entwickelnden Mediums über einen großen Trübungsbereich
und mit sehr guter Genauigkeit zu verfolgen. Es ist besonders interessant,
für diese
automatisierte Einstellung eine Leuchtdiode zu verwenden, die vorzugsweise
im Infrarot um 880 nm herum emittiert. Tatsächlich entwickelt sich die
Spannung, die bei der Emission des Lichtbündels an die Anschlüsse der
emittierenden Diode angelegt wird, proportional zur Trübung, und
man erhält
eine ausgezeichnete Messgenauigkeit.
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Das
gemessene Medium kann flüssig
oder fest sein (Gele, Präparate
für die
Mikroskopie).
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Die
eine oder die mehreren gemessenen optischen Eigenschaften sind für ein gegebenes
Paar von Emissions- und Rezeptionsspektren vorteilhafterweise ausgewählt aus
der Trübung
T, der Extinktion E oder der Fluoreszenz F des Mediums. In unterschiedlichen
Ausführungsformen
wird das Licht nach den folgenden Modalitäten emittiert und empfangen:
- – monochromatische
Lichtquelle oder Lichtquelle mit breiterem Band, Nachweis bei einer
entsprechenden Wellenlänge
(monochromatisch oder mit breiterem Band);
- – monochromatische
Lichtquelle oder Lichtquelle mit breiterem Band, Nachweis bei einer
anderen Wellenlänge
(im Falle der Fluoreszenz);
- – polychromatische
Lichtquelle oder Lichtquelle mit breiteren Bändern, Nachweis bei mehreren
entsprechenden Wellenlängen;
- – weiße Lichtquelle,
Nachweis bei einer oder mehreren Wellenlängen, die durch Filter ausgewählt werden.
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Der
Nachweis der Intensität
des bei mehreren Wellenlängen
empfangenen Lichtbündels
erlaubt es, sich ergänzende
Informationen über
das Medium zu erhalten.
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Die
Lichtquelle besteht aus einem Strahler, wie zum Beispiel einer Diode,
einem Laser, die an eine optische Faser gekoppelt sind oder auch
nicht und die ein monochromatisches Licht oder ein Licht mit Spektralbanden,
eventuell mit variablen Größen, oder
weißes
Licht emittieren sollen. Die Emission kann in den Bereichen des
UV, des Sichtbaren, des nahen oder fernen Infrarot erfolgen.
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Die
Nachweiseinrichtungen bestehen vorteilhafterweise aus einem oder
mehreren Photodetektoren, wie zum Beispiel Dioden (Phototransistor,
Photodarlington-Transistor)
oder photoelektrische Zellen, die jeweils eine monochromatische
Rezeption oder eine Rezeption mit einer größeren Bandbreite in den Bereichen
des UV, des Sichtbaren, des nahen oder fernen Infrarot aufweisen.
Im Falle von Messungen im Infrarot sind die Nachweiseinrichtungen
vorteilhafterweise und zweckmäßigerweise
gegenüber
sichtbarem Licht unempfindlich.
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Unter "vom Medium zurückgeworfenes
Lichtbündel" versteht man ein
ohne Wechselwirkung durchgelassenes, gestreutes oder emittiertes
(zum Beispiel in Fluoreszenzfällen)
Lichtbündel.
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Die
Nachweiseinrichtungen werden unter einem oder mehreren geeigneten
Winkeln zur Richtung des emittierten Lichtbündels platziert, vorzugsweise
ungefähr
180° (in
Transmission notwendigerweise bei ungefähr 180°).
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Vorzugsweise
ist das auf das Medium auftreffende Lichtbündel parallel. So erhält man ein
sehr gutes Verhältnis
von zurückgeworfenem
Licht/emittiertem Licht.
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Jede
Messwellenlänge
wird vorzugsweise so gewählt,
dass man Informationen über
einen bestimmten Teilchentyp erhält.
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So
erlauben zwei verschiedene Wellenlängen bei Trübungsmessungen, Ergebnisse über die
Teilchen mit zwei unterschiedlichen Größen zu erhalten, die in Suspension
nebeneinander vorliegen. Es kann sich zum Beispiel um Zellen, die
mit Phagenpartikeln infiziert sind, und durch die lysierten Zellen
freigesetzte Phagen handeln. Tatsächlich hängt die Menge des gestreuten
oder durchgelassenen Lichts für
einen gegebenen Teilchentyp von der nachgewiesenen Wellenlänge ab.
Außerdem
ist das Verhältnis
durchgelassenes Licht/emittiertem Licht um so größer, je größer die Wellenlänge ist.
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Eine
Ausführungsform
zur Messung bei zwei Wellenlängen
besteht darin, mit Hilfe von zwei Strahlern mit voneinander verschiedenen
Wellenlängen,
zum Beispiel Infrarot und sichtbar, zu emittieren. Eine andere Ausführungsform
besteht darin, weißes
Licht zu emittieren und auf einem Detektor Filter anzubringen, so
dass die zwei Wellenlängen
ausgewählt
werden.
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Für Extinktionsmessungen
erlauben es zwei verschiedene Rezeptionswellenlängen, zwei Typen von Molekülen, die
bei verschiedenen Wellenlängen
absorbieren, zu quantifizieren oder Beobachtungen an einem Typ von
Teilchen miteinander zu korrelieren.
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Im
Allgemeinen können
es Messungen bei mehreren Wellenlängen erlauben, den Anteil und
die Art der Teilchen, der Zellen oder der Moleküle in den analysierten Medien
zu bestimmen und die Größe, die
Form, die Konzentration, die Art und/oder den Anteil verschiedener
Zell-, Teilchen- und/oder Molekülspezies
zu unterscheiden. Wenn die Zahl der Wellenlängen gleich n ist, kann die
mathematische Behandlung anhand eines Systems von n Gleichungen
mit n Unbekannten durchgeführt
werden.
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Vorteilhafterweise
wird die nominelle Intensität
(festgehaltene Intensität
des zurückgeworfenen
Lichtbündels)
in Abhängigkeit
vom Konzentrationsbereich der in dem Medium zu messenden Teilchen
gewählt,
wobei sich die nominelle Intensität verringert, wenn der zu messende
Konzentrationsbereich zunimmt.
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Die
Messvorrichtung gemäß der Erfindung
misst nicht einfach das von einem flüssigen Medium zurückgeworfene
Licht, um die Trübung,
die Extinktion oder die Fluoreszenz zu messen, sondern die von der Quelle
gelieferte Energie, was es erlaubt, eine festgelegte Menge des zurückgeworfenen
Lichts zu erhalten. Diese Energie oder Intensität des emittierten Lichtbündels ergibt
die Trübung,
die Extinktion oder die Fluoreszenz des flüssigen oder festen Mediums
für jede
Messwellenlänge
mittels einer einfachen mathematischen Beziehung, die anhand von
Eichkurven aufgestellt wird. So ist, wenn die Lichtquelle ein infrarotes
Licht um 880 nm herum emittiert, die vom Medium durchgelassene Energiemenge
umgekehrt proportional zur Trübung
des durchquerten Mediums, und die elektronische Regeleinrichtung
passt das emittierte Lichtbündel
automatisch an, so dass das zurückgeworfene
Licht gleich einem festgelegten Wert ist.
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Im
Falle der Fluoreszenzmessung ist die Menge des zurückgeworfenen
Lichts proportional zur Intensität
des emittierten Lichtbündels
und zur Konzentration der fluoreszierenden Substanz. Außerdem wird
sie durch interne Filterphänomene
beeinflusst.
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Die
Messvorrichtung erlaubt es auch, auf alle Probeentnahmen außer für die Probeanalysen
zu verzichten, was die Handhabungen erleichtert, die Fehlerrisiken
im Verlaufe von an die Entnahme anschließenden Verdünnungen unterdrückt und
die Risiken der Kontamination einer Kultur oder der Umgebung (zum
Beispiel im Falle von Kulturen von Krankheitserregern) reduziert.
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Vorteilhafterweise
kann sich die Messvorrichtung ganz außerhalb des flüssigen Mediums
befinden. So braucht die Vorrichtung im Fall, dass dieses Medium
eine Kultur umfasst, nicht sterilisiert zu werden und riskiert nicht,
durch Verschmutzung oder Bedeckung mit Biofilmen beeinträchtigt zu
werden.
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Vorzugsweise
ist die Messvorrichtung automatisiert, insbesondere durch eine automatische
Aufzeichnung der Daten und durch eine automatische Einstellung der
nominellen Intensität
des zurückgeworfenen Lichtbündels. So
ist es möglich,
Experimente mit langer Dauer ohne Eingreifen eines Experimentators
durchzuführen,
insbesondere für
die Verfolgung von Kulturen Tag und Nacht ohne die geringste Überwachung
durch Menschen.
