DE69813553T2 - Anwendung von akustooptischen und sonolumineszenten kontrastmitteln in diagnostischen verfahren - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur diagnostischen Abbildung eines menschlichen oder tierischen Subjekts, insbesondere ein Verfahren, in welchem das Bild aus detektiertem Licht erzeugt wird, welches durch Ultraschall-Bestrahlung des Subjekts erzeugt oder charakteristisch beeinflußt wird.
  • Die optische Bildgewinnung, auch bezeichnet als Licht-Bilderzeugung, ist möglicherweise eines der ältesten medizinischen Werkzeuge für Untersuchung und Diagnose. Allerdings ist die optische Bilderzeugung selbst heute in großem Maße auf Körperoberflächen eingeschränkt. Die hauptsächlichen Fortschritte bei der optischen Bilderzeugung haben im wesentlichen lediglich dazu gedient, den Bereich von Körperoberflächen, der optischen Bilderzeugungstechniken zugänglich ist, zu erweitern. So haben es beispielsweise endoskopische Techniken möglich gemacht, Bilder aus dem Inneren des Magendarmtraktes, des kardiovaskulären Systems, der Blase, der Vagina und Gebärmutter sowie der äußeren Oberfläche fast jeden beliebigen internen Organs zu gewinnen. Allerdings bleibt das tiefe Innere der meisten Organe, mehrere Zentimeter unterhalb der Oberfläche, für eine optische Abbildung nahezu unzugänglich.
  • Es gibt zwei hauptsächliche Schwierigkeiten, welche mit der optischen Suboberflächen-Bilderzeugung assoziiert sind. Diese entstehen aus Lichtabsorption und Lichtstreuung.
  • Im Körper natürlich vorkommende Substanzen absorbieren das meiste sichtbare Licht in starkem Maße, bevor es zu irgendeinem signifikanten Ausmaß durch ein typisches Gewebe gewandert ist. So ist beispielsweise der Absorptionskoeffizient für Licht von einer Wellenlänge von 515 nm. durch die menschliche Leber 18,9 cm–1, was bedeutet, daß ein Photon bei 515 nm durchschnittlich nur etwa 0,5 mm in die Leber wandert, bevor es absorbiert wird.
  • Weil das Photore innerhalb des Gewebes als Ergebnis von Streuung einem nicht-linearen Weg folgt, ist die tatsächliche Eindringtiefe vor der Absorption geringer als die Weglänge von 0,5 mm.
  • Glücklicherweise gibt es ein Wellenlängen-"Fenster" bei 600 bis 1300 nm im Rot- bis Nah-Infrarot-Bereich, in welchem die Lichtabsorption durch den Körper relativ schwach ist. So betragen für Leber- und Brustgewebe die Absorptionskoeffizienten für Licht mit einer Wellenlänge von 635 nm nur 2,3 cm–1 bzw. 0,2 cm–1, was mittlere Weglängen für Photonen bei 635 nm vor der Absorption von etwa 4,3 mm bzw. 50 mm ergibt. Bei diesen Wellenlängen sind auch Knochen und Gehirn relativ transparent, so daß Absorption allein keine Barriere für Licht-Bilderzeugung mit Rot- bis Nah-Infrarot-Licht ist. Somit ist die Eindringtiefe von Licht bei 635 nm um eine Größenordnung höher als diejenige von Licht bei 515 nm.
  • Die Lichtstreuung bleibt jedoch ein Haupthindernis für die Licht-Bilderzeugung von Strukturen unter der Oberfläche. Während Licht mit Wellenlängen von 600 bis 1300 nm durch Gewebe und Organe hindurchtreten kann, bedeutet daher die Streuung, welche auftritt, daß die Information über Strukturen unter der Oberfläche, welche aus dem detektierten hindurchgelassenen oder reflektierten Licht gewinnbar ist, großteils verloren geht, und kleine oder tief eingebettete Strukturen für das Auge nicht distinkt detektierbar sind. Bei 635 nm beträgt der Streuungs-Koeffizient für humanes Brustgewebe 395 cm–1, was bedeutet, daß, obgleich ein Photon durchschnittlich mehrere Zentimeter wandern wird, bevor es absorbiert wird, es konstant durch Streuungsereignisse abgelenkt wird, welche durchschnittlich alle 2 μm auftreten. In anderen Geweben, kann die Streuung weniger stark sein, ist aber immer noch substantiell. Das typische Photore wird lediglich 16 μm zwischen Streuungsereignissen zum Beispiel in der grauen Gehirnsubstanz wandern.
  • Während die Lichtstreuung im Körper statistisch ist, ist sie ebenfalls in hohem Maße anisotrop - die Wege des Photons vor und nach einem Streuungsereignis sind durchschnittlich nicht in hohem Maße divergent. Dieser Streuungstyp ist typisch für Mie-Streuung.
  • Um die Anisotropie der Streuung zu berücksichtigen, wird der reduzierte Streuungskoeffizient μS' anstelle des einfachen Streuungskoeffizienten μs in bestimmten mathematischen Modellen verwendet. μS' hängt mit μs durch die Gleichung μS' = μS (1–g) zusammen, worin g der durchschnittliche Kosinus des Winkels zwischen den Eintritts- und Austrittswegen des Photons für Streuungsereignisse ist. Für menschliche graue Substanz beträgt μS' lediglich 7,22 cm–1, was bedeutet, daß Licht etwa 0,1 mm wandert, bevor seine Ausbreitungsrichtung signifikant verändert wird. Dies bedeutet, daß selbst nach Hindurchtreten durch einige Zentimeter Brust- oder anderes Gewebe ein Lichtstrahl noch eine signifikante. Komponente aufweisen kann, welche im wesentlichen in derselben Richtung wandert, wie der einfallende Lichtstrahl. Diese Komponente wird häufig als die quasi-ballistische Komponente bezeichnet, und es ist diese Komponente, welche von besonderer Nützlichkeit bei der Licht-Bilderzeugung von Strukturen unter der Oberfläche ist.
  • Da die Flugbahn der quasi-ballistischen Photonen durch Gewebe kürzer ist als der Weg der stärker gestreuten Photonen, der diffusen Komponente, ist es somit möglich, das transmittierte Licht in seine quasi-ballistische und diffuse Komponente zu unterteilen. Dies kann beispielsweise unter Verwendung einer gepulsten Lichtquelle und Detektieren der führenden bzw. Kopfränder des transmittierten gepulsten Lichts erfolgen.
  • Trotz ihrer technischen Schwierigkeiten besitzt die Licht-Bilderzeugung dahingehend bedeutende Vorteile gegenüber anderen medizinischen Abbildungs-Modalitäten, daß sie sowohl funktionelle Information als auch räumliche Information über den Körper vorsehen kann. Somit kann sie mit geeigneter Modifikation beispielsweise zur Messung von pH-Wert, Sauerstoffgehalt, Metallkonzentration etc. verwendet werden.
  • Die akusto-optische Bilderzeugung ist ein modifiziertes Vorgehen zur Licht-Bilderzeugung, in welchem fokusierter bzw. gebündelter Ultraschall verwendet wird, um optische Signale aus dem Körper zu isolieren. Es sind mehrere Interaktionsmechanismen möglich. In einem von diesen erzeugt die akustische Welle sich bewegende Regionen von unterschiedlichem Druck, Dichte und Brechungsindex, welche mit dem Licht in sehr ähnlicher Weise wie ein Streuungsgitter interagieren. Die Bewegung der Schallwellen induziert darüber hinaus eine Doppler-Verschiebung der Schallfrequenz zur Lichtfrequenz, was es möglich macht, denjenigen Anteil des Lichts zu identifizieren, welcher tatsächlich mit der Schallwelle interagiert hat. Somit kann das Licht, welches durch die fokusierte Ultraschallregion hindurchgetreten ist, von den anderen Komponenten des detektierten Lichts getrennt werden, weil es hinsichtlich Frequenz und Wellenlänge einer Verschiebung unterliegt. Die akusto-optische Bildgebung wird beispielsweise in US-A-S 171 298 und von Wang et al., Optics Letters 20: 629–631 (1995), Wang et al., Proc. Opt. Soc. Amer. ATuB3–1: 166–168 (1996), und Brooksby et al. Proc. Soc. Photo-Opt. Instr. Engin. 2389: 564–570 (1995) beschrieben.
  • Die akusto-optische Bilderzeugung erweitert tatsächlich das Vermögen der Licht-Bilderzeugung, eine funktionelle Abbildung vorzusehen, weil das Ausmaß, zu welchem die fokusierten Schallwellen mit dem Licht wechselwirken, von den mechanischen Eigenschaften des Körpers an der Fokus-Stelle abhängen wird. Die Fähigkeit, den Zugmodulus und andere mechanische Eigenschaften einer verdächtigen Schädigung zu messen, vereinfacht in großem Maße die Identifizierung des Schadens als gutartig oder bösartig.
  • Somit trägt bei der akusto-optischen Bilderzeugung das detektierte Lichtsignal eine Aufzeichnug der Wechselwirkung des Ultraschalls mit dem Testobjekt. Andere Phänomene besitzen dieses Merkmal ebenfalls. In dem als Sonolumineszenz bekannten Phänomen wird Licht durch die Wirkung von Ultraschall auf gewisse Materialien erzeugt (siehe Suslick, "Ultrasound, its chemical, physical and biological effects", VCH, New York 1988). Die Modulation der Frequenz oder Amplitude des Ultraschalls kann der Sonolumineszenz eine Modulation vermitteln, und die Detektion bei der Modulationsfrequenz liefert ein Mittel zum Herauslösen des Signals aufgrund der Ultraschallbestrahlung vom Hintergund.
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Verbesserungen in Licht-Bilderzeugungs-Verfahrensweisen, worin das detektierte Lichtsignal durch Ultraschallbestrahlung des menschlichen oder tierischen Körpers in Untersuchung beeinflußt wird, und insbesondere auf die Verwendung von Kontrastmitteln in solchen Bilderzeugungsvorgehen. Diese Kontrastmittel sind Materialien, welche Licht im Wellenlängenbereich von 300 bis 1300 nm, vorzugsweise dem Wellenlängenbereich von 600 bis 1300 nm, streuen, emittieren oder absorbieren (oder zwei oder mehreres von diesen), wobei das detektierte Lichtsignal durch die Ultraschallbestrahlung des Körpers, durch die Gegenwart (oder Abwesenheit) des Kontrastmittels im/von dem Ultraschallbestrahlten Abschnitt des Körpers und gegebenenfalls durch die selektive Empfindlichkeit des Kontrastmittels auf Unterschiede in seiner Mikroumgebung innerhalb des Körpers beeinflußt oder hervorgerufen wird.
  • Unter einem Aspekt betrachtet, liefert die Erfindung somit ein Verfahren zur Erzeugung von Information aus (z. B. einem Bild von) einem lebenden menschlichen oder nichtmenschlichen (z. B. Säugetier-, Vogel- oder Reptilien-) Tierkörper, an welchen ein physiologisch tolerierbares Material, fähig zur Absorption, Streuung oder Emittierung von Licht bei einer Wellenlänge im Bereich von 300 bis 1300 nm zuvor verabreicht worden ist, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
    • – Unterziehen wenigstens eines Abschnitts (oder Zielzone) des Körpers unter Ultraschallbestrahlung;
    • – Detektieren von Licht im Wellenlängenbereich von 300 bis 1300 nm, vorzugsweise 600 bis 1300 nm, aus genanntem Abschnitt des Körpers; und
    • – Manipulieren des detektierten Lichts zur Erzeugung der Information (z. B. eines Bildes von wenigstens einem Teil des Körpers).
