ES2212376T3 - Aparato y procedimiento de medicion de propiedades opticas por control reactivo. - Google Patents
Aparato y procedimiento de medicion de propiedades opticas por control reactivo.Info
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Abstract
Aparato de medición de por lo menos una propiedad óptica (T,A,F) de un medio (1), que comprende: - una fuente de luz (3) destinada a emitir un haz luminoso (11) de intensidad variable hacia y en el medio (1), - unos medios de detección (4) destinados a medir la intensidad del haz reflejado (12) por el medio (1), - unos medios de mando (6) de la intensidad del haz emitido (11) por la fuente (3), - unos medios de almacenado destinados a almacenar un valor representativo (V2) de una intensidad nominal del haz reflejado (12), - un sistema de regulación por retroacción (7) conectado a los medios de mando (6), a los medios de detección (4) y a los medios de almacenado, que actúan sobre los medios de mando (6) de manera que la intensidad medida del haz reflejado (12) sea igual a la intensidad nominal, y - unos medios de lectura de la intensidad del haz emitido (11) para dicha intensidad nominal del haz reflejado (12), siendo dichas intensidades del haz emitido (11) y nominal del haz reflejado(12) representativas de dicha por lo menos una propiedad óptica (T,A,F) del medio (1), caracterizado porque dicho aparato comprende unos medios de ajuste de la intensidad nominal, conectados a dichos medios de lectura y de almacenado, destinados a ajustar la intensidad nominal de manera que la intensidad estabilizada del haz emitido (11) esté incluida en una zona predeterminada.
Description
Aparato y procedimiento de medición de
propiedades ópticas por control retroactivo.
La presente invención se refiere a un aparato y a
un procedimiento de medición de propiedades ópticas de un medio, así
como a un microfermentador correspondiente. Estas propiedades
ópticas pueden incluir en particular la turbidez, la absorbencia y
la fluorescencia del medio, a una o varias longitudes de onda o en
unos campos espectrales predeterminados.
En numerosos laboratorios de biología y también
en algunas industrias, es muy a menudo muy necesario cultivar unos
microorganismos en medio líquido y medir la concentración de las
células en diferentes etapas del cultivo. Esta cuantificación puede
realizarse de forma directa sobre unas muestras, por contado de las
células o por medición del peso seco. Aunque muy precisos, estos
procedimientos son largos y fastidiosos y es más fácil realizar una
evaluación de la cantidad de células de forma indirecta, midiendo
por ejemplo la desaparición de substratos o la aparición de
compuestos intracelulares (NADH ...), o extracelulares (alcoholes,
ácidos orgánicos ...). Sin embargo, los procedimientos más cómodos y
más utilizados para evaluar las concentraciones celulares de los
cultivos descansan sobre unas propiedades ópticas de estos
últimos.
Cuando el material es atacado por unas
radiaciones electromagnéticas, estas interactúan con las cargas
electrónicas de los átomos: una parte de estas radiaciones atraviesa
el material sin cambio de dirección (radiación transmitida) y la
otra es difundida en todas las direcciones del espacio,
comportándose cada partícula iluminada entonces como una fuente
luminosa. La cantidad de luz difundida por las partículas presentes
en el medio líquido aumenta con el número y el tamaño de estas
partículas; además, en el caso en que las partículas son unos
microorganismos, se ha demostrado que la difusión de la luz no se
produce de una manera homogénea en todas las direcciones del espacio
sino en la mayor parte en una dirección próxima a la del haz
incidente.
Es en razón de estos fenómenos de difusión que
los cultivos líquidos de microorganismos tienen un aspecto turbio,
cuya densidad aumenta con la concentración celular. Los dispositivos
que permiten cuantificar esta turbidez, o turbidímetros, miden la
turbidez de estos cultivos.
Entre los turbidímetros existentes, se distinguen
los aparatos de medición en discontinuo, con los cuales se mide de
forma repetida la luz transmitida y/o reflejada por un medio
líquido, y los aparatos de medición en línea, para los cuales unas
sondas de medición de turbidez son introducidas en el interior de un
medio líquido y conectadas a un sistema de registro.
Los aparatos de medición en discontinuo, tales
como nefelómetros, colorímetros, espectrofotómetros y turbidímetros
mixtos, no permiten, para la mayor parte de ellos, medir unas
turbideces elevadas. En efecto, su gama de medición no se extiende
habitualmente más allá de 1000 NTU (Nephelometric Turbidity Units) y
está muy a menudo aún mucho más limitada. Es por tanto necesario
diluir unas muestras, lo que aumenta los riesgos de error y la
cantidad de trabajo a realizar por un experimentador. Además, la
toma de muestras es a su vez muy apremiante, puesto que necesita la
presencia de un experimentador a intervalos regulares en toda la
duración de un cultivo. Algunos turbidímetros mixtos han sido
ideados para cubrir una gama más amplia de turbidez, pero se trata
de aparatos costosos.
Los turbidímetros en línea, cuyas gamas de
medición pueden ser bastante vastas, tienen por inconveniente
necesitar unos volúmenes de cultivo importantes (1 litro
aproximadamente) a causa del volumen de las sondas introducidas en
el interior de los cultivos, lo que limita su utilización en el
seno de fermentadores. Además, los cultivos en fermentadores son
generalmente aireados y agitados, lo que provoca numerosas burbujas
que perturban en gran manera las mediciones de turbidez. Estos
dispositivos están también penalizados por su coste elevado.
La solicitud internacional de patente
WO-92/13.482 divulga un aparato y un procedimiento
de medición de un parámetro sanguíneo. El aparato comprende una
fuente de luz roja y una fuente de luz infrarroja que dirige la
luz hacia una muestra sanguínea y un detector que recibe la luz que
proviene de las dos fuentes y reflejada por la sangre. Se utiliza un
bucle de retroacción óptica para cada una de las dos fuentes de
manera que la intensidad de la luz recibida por el detector sea
aproximadamente constante para una zona de valor del parámetro
sanguíneo, lo que permite un mando preciso de las fuentes de luz.
Unas curvas de referencia permiten deducir dos parámetros sanguíneos
de las señales de retroacción obtenidas respectivamente para cada
una de las dos fuentes.
Un inconveniente de esta técnica es que está
limitada en particular por las capacidades de emisión de las fuentes
de luz y sólo permite así cubrir una gama restringida de medición
con una sensibilidad suficiente. Además, la obtención de cada
resultado requiere un plazo de estabilización que penaliza la
rapidez de las mediciones.
Un análisis en serie de un gran número de
muestras o unas mediciones sobre unos medios heterogéneos y/o
perturbados por una circulación de burbujas de gas resulta así muy
difícil, incluso excluida. Por otra parte, se corre el riesgo de
generar imprecisiones cuando tiene lugar la explotación de las
señales de retroacción, en razón de la deriva de valores
capacitivos.
La patente US-4 447 150 se
refiere a un dispositivo y a un procedimiento de medición de
propiedades y de parámetros sanguíneos, utilizados para medir el
nivel de saturación de oxígeno sanguíneo. El aparato divulgado
comprende dos fuentes de luz que emiten respectivamente a dos
longitudes de onda distintas y un detector que mide la luz que
proviene de las fuentes y reflejada por la sangre. La luz reflejada
o transmitida por la sangre es mantenida a un nivel constante por
medio de un bucle de retroacción óptica. Además, la relación de dos
tensiones que corresponden respectivamente a unas luces medidas que
provienen de las dos fuentes da el porcentaje de saturación del
oxígeno sanguíneo.
Esta técnica presenta también el inconveniente de
no permitir una amplia gama de mediciones, así como los otros
inconvenientes mencionados por el documento
WO-92/13.482.
La presente invención prevé un aparato y un
procedimiento de medición que no tiene los inconvenientes
anteriores, permitiendo así en particular efectuar unas mediciones
en diferentes gamas de valores manteniendo al mismo tiempo una buena
sensibilidad.
El aparato y el procedimiento de la invención
pueden también ofrecer una gran rapidez de medición y una buena
precisión.
En particular, la invención tiene por objeto un
aparato de medición de turbidez capaz de medir, con precisión, la
turbidez de cultivos microbianos en una amplia gama de valores,
fiable, fácil de utilización, fácilmente adaptable a
microfermentadores y que puede ser poco voluminoso y económico.
La invención tiene también por objeto un aparato
de medición de absorbencia y un aparato de medición de
fluorescencia, capaces de medir con las mismas ventajas citadas la
absorbencia molecular y/o la fluorescencia de un medio, y más
generalmente, la invención prevé un aparato de medición de una o
varias propiedades ópticas de un medio, líquido o sólido.
La invención se refiere a un aparato de medición
de este tipo ventajosamente automatizado, y que permite así
realizar unas experiencias de largas duraciones sin intervención de
un experimentador.
La invención tiene también por objeto un aparato
de medición de este tipo adaptable a unos microfermentadores en
batería, lo que hace posible efectuar mediciones simultáneas para
los diferentes microfermentadores.
La invención se refiere también a un
microfermentador provisto de un aparato de medición que tiene las
cualidades anteriores.
La invención tiene en particular por objeto un
microfermentador que tiene unos sistemas de alimentación de medio de
cultivo y de gas que son simples y fiables, protegido de cualquier
contaminación exterior y capaz de recibir unos cultivos de pequeños
volúmenes. Así mismo, el sistema protege el exterior de
contaminaciones por el cultivo mismo.
La invención se refiere también a un
microfermentador con extracciones automatizadas para ciertas fases
de turbidez, de absorbencia, y/o de fluorescencia, predeterminadas
y un microfermentador con dilución automática para cultivos
cíclicos.