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Ein
weiterer Vorteil der Messvorrichtung ist ihre Anpassungsfähigkeit
an eine Vielzahl von flüssigen Medien
und insbesondere an kontinuierliche Kulturen aller Art, wie zum
Beispiel Chemostat, Turbitostat oder cyclische Kulturen.
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Vorzugsweise
dienen die Lichtquelle und/oder die Nachweiseinrichtungen zur Messung
der Intensität des
zurückgeworfenen
Lichtbündels
um im Bereich wenigstens einer Wellenlänge, wobei die eine oder die mehreren
optischen Eigenschaften des Mediums jeweils der oder einer der Wellenlängen entsprechen.
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In
einer ersten bevorzugten Ausführungsform
umfassen die eine oder die mehreren optischen Eigenschaften die
Trübung
des Mediums.
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Die
Nachweiseinrichtungen befinden sich dann vorzugsweise in der Richtung
des emittierten Lichtbündels
in Transmission, wobei das Verhältnis
von empfangener Intensität
zu emittierter Intensität
optimal ist. In einer Ausführungsvariante
befinden sich wenigstens einige der Nachweiseinrichtungen schräg in Bezug
auf die Richtung des emittierten Lichtbündels, so dass das gestreute
Licht nachgewiesen wird.
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In
der ersten Ausführungsform
sind die Lichtquelle und/oder die Nachweiseinrichtungen vorzugsweise für Messungen
im Infrarot, vorteilhafterweise um 880 nm herum, geeignet.
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Es
ist zum Beispiel interessant, wenn die Lichtquelle eine Leuchtdiode
oder LED ist, die im Infrarot emittiert.
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Die
Emission von infrarotem Licht mit Wellenlängen, die von 840 nm bis 920
nm mit einem Maximum von 880 nm variieren, vereinfacht die Ausführung der
Messvorrichtung und ergibt eine gute Genauigkeit. Da die Streuung
des Lichts von der Wellenlänge
abhängt,
besteht tatsächlich
die Gefahr, dass die Verwendung von weißem Licht zum Beispiel schwieriger
durchzuführen
ist und weniger genaue Ergebnisse liefert als ein fast monochromatisches
Licht im Infrarot.
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Außerdem dringen
die infraroten Strahlen besser durch die Materie, was für die Messung
starker Trübungen
günstig
ist. Eine Emission bei anderen Wellenlängen oder in weißem Licht
ist jedoch ebenfalls möglich.
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In
einer zweiten bevorzugten Ausführungsform
umfassen die eine oder die mehreren optischen Eigenschaften des
Mediums die Extinktion des Mediums, wobei sich die Erfindung auf
die Colorimetrie und Spektrophotometrie des flüssigen oder festen Mediums
bezieht.
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In
einer dritten bevorzugten Ausführungsform
umfassen die eine oder die mehreren optischen Eigenschaften des
Mediums die Fluoreszenz des Mediums.
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So
emittiert das GFP (Green Fluorescent Protein), das natürlicherweise
bei der Qualle Aequora victoria vorkommt, durch Fluoreszenz, wenn
es durch UV-Licht oder blaues Licht angeregt wird (2 Anregungsmaxima
bei 395 und 475 nm), ein grünes
Licht mit verschiedenen Wellenlängen
(509 und 540 nm), was es erlaubt, es vom einfallenden oder gestreuten
Licht zu unterscheiden. Die Emission erfordert nicht die Anwesenheit
eines Substrats oder Cofaktors. Es gibt modifizierte Versionen des
Gens, das für
dieses Protein codiert, was eine Verbesserung seiner Quantenausbeute
und eine Modifikation seines Emissionsspektrums bewirkt (Helm, R., Nature,
Vol. 373, S. 663–664,
1995).
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Außerdem ist
es auch möglich,
intrazelluläre
oder extrazelluläre
Verbindungen, die durch Fluoreszenz emittieren, zu quantifizieren.
Zum Beispiel:
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So
emittiert NADH, Redoxcoenzym, eine Fluoreszenz bei 450 nm, wenn
es durch ein Licht mit einer Wellenlänge von 350 nm angeregt wird
(NAD, die oxidierte Form, erzeugt keine Fluoreszenz). Im Verlaufe
des Zellwachstums variiert die Menge des NADH mit der Zellkonzentration
(Li, J., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 37, S. 1043–1049, 1991).
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Dasselbe
gilt für
verschiedene fluoreszierende Farbstoffe oder Chromophore (die auch
Fluorochrome oder Fluorophore genannt werden; Fluorescein, fluoreszierende
Antikörper,
Pigmente, Chinin usw.).
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Die
Einführung
der Gene, die für
GFP codieren, in verschiedene Zellen (prokaryontisch oder eukaryontisch)
und ihre Expression unter verschiedenen Bedingungen erlaubt die
kontinuierliche Überwachung
der Fluoreszenz. Die Messvorrichtung gemäß der Erfindung erlaubt es
auch, interne Filterwirkungen von fluoreszierenden Medien zu untersuchen.
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Diese
dritte Ausführungsform
hat Anwendungen in zahlreichen Bereichen, wie die Quantifizierung
fluoreszierender Substanzen in Gelen, "Blots", Mikrotiterplatten. Außerdem sind
Untersuchungen in vivo möglich, wie
die Messung der Expression von Genen durch Verfolgung der Fluoreszenz
der "markierten" Proteine, für die sie
codieren, was gleichzeitig die Quantifizierung und zelluläre Lokalisierung
der letzteren erlaubt. Diese Messungen, die in Fermentern durchgeführt werden,
erlauben es außerdem,
Analysen in Abhängigkeit
von der Zeit, des physiologischen Zustands der Zellen und der Umgebungsbedingungen
der Kultur durchzuführen.
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Vorzugsweise
umfasst die Messvorrichtung eine Verarbeitungseinheit, die mit den
Leseeinrichtungen verbunden ist und Speichereinrichtungen umfasst,
wobei die Speichereinrichtungen dazu dienen, wenigstens eine Gleichung
zu speichern, die durch eine Eichkurve bestimmt ist, welche die
wenigstens eine optische Eigenschaft des Mediums als Funktion der
Intensität
des emittierten Lichtbündels
für jeweils
wenigstens einen Wert der nominellen Intensität des zurückgeworfenen Lichtbündels wiedergibt.
Die Verarbeitungseinheit entnimmt dann die wenigstens eine optische
Eigenschaft des Mediums einerseits aus der stabilisierten Intensität des emittierten
Lichtbündels
für einen
der Werte der nominellen Intensität und andererseits aus der
Gleichung, die diesem Wert der nominellen Intensität entspricht.
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So
wird die Bestimmung der Trübung,
der Extinktion und/oder der Fluoreszenz des Mediums aus den Messungen
automatisiert und kann in Echtzeit durchgeführt werden.
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Es
ist dann vorteilhaft, wenn die Verarbeitungseinheit eine Zentraleinheit
und wenigstens eine Analog/Digital- und Digital/Analog-Wandlerkarte,
die die Zentraleinheit mit den Steuereinrichtungen und mit den Regeleinrichtungen
koppelt, umfasst.
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Solche
Karten erlauben es, auf Strom/Spannungs- und Spannungs/Strom-Umwandlungsschritte
zu verzichten.
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Außerdem entnimmt
die Verarbeitungseinheit vorzugsweise die optische Eigenschaft des
Mediums direkt ausgehend von einem Wert, der der Intensität des emittierten
Lichtbündels
proportional ist.
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Diese
Ausführung
steht im Gegensatz zu den bekannten Techniken, bei denen die optischen
Eigenschaften ausgehend von Rückkopplungssignalen
erhalten werden, die durch ein Integrationssystem laufen müssen, um
verwertbar zu sein. So vermeidet sie die Einführung von Ungenauigkeit in
die Ergebnisse.
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Vorteilhafterweise
umfasst die Messvorrichtung einen Taktgeber, Aufzeichnungseinrichtungen
in den Speichereinrichtungen für
die repräsentativen
Werte der wenigstens einen optischen Eigenschaft des Mediums sowie
Einrichtungen zur wiederholten Aktivierung der Regeleinrichtung
und der Aufzeichnungseinrichtungen.
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So
wird die Aufzeichnung der Ergebnisse automatisiert, wobei die Messungen
vorteilhafterweise in regelmäßigen Abständen durchgeführt werden,
um die Entwicklung der optischen Eigenschaft im Verlauf der Zeit verfolgen
zu können.
In einer ersten Ausführungsform
sind die aufgezeichneten Werte solche, die direkt durch das Ablesen
der Intensität
des emittierten Lichtbündels
erhalten werden, wobei diese Ergebnisse später verarbeitet werden. In
einer zweiten Ausführungsform
bestimmt die Messvorrichtung die optischen Eigenschaften nach jeder
Messung, und diese werden in der Speichereinrichtung aufgezeichnet.