  • Durch dieses Verfahren ist es möglich, die genannte Information zu modifizieren oder zu verstärken (z. B. den Kontrast in einem Bild des genannten Abschnitts zu verstärken oder die Bestimmung von funktioneller Information bezüglich des Abschnitts, wie pH oder Sauerstoffgehalt etc., zu erleichtern).
  • Das in den Verfahren der Erfindung verwendete, physiologisch tolerierbare Material (hierin nachstehend bezeichnet als das Kontrastmittel) kann zweckmäßigerweise ein solches sein, für welches der Kontrasteffekt, z. B. der Effekt auf Lichterzeugung, Lichtstreuung; Lichtabsorption, Lichtausbreitung oder Lichtfrequenz von der Mikroumgebung, z. B. pH, Sauerstoffgehalt etc., abhängig ist.
  • Unter einem weiteren Aspekt betrachtet, sieht die Erfindung die Verwendung eines physiologisch tolerierbaren Materials, das in der Lage ist, Licht bei einer Wellenlänge im Bereich von 300 bis 1300 nm, vorzugsweise 600 bis 1300 nm, zu absorbieren, zu streuen oder zu emittieren, für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Verabreichung an den menschlichen oder tierischen Körper in einem daran vorgenommenen Diagnoseverfahren vor, welches das Unterziehen eines Abschnitts des genannten Körpers unter Ultraschallbestrahlung, das Nachweisen von Licht im Wellenlängenbereich von 300 bis 1300 nm, vorzugsweise 600 bis 1300 nm aus dem genannten Abschnitt und die Manipulierung des detektierten Lichts zur Vorsehung räumlicher und/oder funktioneller Information (z. B. eines Bildes), betreffend genannten Abschnitt, beinhaltet.
  • In den Verfahren der Erfindung wird die Ultraschall-Bestrahlung vorzugsweise auf einen Abschnitt des Körpers fokusiert, in dem sich das Kontrastmittel verteilt oder an welchem sich das Kontrastmittel akkumuliert hat. Die Ultraschall-Bestrahlung wird darüber hinaus vorzugsweise hinsichtlich Frequenz und/oder Amplitude mit einem/einer charakteristischen Modulationsmuster oder -Frequenz moduliert, und die Komponente des detektierten Lichtsignals, welche gleichfalls moduliert ist, wird vorzugsweise extrahiert und verwendet, um die gewünschte Information (z. B. Bild) zu erzeugen.
  • Falls das Kontrastmittel nicht selbst sonolumineszent ist, wird das Verfahren der Erfindung im allgemeinen das Aussetzen mindestens eines Teils des Ultraschall-bestrahlten Bereichs (der Zielzone) des Körpers an Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 300 bis 1300 nm, vorzugsweise 600 bis 1300 nm, vorzugsweise monochromatisches, z. B. Laser-Licht, beinhalten. Derartiges Bestrahlungslicht, welches auf den Körper einfällt, kann darüber hinaus hinsichtlich Frequenz und/oder Amplitude moduliert sein. Als ein Beispiel der Amplitudenmodulation kann das einfallende Licht gepulst sein.
  • Wo der Körper so beleuchtet wird, wird das detektierte Licht im allgemeinen einer durchgelassenen oder gestreuten (z. B. reflektierten) Komponente des Beleuchtungslichtes oder von dem Kontrastmittel im Anschluß an Absorption des Beleuchtungslichtes emittiertem Licht (z. B. einer Fluoreszenzemission) entsprechen.
  • Wenn der Körper beleuchtet wird, kann dies mit einem oder mehreren, z. B. 1, 2, 3 oder 4 nicht-coaxialen Lichtstrahlen erfolgen. Wo eine Mehrzahl von Lichtstrahlen verwendet wird, können diese von unterschiedlichen Wellenlängen sein, obwohl es im allgemeinen bevorzugt wird, Strahlen der gleichen Wellenlängen zu verwenden.
  • Wenn eine Mehrzahl von Lichtstrahlen verwendet wird, werden diese darüber hinaus im allgemeinen auf die Zielzone gerichtet, und es werden im allgemeinen Mittel bereitgestellt, um Licht aus jedem Lichtstrahl, welcher durch die Zielzone hindurchgelaufen ist, zu detektieren. Jeder Strahl kann bei der gleichen Frequenz oder bei unterschiedlichen Frequenzen Amplituden- oder Frequenz-moduliert sein. Wenn das Licht im Körper in hohem Maße gestreut wird, ist die Richtung der Beleuchtung willkürlich.
  • Das für die akusto-optische Bildgebung gemäß der Erfindung verwendete Kontrastmittel kann eine Vielzahl von Formen einnehmen. So kann es ein Partikulat (z. B. ein fester oder halbfester Partikel), ein Flüssigkeitströpfchen, eine Gasblase oder ein Vesikel (z. B. eine Micelle, ein Liposom oder ein Mikroballon) mit einer starren oder flexiblen, kontinuierlichen oder porösen Membran sein, welche ein Gas, einen Gasvorläufer (ein Material oder eine Mischung aus Materialien, welche bei 37°C oder bei durch die Ultraschallbestrahlung erzeugten Temperaturen gasförmig sind), eine Flüssigkeit oder einen Feststoff oder eine Mischung von zwei oder mehreren davon umschließt.
  • Aus Zwecken der Klarheit wird das Wort "Partikel" verwendet, um jedwedes physiologisch annehmbare partikuläre Material zu bezeichnen. Derartige Partikel können fest (z. B. beschichtete oder unbeschichtete kristalline Materialien) oder fluid (z. B. flüssige Partikel in einer Emulsion) sein oder können Aggregate sein (z. B. Fluid-enthaltende Liposomen). Ein partikuläres Material mit einer Teilchengröße, welche kleiner oder gleich zur einfallenden Lichtwellenlänge ist, wird bevorzugt.
  • Derartige Partikulate können Chromophore (Materialien oder Einheiten, welche Licht bei einer Wellenlänge im Bereich von 300 bis 1300 nm, vorzugsweise bei einer Wellenlänge im Bereich von 600 bis 1300 nm, absorbieren und/oder emittieren) sein oder selbige einschließen oder können im wesentlichen farblos sein (z. B. frei von herausragenden Absorptions- oder Emissionsmaxima im Wellenlängenbereich von 600 bis 1300 nm). Somit können partikuläre Kontrastmittel beispielsweise Materialien sein, welche Licht im Wellenlängenbereich von 300 bis 1300 nm, vorzugsweise 600 bis 1300 nm, dank ihrer Größe und des Unterschieds im Brechungsindex von demjenigen der umgebenden Körperflüssigkeiten in der Zielzone streuen. Alternativ dazu können sie aus einem lichtabsorbierenden Farbstoff, mit oder ohne einer farblosen umgebenden Hülle oder Membran, oder aus einem farblosen Kern (fest, flüssig oder gasförmig), umgeben von oder überzogen mit einem lichtabsorbierenden Farbstoff, aufgebaut sein. Für Sonolumineszenz sind Teilchen mit Chromophoren besonders nützlich, wenn sie Licht in einem Wellenlängenbereich außerhalb des Detektionsbereichs absorbieren. Falls teilchenförmig, wird das Kontrastmittel vorzugsweise eine mittlere Teilchengröße im Bereich von 5 nm bis 20 μm (wobei das obere Ende des Bereichs im allgemeinen nur für deformierbare Teilchen angemessen ist), insbesondere 10 nm bis 8 μm, speziell 80 bis 2000 nm und am stärksten bevorzugt 100 bis 500 nm aufweisen.
  • Im allgemeinen werden lipophile Kontrastmittel als Öl-in-Wasser-Emulsionen mit Öl-tröpfchengrößen zwischen 5 und 10000 nm, vorzugsweise zwischen 10 und 2000 nm formuliert werden, welche in einer pharmazeutisch annehmbaren wäßrigen Phase suspendiert sind. Solche Öltröpfchen können ausschließlich aus strahlungsabsorbierenden, streuenden oder fluoreszierenden Komponente(n) aufgebaut sein oder können andere lipophile Substanzen einschließen, welche über das gesamte Tröpfchen hinweg verteilt sind. Diese Emulsionen werden wahrscheinlich. pharmazeutisch annehmbare Träger enthalten, wie sie im Fachgebiet bekannt sind, einschließlich Lecithin, anderen Phospholipiden, Tensiden, wie den Tetronics und Pluronics, lipophilen Additiven, wie Sesamöl, und normalerweise für die Steuerung der Isotonizität, des pH-Wertes und der Osmolalität verwendete Komponenten.
  • Das Kontrastmittel kann alternativerweise ein lösliches Material sein, z. B. ein wasserlösliches Chromophor oder Polychromophor, oder ein farbloses lösliches Polymer, welches die Erzeugung von Licht durch Ultraschall erleichtert.
  • Wo das Kontrastmittel ein Chromophor ist, oder wenigstens eines enthält, ist dies vorzugsweise ein Material oder eine Einheit, welches) ein Absorptionsmaximum im Bereich von 300 bis 1300 nm, vorzugsweise 600 bis 1300 nm, besonders bevorzugt 650 bis 900 nm aufweist.
  • Für Fluorophore, d. h. Materialien, welche Licht absorbieren und Licht bei einer unterschiedlichen Wellenlänge emittieren, wird die Emissionswellenlänge vorzugsweise ebenfalls in dem Bereich von 600–1300 nm liegen. Auf diese Weise wird das Licht, welches das Chromophor absorbiert/emittiert, einer minimalen Absorption durch den Körper unterzogen.
  • Wo das Kontrastmittel ein Chromophor enthält, kann es zweckmäßigerweise ein solches sein, welches charakteristische Absorptions/Emissions-Maxima aufweist, welche empfindlich gegenüber der Mikroumgebung sind, in welcher sich das Kontrastmittel befindet, z. B. pH-Wert, Sauerstoffgehalt etc. Für partikuläre Chromophor-freie Kontrastmittel kann die Empfindlichkeit gegenüber der Mikroumgebung gleichermaßen durch Bilden der Teilchen aus Materialien erzielt. werden, welche optische oder mechanische Eigenschaften (z. B. Härte, Opazität bzw. Trübung, Größe etc.) gemäß des pH, Sauerstoffgehaltes etc. ihrer Mikroumgebung verändern.
  • Somit können die Absorptionswellenlängen und akusto-optischen Eigenschaften des Kontrastmittels gewählt werden, um für die biochemischen oder biophysikalischen Eigenschaften des Organs oder des Gewebes empfindlich zu sein, in welchem sie sich verteilen, was ermöglicht, Informationen hinsichtlich derjenigen biochemischen oder biophysikalischen Eigenschaften, welche aus den im Verfahren der Erfindung detektierten Lichtsignalen gewonnen werden sollen, zu erlangen.
  • Die in dem Verfahren der Erfindung erzeugte "Information" kann in der Form von räumlichen, zeitlichen und/oder funktionellen Bildern, in der Form von quantifizierten Werten für ausgewählte Parameter der Zielzone (z. B. pH, etc.) oder lediglich als Ausdruck einer Anzeige, daß ein Kriterium erfüllt ist oder nicht erfüllt ist (z. B. der pH-Wert verschieden von demjenigen des umgebenden Gewebes ist oder nicht) vorliegen. Wo quantifizierte Werte erzeugt werden, wird dies im allgemeinen eine Kalibration bzw. Eichung gegen Werte für bekannte Standards beinhalten.