La invención tiene también por objeto un
procedimiento de medición de propiedades ópticas que pueden incluir
en particular la turbidez, la absorbencia y la fluorescencia, que
hace posible unas mediciones en una amplia gama de valores con una
gran precisión, una buena fiabilidad y una buena
reproductibilidad.
La invención se aplica a los campos de la
microbiología y de la biotecnología, y más generalmente a cualquier
medición de compuestos turbios, por ejemplo para el análisis y el
tratamiento de aguas, de efluentes agrícolas o industriales o de
contaminantes (medición de turbidez).
La misma se aplica también a unas mediciones
in vivo o in vitro de fluorescencia, y más
precisamente a las mediciones de concentración de compuestos
fluorescentes intra o extracelulares.
A este fin, la invención tiene por objeto un
aparato de medición de por lo menos una propiedad óptica de un
medio, que comprende:
- -
- una fuente de luz destinada a emitir un haz luminoso de intensidad variable hacia y en el medio,
- -
- unos medios de detección destinados a medir la intensidad del haz reflejado por el medio líquido,
- -
- unos medios de mando de la intensidad del haz emitido por la fuente,
- -
- unos medios de almacenado destinados a almacenar un valor representativo de una intensidad nominal del haz reflejado,
- -
- un sistema de retroacción conectado a los medios de mando, a los medios de detección y a los medios de almacenado, que actúa sobre los medios de mando de manera que la intensidad medida del haz reflejado sea igual a la intensidad nominal, y
- -
- unos medios de lectura de la intensidad del haz emitido, para la intensidad nominal del haz reflejado, siendo estas intensidades del haz emitido y nominal del haz reflejado representativas de la o de las propiedad(es) ópti- ca(s) del medio.
Según la invención, el aparato de medición
comprende unos medios de ajuste de la intensidad nominal, conectados
a los medios de lectura y a los medios de almacenado, destinados a
ajustar la intensidad nominal de manera que la intensidad
estabilizada del haz emitido esté incluida en una gama
predeterminada.
La intensidad nominal del haz reflejado es
ajustable. De esta manera, es posible adaptar el aparato de medición
a una gama dada de valores de turbidez, de absorbencia y de
fluorescencia. La elección de la intensidad nominal resulta de un
compromiso. La misma debe ser lo más elevada posible, de manera que
la intensidad del haz emitido varíe en gran manera con la turbidez,
la absorbencia y/o la fluorescencia, lo que da al aparato una
precisión de medición muy buena. En contrapartida, la intensidad
nominal debe ser suficientemente baja para poder cubrir toda la gama
deseada sin que la intensidad del haz emitido sobrepase un umbral de
emisión máximo de la fuente, provocando su saturación y/o su
deterioro.
Este aparato puede así permitir unas mediciones
en diferentes gamas de valores, de los más bajos a los más elevados,
conservando al mismo tiempo una sensibilidad óptima. En el estado de
la técnica, por el contrario, la zona de medición está fijada y está
asociada a la tensión de referencia utilizada.
En particular, el aparato hace posibles unas
mediciones de turbidez en una amplia gama de densidades ópticas con
una buena precisión. Se obtiene así sin dificultad una gama que se
extiende de 45 a más de 17.000 NTU, lo que corresponde para una
suspensión de levadura Saccharomyces cerivisiae,
respectivamente a 0,2 y más de 75 unidades de densidad óptica (DO) a
600 nm con un error del 2% aproximadamente. Este aparato ofrece
también una buena fiabilidad y una buena reproductibilidad de las
mediciones, que corresponden a una baja dispersión de los valores.
Para diferentes organismos, pueden realizarse fácilmente unas curvas
de correspondencia entre turbideces y concentraciones de
células.
Además, el aparato de medición según la invención
puede ser fabricado con bajo coste de realización, puesto que puede
descansar sobre el empleo de componentes electrónicos poco
numerosos y económicos.
Los medios de almacenado están ventajosamente
destinados a almacenar una intensidad de saturación y los medios de
ajuste regulan la intensidad nominal a un valor menor cuando la
intensidad estabilizada del haz emitido es superior a la intensidad
de saturación.
Los valores que pueden ser tomados por la
intensidad nominal son ventajosamente predeterminados.
El ajuste de intensidad nominal es así
automatizado, lo que permite en particular seguir la turbidez de un
medio evolutivo, en una amplia gama de turbidez y con una precisión
muy buena. Es particularmente interesante utilizar un diodo
luminescente, que emita preferentemente en el infrarrojo alrededor
de 880 nm, para este ajuste automatizado. En efecto, la tensión
aplicada a los bornes del diodo de dicho emisor cuando tiene lugar
la emisión del haz luminoso evoluciona proporcionalmente con la
turbidez, y se obtiene una excelente precisión de medición.
El medio medido puede ser líquido o sólido
(geles, preparaciones para microscopía).
La o las propiedad(es) óptica(s)
medida(s) son ventajosamente elegidas entre la turbidez T, la
absorbencia A o la fluorescencia F del medio, para un par dado de
los espectros de emisión y de recepción. En diversos modos de
realización, la luz es emitida y recibida según respectivamente las
modalidades siguientes:
- -
- fuente de luz monocromática, o de banda más ancha, detección a una longitud de onda correspondiente (monocromática o de banda más ancha),
- -
- fuente de luz monocromática, o de banda más ancha, detección a otra longitud de onda (caso de fluorescencia),
- -
- fuente de luz policromática, o de bandas más anchas; detección a varias longitudes de onda correspondientes,
- -
- fuente de luz blanca, detección a una o varias longitudes de onda seleccionadas por unos filtros.
La detección de la intensidad del haz recibido en
varias longitudes de onda permite obtener unas informaciones
complementarias sobre el medio.
La fuente de luz está constituida por un emisor
tal como por ejemplo diodo, láser, acoplados o no a una fibra
óptica, destinada a emitir una luz monocromática o de bandas
espectrales, eventualmente de anchuras variables, o blanca. La
emisión puede realizarse en los campos del UV, del visible, del
infrarrojo próximo o lejano.
Los medios de detección consisten ventajosamente
en uno o varios fotodetector(es), tales como por ejemplo
\hbox{diodo(s)} (phototransistor, photodarlington)
o célula(s) fotoeléctrica(s), que tienen cada uno una
recepción monocromática o con una banda pasante más ancha, en los
campos del UV, del visible, del infrarrojo próximo o lejano. En los
casos de mediciones en el infrarrojo, los medios de detección son
ventajosamente insensibles a la luz visible, por comodidad.
Por "haz reflejado por el medio", se
entiende un haz transmitido sin interacción, difundido, o emitido
(en los casos de fluorescencia, por ejemplo).
Los medios de detección están colocados con uno o
varios ángulo(s) apropiado(s) con respecto a la
dirección del haz emitido, preferentemente a aproximadamente 180º
(necesariamente a aproximadamente 180º en transmisión).
Preferentemente, el haz incidente sobre el medio
es paralelo. Se obtiene así una relación muy buena luz
reflejada/luz emitida.
Cada longitud de onda de medición se elige
preferentemente para dar unas informaciones sobre un tipo distinto
de partículas.
Así, para las mediciones de turbidez, dos
longitudes de onda distintas permiten obtener unos resultados sobre
unas partículas de dos tamaños diferentes, que coexisten en
suspensión. Puede tratarse por ejemplo de células infectadas por
unas partículas fágicas y de fagos liberados por las células
lisadas. En efecto, para un tipo de partículas dado, la cantidad de
luz difundida o transmitida depende de la longitud de onda
detectada. Además, cuanto más elevada es la longitud de onda, mayor
es la relación luz transmitida/luz emitida.
Una forma de realización para medir a las dos
longitudes de onda consiste en emitir con la ayuda de dos emisores
de longitudes de onda diferentes una de la otra, por ejemplo
infrarrojo y visible. Otra forma de realización consiste en emitir
luz blanca y en disponer unos filtros sobre un detector de manera
que seleccione las dos longitudes de onda.
Para unas mediciones de absorbencia, dos
longitudes de onda distintas en recepción permiten cuantificar dos
tipos de moléculas que absorben a unas longitudes de onda
distintas, o correlacionar unas observaciones sobre un tipo de
partículas.
De manera general, unas mediciones en varias
longitudes de ondas pueden permitir determinar la proporción y la
naturaleza de las partículas, de las células o de las moléculas de
los medios analizados, y discriminar el tamaño, la forma, la
concentración, la naturaleza y/o la proporción de diferentes
especies celulares, particulares y/o moleculares. Siendo el número
de longitudes de onda igual a n, el tratamiento matemático puede ser
realizado gracias a un sistema con n ecuaciones y con n
incógnitas.
Ventajosamente, la intensidad nominal (intensidad
fijada del haz reflejado) se elige en función de la gama de
concentración de las partículas a medir en el medio, disminuyendo
la intensidad nominal cuando la gama de concentración a medir
aumenta.
El aparato de medición según la invención no mide
simplemente la luz reflejada por un medio líquido para determinar
la turbidez, la absorbencia o la fluorescencia, sino la energía
proporcionada por la fuente que permite obtener una cantidad fijada
de luz reflejada. Esta energía, o intensidad del haz emitido, da la
turbidez, la absorbencia o la fluorescencia del medio líquido o
sólido, para cada longitud de onda de medición, por medio de una
relación matemática simple establecida gracias a unas curvas de
calibrado. Así, cuando la fuente de luz emite una luz infrarroja
alrededor de 880 nm, la cantidad de energía transmitida por el medio
es inversamente proporcional a la turbidez del medio atravesado y el
sistema de retroacción electrónica ajusta automáticamente el haz
emitido para que la luz reflejada sea igual a un valor fijado.