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Vorzugsweise
sind die Regeleinrichtung und die Steuereinrichtungen so gestaltet,
dass der Abgleich der gemessenen Intensität und der nominellen Intensität des zurückgeworfenen
Lichtbündels
kontinuierlich erreicht wird.
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So
ist die Ansprechzeit vernachlässigbar
und ausschließlich
durch die intrinsischen Ansprechzeiten der elektronischen Bauteile
beschränkt,
die in der Größenordnung
einer Nanosekunde liegen. Diese Ausführung steht im Gegensatz zu
den bekannten Techniken, bei denen der Abgleich durch aufeinanderfolgende
Versuche erfolgt, die durch periodische Pulse getaktet werden. Auf
diese Weise kann die Messvorrichtung eine sehr große Schnelligkeit
der Messung ermöglichen,
was es zum Beispiel erlaubt, eine sehr große Zahl von Proben in Serie
zu analysieren und Messungen an heterogenen und/oder durch eine
Zirkulation von Gasblasen gestörten
Medien vorzunehmen. In diesen letzteren Fällen ist die Messvorrichtung
mit Einrichtungen ausgestattet, um Messungen gebündelt durchzuführen und
um im Verlaufe jedes dieser Bündel
eine statistische Analyse der gesammelten Werte vorzunehmen, um
daraus signifikante Werte zu entnehmen.
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Die
Erfindung betrifft auch einen Mikrofermenter, der mit einer Messvorrichtung
gemäß der Erfindung ausgestattet
ist.
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Die
Tatsache, dass die Messvorrichtung sich gänzlich außerhalb des Mikrofermenters
befinden kann, keine Probenentnahmen und entsprechende Verdünnungen
erfordert und die Automatisierung der Messungen ermöglicht,
erlaubt es, einen Mikrofermenterzu realisieren, der über beträchtliche
Vorteile verfügt.
Insbesondere reicht ein kleines Kulturvolumen für die Messungen aus, was die
Verwendung erleichtert. Man profitiert insbesondere von geringen
Abmessungen und einer geringen Häufigkeit
des Wechsels der Vorratstanks, die die Kulturmedien enthalten. Außerdem können der
Mikrofermenter und seine Systeme zur Zuführung und zur Entfernung von
Ausflüssen
vollständig
von der äußeren Umgebung
isoliert sein. Ihr Betrieb unter Überdruck gewährleistet
Einfachheit und Zuverlässigkeit,
da die Verwendung von Rohren mit bekanntem Druckverlust es erlaubt,
genaue Durchflussmengen zu erhalten und kostspielige und sperrige
Pumpen zu vermeiden. Sie bietet eine Sterilitätsgarantie, indem sie jede
Kontamination des Vorratstanks durch die Kultur und der Kultur durch die
Außenwelt
verhindert und zum Beispiel die völlig sichere Kultur von pathogenen
Stämmen
ermöglicht.
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Andererseits
ermöglicht
die Automatisierung der Messungen die Automatisierung von Probeentnahmen
für die
optischen Dichten, die genauen physiologischen Zuständen entsprechen,
wie zum Beispiel maximales Wachstum, Ende des Wachstums oder Ende
der stationären
Phase. Sie erlaubt es auch, automatische Verdünnungen für cyclische Kulturen durchzuführen.
-
Ein
weiterer Vorteil besteht darin, dass mehrere Mikrofermenter unabhängig voneinander
oder in Kaskade zusammengeschaltet werden können, wobei jeder eine Kultur
unter wohldefinierten und reproduzierbaren Bedingungen enthält. Die
mit den verschiedenen Mikrofermentern verbundenen Messvorrichtungen
sind dann vorteilhafterweise mit einem zentralen System verbunden,
das parallele Messungen steuern soll.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Mikrofermenter:
- – ein Rohr,
das mit einem Stopfen verschlossen ist und dazu dient, eine Kultur
zu enthalten;
- – ein
erstes Leitungssystem zum Einleiten von steriler Luft und Kulturmedium
in die Kultur; und
- – ein
zweites Leitungssystem zur Rückführung der
Ausflüsse;
- – wobei
das Rohr und alle Leitungssysteme unter Druck stehen.
-
In
einer vorteilhaften Ausführungsform
für cyclische
Kulturen umfasst der Mikrofermenter ein Verdünnungssystem zum Verdünnen einer
Kultur. Die Messvorrichtung umfasst dann einen Taktgeber und eine
mit dem Verdünnungssystem
verbundene Datenverarbeitungseinheit, wobei die Verarbeitungseinheit
das Verdünnungssystem
cyclisch auslöst.
-
Diese
Vorrichtung ist sehr vorteilhaft, um Stämme sich entwickeln zu lassen
oder um physiologische Untersuchungen über Wachstumsparameter durchzuführen, wie
zum Beispiel Ausmaß und
Ausbeute des Wachstums oder Messung der Latenzzeit vor der Wiederaufnahme
des Wachstums.
-
Vorzugsweise
aktiviert die Datenverarbeitungseinheit wiederholt das Regelsystem,
zeichnet in den Speichereinrichtungen repräsentative Werte der wenigstens
einen optischen Eigenschaft auf und löst das Verdünnungssystem aus, wenn sie
in einer Menge der letzten aufgezeichneten Werte eine Stagnation
der wenigstens einen optischen Eigenschaft des Mediums feststellt.
-
In
Ausführungsvarianten
löst die
Datenverarbeitungseinheit andere Aktionen am Medium, wie zum Beispiel
Zufuhr verschiedener Lösungen
oder von Gas, aus, wenn sie eine Stagnation feststellt.
-
In
einer anderen Ausführungsform
löst die
Datenverarbeitungseinheit nach einer vorbestimmten Kulturzeit periodisch
das Verdünnungssystem
aus.
-
Die
Erfindung betrifft auch jedes System, das mit einer Messvorrichtung
gemäß der Erfindung
ausgestattet ist, wie zum Beispiel einen Fermenter (Anpassung durch
Ausstülpung
oder im Innern), eine autonome Vorrichtung oder ein Mikrotiterplatten-Lesegerät.
-
Außerdem sind
verschiedene Typen von Kulturen verwendbar: diskontinuierliche Kulturen
(batch), gegebenenfalls mit kontinuierlicher oder sequentieller
Beschickung mit einem oder mehreren Substraten (fed-batch); cyclische
Kulturen; Turbidostat, was eine Erhaltung der Trübung einer Kultur auf einem
konstanten Wert durch Zuführung
von Kulturmedium mit konstantem Volumen in einen Bioreaktor erlaubt,
so dass die Trübung
um einen Sollwert herum pendelt; oder Chemostat, was eine kontinuierliche
Zuführung
von Kulturmedium mit konstantem Volumen in einen Bioreaktor mit
einer Strömungsgeschwindigkeit
erlaubt, die kleiner ist als das maximale Ausmaß des Wachstums des Mikroorganismus.
-
Verschiedene
Einrichtungen zur Einführung
von Fluiden können
verwendet werden, wie zum Beispiel Pumpen, "Alles-oder-nichts-" oder Proportional-Magnetventile, Durchflussmesser, mehrere
Vorratstanks für verschiedene
Substrate oder Verbindungen, die in Abhängigkeit von der Zeit oder
der optischen Dichte zugesetzt werden, und/oder mehrere Gase.
-
Vorzugsweise
sind die Leitungssysteme mittels Verbindungsteilen miteinander verbunden,
die jeweils einen männlichen
Teil, der mit einem ersten der Leitungssysteme verbunden ist, einen
weiblichen Teil, der mit einem zweiten der Leitungssysteme verbunden
ist, und Verbindungseinrichtungen des männlichen Teils mit dem weiblichen
Teil umfassen, wobei der männliche
Teil und der weibliche Teil jeweils folgendes umfassen:
- – ein
längliches
und hohles Ende, das mit dem Leitungssystem verbunden ist, welches
diesem Teil entspricht, und mit diesem Leitungssystem in Verbindung
steht; und
- – eine
längliche
Hülse,
die dieses Ende umgibt und mit diesem Leitungssystem verbunden ist.
-
Das
Ende des männlichen
Teils wird in das Ende des weiblichen Teils eingeführt, die
Hülse eines
der Teile wird in die Hülse
des anderen Teils eingeführt,
und die Hülsen
sind durch die Verbindungseinrichtungen aneinander befestigt.
-
So
können
die Hülsen
den Schutz der Enden, in denen ein Fluid zirkuliert, gewährleisten.