  • Gemäß der Erfindung verwendete, partikuläre oder lösliche Kontrastmittel können, falls gewünscht, Komponenten beinhalten, welche dazu dienen, ihre biologische Verteilung oder Bioeliminierung zu modifizieren, z. B. Targetingvektoren (z. B. Antikörper, Antikörperfragmente, Proteine, Oligopeptide, Rezeptorbindungs-Arzneistoffe etc.), welche in der Lage sind, das Mittel dazu zu veranlassen, sich an besonderen Körperstellen zu akkumulieren, beispielsweise in Tumoren oder an der Oberfläche von Körpergängen oder -Höhlen (z. B. im Gastrointestinaltrakt, in den Lungen, dem Gefäßsystem etc.), oder Mittel zur Verlängerung der Blutpool-Verweildauer (beispielsweise Polyallcylenoxide, Heparinoide und andere Materialien, welche die Entziehung von teilchenförmigen oder löslichen Materialien aus dem Blutstrom verzögern können). Beispiele solcher Vektoren und Blutpool-Verweilzeitverlängerer und ihrer Konjugation an Partikel und Chromophoren sind in unserer gleichzeitig anhängigen internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB98/01245 mit dem Titel "Method of Demarcating Tissue" mit der Veröffentlichungs-Nr. WO 98/48845, welche ebenfalls geeignete Chromophor- und Polychromophor-Materialien auflistet, angegeben.
  • Im allgemeinen werden feste Kontrastmittel als Partikel mit Größen zwischen 5 und 10000 nm, vorzugsweise 10 und 6000 nm, suspendiert in wäßriger Lösung, formuliert. Allerdings werden optimale Lichtabsorption und optimale Lichtstreuung auftreten, wenn die Partikel Durchmesser zwischen 100 und 500 nm aufweisen.
  • Gegebenenfalls kann die Lösung, in welcher feste Partikel suspendiert sind, Puffer und andere Exzipienten enthalten, um den pH-Wert und die Osmolalität zu steuern. Vorzugsweise werden die festen Teilchen mit einem Tensid beschichtet, gewählt z. B. aus Plwonic F-68, Pluronic F-108, Tweens, Spans und Tetronic T-908, um die Aggregation während des Autoklavierens und der Aufbewahrung zu behindern.
  • In dieser Erfindung ist ein Tensidmolekül als ein Emulgator oder Detergens definiert, wie aufgelistet in McCutcheon's Directories, Band 1: Emulsifiers and Detergents (1994), wobei es mindestens eine chemische funktionelle Gruppe enthält, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Alkohol (OH) einer Nitrilogruppe, einschließlich eines primären Amins (NH2) und eines sekundären Amins (NH), einer Carbonsäure (COOH), einem Sulfhydryl (SH), einer Phosphorsäuregruppe, Phosphonsäuregruppe, einer Phenolgruppe, einer Sulfonsäuregruppe, einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung und einem Keton.
  • Chemische funktionelle Gruppen in den Tensidmolekülen können durch chemische Reaktionen, welche dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind, ineinander umgewandelt werden. Zum Beispiel kann eine Hydroxylgruppe in einen Methansulfonsäureester umgewandelt werden, welcher mit Natriumazid behandelt und reduziert werden kann, um eine Amingruppe zu bilden. Carbonsäuregruppen und Ketone können zur Bildung von Alkoholen reduziert werden, und Alkohole können unter Bildung von Ketonen, Aldehyden und Carbonsäuregruppen oxidiert werden.
  • Nützliche Tensidmoleküle sind Emulgatoren oder Detergentien, welche als Dispergiermittel, Benetzungsmittel, Adsorptionsmittel, Anti-Klumpungs-Mittel, Schmutz-Antiwiederablagerungsmittel, Anti-Statik-Mittel, Bindemittel, Träger, Perlglanzmittel, Konditionierungsmittel, Hydrotrope, Schaumverhüter, Weichmacher, Flockungsmittel, Befeuchtungsmittel, Gleitmittel, Trübungsmittel, Weichmacher, Konservierungsstoffe, Trennmittel, Belag-Verhüter, Stabilisatoren, Suspendiermittel, Verdickungsmittel, UV-Absorber, wasserabstoßende Mittel, Wachse und Politurmittel fungieren können, und welche mindestens eine chemische funktionelle Gruppe enthalten, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Alkohol (OH), einer Nitrilogruppe, einschließlich eines primären Amins (NH2) und eines sekundären Amins (NH), einer Carbonsäure (COOH), einem Sulfhydryl (SH), einer Phosphorsäuregruppe, einer Phosphonsäuregruppe, einer Phenolgruppe, einer Sulfonsäuregruppe, einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung und einem Keton.
  • Vorzugsweise umfaßt das Tensidmolekül eine Polyallcylenoxideinheit, gegebenenfalls enthaltend eine Verzweigungsgruppe, wie hierin definiert; weiter bevorzugt eine Polyalkylenoxid-Block-Copolymer-Einheit, gegebenenfalls enthaltend eine Verzweigungsgruppe, wie hierin definiert; und am stärksten bevorzugt eine Polyalkylenoxid-Block-Copolymer-Einheit, gegebenenfalls enthaltend eine Verzweigungsgruppe, wie hierin definiert, und umfassend einen Polypropylenoxidblock und einen Polyethylenoxidblock. Beispiele von nützlichen Tensidmolekülen schließen Blockcopolymere, wie AL 2070, erhältlich von ICI Surfactants, Antarox-Blockcopolymere, erhältlich von Rhone-Poulenc, Delonic -Blockcopolymere, erhältlich von De-Forest, Inc., Hartopol-Blockcopolymere, erhältlich von Texaco Chemical Canada, Macol-Blockcopolymere, erhältlich von PPG Industries, Marlox-Blockcopolymere, erhältlich von Huls America, Pluronic-Blockcopolymere, einschließlich Plwonic F, L, P und R, erhältlich von BASF Corp., Poly-Tergent-Blockcopolymere, erhältlich von Olin Corp., und Tetronic und Tetronic R-Blockcopolymere, erhältlich von BASF Corp., ein. Derzeitig bevorzugte Tensidmoleküle schließen Tetronic- und Pluronic-Blockcopolymere ein, und derzeitig am stärksten bevorzugt werden Tetronic-Blockcopolymere.
  • Wenn die Mittel zur Injektion in das Gefäßsystem beabsichtigt sind, können sie mit einer Substanz, wie Poly(ethylenglykol) beschichtet sein, um die Clearance bzw. Entfernung aus dem Blutstrom zu verlangsamen.
  • Gegebenenfalls können die Tenside und anderen Verbindungen dieser Erfindung an einen Targeting-Vektor angeheftet werden, so daß den Partikeln gestattet wird, sich an bestimmten Stellen im Körper zu akkumulieren, wie spezifischen Organen, Teilen von Organen oder er kranktem Gewebe. Verfahren zur Anheftung werden gelehrt in WO 96/40285, ihren Prioritätsanmeldungen US 08/497 684 und US 08/640 464 und in US 08/392 614.
  • Lösliche Farbstoffe werden als Kontrastmittel für eine akusto-optische Bilderzeugung nützlich sein, weil sie die Interaktion zwischen dem Licht und dem Schall durch Erhöhen des Unterschieds in den optischen Eigenschaften zwischen den Senken und Tälern der akustischen Welle verstärken. Derartige Farbstoffe werden besonders nützlich sein, wenn sie in hohem Maße fluoreszent sind. Wenn die Frequenz des Ultraschalls geeignet gewählt wird, wird er die lokale Umgebung um den Farbstoff herum modifizieren und die Fluoreszenzfrequenz beeinflussen. Die Ultraschallfrequenz sollte zwischen 0,01 und 10 MHz, speziell 0,1 bis 3 MHz, insbesondere 0,5 bis 2,5 MHz betragen. Die Modulation der akustischen Energie bzw. Schallenergie bei einer Frequenz zwischen 0 und 100 kHz, speziell 0 und 30 kHz, insbesondere 0 und 10 kHz wird eine Amplitudenmodulation auf das detektierte Licht bei der gleichen Frequenz vermitteln. Darüber hinaus wird das detektierte Licht bei der Frequenz des Ultraschalls moduliert werden. Die Detektion des Lichts, welches bei einer der Frequenzen moduliert ist, wird die Trennung des Signals, welches Bilderzeugungs- oder funktionelle Information trägt, vom Hintergrundsignal erleichtern, welches größtenteils aus gestreutem Licht aus der eintreffenden Strahlung besteht.
  • Speziell bevorzugt als lösliche Farbstoffe werden polymere Substanzen mit einem genügend hohen Molekulargewicht, um die Clearance der Farbstoffe aus dem Blutstrom zu verlangsamen. Derartige Materialien können aus Chromophoren mit angehefteten Polymersegmenten bestehen, oder sie können Substanzen sein, in welchen die Farbstoffe direkt in das Polymergrundgerüst eingebaut werden. Speziell bevorzugt als Linker zwischen oder für die Konjugation an Farbstoffchromophore werden Segmente von Poly(ethylenglycol). Beispiele solcher Farbstoffe werden offenbart in WO 97/1349 und unserer gleichzeitig anhängigen Internationalen Patent anmeldung Nr. PCT/GB98/01245 mit dem Titel "Method of Demarcating Tissue", eingereicht am 29. April 1998, mit der Veröffentlichungs-Nr. WO 98/48845.
  • Wenn lösiche Farbstoffe als im voraus hergestellte Lösungen zur Verfügung gestellt werden sollen, können die Lösungen gegebenenfalls Stabilisationsmittel enthalten, wie gelehrt in WO 94/23646. Die Lösungen können ebenfalls Exzipienten zur Steuerung des pH-Wertes oder der Osmolalität enthalten.
  • Lösliche Farbstoffe können gegebenenfalls in Vesikeln eingeschlossen sein (z. B. Mizellen oder Liposomen), wie es in WO 96/23424 gelehrt wird. Liposomale Formulierungen können gegebenenfalls Substanzen enthalten, um die Farbstoffe gegen Oxidation oder andere Abbauprozesse zu stabilisieren.
  • Eine bevorzugte Form von liposomaler Formulierung enthält Farbstoffe, welche mit Rhodamin 6G (Aiuchi, T.; Tanabe, H.; Kurihara, K.; Kobatake, Y., "Fluorescence Changes of Rhodamine 6G Associated with Chemotactic Responses in Tetrahymeena Pyriformis", Biochem. Biophys. Acta, 1980, 628, 355–364) und Carboxyfluorescein (Chen, R.F.; Knutson, J.R., "Mechanism of Fluorescence Concentration Quenching of Carboxyfluorescein in Liposomen: Energy Transfer to Nonfluorescent Dimers", 1988, 172, 61–77) die Eigenschaft gemeinsam haben, daß sie ihre Fluoreszenz verlieren, wenn sie in Liposomen eingekapselt werden. Ein Standardverfahren zur Herstellung von Liposomen gleichmäßiger Größe beinhaltet die Sonifikation bzw. Schallbehandlung. Unter dem Einfluß von Ultraschall zerbrechen die Liposomen und bilden sich erneut. Im Körper wird der Effekt des fokusierten Ultraschalls darin bestehen, Farbstoff selektiv an der Fokusierungsstelle freizusetzen. Die Detektion der Fluoreszenz aus dieser Stelle identifiziert dann ihre Lokalisation.
  • Liposomen, welche fluoreszenten Farbstoff freisetzen, werden besonders nützlich als Kontrastmittel sein, wenn die Amplitude des Ultraschalls eine Frequenz zwischen 0,01 und 10 MHz, speziell 0,1 bis 3 MHz, insbesondere 0,5 bis 2,5 MHz aufweist, und bei einer charakteristischen Frequenz zwischen 0 und 100 kHz, speziel 0 und 30 kHz, insbesondere 0 bis 10 kHz, moduliert ist. Dann wird die Komponente des detektierten Signals, welche die Lokalisierung und die Eigenschaften der Stelle der Schallfokusierung direkt reflektiert, ebenfalls bei dieser Frequenz moduliert werden und kann leicht vom Hintergrund getrennt werden. Die effektivste Modulierungsfrequenz wird gewählt werden, um die Rate zu reflektieren, bei welcher Farbstoff aus den Liposomen freigesetzt und erneut von diesen eingefangen wird.