En el caso de medición de fluorescencia, la
cantidad de luz reflejada es proporcional a la intensidad del haz
emitido y a la concentración de la sustancia fluorescente. Además,
la misma está afectada por fenómenos de filtro interno.
El aparato de medición permite también prescindir
de todas las extracciones distintas de las que sean necesarias para
análisis de muestras, lo que facilita las manipulaciones, suprime
riesgos de error en el curso de diluciones subsiguientes a unas
extracciones y reduce los riesgos de contaminación de un cultivo o
del entorno (por ejemplo en el caso de cultivos de patógenos).
Ventajosamente, el aparato de medición puede ser
completamente exterior al medio líquido. Así, en el caso en que este
medio comprende un cultivo, el aparato no tiene que ser esterilizado
y no corre el riesgo de deteriorarse por ensuciado o recubrimiento
por unas biopelículas.
Preferentemente, el aparato de medición está
automatizado, en particular por un registro automático de los datos
y por un ajuste automático de la intensidad nominal del haz
reflejado. Así, es posible realizar unas experiencias de larga
duración sin intervención de un experimentador, en particular para
el seguimiento de cultivos de día como de noche sin la menor
vigilancia humana.
Otra ventaja del aparato de medición es su
capacidad de adaptación a una gran variedad de medios líquidos, y
en particular a unos cultivos continuos de todos los tipos, tales
como por ejemplo quimiostato, turbitostato o cultivos cíclicos.
Preferentemente, la fuente de luz y/o los medios
de detección están destinados a medir la intensidad del haz
reflejado alrededor de por lo menos una longitud de onda,
correspondiendo la o las propiedad(es) óptica(s) del
medio cada una a la, o a una de las, longitud(es) de
onda.
En un primer modo preferido de realización, la, o
las, propiedad(es) óptica(s) del medio comprenden la
turbidez del medio.
Los medios de detección están entonces dispuestos
preferentemente en la dirección del haz emitido, en transmisión,
siendo la relación intensidad recibida/intensidad emitida óptima. En
una variante de realización, algunos por lo menos de los medios de
detección están dispuestos al bies con respecto a la dirección del
haz emitido, de manera que detecten la luz difundida.
En el primer modo de realización, la fuente de
luz y/o los medios de detección están preferentemente destinados a
unas mediciones en infrarrojo, ventajosamente alrededor de 880
nm.
Es por ejemplo interesante que la fuente de luz
sea un diodo luminiscente o LED, que emite en infrarrojo.
La emisión en luz infrarroja con unas longitudes
de onda que varían de 840 nm a 920 nm con un pico de 880 nm
simplifica la utilización del aparato de medición y da una buena
precisión. En efecto, la difusión de la luz que depende de la
longitud de onda, la utilización de luz blanca, por ejemplo, corre
el riesgo de ser más difícil de utilizar y de dar unos resultados
menos precisos que una luz casi monocromática en infrarrojo. Además,
las radiaciones infrarrojas atraviesan mejor el material, lo que es
favorable para la medición de grandes turbideces. Una emisión a
otras longitudes de onda o en luz blanca es sin embargo también
posible.
En un segundo modo preferido de realización, la o
las propiedad(es) óptica(s) del medio comprenden la
absorbencia del medio, aplicándose la invención entonces a la
colorimetría y a la espectrofotometría sobre medio líquido o
sólido.
En un tercer modo preferido de realización, la, o
las, propiedad(es) óptica(s) del medio comprenden la
fluorescencia del medio.
Así, la GFP (Green Fluorescence Protein) presenta
naturalmente en la medusa Aequora victoria emitida por
fluorescencia, cuando es excitada por unas luces UV o azul (2 picos
de excitación a 395 y 475 nm), una luz verde, a diferentes
longitudes de onda (509 y 540 nm), lo que permite distinguirla de la
luz incidente o difundida. La emisión no necesita la presencia de
ningún substrato o cofactor. Existen unas versiones modificadas del
gen que codifica para esta proteína, lo que tiene por efecto mejorar
su rendimiento cuántico y modificar su espectro de emisión (HELM,
R., Nature, vol. 373, pp. 663-664, 1995).
Así mismo, es posible cuantificar unos compuestos
intracelulares o extracelulares que emiten por fluorescencia.
Por ejemplo:
| Fluoróforo | Longitud de onda de excitación | Longitud de onda de fluorescencia (emisión) |
| NADH, NADPH | 350 | 450 |
| FAD | 450 | 520 |
| Aminoácidos aromáticos | 275 | 310 |
| Triptofano | 289 | 330-360 |
| Nucleótidos | 280 | 375 |
| Riboflavinas | 445 | 520 |
| Piridoxina | 313 | 385-415 |
| Antibióticos | Variable | Variable |
| F(420) | 425 | 472 |
Así, el NADH, coenzima de óxidorreducción, emite
una fluorescencia a 450 nm cuando es excitado por una luz de
longitud de onda de 350 nm (el NAD forma oxidada no produce
fluorescencia). En el curso del crecimiento celular, la cantidad de
NADH varía con la concentración celular (Li. J., Biotechnology and
Bioengineering, vol.37, pp. 1043-1049, 1991).
Es lo mismo para diferentes colorantes o
cromóforos (denominados también fluorocromos o fluoroforos)
fluorescentes (fluoresceína, anticuerpos fluorescentes, pigmentos,
quinina ...).
La introducción en diferentes células
(procariotas o eucariotas) de los genes que codifican para la GFP y
su expresión en diferentes condiciones permite la monitorización en
continuo de la fluorescencia. El aparato de medición según la
invención permite también estudiar unos efectos de filtro interno de
medios fluorescentes.
Este tercer modo de realización tiene
aplicaciones en numerosos campos, como la cuantificación de
sustancias fluorescentes en unos geles, unos "blots", unas
microplacas. Además, son posibles los estudios in vivo, como
la medición de expresión de genes por el seguimiento de la
fluorescencia de las proteínas "pintadas" para las cuales
codifican, permitiendo a la vez la cuantificación y la localización
celular de estas últimas. Realizadas estas mediciones en
fermentadores permiten además realizar unos análisis en función del
tiempo, del estado fisiológico de las células y de las condiciones
del entorno del cultivo.
De manera preferida, el aparato de medición
comprende una unidad de tratamiento conectada a los medios de
lectura y que comprende los medios de almacenado, estando los medios
de almacenado destinados a almacenar por lo menos una ecuación
determinada para una curva de calibrado que da la o las
propiedad(es) óptica(s) del medio en función de la
intensidad del haz emitido para respectivamente por lo menos un
valor de la intensidad nominal del haz reflejado. La unidad de
tratamiento extrae entonces la o las propiedad(es)
óptica(s) del medio a partir de la intensidad estabilizada
del haz emitido para uno de los valores de la intensidad nominal,
por un parte, y de la ecuación que corresponde a este valor de la
intensidad nominal, por la otra.
De esta manera, la determinación de la turbidez,
de la absorbencia y/o de la fluorescencia del medio a partir de las
mediciones es automatizada, y puede ser efectuada en tiempo
real.
Es entonces ventajoso que la unidad de
tratamiento comprenda una unidad central y por lo menos una tarjeta
de conversión analógica/numérica y numérica/analógica, que acopla la
unidad central a los medios de mando y a los medios de
regulación.
Dichas tarjetas permiten prescindir de etapas
convertidoras corriente/tensión y tensión/corriente.
Además, la unidad de tratamiento extrae
preferentemente la propiedad óptica del medio directamente a partir
de un valor proporcional a la intensidad del haz emitido.
Esta realización contrasta con las técnicas
conocidas, en las cuales las propiedades ópticas se obtienen a
partir de señales de retroacción, que deben pasar por un sistema de
integración para ser explotables. La misma evita así la introducción
de imprecisión en los resultados.
Ventajosamente, el aparato de medición comprende
un reloj, unos medios de registro en los medios de almacenado de
valores representativos de la, o de las, propiedad(es)
óptica(s) del medio, así como unos medios de activación
repetida del sistema de retroacción y unos medios de registro.
El registro de los resultados está así
automatizado, siendo las mediciones ventajosamente efectuadas a
intervalos regulares a fin de poder seguir la evolución de la
propiedad óptica en el curso del tiempo. En una primera forma de
realización, los valores registrados son los directamente obtenidos
por la lectura de la intensidad del haz emitido, siendo estos
resultados tratados ulteriormente. En una segunda forma de
realización, el aparato de medición determina las propiedades
ópticas después de cada medición, y son éstas las que son
registradas en los medios de almacenado.
Preferentemente, el sistema de regulación por
retroacción y los medios de mando son tales que la igualación de la
intensidad medida y de la intensidad nominal del haz reflejado se
obtiene de forma continua.
Así, el tiempo de respuesta es despreciable y
limitado únicamente por los tiempos de respuesta intrínsecos de los
componentes electrónicos, del orden del nanosegundo. Esta
realización contrasta con las técnicas conocidas, en las cuales el
ajuste se realiza por ensayos sucesivos y ritmados por unos
impulsos periódicos. El aparato de medición puede de esta forma
proporcionar una rapidez de medición muy grande, lo que permite por
ejemplo analizar en serie un número muy grande de muestras y
realizar unas mediciones sobre unos medios heterogéneos y/o
perturbados por una circulación de burbujas de gas. En estos últimos
casos, el aparato de medición está provisto de medios para efectuar
unas mediciones en ráfagas, y para realizar un análisis estadístico
de los valores recogidos en el curso de cada una de estas ráfagas, a
fin de extraer del mismo unos valores significativos.
La invención tiene también por objeto un
microfermentador, provisto de un aparato de medición según la
invención.