-
Vorzugsweise
sind die Verbindungsteile mit Stopfen, die einen dichten Verschluss
gewährleisten,
ausgestattet und werden mit Dampf sterilisiert, zum Beispiel in
einem Autoklaven. Im Verlaufe der Verbindung werden die Stopfen
weggenommen, und die Enden der Hülsen
werden einem kurzen Kontakt mit einer Flamme ausgesetzt, um ihre
Sterilität
und diejenige der Luft, die sich in unmittelbarer Nähe befindet,
zu bewahren. Dieses System erlaubt es, die internen Zonen des männlichen
und des weiblichen Teils kühl
zu halten, und ermöglicht
so eine sofortige Verbindung ohne Beeinträchtigung von Dichtungen, wobei
gleichzeitig eine perfekte Sterilität aufrechterhalten wird.
-
Die
Dichtigkeit der Verbindung zwischen den beiden Enden wird vorteilhafterweise
mittels Dichtungen erhalten, die jeweils formschlüssig mit
dem männlichen
und dem weiblichen Teil verbunden sind und an die die Enden des
weiblichen bzw. männlichen
Teils anstoßen.
-
Vorzugsweise
wird die Hülse
des männlichen
Teils in die Hülse
des weiblichen Teils eingeführt.
Der durch die Hülsen
gewährleistete
Schutz ist so noch sicherer.
-
Außerdem ist
es interessant, dass die Verbindungseinrichtungen einen Klemmring,
der mit dem Leitungssystem verbunden ist, das der aufnehmenden Hülse entspricht,
und ein Befestigungssystem (zum Beispiel Gewinde), das auf der Hülse, die
in die aufnehmende Hülse
eingeführt
wird, vorgesehen ist und mit dem Klemmring zusammenarbeitet, umfassen.
-
Der
Klemmring wird vorteilhafterweise so bearbeitet, dass er einen Anschlag
enthält,
der die Klemmspannung beschränkt.
Diese Ausführungsform
vermeidet ein übermäßiges Zusammendrücken der
Dichtungen und damit ihre Beeinträchtigung.
-
In
einer anderen Ausführungsform
sind den internen Zonen des männlichen
und des weiblichen Teils Dichtungsringe beigefügt. Sie erlauben es, die Sicherheit
und Dichtigkeit zu erhöhen.
-
Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Messung wenigstens einer
optischen Eigenschaft eines Mediums, wobei:
- – ein Lichtbündel mit
variabler Intensität
auf oder in das Medium emittiert wird und
- – die
Intensität
des vom Medium zurückgeworfenen
Lichtbündels
gemessen wird;
- – die
Intensität
des emittierten Lichtbündels
so eingestellt wird, dass die Intensität des zurückgeworfenen Lichtbündels gleich
einer festgelegten nominellen Intensität ist;
- – die
so erhaltene stabilisierte Intensität des emittierten Lichtbündels gelesen
wird; und
- – ein
Wert, der der stabilisierten Intensität entspricht, mit einer Gleichung
in Bezug gesetzt wird, die durch eine Kurve bestimmt ist, welche
die wenigstens eine optische Eigenschaft als Funktion des Werts,
der der stabilisierten Intensität
des emittierten Lichtbündels
entspricht, für
die nominelle Intensität
des zurück geworfenen
Lichtbündels
wiedergibt, so dass man daraus die wenigstens eine optische Eigenschaft
des Mediums erhält.
-
Gemäß der Erfindung
wird die nominelle Intensität
so eingestellt, dass die stabilisierte Intensität des emittierten Lichtbündels in
einem vorbestimmten Bereich liegt.
-
Weitere
Vorteile und Ziele der Erfindung werden durch die Lektüre der Beispiele,
die im folgenden zur Veranschaulichung und nicht einschränkend angegeben
sind, unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren erkennbar, wobei:
-
1 ein Prinzipschema einer
Messvorrichtung gemäß der Erfindung
ist;
-
2 einen Mikrofermenter darstellt,
der mit einer Messvorrichtung gemäß der Erfindung ausgestattet ist;
-
3 eine automatische Station
schematisiert, die acht Mikrofermenter gemäß der Erfindung umfasst;
-
4 einen Längsschnitt
des männlichen
Teils eines Verbindungsteils mit Stopfen darstellt, das für die Mikrofermenter
der 2 und 3 verwendet wird;
-
5 ein Querschnitt V-V des
männlichen
Teils der 4 ist;
-
6 einen Längsschnitt
des weiblichen Teils des Verbindungsteils, das dem männlichen
Teil der 4 entspricht,
mit Stopfen darstellt;
-
7 ein Querschnitt VII-VII
des weiblichen Teils der 6 ist;
-
8 das Verbindungsteil zeigt,
das aus dem männlichen
und dem weiblichen Teil der 4 bis 7 zusammengesetzt ist;
-
9 ein elektronisches Ausführungsschema
einer Messvorrichtung gemäß der Erfindung
darstellt, die sich auf den Mikrofermenter der 2 und auf die automatische Station der 3 anwenden lässt;
-
10 eine zweite elektronische
Ausführungsform
anstelle derjenigen von 9 zeigt;
-
11 eine dritte elektronische
Ausführungsform
anstelle derjenigen von 9 und 10 zeigt;
-
12 eine Menge von Eichkurven
darstellt, die mit einer Kultur der Hefe Saccharomyces cerevisiae hergestellt
wurden und die Spannung, die repräsentativ für die Intensität des emittierten
Lichtbündels
ist, als Funktion der Trübung
für eine
Menge von Spannungen, die für
die nominelle Intensität
des durchgelassenen Lichtbündels
repräsentativ
sind, angeben;
-
13 mit einer Messvorrichtung
gemäß der Erfindung
erhaltene Wachstumskurven zeigt, die die Entwicklung der Trübung als
Funktion der in Stunden ausgedrückten
Zeit für
drei Stämme
von Saccharomyces cerevisiae der Typen FY23, FY73 bzw. FY1679 angeben,
die in YPD-Komplexmedium (Hefeextrakt, Pepton, Glucose) bei 30°C kultiviert
wurden;
-
14 parallel die mit einer
Messvorrichtung gemäß der Erfindung
erhaltenen Wachstumskurven (natürlicher
Logarithmus der Trübung
als Funktion der Zeit in Stunden) des Stamms des Typs FY23 und der
Mutante des Typs FYBL2-5D/Dn049
zeigt, die bei 30°C
in YPD-Komplexmedium kultiviert wurden;
-
15 die mit einer Messvorrichtung
gemäß der Erfindung
erhaltene Wachstumskurve in einer automatisierten cyclischen Kultur
des Stamms des Typs FY1679 zeigt, der bei 30°C in YPD-Komplexmedium kultiviert
wurde.
-
Die
technische Lehre dieser Figuren, insbesondere der 4 bis 11,
wird als wesentlicher Bestandteil der folgenden Beschreibung angesehen.
-
In
den 9 bis 11 sind identische Elemente
mit denselben Bezugszeichen identifiziert.
-
Eine
Vorrichtung zur Messung der Trübung
T (1) eines flüssigen Mediums 1,
das in einem transparenten Behälter 2 enthalten
ist, umfasst einen Strahler 3, der ein Lichtbündel 11 zum
Medium 1 emittiert. Vorzugsweise ist der Strahler fast
monochromatisch und emittiert im Infrarot, zum Beispiel um 880 nm
herum.
-
Das
Lichtbündel 11 wird,
nachdem es das Medium 1 durchquert hat, zu einem durchgelassenen
Lichtbündel 12,
dessen Intensität
mit einem Photorezeptor 4 gemessen wird. Der Photorezeptor 4 ist
zum Beispiel vom Photodarlington-Typ. Vorzugsweise sind der Strahler 3,
der Behälter 2 und
der Photorezeptor 4 in einer Linie angeordnet. In Ausführungsvarianten
ist der Photorezeptor 4 nicht mit dem Strahler 3 und
dem Behälter 2 in
einer Linie ausgerichtet, so dass er ein gestreutes oder reflektiertes
Lichtbündel
nachweist. Die bevorzugte Ausführungsform
entspricht jedoch einer optimalen Genauigkeit.
-
Der
Strahler 3 ist mit einem Steuerblock 6 verbunden,
der eine Spannung U1, die der Stärke
des den Strahler 3 durchfließenden Stroms I1 und folglich
der Intensität
des emittierten Lichtbündels 11 direkt
proportional ist, lesen und modifizieren kann. Der Photorezeptor 4 ist
mit einer Regeleinheit 7 verbunden, die dazu dient, Werte,
die repräsentativ
für das
durchgelassene Lichtbündel 12 sind,
vorzugeben und zu lesen. Vorzugsweise sind die Werte, die für das emittierte
Lichtbündel 11 und
für das
durchgelassene Lichtbündel 12 repräsentativ
sind, direkt proportional zur Stärke
des Stroms I1 bzw. I2, der den Strahler 3 bzw. den Photorezeptor 4 durchfließt.