  • Kontrastmittel für die akusto-optische Bilderzeugung können auch die Form von gasgefüllten Blasen aufweisen, wobei Farbstoffe, welche mit Rhodamin 6G und Carboxyfluorescein die Eigenschaft gemeinsam haben, daß sie ihre Fluoreszenz bei Einkapselung in Liposomen verlieren, in die Hüllen eingebracht werden. Mit der Ausnahme der Gegenwart des Farbstoffs werden diese Blasen eine Form aufweisen, ähnlich zu derjenigen von Kontrastmitteln für die Ultraschall-Bilderzeugung. Die Erwärmung des innerhalb dieser Blasen enthaltenen Gases durch Ultraschall wird zur Expansion des Gases, zum Zerreißen der Blasen und zur Freisetzung der fluoreszenten Farbstoffe führen. Erneut können diese Mittel Mittel auf der Oberfläche, wie PEG, enthalten, um die Blut-Clearance zu verlangsamen, oder können angeheftete spezifische Targetingvektoren aufweisen.
  • Sonolumineszenz ist experimentell mit dem Kollaps von Mikrobläschen assoziiert, welcher durch Hoch-Intensitäts-Ultraschall erzeugt wird (Kavitation) (Suslick, K.S., Hrsg., "Ultrasound, Its Chemical, Physical, and Biological Effects", VCH, New York, 1988). Die Blasenbildung wird durch feste Teilchen erleichtert, welche als Nukleations-Zentren wirken. Kontrastmittel, bestehend aus suspendierten Teilchen mit Durchmessern zwischen 200 und 5000 nm, werden besonders nützlich als Kontrastmittel für Sonolumineszenz sein. Diese sollten so groß wie möglich innerhalb der biologischen Einschränkungen sein, welche notwendig sind, um nachteilige Reaktionen zu verhindern. Im allgemeinen werden die suspendierten Teilchen Substanzen, wie Poly(ethylenglycol) auf ihren Oberflächen aufweisen, um die Aufnahme durch Makrophagen innerhalb des Körpers zu verlangsamen und die Blut-Lebensdauer zu verlängern. Gegebenenfalls können sie spezifische Targeting-Vektoren enthalten. Gegebenenfalls können sie auch angeheftete Materialien aufweisen, um freie Radikale zu beseitigen, welche durch den Kavitations-Prozess erzeugt werden.
  • Alternativ dazu werden Kontrastmittel ohne Radikalfänger für die Überwachung von therapeutischen Verfahrensweisen nützlich sein, in denen zielgerichteter Ultraschall verwendet wird, um Erkrankungs-Läsionen zu zerstören.
  • Kavitation führt bekanntermaßen zur Bildung von freien Radikalen. Wenn diese Radikale mit Vorläufern unter Bildung gefärbter freier Radikale interagieren, können sie für die Erzeugung von Markern der Stelle der Ultraschallfokusierung verwendet werden, welche durch optische Bilderzeugung detektiert werden können und als eine Anzeige verwendet werden können, wo der Ultraschall konzentriert wird. Dieses Verfahren wird besonders nützlich sein, wenn der Ultraschall für therapeutische Zwecke, beispielsweise die selektive Zerstörung von krebsartigen Läsionen, sowie für Bilderzeugung verwendet wird.
  • Wasserlösliche Polymer werden die Erzeugung von Licht durch Ultraschall erleichtern. Die gemäß der Erfindung verwendeten wasserlöslichen Polymere besitzen zweckmäßigerweise ein Molekulargewicht (MW) von 150 bis 1000000 (speziell 500 bis 500000, am stärksten bevorzugt 1 bis 50000), und sind vorzugsweise Hexamere oder höhere Polymere. Die Polymere enthalten vorzugsweise Monomerreste, welche 2 bis 6 Atome zum Polymergrundgerüst beitragen, speziell 2, 3 oder 4 Atome. Die Polymere können zweckmäßigerweise Reste von Monomeren umfassen, wie Alkylenoxide, Hydroxyalkyl-acrylate oder -methacrylate, Vinylalkohol, Vinylpyrrolidon, Acrylamid, Styrole etc. Besonders bevorzugt werden die Polymere polymere Tenside sein.
  • Beispiele von geeigneten Polymeren beinhalten: Polyalkylenoxidpolymere und Copolymere (einschließlich statistischer und Block- und Pfropf-Copolymere) und Oligomere, wie Poly(ethylenoxid), ebenfalls bekannt als Poly(ethylenglycol), ebenfalls bekannt als PEG, sowie Poloxamere und Poloxamine (ebenfalls bekannt als Pluronics und Tetronics);
    PEG-Derivate, wie PEG-Mono- und -Bis-Ether von Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppen, enthaltend 1 bis etwa 26 Kohlenstoffatome, wobei selbige linear oder verzweigt sein können, und welche eine Cycloalkyl- oder Cycloalkenylgruppe mit einer Ringgröße von 3 bis 10 Kohlenstoffatomen (vorzugsweise eine Cyclohexenyl-, Cyclooctenyl- oder Cyclooctadienyl-Gruppe) umfassen können, so daß diese Gesamtanzahl von Kohlenstoffatomen in der Gruppe geringer als 26 ist;
    PEG-Mono- und Bis-Ester (einschließlich alpha-Methoxy-PEG-Monoestern) und PEG-Mono- und -Bis-Amide (einschließlich alpha-Methoxy-PEG-Monoamiden) von Alkyl-, Alkenyl- und Alkinyl-Carbonsäuregruppen, enthaltend 1 bis etwa 26 Kohlenstoffatome, wobei selbige linear oder verzweigt sein können, und welche eine Cycloalkyl- oder Cycloalkenylgruppe mit einer Ringgröße von 3 bis 10 Kohlenstoffatomen (vorzugsweise eine Cyclohexenyl-, Cyclooctenyl- oder Cyclooctadienyl-Gruppe) umfassen können, so daß die Gesamtanzahl von Kohlenstoffatomen in der Gruppe geringer als 26 ist; und Derivate von PEG, wie obenstehend beschrieben, konjugiert an eine polyiodierte aromatische Verbindung, z. B. PEG-Ester und -Amide von mono- , di- und tri-iodierten aromatischen Benzoesäure-Derivaten, wie Diatrizonsäureester und -Amide;
    Poly(propylenglycol) (PPG, ebenfalls bekannt als Poly(propylenoxid)) und PPG-Derivate und statistische und vorzugsweise Block-PEG-PPG-Copolymere, Poly(hydroxyalkyl)acrylate und -methacrylate, Polyvinylalkohol, Polyvinylpynolidon, Polyacrylamid, wasserlösliche Polystyrole, einschließlich sulfoniertem Polystyrol, hydroxyalkyliertem und polyhydroxyalkyliertem Polystyrol, und PEG-Ester und Ester von hydroxyalkyliertem und polyhydroxyalkyliertem Polystyrol; Tenside, umfassend PEG und Hydroperoxide und Peroxide von PEG, wie Pluronics (z. B. Pluronic-F108 von BASF).
  • Wenn das Polymer ein Polyalkylenoxid umfaßt, kann die Polyalkylenoxideinheit linear oder verzweigt sein und ist vorzugsweise eine homopolymere oder copolymere, speziell blockcopolymere Einheit, enthaltend wiederkehrende Einheiten CnH2nO, worin n für 2, 3 oder 4, vorzugsweise 2 oder 3 steht, speziell bevorzugt CH2CH2O, OCHCH3CH2, CH3CHCH2O oder CH2CH2CH2O-Wiederholungseinheiten. Innerhalb der PAO-Einheit können ein oder mehrere, vorzugsweise ein oder zwei der Ether-Sauerstoffe durch eine Amingruppe NH oder NE ersetzt sein, worin E eine Bindung oder eine Alkyl- oder Hydroxyalkylgruppe oder eine (CnH2nO)qE'-Seitenkette ist (worin n 2, 3 oder 4 ist, und q eine ganze Zahl ist, deren Maximumwert durch die Molekulargewichtsgrenze für das PAO gesetzt wird, und E' für H oder Alkyl, eine chemische Bindung oder ein Chromophor steht).
  • Jedwede Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinyleinheiten weisen, es sei denn es ist anderweitig definiert, vorzugsweise bis zu 12, speziell bevorzugt bis zu 6 Kohlenstoffatome auf.
  • In einem Aspekt kann eine Verzweigungsgruppe im Grundgerüst der Polyalkylenoxideinheit aus der Gruppe gewählt werden, bestehend aus einem Stickstoffatom und einem Kohlenstoffatom. Mindestens eine zusätzliche Polyalkylenoxidylgruppe kann an die Verzweigungsgruppe mittels einer chemischen Bindung, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus chemischen Kohlenstoff-Kohlenstoff-, Kohlenstoff-Stickstoff- und Kohlenstoff-Sauerstoff-Bindungen, oder mittels einer Verknüpfungsgruppe angeheftet werden.
  • Bevorzugte Verknüpfungsgruppen an eine Stickstoffverzweigungsgruppe schließen folgendes ein:
    Methylengruppen [-CH2-];
    Poly(methylen)gruppen, [-(CH2)n-], worin n eine ganze Zahl von 2 bis etwa 16 ist, wie sie gebildet werden können durch Reaktion zwischen einer Stickstoff-NH-Gruppe und einer Alkylenylgruppe, enthaltend ein endständiges Halogenid (z. B. Cl, Br, I), oder Sulfonatgruppe (z. B. Methansulfonat, Toluolsulfonat, Benzolsulfonat und dergleichen);
    Alkylencarbonylgruppen [-(CH2)n''-C(=O)-] worin n'' eine ganze Zahl von 1 bis etwa 16 ist, wie sie gebildet werden können durch Umsetzen einer NH-Gruppe mit einer Halogenallcylencarbonylgruppe;
    Ethylensulfonylethylengruppen [-CH2CH2-S(=O)2-CH2CH2-], wie sie gebildet werden können durch Umsetzen einer NH-Gruppe mit einer Vinylsulfonylethylengruppe [CH2-CH-S(=O)2-CH2CH2-];
    Ethylensulfonylmethylenoxymethylensulfonylethylen-Gruppen [-CH2CH2-S(=O)2-CH2-O-CH2-S(=O)2-CH2CH2-], wie sie gebildet werden können durch Umsetzen einer NH-Gruppe mit einer Vinylsulfonylmethylenoxymethylensulfonylethylen-Gruppe [CH2=CH-S(=O)2-CH2-O-CH2-S(=O)2-CH2CH2-];
    Ethylensulfonylmethylensulfonylethylen-Gruppen [-CH2CH2-S(=O)2-CH2-S(=O)2-CH2CH2-], wie sie gebildet werden können durch Umsetzen einer NH-Verzweigungsgruppe mit einer Vinylsulfonylmethylensulfonylethylen-Gruppe [CH2=CH-S(=O)2-CH2-S(=O)2-CH2CH2-];
    Carbonylgruppen [-(C=O)-], welche eine Amid-Verknüpfungsgruppe umfassen können, gebildet beispielsweise durch Umsetzen einer NH-Verzweigungsgruppe mit einem aktivierten Ester, wie einem N-Hydroxysuccinimidyl-Ester, oder mit einem gemischten Anhydrid, wie einem Trifluormethyloxycarbonyl; oder mit einem Säurehalogenid, wie einem Säurechlorid, z. B. Cl-(C=O)-;
    Sulfonyl-Gruppen [S(=O)2-], welche eine Sulfonamid-Verknüpfungsgruppe umfassen können, gebildet beispielsweise durch Umsetzen einer NH-Verzweigungsgruppe mit einem Sulfonylhalogenid, wie einem Polyalkylenoxidylalkylensulfonylchlorid, z. B. Cl-S(=O)2-(CH2)n-O-PAO; worin n eine ganze Zahl von 2 bis etwa 16 ist, und PAO eine Polyalkylenoxidyl-Gruppe ist;
    Carbonyloxy-Gruppen [-C(=O)-O-], wie diejenigen, gefunden in Urethan-Gruppen, wie sie erhalten werden können durch Umsetzen einer Polyalkylenoxy-Gruppe mit Phosgen und dann mit einer NH-Gruppe;
    Thiocarbonyl-Gruppen [-C(=S)-], wie diejenigen, gefunden in Thiourethan-Gruppen, wie sie erhalten werden können durch Umsetzen einer Polyalkylenoxy-Gruppe mit Thiophosgen und dann mit einer NH-Gruppe;
    Alkylencarbonyloxymethylenoxycarbonylalkylen-Gruppen [-(CH2-)n '-C(=O)-O-C(R'R'')-O-C(=O)-(CH2-)n'-], worin jedes n' unabhängig gewählt wird aus der Gruppe von ganzen Zahlen von 1 bis 16, und jedes R' und R" unabhängig gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus H und Methyl; und
    Carbonylalkylencarbonyl-Gruppe [-C(=O)-(CH2)w-C(=O)-], worin w eine ganze Zahl von 1 bis etwa 6 ist, wie Succinat und Adipat.