El hecho de que el aparato de medición pueda ser
completamente exterior al microfermentador, que no necesite
extracciones y diluciones correspondientes, y que haga posible la
automatización de las mediciones, permite realizar un
microfermentador que dispone de recursos considerables. En
particular, un pequeño volumen de cultivo es suficiente para las
mediciones, lo que mejora la facilidad de utilización. Se aprovecha
en particular de un bajo volumen y de una pequeña frecuencia de
cambios de los depósitos de alimentación que contienen los medios de
cultivo. Además, el microfermentador y sus sistemas de alimentación
y de eliminación de efluentes pueden estar completamente aislados
del medio exterior. Su puesta en sobrepresión asegura simplicidad y
fiabilidad, puesto que la utilización de tubos de pérdida de carga
conocida permite obtener unos caudales precisos y evitar bombas
costosas y voluminosas. El mismo ofrece una garantía de esterilidad
impidiendo cualquier contaminación del depósito de alimentación por
el cultivo y del cultivo por el exterior y permite el cultivo por
ejemplo de cepas patógenas con toda seguridad.
Por otra parte, la automatización de las
mediciones hace posible la automatización de extracciones para unas
densidades ópticas que correspondan a unos estados fisiológicos
precisos, tales como por ejemplo, porcentaje de crecimiento máximo,
final de crecimiento o final de fase estacionaria. La misma permite
también efectuar diluciones automáticas para cultivos cíclicos.
Otra ventaja es que varios microfermentadores
pueden estar asociados en batería, independientemente o en cascada,
conteniendo cada uno un cultivo en unas condiciones bien definidas
y reproducibles. Los aparatos de medición asociados a los
diferentes microfermentadores están entonces ventajosamente
conectados a un sistema central destinado a mandar unas mediciones
en paralelo.
En un modo de realización preferido, el
microfermentador comprende:
- -
- un tubo cerrado por un tapón, destinado a contener un cultivo,
- -
- una primera conducción, destinada a inyectar aire estéril y medio de cultivo en el cultivo, y
- -
- un segundo conducto, destinado a recuperar unos efluentes, estando el tubo y todas las conducciones a presión.
En una realización ventajosa para cultivos
cíclicos, el microfermentador comprende un sistema de dilución
destinado a diluir un cultivo. El aparato de medición comprende
entonces un reloj y una unidad de tratamiento conectada al sistema
de dilución, disparando la unidad de tratamiento cíclicamente el
sistema de dilución.
Este dispositivo es muy ventajoso para hacer
evolucionar unas cepas o para realizar unos estudios fisiológicos
sobre unos parámetros de crecimiento tales como, por ejemplo,
porcentaje y rendimiento de crecimiento o medición del tiempo de
latencia antes del reemprendido del crecimiento.
Preferentemente, la unidad de tratamiento activa
de forma repetida el sistema de retroacción, registra en los medios
de almacenado unos valores representativos de la, o de las,
propiedad(es) óptica(s) del medio, y dispara el
sistema de dilución cuando constata en una pluralidad de los últimos
valores registrados un estancamiento de la, o de las,
propiedad(es) óptica(s) del medio.
En unas variantes de realización, la unidad de
tratamiento dispara otras acciones sobre el medio, tales como por
ejemplo la aportación de diversas soluciones o de gas, cuando
constata el estancamiento.
En otro modo de realización, la unidad de
tratamiento dispara el sistema de dilución periódicamente, después
de una duración de cultivo predeterminada.
La invención se refiere también a cualquier
sistema provisto de un aparato de medición según la invención, tal
como por ejemplo un fermentador (adaptación por excrecencia o en el
interior), un aparato autónomo o un lector de microplacas.
Son utilizables por otra parte diferentes tipos
de cultivos: cultivos discontinuos (batch) eventualmente con adición
continua o secuencial de uno o varios substratos (fed batch);
cultivos cíclicos; turbidostato, que permite un mantenimiento de la
turbidez de un cultivo con un valor constante por adición del medio
de cultivo a volumen constante en un biorreactor, de manera que la
turbidez oscila alrededor de un punto de consigna; o quimiostato,
que permite una adición de medio de cultivo a volumen constante en
un biorreactor, de forma continua y a un caudal inferior al
porcentaje de crecimiento máximo del microorganismo.
Pueden ser utilizados diversos medios de
introducción de fluidos, tales como por ejemplo bombas,
electroválvulas "todo o nada" o proporcionales, caudalímetros,
varios depósitos de alimentación para diferentes substratos o
compuestos, añadidos en función del tiempo o de la densidad óptica
y/o varios gases.
De manera preferida, las conducciones están
conectadas por medio de conectores que comprenden cada uno una parte
macho conectada a una primera de las conducciones, una parte hembra
conectada a una segunda de las conducciones, y unos medio de
conexión de la parte macho a la parte hembra, comprendiendo cada una
de estas partes macho y hembra:
- \bullet
- un extremo alargado y hueco conectado a la conducción correspondiente a esta parte y que comunica con esta conducción, y
- \bullet
- un manguito alargado, que rodea este extremo y conectado a esta conducción.
El extremo de la parte macho está introducido en
el extremo de la parte hembra, el manguito de una de las partes es
introducido en el manguito de la otra parte y los manguitos son
fijados uno a otro por los medios de conexión.
Así, los manguitos pueden asegurar la protección
de los extremos, en los cuales circula un fluido.
Preferentemente, los conectores están provistos
de tapones que aseguran un cierre estanco y están esterilizados al
vapor, por autoclave por ejemplo. En el curso de la conexión, los
tapones son extraídos y los extremos de los manguitos son sometidos
a un breve contacto con una llama, a fin de conservar su esterilidad
y la del aire que está en la proximidad inmediata. Este sistema
permite mantener frías las zonas internas de las partes macho y
hembra y permite así una conexión inmediata sin deterioro de juntas,
manteniendo al mismo tiempo una perfecta esterilidad.
La estanqueidad de la conexión entre los dos
extremos se obtiene ventajosamente por medio de juntas
respectivamente solidarias de las partes macho y hembra y contra
las cuales pasan respectivamente a topar los extremos de las partes
hembra y macho.
Preferentemente, el manguito de la parte macho es
introducido en el manguito de la parte hembra. La protección
asegurada por los manguitos es así aún más segura.
Además, es interesante que los medios de conexión
comprendan un anillo de apriete unido a la conducción
correspondiente al manguito receptor y un sistema de fijación
(fileteado, por ejemplo) previsto en el manguito introducido en el
manguito receptor y que coopera con este anillo.
El anillo de apriete está ventajosamente
mecanizado para contener un tope que limita el apriete. Esta
realización evita una compresión excesiva de las juntas y por tanto
su deterioro.
En otra forma de realización, se añaden unas
juntas tóricas a las zonas internas de las partes macho y hembra.
Permiten reforzar la seguridad y la estanqueidad.
La invención tiene también por objeto un
procedimiento de medición de por lo menos una propiedad óptica de
un medio, en el cual:
- -
- se emite un haz luminoso de intensidad variable hacia o en el medio, y
- -
- se mide la intensidad del haz reflejado por el medio,
- -
- se ajusta la intensidad del haz emitido de manera que la intensidad del haz reflejado sea igual a una intensidad nominal fijada,
- -
- se lee la intensidad estabilizada del haz emitido así obtenida, y
- -
- se aplica un valor
representativo de la intensidad estabilizada a una ecuación
determinada por una curva que da la, o las, propiedad(es)
óptica(s) en función del valor representativo de la
intensidad estabilizada del haz emitido para la intensidad nominal
del haz reflejado, de manera que se extraiga la, o las,
propiedad(es)
\hbox{óptica(s)}del medio.
Según la invención, se ajusta la intensidad
nominal de manera que la intensidad estabilizada del haz emitido
esté incluida en una zona predeterminada.
Otras ventajas y objetos de la invención
aparecerán con la lectura de ejemplos dados a continuación con un
fin ilustrativo y no limitativo, con referencia a las figuras
anexas, en las cuales:
La Figura 1 es un esquema de principio de un
aparato de medición según la invención.
La Figura 2 representa un microfermentador
equipado con un aparato de medición según la invención.
La Figura 3 esquematiza una estación automática
que comprende ocho microfermentadores según la invención.
La Figura 4 representa una sección longitudinal
de la parte macho de un conector, con tapón, utilizado para los
microfermentadores de las figuras 2 y 3.
La Figura 5 es una sección transversal
V-V de la parte macho de la Figura 4.
La Figura 6 representa una sección longitudinal
de la parte hembra del conector correspondiente a la parte macho de
la Figura 4, con tapón.
La Figura 7 es una sección transversal
VII-VII de la parte hembra de la Figura 6.
La Figura 8 muestra el conector ensamblado a
partir de las partes macho y hembra de las Figuras 4 a 7.
La Figura 9 representa un esquema de realización
electrónica de un aparato de medición según la invención, aplicable
al microfermentador de la Figura 2 y a la estación automática de la
Figura 3.
La Figura 10 ilustra un segundo modo de relación
electrónica en lugar del de la Figura 9.
La Figura 11 ilustra un tercer modo de
realización electrónica en lugar de los de las Figuras 9 y 10.
La Figura 12 representa un conjunto de curvas de
calibrado preparadas con un cultivo de levadura Saccharomyces
cerevisiae, que da la tensión representativa de la intensidad
del haz emitido en función de la turbidez para un conjunto de
tensiones representativas de la intensidad nominal del haz
transmitido.
La Figura 13 muestra unas curvas de crecimiento,
que dan la evolución de la turbidez, en función del tiempo expresado
en horas, de tres cepas de Saccharomyces cerevisiae,
respectivamente de los tipos FY23, FY73 y FY1679, cultivadas en
medio complejo YPD (extracto de levadura, peptona, glucosa) a 30ºC,
obtenidos con un aparato de medición según la invención.