-
Die
Regeleinheit 7, die mit dem Photorezeptor 4 und
mit der Datenverarbeitungseinheit 5 verbunden ist, soll
eine Spannung U2, die der Stärke
des den Photorezeptor durchfließenden
Stroms I2 direkt proportional ist, mit einem Sollwert V2 vergleichen.
Dieser letztere Wert, der durch die Datenverarbeitungs einheit 5 geliefert wird,
ist für
einen gegebenen Messbereich repräsentativ
für eine
nominelle Intensität
des durchgelassenen Lichtbündels 12.
-
Die
Datenverarbeitungseinheit 5 kann außer Datenverarbeitungseinrichtungen
insbesondere auch Einrichtungen, die es erlauben, der Einheit 7 den
Wert der Spannung V2 vorzugeben, Leseeinrichtungen für repräsentative
Werte U1 der Intensität
des emittierten Bündels 11 sowie
Datenspeichereinrichtungen umfassen. Die Regeleinheit 7 ist
außerdem
mit dem Steuerblock 6 verbunden und wirkt in Abhängigkeit
der Differenz zwischen den Spannungen U2 und V2 auf diesen ein.
Diese Rückkopplungsschleife,
zu der die Einheiten 3, 4, 6 und 7 beitragen,
dient also dazu, diese Differenz auf Null zu reduzieren. Im Gleichgewicht
ist die Spannung U2 gleich dem Sollwert V2, und die Spannung U1
ist auf einen Wert V1 stabilisiert.
-
Diese
Spannung V1 ist repräsentativ
für die
Trübung
T des Mediums 1. Diese Spannung V1 wird an die Datenverarbeitungseinheit 5 geschickt,
die für
einen gegebenen Sollwert V2 die Trübung T für die Spannung V1 einer mathematischen
Funktion entnimmt, die ausgehend von einer Eichkurve für die Messvorrichtung
aufgestellt wurde und die Trübung
T als Funktion der Spannung V1 für
den Wert V2 angibt.
-
So
ist eine Menge von Eichkurven 101–117 in 12 eingezeichnet, wobei
eine erste Achse 61 die Trübung T in Einheiten der OD
angibt und eine zweite Achse 62 die stabilisierte Spannung
V1 in Volt angibt. Diese Eichkurven 101–117 entsprechen jeweils
den folgenden Sollwerten V2:
8 V, 7 V, 6 V, 5 V, 4 V, 3 V,
2 V, 1,5 V, 1 V, 0,75 V, 0,5 V, 0,4 V, 0,3 V, 0,2 V, 0,1 V, 0,05
V, 0,025 V.
-
Die
Wahl des Sollwerts V2 hängt
vom Bereich der Trübung
T ab, den man abdecken möchte.
Tatsächlich
wächst
die stabilisierte Spannung V1 um so schneller mit der Trübung T,
je höher
der Sollwert V2 ist. Da die Spannung V1 nach oben begrenzt ist,
kann der Wert V2 also für
eine obere Schwelle, die diesem Trübungsbereich entspricht, nicht
aufrechterhalten werden. Für
einen gegebenen Bereich ist es jedoch vorteilhaft, den Sollwert
V2 so groß wie
möglich
zu wählen,
um die größte Steigung
der Variation der Spannung V1 als Funktion der Trübung T und
somit die beste Genauigkeit der Messung zu erhalten.
-
Vorzugsweise
stellt die Messvorrichtung den Sollwert V2 als Funktion der Messungen
automatisch ein. Dazu geht sie vorteilhafterweise in folgender Weise
vor. Die Datenverarbeitungseinheit 5 verfügt über eine Oberschwelle
der Spannung V1 und über
eine Liste der vorbestimmten Werte V2, die in abnehmender Reihenfolge
angeordnet sind. Am Anfang einer Reihe von Messungen überträgt die Datenverarbeitungseinheit 5 den
höchsten
Wert V2 der Liste an die Regeleinheit 7, dann stellt die
Rückkopplungsschleife
die Spannung U1 so ein, dass U2 gleich V2 ist. Dann wird der Wert
V1 der Spannung U1 an die Datenverarbeitungseinheit 5 geschickt,
die bei jeder Messung überprüft, dass
die stabilisierte Spannung V1 unterhalb der vorbestimmten Schwellenspannung
bleibt. Wenn die Spannung V1 diese Schwelle überschreitet, schickt die Datenverarbeitungseinheit 5 einen
geringeren Sollwert V2 an die Regeleinheit 7, und dieser
neue Sollwert wird für
die folgenden Messungen verwendet. Wenn eine mathematische Beziehung
den Wert V1 für
mehrere Trübungsbereiche
mit dem Wert V2 verbindet, ist es auch möglich, die Datenverarbeitungseinheit 5 aufzufordern,
die Sollwerte V2, die für
die Berechnung der Trübung
am besten geeignet sind, selbst zu berechnen.
-
Vorzugsweise
bestimmt die Messvorrichtung nach jeder Messung automatisch die
Trübung
T. Diese Bestimmung wird dann von der Datenverarbeitungseinheit 5 ausgehend
von den Eichkurven 101–117 vorgenommen.
-
Die
Messvorrichtung wird vorteilhafterweise auf einen Mikrofermenter 20 angewendet,
wie er in 2 dargestellt
ist. In dem vorgestellten Ausführungsbeispiel
ist der Behälter 2 ein
Glasrohr, zum Beispiel mit einem quadratischen Querschnitt mit 20
mm Seitenlänge
und einer Höhe
von 160 mm, was ein nützliches
Kulturvolumen von ungefähr
55 bis 60 ml ergibt. Allgemeiner gesagt enthält das Glasrohr 2 ein
nützliches
Volumen, das vorteilhafterweise zwischen 10 und 60 ml liegt. Das
Rohr 2 befindet sich in einem Block 21 aus einer
Metalllegierung, der sich selbst auf einem thermostatisierten trockenen
Bad befindet. Der Block selbst kann mit einem autonomen Heizungssystem
ausgestattet sein. Auf das Rohr 2 ist ein Stopfen 22 montiert,
durch den mehrere kleine Leitungssysteme aus Glas oder aus Kunststoff
verlaufen. Ein erstes dieser Leitungssysteme aus Glas, das als 33 bezeichnet
wird, reicht bis zum Boden des Rohrs 2 und leitet ständig sterile
Luft oder steriles Gas 14 in die Kultur ein. Es kann auch
in bestimmten Momenten neues Kulturmedium 15 einleiten.
Dieses Leitungssystem aus Glas 33 ist außerhalb
des Rohrs 2 mit einem Zuleitungssystem 23 verbunden,
in dem die Zuleitungssysteme 24 und 25 für sterile
Luft oder steriles Gas 14 bzw. Kulturmedium 15 zusammenlaufen.
Die Zuleitungssysteme 24 und 25 sind vorzugsweise
mit einem Magnetventil ausgestattet. Der Mikrofermenter 20 umfasst
auch ein zweites Leitungssystem aus Glas 36, das in mittlerer
Höhe vom
Rohr 2 abzweigt und das die Durchführung der Impfung und der Probenentnahmen
erlaubt. Das Leitungssystem aus Glas 36 ist außerhalb des
Rohrs 2 mit einem Entnahmeleitungssystem 26 für die Entnahme
der Probe 16 verbunden.
-
Der
Mikrofermenter 20 umfasst auch ein drittes Leitungssystem
aus Glas 37, das oben auf das Rohr 2 platziert
wird und mittels eines Entfernungsleitungssystems 27, das
sich außerhalb
des Rohrs 2 befindet und die Entfernung der Ausflüsse 17 ermöglicht,
mit einer Ausflussflasche verbunden ist.
-
Die äußeren Leitungssysteme 23–27 sind
vorzugsweise biegsam.
-
Der
Strahler 3 und der Photorezeptor 4 werden beiderseits
des Rohrs 2 in Öffnungen
des Blocks 21 aus Metalllegierung eingesetzt und mittels
elektrischer Drähte 31 bzw. 32 mit
dem Messsystem verbunden.
-
Die
Gesamtheit des Mikrofermenters 20 mit seinen äußeren Leitungssystemen 23–27 sowie
dem Vorratstank, der das Kulturmedium 15 für den Mikrofermenter 20 liefert,
stehen vorzugsweise unter Überdruck. Außerdem zirkuliert
die sterile Luft bzw. das sterile Gas 14 nur in einer Richtung,
was jede Kontamination verhindert. Die äußeren Leitungssysteme 24 und 25 sind
dann vorteilhafterweise Rohre mit bekanntem Druckverlust, die es
erlauben, eine genaue Durchflussmenge zu erhalten. Die Gesamtheit
der Montage ist heiß sterilisierbar
und völlig
dicht.