  • Bevorzugte Verknüpfungsgruppen an eine Kohlenstoff-Verzweigungsgruppe schließen folgendes ein:
    Ethergruppen [-O-];
    Thioethergruppen [-S-];
    Thiosulfoxidgruppen [-S(=O)-];
    Thiosufonylgruppen [-S(=O)2-];
    Oxycarbonylgruppen [-O-C(=O)-];
    Aminocarbonylgruppen [-NH-C(=O)-];
    Carbonylgruppen [-(C=O)-];
    Carbonyloxygruppen [-C(=O)-O];
    Carbonatgruppen [-O-C(=O)-O-];
    Carbonyloxymethylenoxycarbonylalkylen-Gruppen [-(-C(=O)-O-C(R'R'')-O-C(=O)-(-CH2-)n'-], worin n' eine ganze Zahl von 1 bis 16 ist, und jedes R' und R" unabhängig gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus H und Methyl;
    Urethangruppen [-O-C(=O)-NH-]; und
    Thiourethangruppen [-O-(C=S)-NH-].
  • Unter einem anderen Aspekt kann eine Verzweigungsgruppe die Einheit -NR1'-CR2'R3'-CR4'R5'- umfassen, worin R1' gewählt werden kann aus der Gruppe, bestehend aus H, einer Alkylgruppe von 1 bis etwa 16 Kohlenstoffatomen, welche linear, verzweigt, gesättigt, ungesättigt sein kann, oder einen carbocyclischen Ring von 3 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen enthält, oder einer Carbonylalkylgruppe, worin die Alkylgruppe unmittelbar obenstehend definiert ist;
    R2' und R3' unabhängig voneinander gewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus H, einer Alkylen-Gruppe von 1 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen, welche linear, verzweigt, gesättigt oder ungesättigt sein kann, und einen carbocyclischen Ring von 3 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen enthalten kann, und an welche eine Polyalkylenoxidylgruppe über eine Heteroatom-Gruppe an geheftet ist, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus NH, 0, S, O-C(=O) und C(=O)-O, z. B. wie 4-(Polyalkylenoxyethylcarbonylaminobutyl),
    [PAO-CH2CH2C(=O)NH-(CH2)4-], 2-(Polyalkylenoxycarbonyl)ethyl,
    [PAO-C(=O)CH2CH2-], Polyalkylenoxycarbonylmethyl, [PAO-C(=O)CH2-], Polyalkylenoxyethylaminocarbonylmethyl, [PAO-CH2CH2NHC(=O)CH2-], Polyalkylenoxyethylaminocarbonylethyl, [PAO-CH2CH2NHC(=O)CH2CH2 ], Polyalkylenoxymethyl, [C], und Polyalkylenoxyethylthiomethyl, [PAO-CH2CH2-S-CH2-];
    R4' und R5' unabhängig gewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus H, einer Alkyl-Gruppe von 1 bis etwa 16 Kohlenstoffatomen, welche linear, verzweigt, gesättigt, ungesättigt sein kann, oder einen carbocyclischen Ring von 3 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen, oder eine Carbonylalkyl-Gruppe enthalten, wobei die Alkylgruppe wie obenstehend definiert ist, oder worin vorzugsweise sowohl R4' als auch R5' zusammengenommen eine Carbonylgruppe bilden;
    und worin mindestens eines von R2',R3' nicht H ist.
  • Bevorzugte Einheiten -NR1'-R2'R3'-CR4'R5'- werden gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Cystein und Serin im Grundgerüst der Polyalkylenoxid-Einheit und enthalten mindestens ein zusätzliches Polyalkylenoxid, gebunden beispielsweise an die epsilon-Amin-Stelle von Lysin, an die gamma-Carbonsäure-Stelle von Asparaginsäure, an die delta-Carbonsäure-Stelle von Glutaminsäure, an die Beta-Sulfhydryl-Gruppe in Cystein und an die Beta-Hydroxy-Stelle von Serin.
  • Unter einem anderen Aspekt können eine Verzweigungsgruppe und ein Kohlenstoffatom im Grundgerüst der Polyalkylenoxid-Einheit oder zwei Verzweigungsgruppen im Grundgerüst der Polyalkylenoxid-Einheit durch eine Alkylengruppe von 2 bis 12 Kohlenstoffatomen verknüpft sein. Die Alkylengruppe kann linear oder verzweigt sein, wie Ethylen, Propylen, Butylen, Isobutylen, Pentylen, Hexylen, Octylen, Decylen und Dodecylen. Die Alkylengruppe kann gesättigt oder ungesättigt sein, wie 2-Butenyliden, Isoprenylen und 2 Butinyliden. Unter einem , anderen Aspekt kann die Alkylengruppe eine gesättigte oder ungesättigte cyclische Gruppe umfassen, wie Cyclopropyliden, Cyclobutyliden, 1,2-Cyclopentyliden, 1,3-Cyclopentyliden, 1,2-Cyclohexyliden, 1,3-Cyclohexyliden, 1,4-Cyclohexyliden, einen Cyclohexenyliden-Ring, wie er gebildet werden kann durch eine Diels-Alder-Reaktion zwischen einem Dien und einem Dienophil, 1,4-Cyclohexylidenbismethylen, Ethylen-l,2-cyclopropylidenmethyliden, 1,1-Spirocyclopropyliden-bismethylen, und dergleichen, wobei selbige ein Sauerstoff- oder Schwefeletheratom enthalten kann, wie eine 2,5-Tetrahydrofuranylen-Gruppe und eine 2,6-Tetrahydropyranylen-Gruppe.
  • In einem anderen Aspekt können eine Verzweigungsgruppe und ein Kohlenstoffatom im Grundgerüst der Polyalkylenoxid-Einheit oder zwei Verzweigungsgruppen in dem Grundgerüst der Polyalkylenoxid-Einheit durch einen aromatischen Ring von 6 bis 14 Kohlenstoffatomen getrennt sein, wie p Phenylen oder m Phenylen oder m-Toluiden, 9,10-Anthracenyliden oder 1,4-Naphthalinyliden oder eine Aralkylen-Gruppe, wie p-Phenylenbismethylen oder 9,10-Anthracenylidenbismethylen, wobei der aromatische Ring eine 5- oder 6-gliedrige Heterocyclylen-Gruppe umfassen kann, enthaltend ein oder zwei Heteroatome, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel, wie 2,6-Pyridinylen, 1,4-Imidazoliden, 5,8-Chinolinyliden und 1,1-Spiro-2,6-dithiacyclohexylen, oder eine symmetrische Triazinylen-Gruppe.
  • Die polymeren Verbindungen können Homo- oder Copolymere sein, und, falls Copolymere, statistisch, blockartig oder gepfropft sein, und können individuelle Comonomer-Reste enthalten, wie die Diaminreste in den Poloxaminpolymeren. Poly(alkylenoxid)-Polymere werden besonders bevorzugt.
  • Derartige Poly(alkylenoxid)-Verbindungen sind ohne weiteres kommerziell erhältlich, z. B. als Pluronics, Tetronics oder PEGS von verschiedenen Molekulargewichten.
  • Die Poly(alkylenoxide) können eine Poly(alkylenoxidyl)-Einheit (z. B. eine Einheit der Formel ((X)nO)p, worin X eine Alkylengruppe (z. B. ein C2–4-Alkylen) ist und n und p positive ganze Zahlen sind (wobei n zweckmäßig 1 bis 5 ist und p 1 bis 20 000 ist), gegebenenfalls unter Beinhaltung einer Alkylenamino- oder Alkylendiaminogruppe, wie einer Ethylenamin- oder Ethylendiamingruppe), enthalten und können einfach aus einer derartigen Einheit bestehen, terminiert durch einfache funktionelle Gruppen, z. B. Hydroxyl-, Amin-, Sulfat-; Carboxylat-, Phosphat- und Phosphonatgruppen.
  • Konjugate der gemäß der Erfindung verwendeten Polymere können Einheiten enthalten, welche von der wasserlöslichen (d. h. hydrophilen) Polymer-Einheit verschieden sind, welche kovalent miteinander gebunden sind, z. B. Chromophore, lipophile Gruppen (z. B. Phospholipid-Gruppen), Biotargeting-Vektor-Gruppen und Gruppen, welche bei in vivo-Diagnose-Bilderzeugungs-Modalitäten detektierbar sind, wie beispielsweise MR- und Röntgenstrahl (z. B. CT)-Bilderzeugung.
  • Vorgeformte eingekapselte Gasblasen- werden als Kontrastmittel für Sonolumineszenz-Bilderzeugung besonders bevorzugt. Ähnliche gasgefüllte Blasen sind als Kontrastmittel für Ultraschall-Bilderzeugung nützlich. Das eingeschlossene Gas, kann Luft, Xenon, Argon, Helium oder jedwedes andere physiologisch annehmbare Gas sein. Mischungen von Gasen, wie Xenon und Stickstoff, Argon und Stickstoff, und Helium und Stickstoff, liegen ebenfalls innerhalb des Umfangs der Erfindung. Eine bevorzugte Mischung ist 1 bis 99% Xenon in Stickstoff. Besonders bevorzugt wird eine Mischung von 1 bis 10% Xenon in Stickstoff.
  • Besondere Beispiele von Materialien, welche zur Verwendung als Kontrastmittel für Sonolumineszenz-Bilderzeugung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind: Partikulat-Suspensionen, enthaltend 1,1',3,3,3',3'-Hexamethylindotricarbocyaniniodid, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 1 von WO 97/13490; und die Verbindungen der Beispiele 1–7 von WO 96/17628; wobei alle diese Beispiele hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind.