La Figura 14 muestra en paralelo las curvas de
crecimiento (Logaritmo neperiano de la turbidez en función del
tiempo en horas) de la cepa del tipo FY23 y del mutante del tipo
FYBL2-5D/Dn049, cultivados en medio complejo YPD a
30ºC, obtenidos con un aparato de medición según la invención.
La Figura 15 muestra la curva de crecimiento en
cultivo cíclico automatizado de la cepa del tipo FY1679 cultivada
en medio complejo YPD a 30ºC, obtenida con un aparato de medición
según la invención.
La enseñanza técnica de estas figuras, en
particular las Figuras 4 a 11 es considerada como que forma parte
integrante de la descripción que sigue.
En las Figuras 9 a 11, unos elementos idénticos
están identificados por las mismas referencias.
Un aparato de medición de la turbidez T (Figura
1) de un medio líquido 1, contenido en un recipiente transparente
2, comprende un emisor 3 que emite un haz luminoso 11 hacia el
medio 1. Preferentemente, el emisor es casi monocromático y emite
en infrarrojo, por ejemplo alrededor de 880 nm.
El haz 11 resulta, después de atravesado del
medio 1, un haz transmitido 12 cuya intensidad es medida por un
fotoreceptor 4. El fotoreceptor 4 es por ejemplo del tipo
fotodarlington. De manera preferida, el emisor 3, el recipiente 2 y
el fotoreceptor 4 están alineados. En unas variantes de
realización, el fotoreceptor 4 no está alineado con el emisor 3 y el
recipiente 2, de tal manera que detecta un haz difundido o
reflejado. El modo de realización preferido corresponde sin embargo
a una precisión óptima.
El emisor 3 está conectado a un bloque de mando
6, capaz de leer y de modificar una tensión U1, directamente
proporcional a la corriente I1 que atraviesa el emisor 3 y en
consecuencia la intensidad del haz emitido 11. El fotoreceptor 4
está conectado a una unidad de regulación 7 destinada a imponer y a
leer unos valores representativos del haz transmitido 12.
Preferentemente, los valores representativos del haz emitido 11 y
del haz transmitido 12 son linealmente proporcionales a las
corrientes I1 e I2 que atraviesan respectivamente el emisor 3 y el
fotoreceptor 4.
La unidad de regulación 7, conectada al
fotoreceptor 4 y a la unidad de tratamiento 5, está destinada a
comparar una tensión U2, directamente proporcional a la corriente I2
que atraviesa el fotoreceptor 4, con un valor de consigna V2. Este
último valor, proporcionado por la unidad de tratamiento 5, es
representativo de una intensidad nominal del haz transmitido 12 para
una gama de medición dada.
La unidad de tratamiento 5, además de los medios
de tratamiento de los datos, puede en particular comprender unos
medios que permitan imponer el valor de la tensión V2 a la unidad 7,
unos medios de lectura de los valores representativos U1 de la
intensidad del haz emitido 11, así como unos medios de almacenado
de los datos. La unidad de regulación 7 está también conectada al
bloque de mando 6 y actúa sobre éste en función de la diferencia
entre las tensiones U2 y V2. Este bucle de retroacción al cual
concurren las unidades 3, 4, 6 y 7, tiene así como función reducir
esta diferencia a cero. En equilibrio, la tensión U2 es igual al
valor de consigna V2 y la tensión U1 está estabilizada a un valor
V1.
Esta tensión V1 es representativa de la turbidez
T del medio 1. Esta tensión V1 es enviada a la unidad de tratamiento
5 que, para un valor de consigna V2 dado, extrae la turbidez T de la
tensión V1 gracias a una función matemática establecida a partir de
una curva de calibrado del aparato de medición que da la turbidez T
en función de la tensión V1 para el valor V2.
Un conjunto de curvas de calibrado
101-117 son así trazadas en la Figura 12 según un
primer eje 61 que da la turbidez T en unidades de DO y un segundo
eje 62 que da la tensión estabilizada V1 en Voltios. Estas curvas de
calibrado 101-117 corresponden respectivamente a
los valores de consigna V2 siguientes:
8 V, 7 V, 6 V, 5 V, 4 V, 3 V, 2 V, 1,5 V, 1 V,
0,75 V, 0,5 V, 0,4 V, 0,3 V, 0,2 V, 0,1 V, 0,05 V, 0,025 V.
La elección del valor de consigna V2 depende de
la gama de turbidez T que se desea cubrir. En efecto, cuanto más
elevado es el valor de consigna V2, más rápidamente crece la
tensión estabilizada V1 con la turbidez T. Dado que la tensión V1
está limitada superiormente, el valor V2, no puede por tanto ser
mantenido para un umbral superior correspondiente a esta gama de
turbidez. Para una gama dada, sin embargo, es ventajoso elegir el
valor de consigna V2 lo mayor posible, a fin de obtener la mayor
pendiente de variación de la tensión V1 en función de la turbidez T,
por tanto la mejor precisión de la medición.
Preferentemente, el aparato de medición ajusta
automáticamente el valor de consigna V2 en función de las
mediciones. Para ello, se procede ventajosamente de la manera
siguiente. La unidad de tratamiento 5 dispone de un umbral superior
de la tensión V1 y de una lista de valores V2 predeterminados y
ordenados de forma decreciente. Al principio de una serie de
mediciones, la unidad de tratamiento 5 transmite a la unidad de
regulación 7 el valor V2 más elevado de la lista, y después el bucle
de retroacción ajusta la tensión U1 a fin de que U2 sea igual a V2.
El valor V1 de la tensión U1 es entonces enviado a la unidad de
tratamiento 5, que verifica a cada medición que la tensión
estabilizada V1 permanezca inferior a la tensión de umbral
predeterminada. Si la tensión V1 sobrepasa este umbral, la unidad de
tratamiento 5 envía a la unidad de regulación 7 un valor de consigna
V2 más bajo y este nuevo valor de consigna es adoptado para las
mediciones siguientes. En el caso en que una relación matemática
liga el valor V1 al valor V2 para varias zonas de turbidez, es
también posible solicitar a la unidad de tratamiento 5 calcular a su
vez los valores de consigna V2 más apropiados para el cálculo de la
turbidez.
Preferentemente, el aparato de medición determina
automáticamente después de cada medición la turbidez T. Esta
determinación es entonces efectuada por la unidad de tratamiento 5
a partir de las curvas de calibrado 101-117.
El aparato de medición está ventajosamente
aplicado a un microfermentador 20, como se ha representado en la
Figura 2. En el ejemplo de realización representado, el recipiente 2
es un tubo de cristal, por ejemplo de sección cuadrada de 20 mm de
lado y de 160 mm de altura, lo que da un volumen de cultivo útil de
aproximadamente 55 a 60 ml. Más generalmente, el tubo de cristal 2
contiene un volumen útil ventajosamente comprendido entre 10 y 60
ml. El tubo 2 está alojado en un bloque 21 de aleación metálica, a
su vez colocado en un baño seco termostatado. El bloque puede estar
equipado a su vez con un sistema de calefacción autónomo. El tubo 2
está coronado por un tapón 22, a través del cual pasan varias
pequeñas conducciones de cristal o de material plástico. Una primera
de estas conducciones de cristal, referenciada 33, llega al fondo
del tubo 2, inyectando constantemente aire o gas estéril 14 en el
cultivo. La misma puede también, en ciertos momentos, inyectar medio
de cultivo nuevo 15. Esta conducción de cristal 33 está conectada,
exteriormente al tubo 2, a una conducción de alimentación 23 en la
cual convergen las conducciones de alimentación 24 y 25,
respectivamente de aire o gas estéril 14 y de medio de cultivo 15.
Las conducciones 24 y 25 están preferentemente equipadas con una
electroválvula. El microfermentador 20 comprende también una segunda
conducción de cristal 36 que desemboca a una altura media del tubo 2
y que permite realizar la inoculación y las extracciones. La
conducción de cristal 36 está conectada, exteriormente al tubo 2, a
una conducción de extracción 26 para toma de muestras 16.
El microfermentador 20 comprende también una
tercera conducción de cristal 37, dispuesta en la parte alta del
tubo 2, conectada a una bombona de efluentes por medio de una
conducción de eliminación 27, exterior al tubo 2, que permite
eliminar unos efluentes 17.
Las conducciones exteriores 23-27
son preferentemente flexibles.
El emisor 3 y el fotoreceptor 4 están insertados
en unas aberturas del bloque 21 de aleación metálica, a uno y otro
lado del tubo 2, y están conectados por medio respectivamente de
hilos eléctricos 31 y 32 al sistema de medición.
El conjunto del microfermentador 20, con sus
conducciones exteriores 23-27, así como el depósito
de alimentación que proporciona el medio de cultivo 15 al
microfermentador 20, están preferentemente a sobrepresión. Además,
el aire o el gas estéril 14 sólo circula en un sentido, lo que
impide cualquier contaminación. Las conducciones exteriores 24 y 25
son entonces ventajosamente unos tubos de pérdida de carga conocida,
que permiten obtener unos caudales precisos. El conjunto del montaje
es esterilizable por el calor y totalmente estanco.
En un primer modo de realización, el aparato de
medición de turbidez está aplicado a un microfermentador aislado.
En un segundo modo de realización, ilustrado en la Figura 3, un
conjunto de aparatos de medición de turbidez están aplicados a una
batería 40 de 8 microfermentadores. A título de ejemplo, la batería
40 comprende 8 microfermentadores 41-48 del tipo
del microfermentador 20 descrito más arriba. El conjunto de las
conducciones exteriores 24, 25 y 27 de los microfermentadores
41-48 están entonces respectivamente acopladas a
tres conducciones centrales 54, 55 y 57. Cada una de las
conducciones 25 está equipada con una electroválvula 35. Así mismo,
cada una de las conducciones 24 está equipada con una
electroválvula 34.