-
In
einer ersten Ausführungsform
wird die Vorrichtung zur Trübungsmessung
auf einen isolierten Mikrofermenter angewendet. In einer zweiten
Ausführungsform,
die in 3 gezeigt ist,
wird eine Menge von Vorrichtungen zur Trübungsmessung auf eine Batterie 40 von
8 Mikrofermentern angewendet. Zum Beispiel umfasst die Batterie 40 acht
Mikrofermenter 41–48 des
weiter oben beschriebenen Mikrofermentertyps 20. Die Menge
der äußeren Leitungssysteme 24, 25 und 27 der
Mikrofermenter 41–48 ist
dann jeweils mit drei zentralen Leitungssystemen 54, 55 und 57 gekoppelt.
Jedes der Leitungssysteme 25 ist mit einem Magnetventil 35 ausgestattet.
Außerdem
ist jedes der Leitungssysteme 24 mit einem Magnetventil 34 ausgestattet.
-
Die
Leitungssysteme 27 können
mit Magnetventilen ausgestattet sein, um automatische Probeentnahmen
zu ermöglichen.
Das Leitungssystem 57, in dem die Leitungssysteme 27 zusammenlaufen,
zweigt in eine Ausflussflasche 52 ab, die Abfälle 53 enthalten
soll.
-
Der
Vorratstank für
das Kulturmedium 15 steht unter Druck und umfasst einen
Behälter 51,
der mit einem Stopfen 59 verschlossen ist und durch ein
Leitungssystem 58, das den Stopfen 59 durchquert
und am Boden des Behälters 51 abzweigt,
mit steriler Luft oder sterilem Gas 18 versorgt wird. Das
Leitungssystem 55 durchquert den Stopfen 59 und
reicht bis zum Boden des Behälters 51.
Diese Vorrichtung erlaubt es, den am Boden des Vorratstanks herrschenden
Druck einzustellen. Dieser Druck ist gleich dem Druck des Gases
des Leitungssystems 58, unabhängig von der Flüssigkeitshöhe (Mariottesche
Flasche).
-
Die
Leitungssysteme 23–27, 33, 36, 37, 54, 55 und 57 sind
vorzugsweise mittels Verbindungsteilen 200, die in 8 dargestellt und im folgenden
ausführlich
beschrieben sind, angeschlossen.
-
Das
Verbindungsteil 200 umfasst:
- – ein männliches
Teil 201 (4 und 5), das mit einem ersten
Rohr 211 verbunden ist, welches eines der Leitungssysteme
bildet und durch einen ersten Stopfen 212 verschlossen
ist; und
- – ein
weibliches Teil 202 (6 und 7), das mit einem zweiten
Rohr 214 verbunden ist, welches ein anderes der Leitungssysteme
bildet und durch einen zweiten Stopfen 215 verschlossen
ist.
-
Das
männliche
Teil 201 umfasst:
- – einen Rumpf 216,
vorzugsweise aus nichtoxidierbarem Metall, der über ein Teil 217,
das leicht verjüngt sein
kann, an das Rohr 211 angeschlossen ist;
- – eine
interne Stoßkante 218;
- – ein
internes Ende 219;
- – eine
Hülse 220;
- – ein
Gewindeklemmsystem 221 in Form eines Rings; und
- – eine
flache runde Dichtung 222, die in der Mitte durchbohrt
ist.
-
Der
Stopfen 212 des männlichen
Teils 201 hat einen Boden, der mit einer flachen runden
Dichtung 223 ausgestattet ist, und ein Ende 225,
das mit einem Außengewinde
ausgestattet ist, welches eine Verschraubung mit dem Klemmsystem 221 erlaubt.
-
Das
weibliche Teil 202 umfasst:
- – einen
Rumpf 230, vorzugsweise aus nichtoxidierbarem Metall, der über ein
Teil 231, das leicht verjüngt sein kann, an das Rohr 214 angeschlossen
ist;
- – eine
interne Stoßkante 232;
- – ein
internes Ende 233;
- – eine
Hülse 234 mit
einem Ende 237, das mit einem Außengewinde versehen ist; und
- – eine
flache runde Dichtung 235, die in der Mitte durchbohrt
ist.
-
Der
Stopfen 215 des weiblichen Teils 202 hat einen
Boden, der mit einer flachen Dichtung 236 versehen ist,
und ein Ende 238, das mit einem Innengewinde versehen ist,
welches eine Verschraubung mit dem äußeren Ende 237 der
Hülse 234 erlaubt.
-
Vor
der Verbindung werden das männliche
Teil 201 und das weibliche Teil 202, die an die
Rohre 211 bzw. 214 angeschlossen und mit ihren
Stopfen 212 bzw. 215 versehen sind, sterilisiert,
zum Beispiel mit Dampf.
-
Die
Verbindung erfolgt in folgender Weise:
- – die Stopfen 212 und 215 des
männlichen
Teils 201 und des weiblichen Teils 202 werden
losgeschraubt, ohne sie abzumachen;
- – dann
orientiert man über
einer Flamme die Enden 219 und 233 des männlichen
Teils 201 und des weiblichen Teils 202 nach unten;
dies hat zur Folge, dass die beiden Stopfen 212 und 215 herunterfallen;
- – dann
werden die Hülsen 220 und 234 schnell
in die Flamme gehalten;
- – man
führt das
männliche
Teil 201 in das weibliche Teil 202 ein, bis das
Ende 219 mit der Dichtung 235 in Kontakt ist und
das Ende 233 mit der Dichtung 222 in Kontakt ist;
und
- – man
schraubt das Klemmsystem 221 auf das Gewinde des Endes 238 der
Hülse 234.
-
So
erhält
man das Verbindungsteil 200, das eine dichte und zuverlässige Verbindung
mit Schutz durch die Hülsen 220 und 234 bietet,
wie es in 8 dargestellt
ist.
-
Die
Strahler 3, Photorezeptoren 4, Steuereinheit 6 und
Regeleinheit 7 sowie die Magnetventile 34 und 35,
die mit den Mikrofermentern 41–48 verbunden sind,
sind mit einer Datenverarbeitungseinheit 5 verbunden, die
eine Zentraleinheit 8 enthält, die aus einem Mikrocomputer
besteht, der an ein Analog/Digital- und Digital/Analog-Interfacesystem
gekoppelt ist.
-
Ein
erstes besonderes elektronisches Ausführungsschema einer Vorrichtung
zur Trübungsmessung, das
in 9 dargestellt ist,
ist auf einen isolierten Mikrofermenter oder auf einen Mikrofermenter
einer Batterie anwendbar.
-
In
dem elektronischen Schema ist die Masse durch das Bezugszeichen 80 bezeichnet,
und die Anschlüsse
des negativen und positiven Eingangs sowie der Ausgangsanschluss
der Operationsverstärker
sind mit A, B bzw. C bezeichnet.
-
Die
symmetrische Versorgung wird vorzugsweise auf eine Spannung +V von
+12 Volt und –V
von –12 Volt
stabilisiert und geregelt.
-
Außerdem sind
alle festen Widerstände
beispielsweise Metallschichtwiderstände 1/4 W, und die Kondensatoren
sind nichtpolarisiert. Man gibt außerdem die Werte der Abgleichwiderstände und
der Potentiometer an für
10 Durchgänge – 1/2 W.
-
Der
Strahler 3 umfasst eine Infrarot-Leuchtdiode 73 oder
LED, und der Photorezeptor 4 umfasst einen Phototransistor 74 des
Darlington-Typs. Dieser Phototransistor 74 ist mit einem
Kondensator C1 von 0,1 μF ausgestattet,
der Schwingungen vermeiden soll.
-
Der
Steuerblock 6 umfasst einen Operationsverstärker 81,
dessen positiver Eingang B eine gesteuerte Spannung empfängt und
dessen negativer Eingang A über
den Widerstand R1 mit der Masse 80 verbunden ist. Der Ausgang
C des Verstärkers 81 steuert über den
Umweg eines Transistors 87, der die Rolle des Dämpfungsorgans
oder Puffers spielt, die Intensität des Stroms I1, der die Diode 73 durchströmt, und
folglich die Intensität
des emittierten Lichtbündels 11.
Der Verstärkungsfaktor
des Verstärkers 81 ist
durch Widerstände R1
und R3 von jeweils 1 kΩ auf
2 festgelegt. Der Steuerblock 6 umfasst außerdem einen
Widerstand R5 von 90,9 Ω,
an dessen Anschlüssen
man die Spannung U1 misst.
-
Dieser
Widerstand R5 erfüllt
eine Funktion der Strom/Spannungs-Umwandlung und beschränkt die maximale
Stromstärke
durch die Diode 73 auf 100 mA.