  • In den Verfahren der Erfindung ist das Kontrastmittel im voraus an ein in Untersuchung befindliches Subjekt (z. B. einen menschlichen Patienten) auf eine derartige Weise verabreicht worden, daß es die Zielzone von Interesse erreichen kann, z. B. die Brust, das Gehirn, die Leber, Lymphknoten, Hautschädigung etc. Eine derartige Verabreichung kann auf jedwedem herkömmlichen Weg erfolgen, z. B. Verabreichung in den Magen-Darm-Trakt, Injektion oder Infusion in das Gefäßsystem, subkutane, intramuskuläre oder interstitielle Injektion oder Infusion, sublinguale oder nasale Verabreichung, Verabreichung in die Lungen, Vagina, Blase oder Uterus, topische oder transdermale Applikation, etc. Im allgemeinen wird Injektion oder Infusion in das Gefäßsystem, subkutane oder interstitielle Verabreichung, topische Applikation oder Verabreichung in den Magen-Darm-Trakt bevorzugt werden. Die Verabreichung kann an der Zielzone stattfinden oder an einer Stelle, von welcher aus das Kontrastmittel zur Zielstelle transportiert wird, z. B. durch Aufnahme durch die Wände des Magen-Darm-Trakts oder durch Transport innerhalb der Blutgefäße. Die Informationsaufzeichnung (z. B. Bilderzeugung) kann stattfinden, bevor das Kontrastmittel die Zielzone erreicht hat, wird aber in diesem Fall ebenfalls stattfinden, nachdem das Kontrastmittel die Zielstelle erreicht hat.
  • Für die Informationserzeugungs-Vorgehensweise wird die Zielzone mit Ultraschall bestrahlt, vorzugsweise fokussiertem Ultraschall, z. B. mit einer Frequenz von 0,01 bis 10 MHz, speziell 0,1 bis 3 MHz, insbesondere 0,5 bis 2,5 MHz. Die Ultraschallbestrahlung kann an der Zielzone kontinuierlich und gleichmäßig erfolgen, oder kann weiter bevorzugt frequenz- und/oder amplitudenmoduliert sein. Eine Form vom Amplitudenmodulation, welche verwendet werden kann, ist gepulster Ultraschall. Im allgemeinen wird die Frequenz- und Amplitudenmodulation jedoch die Vermittlung bzw. Verleihung einer Variation der Frequenz und/oder Amplitude beinhalten, welche ihre eigene charakteristische Frequenz (die Ultraschallmodulationsfrequenz) aufweist. Die Modulationsfrequenz wird zwischen 0 und 100 kHz, speziell 0 und 30 kHz, insbesondere 0 und 10 kHz betragen.
  • Wo das Kontrastmittel sonolumineszent ist, und die Information unter Verwendung detektierter Sonolumineszenz-Emissionen erzeugt wird, ist der Ultraschall vorzugsweise moduliert, speziell Amplituden-moduliert. Besonders bevorzugt liegen die Amplituden-Minima unterhalb des Spiegels, wo die resultierende Sonolumineszenz nachweisbar ist, während die Amplituden-Maxima oberhalb dieses Spiegels sind. In diesem Fall wird das erzeugte Licht bei der Modulationsfrequenz und Harmonischen bzw. Oberschwingungen davon moduliert sein. Die Detektion der Amplitude des Lichts bei einer oder mehreren dieser Frequenzen wird die Trennung vom Licht-Hintergrund aus Umgebungsquellen vereinfachen. Wo eine räumliche Auflösung nicht kritisch ist, und wo das Hintergrundrauschen reduziert oder eliminiert wird (z. B. durch Durchführen des Vorgehens im Dunkeln oder in sichtbarem Licht, das gefiltert ist, um Rot- bis Nahinfrarot-Komponenten zu entfernen), muß es nicht notwendig sein, eine modulierte Komponente aus dem detektierten Lichtsignal herauszulösen.
  • Wo die Frequenz der sonolumineszenten Emission abhängig von der Mikroumgebung des Kontrastmittels ist, kann das detektierte Licht gefiltert oder hinsichtlich Frequenz analysiert werden, um die unter verschiedenen Bedingungen, z. B. von pH oder Sauerstoff-Konzentration, erzeugten Komponenten herauszutrennen und somit eine Information über die physikochemische Natur der Zielzone vorzusehen.
  • Wo das detektierte Licht Sonolumineszenz ist, wird es speziell bevorzugt, daß die Ultraschallbestrahlung fokussiert wird, um zu gewährleisten, daß das detektierte Signal aus einer klar lokalisierbaren Zielzone stammt. Aus diesem Grunde kann die Verwendung der quasiballistischen Komponente der Sonolumineszenz (d. h. derjenigen Komponente, welche einem relativ geraden Weg von der Lichterzeugungsstelle zum ersten Teil des Lichtdetektor-Aufbaus, auf welchen sie trifft, folgt) ebenfalls bevorzugt werden.
  • Wo die Sononlumineszenz-Erzeugung abhängig von der Frequenz der Ultraschall-Bestrahlung ist, kann eine Modulation der Ultraschallfrequenz auf die gleiche Weise verwendet werden, wie eine Modulation der Ultraschallamplitude, um eine Komponente mit relativ niedrigem Rauschen des detektierten Lichtsignals zu selektieren, aus welcher die gewünschte Information oder das gewünschte Bild erzeugt werden soll.
  • In Ausführungsformen der Erfindung, wo das Kontrastmittel nicht sonolumineszent ist, wird die Zielzone auch mit Licht einer Frequenz im Bereich von 300 bis 1300 nm, vorzugsweise 600 bis 1300 nm, speziell 650 bis 900 nm beleuchtet werden. Derartiges Licht kann polychromatisch und polydirektional sein; jedoch wird man vorzugsweise einen im wesentlichen monochromatischen, fokussierten Lichtstrahl, insbesondere vorzugsweise einen Laserstrahl, z. B. aus einem abstimmbaren Farbstofflaser, verwenden. Das einfallende Licht kann wiederum hinsichtlich Amplitude und/oder Frequenz moduliert sein, wobei die Amplitudenmodulation bevorzugt wird. Wie bei der obenstehend erörterten Ultraschall-Modulation, ermöglicht die Modulation des einfallenden Lichtstrahls bei einer charakteristischen Modulationsfrequenz und die Analyse des detektierten Lichtsignals und Herauslösung einer Komponente, welche ebenfalls bei dieser charakteristischen Modulationsfrequenz moduliert ist, die Erzeugung von Information und Bildern unter Verwendung eines Signals, welches einen niedrigeren Rauschstörungspegel enthält.
  • Wo die Wechselwirkung des Kontrastmittels und des bestrahlenden Lichts eine Streuungsinteraktion ist, z. B. wo das Kontrastmittel ein chromophorfreies Partikulat ist, kann des detektierte Lichtsignal hinsichtlich der Frequenz analysiert werden, um die Komponente herauszuziehen, welche durch Interaktion mit Ultraschall in der Zielzone Doppler-verschoben ist, wodurch wiederum der Spiegel des Rauschens in der zur Informationserzeugung verwendeten Komponente verringert wird. In ähnlicher Weise kann, falls gewünscht, die quasi-ballistische Komponente des detektierten Amplituden- (oder Frequenz-)-modulierten Lichts zur Informationserzeugung verwendet werden.
  • Wo das Kontrastmittel in den Verfahren der Erfindung Licht emittiert oder Licht streut, wird es besonders bevorzugt, die quasi-ballistische Komponente des Lichts aus der Zielzone zu detektieren. Wo die Zielzone beleuchtet wird, kann die Gegenwart eines Kontrastmittels die quasi-ballistische Komponente des transmittierten bestrahlenden Lichts reduzieren, d. h. die quasiballistische Komponente entlang der optischen Achse zwischen der Lichtquelle und dem Licht-Detektor. Abseits dieser Achse wird jedoch die quasi-ballistische Komponente des Lichts, welches aus der Zielzone stammt oder darin gestreut wird, vergrößert werden.
  • In dem Verfahren der Erfindung wird Ultraschall-Bestrahlung vorzugsweise unter Verwendung eines fokussierten Transducers bewirkt, z. B. eines 3,5 MHz-Transducers mit einer Brennweite von 12,5 cm, welcher bei einem elektrischen Ansteuersignal bei 3,5 MHz operiert, bestehend aus 50-μsec-Pulsen mit Peak-Spannungen von 100 Volt und einer Wiederholungsrate von 40 Hz. Im allgemeinen kann die Ultraschallfrequenz zwischen 0,1 und 10 MHz betragen, und die Brennweite sollte zwischen 1 und 20 cm betragen. Der Peak-Druck am Brennpunkt sollte niedriger als 50 bar sein. Jedwede Laser-Beleuchtung erfolgt vorzugsweise bei einem Leistungs-Spiegel von 10 Milliwatt oder weniger. Die Lichtdetektion kann unter Verwendung herkömmlicher Photodetektoren erfolgen, vorzugsweise eines Photomultiplier-Rohres, wie dem Hamamatsu HC 123–01.
  • Um das "Rauschen" zu minimieren können die Detektionen abgeschirmt werden, um Licht, welches von demjenigen des Subjekts unter Untersuchung verschieden ist, am Erreichen der Photodetektoren zu hindern.
  • Ultraschall-Bestrahlung und Licht-Bestrahlung und Detektion können unter Verwendung von Vorrichtungen bewirkt werden, welche extern zu dem Subjekt unter Untersuchung lokalisiert sind, oder alternativerweise unter Verwendung von Vorrichtungen, welche durch eine natürliche oder chirurgisch hergestellte Öffnung in eine Körperhöhle eingeführt werden.
  • Die Kontrastmittel der Erfindung können an Patienten für die Bilderzeugung in ausreichenden Mengen verabreicht werden, um in der jeweiligen Technik effektiv zu sein.
  • Die Dosierung der Kontrastmittel wird von der untersuchten Stelle, der Natur des Kontrastmittels und den Details des Bilderzeugungs-Vorgehens abhängen. Für die intravenöse Zuführung mit Emulsionen haben sich Dosen bis 1000 mg/kg/Tag im allgemeinen als sicher erwie sen, aber für die Bilderzeugung werden die Dosen im allgemeinen 0,1 bis 10 ml/kg der Suspension oder 15 bis 1500 mg/kg der Öl-Komponente der Suspension betragen. Für suspendierte Feststoffe wird die Dosis von 100 bis 500 mg/kg des Feststoffs variieren. Für Polymere wird die Dosis von 1 bis 700 mg/kg schwanken.
  • Die Kontrastmittel können mit herkömmlichen pharmazeutischen oder tiermedizinischen Hilfsstoffen formuliert werden, beispielsweise Emulgiermittel, Fettsäureestern, Gelbildungsmitteln, Stabilisatoren, Antioxidationsmitteln, Osmolalitäts-einstellenden Mitteln, Puffern, pH-Einstellmitteln, etc., und können in einer zur parenteralen oder enteralen Verabreichung geeigneten Form vorliegen, beispielsweise zur Injektion oder Infusion oder zur direkten Verabreichung in eine Körperhöhle mit einem nach außen führenden Leerungsgang, beispielsweise dem Magen-Darm-Trakt, der Blase oder Gebärmutter. Somit können die Kontrastmittel in herkömmlichen pharmazeutischen Verabreichungsformen, wie Tabletten, Kapseln, Pulvern, Lösungen, Suspensionen, Dispersionen, Sirups, Suppositorien etc., präsentiert werden. Allerdings werden Lösungen, Suspension und Dispersionen in physiologisch annehmbaren Trägermedien, z. B. Wasser zur Injektion im allgemeinen bevorzugt werden.
  • Die Kontrastmittel können deshalb zur Verabreichung unter Verwendung physiologisch annehmbarer Träger oder Exzipienten in einer Weise formuliert werden, welche vollständig innerhalb des Kenntnisstands auf dem Fachgebiet liegt. Beispielsweise können die Kontrastmittel, gegebenenfalls unter Zugabe pharmazeutisch annehmbarer Exzipienten, in einem wäßrigen Medium suspendiert oder gelöst werden, wobei die resultierende Lösung oder Suspension dann sterilisiert wird.