Las conducciones 27 pueden estar equipadas con
electroválvulas para permitir unas extracciones automáticas. La
conducción 57, sobre la cual convergen las conducciones 27,
desemboca en una bombona 52 de efluentes destinada a contener unos
desechos 53.
El depósito de alimentación del medio de cultivo
15, a presión, comprende un recipiente 51 cerrado por un tapón 59 y
alimentado con aire o gas estéril 18 por una conducción 58 que
atraviesa el tapón 59 y que desemboca en el fondo del recipiente 51.
La conducción 55 atraviesa el tapón 59 y llega al fondo del
recipientes 51. Este dispositivo permite ajustar la presión que
reina en el fondo del depósito de alimentación. Esta presión es
igual a la presión del gas de la conducción 58, cualquiera que sea
la altura del líquido (vaso de Mariotte).
Las conducciones 23-27, 33, 36,
37, 54, 55 y 57 están preferentemente conectadas por medio de
conectores 200, representados en la Figura 8 y detallados a
continuación.
El conector 200 comprende:
- \bullet
- una parte macho 201 (Figuras 4 y 5) conectada a un primer tubo 211 que constituye una de las conducciones y cerrado por un primer tapón 212, y
- \bullet
- una parte hembra 202 (Figuras 6 y 7) conectada a un segundo tubo 214 que constituye otra de las conducciones y cerrado por un segundo tapón 215.
La parte macho 201 comprende:
- \bullet
- un cuerpo 216 preferentemente de metal inoxidable, conectado al tubo 211 por una parte que puede ser ligeramente afilada 217,
- \bullet
- un reborde interno 218,
- \bullet
- un extremo 219 interno,
- \bullet
- un manguito 220,
- \bullet
- un sistema de apriete con paso de tornillo 221 en forma de anillo, y
- \bullet
- un junta 222 plana y redonda perforada en su centro.
El tapón 212 de la parte macho 201 tiene un fondo
provisto de una junta 223 plana y redonda, y un extremo 225 provisto
de un fileteado exterior que le permite roscarse con el sistema de
apriete 221.
La parte hembra 202 comprende:
- \bullet
- un cuerpo 230 preferentemente de metal inoxidable, conectado al tubo 214 por una parte que puede ser ligeramente afilada 231,
- \bullet
- un reborde interno 232,
- \bullet
- un extremo 233 interno,
- \bullet
- un manguito 234 que tiene un extremo 237 provisto de un fileteado exterior, y
- \bullet
- una junta 235 plana y redonda perforada en su centro.
El tapón 215 de la parte hembra 202 tiene un
fondo provisto de una junta plana 236 y un extremo 238 provisto de
un fileteado interior que le permite roscarse sobre el extremo 237
externo del manguito 234.
Antes de la conexión, las partes macho 201 y
hembra 202 conectadas respectivamente a los tubos 211 y 214 están
provistas sus tapones 212 y 215 respectivos, son esterilizadas, por
ejemplo con vapor.
La conexión se efectúa de la forma siguiente:
- \bullet
- se desenroscan los tapones 212 y 215 de las partes macho 201 y hembra 202 sin quitarlos;
- \bullet
- después, colocándolos encima de una llama, se orientan hacia abajo los extremos 219 y 233 de las partes macho 201 y hembra 202; esto tiene como consecuencia hacer caer los dos tapones 212 y 215;
- \bullet
- se pasa a continuación rápidamente los manguitos 220 y 234 por la llama;
- \bullet
- se introduce la parte macho 201 en la parte hembra 202 hasta que el extremo 219 esté en contacto con la junta 235 y que el extremo 233 esté en contacto con la junta 222; y
- \bullet
- se rosca el sistema de apriete 221 sobre el fileteado del extremo 238 del manguito 234.
Se obtiene así el conector 200, que ofrece una
conexión estanca y fiable, con protección por los manguitos 220 y
234 como se ha representado en la Figura 8.
Los emisores 3 fotoreceptores 4, unidad de mando
6, y de regulación 7 así como las electroválvulas 34 y 35, asociadas
respectivamente a los microfermentadores 41-48 están
conectados a una unidad de tratamiento 5 que contiene una unidad
central 8 compuesta por un microordenador acoplado a un sistema de
intercara analógico/numérico y numérico/analógico.
Un primer esquema de realización electrónica
particular de un aparato de medición de turbidez, representado en la
Figura 9, es aplicable a un microfermentador aislado o a un
microfermentador de una batería.
En el esquema electrónico, la masa está designada
por la referencia 80 y los amplificadores operativos tienen sus
bornes de entrada negativa y positiva y su borne de salida
respectivamente referenciados A, B y C.
La alimentación, simétrica, está preferentemente
estabilizada y regulada, a una tensión +V igual a + 12 Voltios y -V
igual a -12 Voltios.
Además, todas las resistencias fijas son a título
de ejemplo de capa metálica 1/4 w y los condensadores no están
polarizados. Se dan por otra parte los valores de las resistencias
ajustables y de los potenciómetros para 10 vueltas -1/2 W.
El emisor 3 comprende un diodo
electroluminiscente 73 o LED de infrarrojo y el fotoreceptor 4
comprende un fototransistor 74 del tipo Darlington. Este
fototransistor 74 está provisto de un condensador C1 de 0,1 \muF,
que sirve para evitar las oscilaciones.
El bloque de mando 6 comprende un amplificador
operativo 81, cuya entrada positiva B recibe una tensión mandada y
cuya entrada negativa A está conectada a la masa 80 por la
resistencia R1. La salida C del amplificador 81 manda, por medio de
un transistor 87 que desempeña la función de órgano tampón o buffer,
la intensidad de corriente I1 que atraviesa el diodo 73, y por
consiguiente la intensidad del haz 11 emitido. La ganancia del
amplificador 81 está fijada a 2 por unas resistencias R1 y R3 de 1
k\Omega cada una. El bloque de mando 6 comprende también una
resistencia R5 de 90,9 \Omega, en los bornes de la cual se mide la
tensión U1. Esta resistencia R5 cumple una función de conversión
corriente/tensión y limita la corriente máxima que atraviesa el
diodo 73 a 100 mA.
El bloque de mando 6 comprende también dos
resistencias R2 y R4 que valen respectivamente 1 k\Omega y 100
\Omega.
La unidad de regulación por retracción 7
comprende una resistencia R6 de 1 k\Omega, que transforma la
intensidad I2 que sale del fototransistor 74 en la tensión U2. La
unidad de regulación por retroacción 7 comprende también un
amplificador operativo 82, cuya entrada negativa A recibe esta
tensión U2, y cuya entrada positiva B recibe el valor de consigna V2
y cuya salida C está conectada a la entrada positiva B del
amplificador 81 del bloque de mando 6. La ganancia del amplificador
82 es muy grande debido a que no hay resistencia de contrarreacción,
de lo que resulta una gran sensibilidad a las variaciones de la
intensidad del haz transmitido 12, que produce una gran eficacia del
retocontrol. El amplificador 82 está provisto de un condensador C2
de 1 \muF, que sirve para evitar oscilaciones.
La unidad de regulación 7 comprende también una
resistencia R7, conectada a la entrada positiva B del amplificador
82, que vale 1 k\Omega.
En el ejemplo ilustrado, la unidad de tratamiento
5 está constituida, por una parte, por una etapa 72 convertidora
corriente/tensión que la conecta a la unidad 7 por una etapa 71
convertidora tensión/corriente que la conecta a la unidad 6 y por
otra parte, por una unidad central 8 constituida por un
microordenador provisto de una intercara de conversión
analógica/numérica, numérica/analógica que comunica por bucle de
corriente 4-20 mA. Este último tipo de comunicación
por bucle de corriente hace las etapas 71 y 72 necesarias. Un
sistema informático provisto de una tarjeta de conversión que
trabaja directamente en tensión permite prescindir de las etapas 71
y 72.
La etapa convertidora 71 descansa sobre la
utilización de un amplificador operativo 83, cuya entrada positiva B
recibe la tensión U1, y sobre el circuito convertidor 84
tensión/corriente, cuya entrada está conectada a la salida C del
amplificador 83. La etapa convertidora 71 comprende también unas
resistencias R8-R12 que valen respectivamente 2,43
k\Omega, 2,43 k\Omega, 1 k\Omega, 1 k\Omega y 2,25
k\Omega. El mismo comprende también un potenciómetro P1 de 200
\Omega, una resistencia ajustable P2 de 50 \Omega y un
condensador C3 de 1 \muF.
La etapa convertidora 72 descansa sobre la
utilización de dos amplificadores operativos 85 y 86. La entrada
positiva B del amplificador 85 recibe una tensión de la unidad
central 8, representativa del valor de consigna V2. La salida C del
amplificador 85 está conectada a la entrada positiva B del
amplificador 86 y la salida C del amplificador 86 está conectada a
la entrada positiva B del amplificador 82 de la unidad de regulación
por retroacción 7. Así, la unidad de tratamiento 5 envía el valor de
consigna V2 a la unidad de regulación por retroacción 7, lo que le
permite, en caso necesario, dar una orden de cambio de gama de
medición.
La etapa convertidora 72 comprende también unas
resistencias R13-R20, las resistencias
R14-R16, R19 y R20 que valen 1 k\Omega, y las
resistencias R13, R17 y R18 que valen respectivamente 250 \Omega,
1,3 k\Omega, y 1,82 k\Omega. La etapa convertidora 72 comprende
también un potenciómetro P3 de 500 \Omega, una resistencia
ajustable P4 de 1 k\Omega y unos condensadores C4 y C5 de 1 \muF
cada uno.