-
Der
Steuerblock 6 umfasst außerdem zwei Widerstände R2 und
R4 mit Werten von 1 kΩ bzw.
100 Ω.
-
Die
Regeleinheit 7 umfasst einen Widerstand R6 von 1 kΩ, der die
Intensität
I2, die den Phototransistor 74 verlässt, in die Spannung U2 umwandelt.
Die Regeleinheit 7 umfasst auch einen Operationsverstärker 82, dessen
negativer Eingang A diese Spannung U2 empfängt, dessen positiver Eingang
B den Sollwert V2 empfängt
und dessen Ausgang C mit dem positiven Eingang B des Verstärkers 81 des
Steuerblocks 6 verbunden ist. Der Verstärkungsfaktor des Verstärkers 82 ist
sehr groß,
da es keinen Gegenreaktionswiderstand gibt, und daher resultiert
eine große
Empfindlichkeit gegenüber
Variationen der Intensität
des durchgelassenen Lichtbündels 12,
was zu einer großen
Wirksamkeit der Regelung führt.
Der Verstärker 82 ist
mit einem Kondensator C2 von 1 μF
ausgestattet, der dazu dient, Schwingungen zu vermeiden.
-
Die
Regeleinheit 7 umfasst auch einen Widerstand R7, der mit
dem positiven Eingang B des Verstärkers 82 verbunden
ist und einen Wert von 1 kΩ hat.
-
In
dem gezeigten Beispiel besteht die Datenverarbeitungseinheit 5 einerseits
aus einer Strom/Spannungs-Umwandlungsstufe 72, die sie
mit der Einheit 7 verbindet, einer Spannungs/Strom-Umwandlungsstufe 71,
die sie mit der Einheit 6 verbindet, und andererseits aus
einer Zentraleinheit 8, die aus einem Mikrocomputer besteht,
der mit einem Analog/Digital-Digital/Analog-Wandler-Interface ausgestattet
ist, das über
eine Stromschleife von 4–20
mA kommuniziert. Diese letztere Art der Kommunikation durch eine
Stromschleife macht die Stufen 71 und 72 notwendig.
Ein Informatiksystem, das mit einer Wandlerkarte ausgestattet ist,
die direkt in Spannung arbeitet, erlaubt es, auf die Stufen 71 und 72 zu
verzichten.
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Die
Umwandlungsstufe 71 beruht auf der Verwendung eines Operationsverstärkers 83,
dessen positiver Eingang B die Spannung U1 empfängt, und auf einer Spannungs/Strom-Umwandlungsschaltung 84,
deren Eingang mit dem Ausgang C des Verstärkers 83 verbunden
ist. Die Umwandlungsstufe 71 umfasst außerdem Widerstände R8–R12 mit
den Werten 2,43 kΩ,
2,43 kΩ,
1 kΩ, 1
kΩ bzw.
2,25 kΩ.
Sie umfasst auch ein Potentiometer P1 von 200 Ω, einen Abgleichwiderstand
P2 von 50 Ω und
einen Kondensator C3 von 1 μF.
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Die
Umwandlungsstufe 72 beruht auf der Verwendung von zwei
Operationsverstärkern 85 und 86.
Der positive Eingang B des Verstärkers 85 empfängt eine
Spannung der Zentraleinheit 8, die repräsentativ für den Sollwert V2 ist. Der
Ausgang C des Verstärkers 85 ist
mit dem positiven Eingang B des Verstärkers 86 verbunden,
und der Ausgang C der Verstärkers 86 ist
mit dem positiven Eingang B des Verstärkers 82 der Regeleinheit 7 verbunden.
So schickt die Datenverarbeitungseinheit 5 den Sollwert
V2 an die Regeleinheit 7, was es ihr erlaubt, gegebenenfalls
einen Befehl zur Änderung
des Messbereichs zu geben.
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Die
Umwandlungsstufe 72 umfasst auch Widerstände R13–R20, wobei
die Widerstände
R14–R16, R19
und R20 einen Wert von 1 kΩ haben
und die Widerstände
R13, R17 und R18 Werte von 250 Ω,
1,3 kΩ bzw.
1,82 kΩ.
Die Umwandlungsstufe 72 umfasst auch ein Potentiometer
P3 von 500 Ω,
einen Abgleichwiderstand P4 von 1 kΩ und Kondensatoren C4 und C5
von jeweils 1 μF.
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Die
Datenverarbeitungseinheit 5 umfasst vorteilhafterweise
eine Steuereinheit, die dazu dient, die Öffnung und Schließung von
Magnetventilen zu steuern, die sich in variabler Anzahl auf den
Leitungen für
die Zufuhr von Kulturmedium 15 und auch von steriler Luft
oder sterilem Gas 14 befinden. Zum Beispiel wirkt die Datenverarbeitungseinheit 5 mittels
der Steuersysteme 91–98 auf
die Magnetventile 34 und 35 der Mikrofermenter 41–48.
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Als
Ausführungsbeispiel
sind die Diode 73 und der Phototransistor 74,
die von der Firma Honeywell gebaut wurden, vom Typ, der unter den
Namen SE5470-003
und SD5410-002 vermarktet wird, und die Operationsverstärker 81, 82, 83, 85, 86 werden
unter dem Namen LM358A von der Firma National Semiconductor (NSC)
hergestellt und vermarktet. Die Umwandlungsschaltung 84 ist
vom Typ 2B20A und wird von der Firma Analog Devices (AD) hergestellt,
während
der Transistor 87 unter der Bezeichnung 2N2222 vermarktet
wird.
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Gemäß einem
zweiten elektronischen Ausführungsschema
(10) ersetzt man die
Stufen 71 und 72 mittels einer elektronischen
Karte, die die Analog/Digital- und Digital/Analog-Umwandlungen direkt
durchführt und
die Ergebnisse und Befehle in digitaler Form über einen Kommunikationsbus
weitergibt.
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Die
Spannung U1 an den Anschlüssen
des Widerstands R5 wird dann in Form eines analogen Signals über einen
Ausgangspunkt PT1 auf die Karte übertragen.
Außerdem
ist der positive Eingang B des Operationsverstärkers 82 mittels des
Widerstands R7 durch einen Eingangspunkt PT2 mit der Karte verbunden.
So schickt die Karte den Sollwert V2 in analoger Form an die Regeleinheit 7.
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Gemäß einem
dritten elektronischen Ausführungsschema
(11), die eine Variante
des zweiten Schemas ist, ist der negative Eingang A des Operationsverstärkers 82 über einen
Steuerpunkt PT3 ebenfalls mit der Karte verbunden. Dieser Punkt
PT3, der es erlaubt, den Wert der Spannung U2 zu übertragen,
dient dazu, die Funktionsfähigkeit
der Spannungseinstellung und der Rückkopplung zu überprüfen. So
ermöglicht er
durch Ermittlung der Differenzen zwischen den Spannungen U2 und
V2 eine globale Kontrolle aller Elemente der Kette.
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Vorzugsweise
sind alle Bestandteile des Steuerblocks 6 und der Regeleinheit 7 auf
einer elektronischen Karte implantiert.
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Vorteilhafterweise
sind mehrere Karten in einem Gehäuse
integriert, darunter eine spezifische Initialisierungskarte.
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In
der Funktion ist es interessant, in der im folgenden beschriebenen
Weise für
einen der Mikrofermenter 41–48 der Batterie 40 vorzugehen,
wobei die Mikrofermenter voneinander unabhängig sind, da sie jeweils von
einem eigenen Informatikprogramm gesteuert werden. In regelmäßigen Abständen beginnt
ein Zeitzähler zu
laufen, und wenn die Zeit einem festgelegten Wert entspricht, werden
die folgenden Ereignisse ausgelöst:
- – Ein
Signal wird vom Programm der Zentraleinheit 8 gesendet,
die so mittels eines Relais (Steuersysteme 91–98)
das Magnetventil 34 auslöst; dieses unterbricht die
Einleitung von steriler Luft oder sterilen Gasen in die Mikrofermenter 41–48,
um keine Blasen zu verursachen, die Fehler in den Messungen verursachen würden.
- – Durch
das Programm wird der Sollwert V2 in die Regeleinheit 7 eingegeben.
- – Da
der Sollwert V2 festgelegt ist, stellt die autonom funktionierende
Regeleinheit 7 die Spannung U1 so ein, dass die genaue
Menge an Licht emittiert wird, die nach Durchgang durch das Rohr 2 das
Auftreten einer Spannung U2 hervorruft, die gleich dem Sollwert
V2 und proportional zur Stärke
des Stroms I2, der durch den Photorezeptor 4 fließt, ist.
- – Der
Wert der Spannung U1 wird in einen digitalen Wert umgewandelt und
vom Programm aufgezeichnet.
- – Das
Paar Strahler 3/Photorezeptor 4 wird in den Ruhezustand
versetzt.