  • Für einige Bereiche des Körpers ist die am stärksten bevorzugte Verabreichungsweise der Kontrastmittel die parenterale, z. B. intravenöse Verabreichung. Parenteral verabreichbare Formen, z. B. intravenöse Lösungen oder Dispersionen, sollten steril und frei von physiologisch unannehmbaren Mitteln sein und sollten eine geringe Osmolalität aufweisen, um Reizungs- oder andere nachteilige Effekte nach der Verabreichung zu minimieren, und daher sollte das Kontrastmedium vorzugsweise isotonisch oder geringfügig hypertonisch sein. Geeignete Vehikel schließen wäßrige Vehikel ein, welche üblicherweise für die Verabreichung parenteraler Lösungen oder Dispersionen verwendet werden, wie Natriumchlorid-Injektion, Ringer-Injektion, Dextrose-Injektion, Dextrose- und Natriumchlorid-Injektion, mit Lactat versetzte Ringer-Injektion und andere Lösungen, wie sie beschrieben sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. Auflage, Easton: Mack Publishing Co., S. 1405–1412 und 1461–1487 (1975) und The National Formulary XIV, 14. Auflage, Washington: American Pharmaceutical Association (1975). Die Lösungen oder Dispersionen können Konservierungsstoffe, antimikrobielle Mittel, Puffer und Antioxidationsmittel, welche herkömmlicherweise für parenterale Lösungen verwendet werden, Exzipienten und andere Zusatzstoffe enthalten, welche mit den Farbstoffen kompatibel sind und welche bei Herstellung, Lagerung oder Anwendung nicht stören werden.
  • Die Erfindung wird nun ferner unter Bezugnahme auf die folgenden nichteinschränkenden Beispiele beschrieben.
  • Beispiel 1
  • Wahlfrei photomarkierte nanopartikuläre Suspensionen (hergestellt wie beschrieben in WO 96/23524)
  • Eine Lösung von WIN 70177 (ein iodiertes Kontrastmittel, hergestellt wie beschrieben in WO 96/23524) und gegebenenfalls Fluorescein in dem Molverhältnis von 100 : 1, optimalerweise 50 : 1, am optimalsten 25 : 1, in DMSO (oder DMF) wird in Wasser präzipitiert. Das resultierende Präzipitat wird, wie beschrieben in der US-A-S 145 684, zusammen mit einem Tensid-Stabilisator (z. B. Pluronic-F108 oder Tetronic T-908 oder 1508) zu einer Teilchengröße von 0,2 μm zermahlen und in einem Medium zu einer Kontrastmittelkonzentration von 0,5 bis 25 Gew.-% und einer Tensidkonzentration von 0,1 bis 30 Gew.-% dispergiert. Ein Trübungspunkt-Modifizierer, wie Poly(ethylenglykol) 400 (PEG 400) oder Propylenglykol, wie offenbart in US-A-S 352 459, kann ebenfalls eingeschlossen werden, um Stabilität bei Autoklaven-Stabilisation sicherzustellen.
  • Beispiel 2
  • Suspendierte Farbstoff-Partikulate
  • Der schlechtlösliche Farbstoff 3,3'-Diethylthiatricarbocyaniniodid (Fisher) wird in eine 1,5 oz bzw. Unzen große braune Glasflasche gegeben, enthaltend ungefähr 12 ml 1,1 mm-Durchmesser-Perlen aus Zirkoniumsulfat in einer ausreichenden Menge, um 15% (w/v) der Endsuspension zu betragen. Die Lösung in der Flasche wird auch auf 3% Pluronic F-68 und 10% PEG-400 (Shearwater) gebracht. Sie wird bis zu insgesamt 9 Tage lang bei ungefähr 150 U/min zermahlen, wobei während dieser Zeit die Teilchengröße durch Lichtstreuung oder andere analytische Verfahren überwacht wird. Das Verfahren wird eingestellt, wenn die durchschnittliche Teilchengröße 100–400 nm beträgt. Das resultierende Produkt wird ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von rund 772 nm aufweisen und kann ohne Änderung der Teilchengröße autoklaviert werden.
  • Beispiel 3
  • Photomarkierte Liposomen
  • Eine Liposomensuspension wird unter Verwendung einer 0,01 M Lösung von Rhodamin 6G und 5 bis zu 10% eines, Phospholipids (Verhältnis von Lecithin zu Dipalmitolylphosphatidylserin von 10 : 1) hergestellt. Die Herstellung wird durch herkömmliche Techniken bewirkt (z. B. Ultraschallbehandlung), gefolgt von Extrusion durch Filter von kontrollierter Porengröße und Diafiltration oder Mikrofluidisierung. Die resultierenden Liposomen sind dampfsterilisierbar und sind sterilfiltrierbar.
  • Beispiel 4
  • Herstellung von Nanoteilchen-Suspension von WIN 72115
  • Nanopartikel WIN 72115 (ein fluoreszierendes iodiertes Kontrastmittel) wurde hergestellt durch Vereinigen von WIN 72115 (hergestellt wie beschrieben in Beispiel 21 von WO 96/23524) und Pluronic F108 (BASF, Parsippany, NJ) in einem Glasgefäß bei Konzentrationen von 15 g/100 ml Suspension und 3 g/100 ml Suspension. Das Gefäß wurde dann zur Hälfte gefüllt mit Zirkoniumsilicat-Perlen von 1,0 mm Durchmesser, und ausreichend Wasser wurde zugegeben, um die erforderlichen Konzentrationen von Mittel/Tensid, wie obenstehend angegeben, einzustellen. Alternativ dazu kann das Tensid in dem Wasser vor Zugeben in das Gefäß gelöst werden (mit oder ohne Sterilfiltration durch 0,2-Mikrometer-Filter).
  • Das Gefäß wird dann für nicht weniger als 27 Stunden oder mehr als 14 Tage bei einer Rotationsrate auf seiner Seite gerollt, welche ausreichend ist, um zu verursachen, daß die Perlen innerhalb des Gefäßes die Wände des Gefäßes herab "kaskadieren", während es sich umdreht (siehe US-A-S 145 684). Am Ende des Mahlzyklus wird das Material aus dem Gefäß gewonnen und von den Zerkleinerungsperlen getrennt.
  • Auf diese Weise hergestellte Nanopartikel von WIN 72115 besitzen eine durchschnittliche Teilchengröße von 225 nm mittels Lichtstreuung.
  • WIN 72115 wurde entworfen, um mit einfallender Strahlung aus einem Argon-Ionen-Laser (im Grün, nahe 514 nm) angeregt zu werden und Licht bei Wellenlängen oberhalb dieses Wertes zu emittieren. Somit wird, nach Injektion, die Beleuchtung des Patienten mit grünem Licht die Emission von Licht einer geringfügig unterschiedlichen Wellenlänge stimulieren, welche für diagnostische Zwecke verwendet werden könnte. Eine Ultraschallbestrahlung wird die Frequenz des beobachteten Signals verschieben und modulieren. Die Schlüsselmerkmale des Mittels bestehen darin, daß es als Nanopartikel hergestellt werden kann, innerhalb des Gefäßsystems mehr als 15 Minuten lang verbleiben kann und sowohl Streuungs- als auch Fluoreszenzkontrast für Licht-Bilderzeugung vorsehen kann.
  • Anstelle von WIN 72115 kann das photomarkierte Mittel aus Beispiel 22 von WO 96/23524 verwendet werden.
  • Beispiel 5
  • Herstellung von WIN 70146 in Pluronic F108 (I-404)
  • WIN 70146 (hergestellt wie in Beispiel 23 von WO 96/23524) wurde mit Zirkoniumsilicat-Perlen mit einem Durchmesser von 1,1 mm 3 Tage lang unter aseptischen Bedingungen zermahlen. Die Konzentration dieses Mittels belief sich auf 15% WIN 70146 in Gegenwart von 4% Pluronic F-108. Es wurden keine zusätzlichen Salze oder Tenside zugesetzt. Die durchschnittliche Teilchengröße der resultierenden Nanopartikel-Suspension belief sich auf 162 nm, wie bestimmt durch Lichtstreuung.
  • Beispiel 6
  • Herstellung einer autoklavierbaren Formulierung von WIN 70146 unter Verwendung von Pluronic F-108 und PEG 400
  • WIN 70146 (hergestellt wie in Beispiel 23 von WO 96/23524) wurde mit Zirkoniumsilicat-Perlen von einem Durchmesser von 1,1 mm in Gegenwart von Pluronic F-108 3 Tage lang zermahlen. Die Endteilchengröße wurde als 235 nm bestimmt. An diesem Punkt wurde steriles PEG 400 so zu der Suspension zugesetzt, daß die Formulierung beim Abschluß 15% (w/v%) WIN 70146, 3% (w/v%) Pluronic F-108 und 10% PEG 400 enthielt. Diese Formulierung wurde dann unter Standardbedingungen (d. h. 121 °C während 20 min) autoklaviert, was zu einer Endteilchengröße von 248 nm führte.
  • Beispiel 7
  • Herstellung und akutes Sicherheitstesten von Nanoteilchen-Suspensionen von WIN 70146 in Pluronic F108
  • Partikuläres WIN 70146 wurde hergestellt wie in den Beispielen 23 und 10 von WO 96/23524 und in die Schwanzvene von Mäusen bei Dosierungen von 3 ml/kg, 15 ml/kg und 30 ml/kg (d. h. 0,45 g/kg, 2,25 g/kg und 4,5 g/kg) injiziert. Es wurden keine unangemessenen Effekte in einer beliebigen der Mäuse bei jedweder Dosis während einer Dauer von 7 Tagen bemerkt, wobei die Tiere nach dieser Zeit getötet wurden. Die allgemeine Beobachtung dieser Tiere ergab keinerlei sichtbare Schäden oder Entstellungen.
  • Weitere gründliche Sicherheitsuntersuchungen in Ratten zeigten keine signifikanten Sicherheitsbedenken aufgrund einer Einzeldosis von WIN 70146/F-108 bei Spiegeln bis zu und einschließlich 30 ml/kg (4,5 g/kg). Diese Untersuchungen beinhalteten eine sehr gründliche Histopathologie, klinische Chemie und Beobachtungen am lebendigen Objekt.
  • Beispiel 8
  • Formulierung von Indocyanin-Grün in einem Linosom
  • Indocyanin-Grün (ICG) wurde zu einer Liposomen-Suspension zugesetzt, gebildet aus 8,2% Lecithin (Phosphatidylcholin), 0,8% Dimyristalphosphatidylglycerol und 0,1% eines nichtionischen, polymeren Tensids P-79, welches entworfen ist, um dem Liposom eine verlängerte Verweilzeit im Blut-Pool zu vermitteln. Die Phospholipide und das Tensid wurden in Wasser unter Verwendung von Ultraschallenergie aus einem Sonden-Sonikator gemischt (Bransonic Sonifier 450, 90% Leistungszyklus, Ausstoßstufe 10). Liposomen wurden unter Verwendung eines Microfluidics M110S-Microfluidizers bei 14 000 PSI und 4 Durchläufen der Phospholipid-Mischung durch die Wirkungskammer hergestellt. Die resultierenden Liposomen wiesen einen durchschnittlichen Durchmesser von ungefähr 100 nm auf, wie bestimmt durch Lichtstreuung, und behielten nach einer Autoklaven-Sterilisation dieselbe Größe bei. Darüber hinaus waren die Liposomen in der Lage, durch einen sterilen Filter (d. h. 0,2 μm Porengröße) hindurchzutreten. Die Zugabe von ICG in einer ausreichenden Menge, um die Suspension auf ungefähr 7 mg/ml ICG einzustellen, veränderte die physikalischen Merkmale der liposomalen Suspensionen nicht. Nach Sterilisation unter einer Stickstoffatmosphäre waren diese ICG-Liposomen mindestens 6 Wochen lang bei Raumtemperatur stabil.