La unidad de tratamiento 5 comprende
ventajosamente una unidad de mando, destinada a mandar la apertura y
el cierre de electroválvulas en número variable dispuestas sobre
los circuitos de llegada del medio de cultivo 15 y también de aire o
de gas estériles 14. A título de ejemplo, la unidad de tratamiento
5 actúa sobre las electroválvulas 34 y 35 de los microfermentadores
41-48 por medio respectivamente de sistemas de
mando 91-98.
A modo de ejemplo de realización, el diodo 73 y
el fototransistor 74 de los que el constructor es la sociedad
Honeywelll, son del tipo respectivamente comercializado bajo los
nombres SE5470-003 y SD5410-002 y
los amplificadores operativos 81, 82, 83, 85, 86 son fabricados y
comercializados, bajo el nombre LM358A por la sociedad National Semi
Conducteurs (NSC). El circuito convertidor 84 es del tipo 2B20A y es
fabricado por la sociedad Analog Devices (AD) mientras que el
transistor 87 es comercializado bajo la referencia 2N2222.
Según un segundo esquema de realización
electrónica (Figura 10), se prescinde de las etapas 71 y 72 por
medio de una tarjeta electrónica, que efectúa directamente las
conversiones analógica/numérica y numérica/analógica y comunica los
resultados y las órdenes en forma numérica a través de un bus de
comunicación.
La tensión U1 en los bornes de resistencia R5 es
entonces transmitida a la tarjeta en forma de señal analógica por
un puente PT1 de salida. Además, la entrada positiva B del
amplificador operativo 82 está conectada a la tarjeta por medio de
la resistencia R7, por un puente PT2 de entrada. La tarjeta comunica
así en forma analógica a la unidad de regulación 7 el valor de
consigna V2.
Según un tercer esquema de realización
electrónica (Figura 11), variante del segundo esquema, la entrada
negativa A del amplificador operativo 82 está también conectada a la
tarjeta, por un puente PT3 de control. Este puente PT3, que permite
transmitir el valor de la tensión U2, está destinado a verificar el
buen funcionamiento del ajuste de tensión y de la retroacción. El
mismo hace así posible, por referenciado de las diferencias entre
las tensiones U2 y V2, un control global de todos los elementos de
la cadena.
Preferentemente, todos los componentes del bloque
de mando 6 y de la unidad de regulación 7 están implantados sobre
una tarjeta electrónica.
Ventajosamente, varias tarjetas están integradas
en una caja, de las que una es una tarjeta de inicialización
específica.
En funcionamiento, es interesante proceder de la
forma descrita a continuación para cualquiera de los
microfermentadores 41-48 de la batería 40, siendo
los microfermentadores independientes unos de los otros puesto que
están mandados por un programa informático distinto. A intervalos
regulares, un contador de tiempo se pone en marcha y cuando el
tiempo es igual al valor fijado, son disparados los sucesos
siguientes:
- \bullet
- una señal es enviada por el programa de la unidad central 8 que dispara así, por medio de un relé (sistemas de mando 91-98), la electroválvula 34; esta interrumpe el paso del aire o del gas estériles en los microfermentadores 41-48 a fin de no provocar burbujas, fuente de errores en las mediciones.
- \bullet
- Gracias al programa, el valor de consigna V2 es inyectado en la unidad de regulación por retroacción 7.
- \bullet
- Estando el valor de consigna V2 fijado, la unidad de regulación por retroacción 7, que funciona de forma autónoma, ajusta la tensión U1 para emitir la cantidad exacta de luz que, después de paso a través del tubo 2, provoca la aparición de una tensión U2 igual al valor de consigna V2 y proporcional a la corriente I2 que atraviesa el fotoreceptor 4.
- \bullet
- El valor de la tensión U1 es convertido en valor digital y registrado por el programa.
- \bullet
- El par emisor 3-fotoreceptor 4 es puesto en reposo.
- \bullet
- El paro de la electroválvula 34 restablece la aireación o el paso de gas.
- \bullet
- El contador de tiempo es puesto de nuevo a cero.
- \bullet
- Si el valor de U1 medido no sobrepasa ciertos umbrales fijados, el programa calcula el valor de turbidez T correspondiente, utilizando una ecuación determinada anteriormente de forma empírica. A cada valor de consigna V2, corresponde una ecuación, por ejemplo de la forma:
T = a x U1^{3} + b x
U1^{2} + c x U1 +
d
en la que los coeficientes a, b, c y d han sido
determinados experimentalmente para el valor de
V2.
- \bullet
- El ciclo empieza de nuevo.
- \bullet
- Si el valor de U1 medido sobrepasa el umbral fijado, entonces se elige un valor de consigna V2 más bajo y el contador de tiempo es incrementado artificialmente a fin de realizar de nuevo enseguida una medición con este nuevo parámetro, y después se calcula la turbidez T.
- \bullet
- El ciclo empieza de nuevo.
Los valores de la turbidez T son representados en
la pantalla del microordenador de la unidad central 8, lo que
permite seguir la evolución del cultivo en el curso del tiempo.
Además, estos valores son archivados en un fichero, a fin de tratar
los datos ulteriormente, por ejemplo con un tabulador.
En una variante de realización y de utilización,
se efectúan unas mediciones en ráfagas. La utilización de la
electroválvula 34 resulta entonces inútil.
Es interesante que el dispositivo anteriormente
descrito sea utilizado para automatizar los cultivos cíclicos. En
una utilización ventajosa, un algoritmo de control determina el
incremento de población de las células realizando un cálculo de
regresión lineal sobre los n últimos valores de turbidez T medidos,
pudiendo n ser regulable. Se calcula la pendiente de la recta de
regresión obtenida: si la misma es inferior o igual a un valor
fijado, el incremento de población es considerado como nulo y un
contador de tiempo se pone en marcha. Si el cultivo crece de nuevo,
por ejemplo después de una fase de diauxia, el contador es puesto de
nuevo a cero. Cuando el contador alcanza un valor fijado, el
programa de la unidad central 8 dispara la apertura de la
electroválvula 35 interesada, a través de las intercaras, lo que
permite una alimentación con medio de cultivo fresco durante un
tiempo determinado, a fin de realizar una dilución exponencial.
Después, los ciclos de medición empiezan de nuevo.
Se exponen a continuación diversos resultados
obtenidos por medio de un microfermentador equipado con un aparato
de medición de turbidez de acuerdo con la descripción anterior. Se
obtienen unas curvas de crecimiento a partir de cepas de levadura
Saccharomyces cerevisiae cultivadas en medio complejo YPD a
30ºC. Los resultados obtenidos, representados en las Figuras 13 a
15, muestran una gran homogeneidad de los valores, es decir muy
poca dispersión, y unas diferencias del orden del 2% con respecto a
unas mediciones efectuadas en paralelo con un espectrofotómetro,
sobre unas extracciones de estos cultivos. En razón de su
fiabilidad, el aparato de medición de turbidez permite por tanto
comparar muy fácilmente los crecimientos de las cepas.
De manera general, las curvas de crecimiento, que
dan la turbidez T en función del tiempo, comprenden cada una una
parte 131 con un porcentaje elevado (pendiente fuerte) de
crecimiento seguido de una parte 132 con porcentaje de crecimiento
bajo (pendiente pequeña), separadas por un plano 133. Así, las
curvas de cultivo de las cepas salvajes FY23, FY73 y FY1679,
referenciadas respectivamente 123, 124 y 125 y trazadas en la Figura
13 según un eje 63 de tiempo (en horas) y el eje 61 de turbidez T
(en unidades de DO), tienen respectivamente unas partes con grandes
porcentajes de crecimiento 131A, 131B y 131C, unas partes con bajos
porcentajes de crecimiento 132A, 132B y 132C y unos planos de
transición 133A, 133B y 133C.
La comparación de estas curvas de crecimiento
123-125 muestra que la cepa FY73, después de haber
consumido toda la glucosa del medio, crece muy lentamente sobre el
etanol producido por fermentación de la glucosa. En contrapartida,
las cepas FY23 y FY1679 tienen un crecimiento más rápido sobre
etanol (partes con pendientes pequeñas 132A y 132C). Además, los
planos 133B y 133C de diauxia de las cepas FY73 y FY1679 se inician
con una turbidez más baja (a 12,8 unidades de DO) que el plano 133A
de la cepa FY23 (a 14,8 unidades de DO).
Otros resultados, representados en la Figura 14
según el eje 63 de tiempo en horas y un eje 64 que da el logaritmo
neperiano de la turbidez T (InDO), representan las curvas de
crecimiento 127 y 128, respectivamente, del mutante
FYBL2-5D/Dn049 y de la cepa FY23. Las curvas 127 y
128 comprenden respectivamente unas partes de alto porcentaje de
crecimiento 131D y 131E, unas partes con bajo porcentaje de
crecimiento 132D y 132E y unos planos de transición 133D y 133E. Se
constata que la cepa FY23 tiene un porcentaje de crecimiento igual
a 0,545 h^{-1}, que es casi el doble del porcentaje de crecimiento
de la cepa FYBL2-5D/Dn049, igual 0,286
h^{-1}.
Una curva de crecimiento 129 de un cultivo
cíclico de FY1679 cuyas diluciones son completamente mandadas por
microordenador, representada en la Figura 15, comprende una sucesión
de ciclos 141-143 similares. Cada uno de estos
ciclos incluye una parte con alto porcentaje de crecimiento 131 y
una parte con bajo porcentaje de crecimiento 132, separadaspor un
plano de transición 133. La dilución es disparada en un punto de
dilución 135, 24 horas después del inicio del cultivo. La dilución
puede ser también disparada cuando el porcentaje de crecimiento ha
resultado casi nulo, o después de una cierta duración de fase
estacionaria del cultivo.