- – Durch
Anhalten des Magnetventils 34 wird die Belüftung oder
der Gasdurchgang wieder aufgenommen.
- – Der
Zeitzähler
wird auf Null zurückgesetzt.
- – Wenn
der gemessene Wert von U1 bestimmte festgelegte Schwellen nicht überschreitet,
berechnet das Programm den entsprechenden Wert der Trübung T,
indem es eine Gleichung verwendet, die zuvor empirisch bestimmt
wurde. Jedem Sollwert V2 entspricht eine Gleichung zum Beispiel
der Form: T = a × U13+
b × U12 + c × U1
+ d,wobei die Koeffizienten a, b, c und d für den Wert von V2 experimentell
bestimmt wurden.
- – Der
Cyclus beginnt von neuem.
- – Wenn
der gemessene Wert von U1 die festgelegte Schwelle überschreitet,
wird ein niedrigerer Sollwert V2 gewählt, und der Zeitzähler wird
künstlich
weitergestellt, um sogleich eine Messung mit diesem neuen Parameter
vorzunehmen, und dann wird die Trübung T berechnet.
- – Der
Cyclus beginnt von neuem.
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Die
Werte der Trübung
T werden auf dem Bildschirm des Mikrocomputers der Zentraleinheit 8 angezeigt,
was es erlaubt, die Entwicklung der Kultur im Laufe der Zeit zu
verfolgen. Außerdem
werden diese Werte in einer Datei archiviert, um die Daten später zu verarbeiten,
zum Beispiel mit einem Tabellenkalkulationsprogramm.
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In
einer Realisierungs- und Ausführungsvariante
führt man
die Messungen gebündelt
durch (in Bursts). Die Verwendung des Magnetventils 34 wird
dann unnötig.
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Es
ist interessant, dass die zuvor beschriebene Vorrichtung verwendet
wird, um cyclische Kulturen zu automatisieren. In einer vorteilhaften
Ausführungsform
bestimmt ein Steueralgorithmus das Wachstum der Zellpopulation,
indem er eine lineare Regressionsrechnung mit den n letzten gemessenen
Werten der Trübung T
durchführt,
wobei n regulierbar sein kann. Die Steigung der erhaltenen Regressionsgeraden
wird berechnet: Wenn sie kleiner oder gleich einem festgelegten
Wert ist, wird das Wachstum der Population als nicht vorhanden angesehen,
und ein Zeitzähler
beginnt zu laufen. Wenn die Kultur wieder zu wachsen beginnt, zum
Beispiel nach einer Diauxiephase, wird der Zähler auf Null zurückgestellt.
Wenn der Zähler
einen festgelegten Wert erreicht, löst das Programm der Zentraleinheit 8 über die
Schnittstellen die Öffnung
des betreffenden Magnetventils 35 aus, was eine Zuführung von
frischem Kulturmedium während
einer bestimmten Zeit erlaubt, um eine exponentielle Verdünnung vorzunehmen.
Dann beginnen die Messcyclen von neuem.
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Wir
stellen im folgenden verschiedene Ergebnisse vor, die mittels eines
Mikrofermenters erhalten wurden, der mit einer Vorrichtung zur Trübungsmessung
gemäß der vorstehenden
Beschreibung ausgestattet ist. Wachstumskurven wurden von Stämmen der
Hefe Saccharomyces cerevisiae erhalten, die bei 30°C in YPD-Komplexmedium
kultiviert wurden. Die erhaltenen Ergebnisse, die in den 13 bis 15 dargestellt sind, zeigen eine große Homogenität der Werte,
d. h. sehr wenig Dispersion, und Unterschiede in der Größenordnung
von 2% in Bezug auf Messungen, die parallel mit einem Spektrophotometer
an aus diesen Kulturen entnommenen Proben durchgeführt wurden.
Aufgrund seiner Zuverlässigkeit
erlaubt es die Vorrichtung zur Trübungsmessung also, das Wachstum
der Stämme
sehr leicht zu vergleichen.
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Im
Allgemeinen umfassen die Wachstumskurven, die die Trübung T als
Funktion der Zeit angeben, jeweils einen Teil 131 mit einem
erhöhten
Wert (hohe Steigung) des Wachstums, gefolgt von einem Teil 132 mit
geringem Wachstumswert (geringe Steigung), die durch ein Plateau 133 voneinander
getrennt sind. So haben die Kulturkurven der Wildstämme FY23,
FY73 und FY1679, die als 123, 124 bzw. 125 bezeichnet
werden und in 13 auf
einer Zeitachse 63 (in Stunden) und der Achse 61 für die Trübung T (in
OD-Einheiten) aufgetragen sind, jeweils Teile mit starkem Wachstum 131A, 131B bzw. 131C,
Teile mit geringem Wachstum 132A, 132B und 132C sowie Übergangsplateaus 133A, 133B bzw. 133C.
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Der
Vergleich dieser Wachstumskurven 123–125 zeigt, dass der
Stamm FY73, nachdem er die ganze Glucose des Mediums verbraucht
hat, auf dem Ethanol, das durch Fermentation von Glucose erzeugt
wurde, sehr langsam wächst.
Dagegen haben die Stämme
FY23 und FY1679 auf Ethanol ein sehr schnelles Wachstum (Teile mit
geringen Steigungen 132A und 132C). Außerdem beginnen die
Plateaus 133B und 133C der Diauxie der Stämme FY73
und FY1679 mit einer geringeren Trübung (bei 12,8 OD-Einheiten)
als das Plateau 133A des Stamms FY23 (bei 14,8 OD-Einheiten).
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Andere
Ergebnisse, die in 14 gemäß der Zeitachse 63 in
Stunden und einer Achse 64, die den natürlichen Logarithmus der Trübung (In
OD) wiedergibt, dargestellt sind, stellen die Wachstumskurven 127 bzw. 128 der
Mutante FYBL2-5D/Dn049
und des Stamms FY23 dar. Die Kurven 127 und 128 umfassen
jeweils Teile mit hohem Wachstum 131D und 131E,
Teile mit geringem Wachstum 132D und 132E und Übergangsplateaus 133D und 133E.
Man stellt fest, dass der Stamm FY23 einen Wachstumswert von 0,545
h–1 hat,
also fast das Doppelte des Wachstumswerts des Stamms FYBL2-5D/Dn049,
der 0,286 h–1 beträgt.
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Eine
in 15 dargestellte Wachstumskurve 129 einer
cyclischen Kultur von FY1679, deren Verdünnungen vollständig durch
Mikrocomputer gesteuert werden, umfasst eine Folge von gleichartigen
Cyclen 141–143.
Jeder dieser Cyclen beinhaltet einen Teil mit starkem Wachstum 131 und
einen Teil mit geringem Wachstum 132, die durch ein Übergangsplateau 133 voneinander
getrennt sind. Die Verdünnung
wird 24 Stunden nach dem Beginn der Kultur an einem Verdünnungspunkt 135 ausgelöst. Die
Verdünnung
kann auch ausgelöst
werden, wenn der Wachstumswert fast gleich Null geworden ist, oder
nach einer bestimmten Dauer der stationären Phase der Kultur.
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In
einer anderen Ausführungsform
umfasst die Messvorrichtung:
- – ein in
die Vorrichtung integriertes Strahler/Lichtrezeptor-Paar;
- – eine
Schnittstellenvorrichtung, die einen Datenbus zum Datenaustausch
zwischen einer automatischen Datenverarbeitungsvorrichtung und einem
oder mehreren Mess- und Relaisgehäusen umfasst;
- – eine
automatische Datenverarbeitungsvorrichtung, wie einen Mikrocomputer,
der mit elektronischen Karten, die es erlauben, den Datenfluss im
Datenbus und in einer elektronischen Karte zu steuern, oder mit einer
Software, die die gesammelten Daten elektronisch behandeln kann,
ausgestattet ist.
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Das
bzw. die Messgehäuse
umfassen vorteilhafterweise jeweils eine oder mehrere Relaiskarten
zum Aktivieren der Magnetventile und eine oder mehrere Messkarten.
Diese letzteren umfassen:
- – ein Messsystem, das mit dem
Strahler und mit dem Rezeptor verbunden ist; und
- – einen
Digital/Analog-Wandler, der es erlaubt, die vom Bus kommenden Daten
zu verarbeiten und so eine adäquate
Spannung festzulegen, die an den Strahler anzulegen ist, damit die
Referenzspannung des Rezeptors aufrechterhalten wird.
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Vorteilhafterweise
umfasst ein Messgehäuse
zum Beispiel zehn Messkarten und fünf Relaiskarten, wobei jede
der Messkarten mit einem Mikrofermenter verbunden ist und die Relaiskarten
mit den Magnetventilen verbunden sind.