En otro modo de realización, el aparato de
medición comprende:
- -
- un par emisor/receptor de luz integrado en el aparato,
- -
- un dispositivo de intercara que comprende un bus de circulación de datos entre un dispositivo de tratamiento automatizado de los datos y uno o varias cajas de medición, y de relés,
- -
- un dispositivo de tratamiento automatizado de los datos, tal como un microordenador, provisto de tarjetas electrónicas que permiten mandar el flujo de datos en el seno del bus de datos y una tarjeta electrónica o de una lógica capaz de tratar matemáticamente los datos recogidos.
La o las caja(s) de medición comprenden
ventajosamente cada una una o varias tarjetas de relés, destinadas a
activar unas electroválvulas, y una o varias tarjetas de medición.
Estas últimas comprenden:
- -
- un sistema de medición conectado con el emisor y con el receptor, y
- -
- un convertidor digital/analógico que permite tratar los datos que vienen del bus y fijar así una tensión adecuada a aplicar al emisor a fin de mantener la tensión de referencia del receptor.
Ventajosamente, una caja de medición comprende,
por ejemplo, diez tarjetas de medición y cinco tarjetas de relés
estando cada una de las tarjetas de medición conectada a un
microfermentador y estando las tarjetas de relés conectadas a las
electroválvulas.
Claims (19)
1. Aparato de medición de por lo menos una
propiedad óptica (T, A, F) de un medio (1), que comprende:
- -
- una fuente de luz (3) destinada a emitir un haz luminoso (11) de intensidad variable hacia y en el medio (1),
- -
- unos medios de detección (4) destinados a medir la intensidad del haz reflejado (12) por el medio (1),
- -
- unos medios de mando (6) de la intensidad del haz emitido (11) por la fuente (3),
- -
- unos medios de almacenado destinados a almacenar un valor representativo (V2) de una intensidad nominal del haz reflejado (12),
- -
- un sistema de regulación por retroacción (7) conectado a los medios de mando (6), a los medios de detección (4) y a los medios de almacenado, que actúan sobre los medios de mando (6) de manera que la intensidad medida del haz reflejado (12) sea igual a la intensidad nominal, y
- -
- unos medios de lectura de la intensidad del haz emitido (11) para dicha intensidad nominal del haz reflejado (12), siendo dichas intensidades del haz emitido (11) y nominal del haz reflejado (12) representativas de dicha por lo menos una propiedad óptica (T, A, F) del medio (1),
caracterizado porque dicho aparato
comprende unos medios de ajuste de la intensidad nominal,
conectados a dichos medios de lectura y de almacenado, destinados a
ajustar la intensidad nominal de manera que la intensidad
estabilizada del haz emitido (11) esté incluida en una zona
predeterminada.
2. Aparato de medición según la reivindicación 1,
caracterizado porque los medios de almacenado están
destinados a almacenar una intensidad de saturación y porque los
medios de ajuste regulan la intensidad nominal a un valor menor
cuando la intensidad estabilizada del haz emitido (11) es superior
a la intensidad de saturación.
3. Aparato de medición según una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la fuente de luz
(3) y/o los medios de detección (4) están destinados a medir la
intensidad del haz reflejado (12) alrededor de por lo menos una
longitud de onda, correspondiendo cada una de dichas por lo menos
una propiedad óptica (T, A, F) del medio (1) a una de dichas por lo
menos una longitud de onda.
4. Aparato de medición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dichas por lo
menos una propiedad óptica del medio (1) comprenden la turbidez (T)
del medio (1).
5. Aparato de medición según la reivindicación 4,
caracterizado porque la fuente de luz (3) y/o los medios de
detección (4) están destinados a unas mediciones en infrarrojo.
6. Aparato de medición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicha por lo
menos una propiedad óptica del medio (1) comprende la absorbencia
(A) del medio (1).
7. Aparato de medición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicha por lo
menos una propiedad óptica del medio (1) comprende la fluorescencia
(F) del medio (1).
8. Aparato de medición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende una
unidad de tratamiento (5) conectada a los medios de mando (6) y de
regulación por retroacción (7) y que comprende los medios de
almacenado, estando los medios de almacenado destinados al almacenar
por lo menos una ecuación determinada por una curva de calibrado
(101-107) que da dicha por lo menos una propiedad
óptica (T, A, F) del medio (1) en función de la intensidad del haz
emitido (11) para respectivamente por lo menos un valor de la
intensidad del haz reflejado (12), y porque la unidad de tratamiento
extrae dicha por lo menos una propiedad óptica (T, A, F) del medio
(1) a partir de la intensidad estabilizada del haz emitido (1) para
uno de dichos valores de la intensidad nominal, por una parte, y de
la ecuación correspondiente a dicho valor de la intensidad nominal,
por otra parte.
9. Aparato de medición según la reivindicación 8,
caracterizado porque la unidad de tratamiento (5) comprende
una unidad central (8) y por lo menos una tarjeta de conversión
analógica/numérica y numérica/analógica, que acopla la unidad
central (8) al medio de mando (6) y a los medios de regulación
(7).
10. Aparato de medición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende
un reloj, unos medios de registro en los medios de almacenado de
valores representativos (V1, T, A, F) de dicha por lo menos una
propiedad óptica del medio (1), así como unos medios de activación
repetida del sistema de regulación por retroacción (7) y unos medios
de registro.
11. Aparato de medición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el sistema
de regulación por retroacción (7) y los medios de mando (6) son
tales que la igualación de la intensidad medida y de la intensidad
nominal del haz reflejado (12) se obtiene de forma continua.
12. Microfermentador (20, 41-48)
caracterizado porque está provisto de un aparato de medición
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. Microfermentador según la reivindicación 12,
caracterizado porque comprende:
- -
- un tubo (2) cerrado por un tapón (22) destinado a contener un cultivo (1),
- -
- una primera conducción (23, 24, 25, 33, 54, 55) destinada a inyectar aire o gas estériles(14) y medio de cultivo (15) en el cultivo (1), y
- -
- una segunda conducción (27, 37, 57), destinada a recuperar unos efluentes (17);
- -
- estando el tubo (2) y todas las conducciones (23-27, 33, 36, 37, 54, 55, 57) a presión.
14. Microfermentador según una de las
reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado porque comprende un
sistema de dilución destinado a diluir un cultivo y porque el
aparato de medición comprende un reloj y una unidad de tratamiento
informático (5) conectada al sistema de dilución, disparando la
unidad de tratamiento cíclicamente el sistema de dilución.
15. Microfermentador según la reivindicación 14,
caracterizado porque la unidad de tratamiento informático (5)
activa de forma repetida el sistema de regulación por retroacción
(7), registra en los medios de almacenado unos valores
representativos (V1, T, A, F) de dicha por lo menos una propiedad
óptica, y dispara el sistema de dilución cuando constata sobre una
pluralidad de los últimos valores registrados un estancamiento de
dicha por lo menos una propiedad óptica (T, A, F) del medio (1).
16. Microfermentador según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 15, caracterizado porque las
conducciones (23-27, 33, 36, 37, 54, 55, 57) están
conectadas por medio de conectores (200) que comprenden cada uno una
parte macho (201) conectada a una primera (211) de las conducciones,
una parte hembra (202) conectada a una segunda (214) de las
conducciones y unos medios de conexión (221, 237) de la parte macho
(201) a la parte hembra (202), comprendiendo cada una de dichas
parte macho (201) y la parte hembra (202):
- \bullet
- un extremo (219, 233) alargado y hueco conectado a dicha conducción (211, 214) correspondiente a dicha parte (201, 202) y que comunica con dicha conducción, y
- \bullet
- un manguito (220, 234) alargado, que rodea dicho extremo (219, 233) y conectado a dicha conducción (211, 214) estando el extremo (219) de la parte macho (201) introducido en el extremo (233) de la parte hembra (202), y estando el manguito (220) de una de las partes (201) introducido en el manguito (234) de la otra parte (202) y estando dichos manguitos (220, 234) fijados uno al otro por los medios de conexión (221, 237).
17. Microfermentador según la reivindicación 16,
caracterizado porque el manguito (220) de la parte macho
(201) está introducido en el manguito (234) de la parte hembra
(202).
18. Microfermentador según una de las
reivindicaciones 16 ó 17, caracterizado porque los medios de
conexión (221, 237) comprenden un anillo de apriete (221) conectado
a la conducción (211) correspondiente al manguito (220) receptor y
un sistema de fijación (237) previsto sobre el manguito (234)
introducido en el manguito (220) receptor y que coopera con dicho
anillo (221).
19. Procedimiento de medición de por lo menos una
propiedad óptica (T, A, F) de un medio (1), en el cual:
- -
- se emite un haz luminoso (11) de intensidad variable hacia el medio (1), y
- -
- se mide la intensidad del haz reflejado (12) por el medio (1),
- -
- se ajusta la intensidad del haz emitido (11) de manera que la intensidad del haz reflejado (12) sea igual a una intensidad nominal fijada,
- -
- se lee la intensidad estabilizada del haz emitido (11) así obtenida, y
- -
- se aplica un valor representativo de la intensidad estabilizada a una ecuación determinada por una curva (101-117) que da dicha por lo menos una propiedad óptica (T, A, F) en función del valor representativo de la intensidad estabilizada del haz emitido (11) para dicha intensidad nominal del haz reflejado (12), de manera que se extraiga dicha por lo menos una propiedad óptica (T, A, F) del medio (1),
\newpage
caracterizado porque se ajusta la
intensidad nominal de manera que la intensidad estabilizada del haz
emitido (11) esté incluida en una zona determinada.
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