  • Eine Untersuchung der Spektraleigenschaften des liposomalen ICG relativ zu OCG, gelöst in Wasser oder Kochsalzlösung, zeigte den Einfluß der liposomalen Umgebung. Sowohl die Maximum-Anregungswellenlänge als auch die Emissionsmaximum-Wellenlänge wurden zu niedrigeren Energien (d. h. höheren Wellenlängen) relativ zu den homogenen Wasserlösungen verschoben. Darüber hinaus zeigten sorgfältige Messungen der Quantenausbeute eine mindestens vierfache Erhöhung der Quantenausbeute des liposomalen ICG relativ zu den wäßrigen ICG-Lösungen.
  • Es wird angenommen, daß die Bestrahlung mit Licht des Absorptionsmaximums von ICG zusammen mit gleichzeitiger Ultraschallbestrahlung einen signifikanten Vorteil bei der Detektion der Fluoreszenzemission aus dem ICG ergeben wird. Der Vorteil hinsichtlich der Fluoreszenz wird aus der Möglichkeit stammen, daß eine verbesserte Quantenausbeute an ICG innerhalb des Liposoms durch die Ultraschallquelle moduliert werden kann, was eine bessere Detektion oder phasensensitive Detektion ergibt.
  • Die Lichtbilderzeugungs-Detektion der Fluoreszenz von ICG kann ferner verstärkt werden durch Verwenden einer Differenztechnik, worin das Bild ohne Ultraschall von demjenigen mit dem Ultraschall subtrahiert wird, speziell wenn der Ultraschall so abgestimmt wird, daß die Liposomen zerbrochen werden, wodurch das Fluoreszenzsignal des darin befindlichen ICG verändert wird. Dies wird eine verstärkte Empfindlichkeit ergeben, speziell wenn der Ultraschall oder das Eingangs-Lichtsignal oder beide moduliert werden, um das Lichtsignal weiter von nicht-modulierten Hintergrund-Gewebesignalen zu unterscheiden. Die empfohlene Dosis der liposomalen Suspension von ICG für die Bilderzeugung beläuft sich auf 0,1 bis 15 ml/kg.
  • Beispiel 9
  • Liposomale Suspension von Röntgenstrahl-absorbierendem Farbstoff für die akusto-optische Bilderzeug
  • Liposomen (CTP-10) von Phosphatidylcholin und Phosphatidylserin in einem Molverhältnis von 10 : 1 wurden durch Extrusion durch gestapelte 1-Mikrometer-Porengröße-Filter unter Druck hergestellt. Diese Liposomen wurden in einer Lösung hergestellt, welche 400 mg/ml Iodixanol, ein iodiniertes lösliches Röntgenkontrastmittel, enthielt. Somit enthielt jedes Liposom eine signifikante Menge an iodiertem Kontrastmittel innerhalb des internen wäßrigen Pool des Liposoms. Diese Formulierung von Liposomen-eingekapseltem CT-Röntgenkontrastmittel (d. h. Iodixanol) wurde an Kaninchen als ein Einzelbolus von 150 mg Iod/kg, ein geteilter Bolus von 2 × 75 mg Iod/kg und eine 10-Minuten-Infusion von 80 mg I/Minute (Gesamtdosis = 800 mg I oder ungefähr 265 mg Iod/kg bei 1 ml/min) verabreicht. Eine Röntgenstrahl-Bilderzeugung wurde auf einem GE-Spinal-CT-Scanner im Palo Alto Veterans Hospital, Palo Alto, CA, durchgeführt. Weder der Einzelbolus noch der unterteilte Bolus ergaben eine signifikante Blutopazifizierung über 1 Minute nach der Verabreichung hinaus. Die Infusion liefert jedoch eine nützliche Opazifizierung des Blutes während der Infusion, sowie eine Leber-Verstärkung. Sogar nach 5 Minuten Infusion beträgt der Kontrast in der Aorta ungefähr 125 HU, mindestens 50 HU oberhalb der Hintergrund-Opazifizierungs-Spiegel.
  • In Bezug auf die akusto-optische Bilderzeugung zeigen die CT-Daten deutlich die Spiegel an Kontrastmittel, welche innerhalb der verschiedenen Strukturen (d. h. Leber, Blut) vorhanden sind. Der derzeitige Kenntnisstand auf dem Fachgebiet besteht darin, daß jede 30 HU für ungefähr 1 mg/g Iod, oder in besserer Nährung 2 mg Kontrastmittel/g Gewebe stehen. Somit werden Kontrastmittelspiegel bis zu 8 bis 10 mg/g Gewebe in den obenstehenden Dosierungsplänen erzielt. Diese Liposomen sind bekanntermaßen sehr gute Streuungsmittel über einen weiten Bereich von Lichtwellenlängen. Unter dem Einfluß einer modulierten Ultraschallquelle könnte transmittiertes Licht somit in ähnlicher Weise moduliert werden und einen Empfindlichkeitsvorteil gegenüber herkömmlichem ballistischen oder semiballistischen Licht zur Abbildung des Körpers gewähren. Wenn der einfallende Lichtstrahl entweder elektronisch oder über einen Verschluß bei der gleichen Frequenz wie der Ultraschall oder einer harmonischen Frequenz moduliert werden könnte, wird das akusto-optische Signal (aus Streuung) ebenfalls moduliert werden, so daß die Hintergrund-Störwirkung reduziert wird.
  • Für Sonolumineszenz-Bilderzeugung werden die Teilchen als Nukleationsstellen für die Blasenbildung dienen. Das Wachstum und der Kollaps dieser Blasen werden für die Lichterzeugung benötigt.
  • Beispiel 10
  • Herstellung einer stabilen Emulsion von Sudan III
  • Sudan III (ebenfalls bekannt als D&C Red No. 17, Solvent Red 23, Ceresin Red) ist stark wasserunlöslich aber löslich in Sesamöl, einem gutbekannten Öl für parenterale Öl-in-Wasser-Emulsionen (z. B. Intralipid, Liposyn, etc.), und besitzt eine Maximumwellenlänge der Lichtabsorption von 507 nm. Daher wurde eine Emulsion von Sudan III wie folgt hergestellt: Eine gesättigte Lösung von Sudan III in Sesamöl wurde hergestellt durch sanftes Umdrehen des Behälters während eines Wochenendes (ungefähr 72 Stunden). Die Öllösung wurde dann durch einen 5 Mikrometer-Spritzenfilter filtriert, gefolgt von einem 0,8 Mikrometer-Filter, um ungelöstes festes Sudan III zu entfernen. Die resultierende gesättigte Lösung wurde dann in Wasser bei einem Verhältnis von 10% "Öl" zu 90% wäßriger Tensidlösung emulgiert, wobei Ultraschallenergie, gefolgt von Mikrofluidisieren bei ungefähr 14 000 PSI eingesetzt wurde, bis eine konstante Tröpfchengröße erreicht war. Die Tröpfchengröße wurde durch Lichtstreuung unter Verwendung einer Horiba 910-Lichtstreuungsvorrichtung und eines Volumen-gewichteten Durchschnitts gemessen. Die resultierenden Emulsionen wurden auch durch herkömmliche Dampfsterilisation sterilisiert, und die Tröpfchengröße wurde erneut mit den folgenden Ergebnissen gemessen:
  • Figure 00270001
  • P79, beschrieben in Beispiel 2k von PCT/GB 95/02109, ist ein PEG-Doppelester mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 und der Formel CH3(CH2)13COO(CH2)15COO-((CH2)2O)11CH3. P79 ist ein polymeres Tensid, welches in großem Maße zu der Fähigkeit beizutragen scheint, ein kleines Emulsionströpfchen von Sesamöl, gesättigt mit Sudan III, herzustellen. Die resultierende rosafarbige Emulsion ist lagerungsstabil.
  • Während der akusto-optischen Bilderzeugung wird das teilweise Zerbrechen der emulgierten Teilchen in Regionen mit starker Ultraschallbestrahlung den Kontakt zwischen den Farbstoffmolekülen und Wasser erhöhen, und die optischen Eigenschaften der Farbstoffe werden verändert. Dies wird das Durchtreten von Licht durch die Regionen mit hohem Farbstoffgehalt und hoher Ultraschallbestrahlung beeinflussen, und der Kontrast in dem akusto-optischen Bild zwischen den Regionen mit hohem und niedrigem Farbstoffgehalt wird verstärkt werden.
  • Beispiel 11
  • Formulierung von Liposomen-stabilisierten Luftblasen für Sonolumineszenz
  • Eine Liposomensuspension wurde gebildet aus 8,2% Lecithin (Phosphatidylcholin), 0,8% Dimyristalphosphatidylglycerol und 0,1% eines nichtionischen polymeren Tensids, P-79, welches ausgelegt ist, um dem Liposom eine verlängerte Verweildauer im Blut-Pool zu vermitteln. Die Phospholipide und das Tensid wurden in Wasser unter Verwendung von Ultraschallenergie aus einem Sonden-Sonikator (Bransonic Sonifier 450, 90% Leistungszyklus, Ausstoß 10) gemischt. Liposomen wurden hergestellt unter Verwendung eines Microfluidics M110S-Microfluidizers bei 14000 PSI und 4 Durchläufen der Phospholipidmischung durch die Wirkungskammer. Die resultierenden Liposomen hatten ungefähr einen durchschnittlichen Durchmesser von 100 nm, wie bestimmt durch Lichtstreuung, und behielten die gleiche Größe nach Autoklavensterilisierung. Darüber hinaus waren diese Liposomen in der Lage, durch einen sterilen Filter (d. h. 0,2 Mikrometer Porengröße) hindurchzutreten. Die resultierende liposomale Suspension wurde gefriergetrocknet, um einen weißen Kuchen am Boden einer Flasche zu ergeben. Während die Zurückgewinnung unter Raumluft durchgeführt wurde, konnte das Ablassen des Vakuums aus dem Lyophilisierungs-Verfahren unter jedweder gewünschten gasartigen Atmosphäre durchgeführt werden (d. h. Stickstoff, Xenon, Helium, etc.). Die zurückgewonnenen Gefäße wurde verschlossen und im Dunklen bei 5°C bis zur Verwendung aufbewahrt.
  • Die Rekonstitution mit Wasser zur Injektion führte zu Liposomen, welche während einer gewissen. Zeit Luftblasen innerhalb der Phospholipid-Membranen eingeschlossen aufwiesen. Diese Suspension konnte in ein Tier oder einen Menschen injiziert werden, gefolgt von Ultraschallbestrahlung, welche die Blasen für den sonolumineszenten Effekt aktivieren wird. Die biologische Verteilung dieser luftgefüllten Liposomen wird von der Oberflächenbeschichtung beherrscht, welche in diesem Fall nichtionisch und in der Lage ist, die Liposomen vor den MPS-Zellen zu "verstecken".
  • Diese Teilchen werden besonders nützlich für Sonolumineszenz-Bilderzeugung sein. Lediglich der Teil des Gefäßsystems, welcher die Liposomen tatsächlich enthält, wird ein Sonolumineszenz-Signal ergeben.
  • Beispiel 12
  • Liposomensuspension von eingefangenen Luftblasen stabilisiert während Gefriertrocknung durch einen röntgenabsorbierenden Farbstoff für Sonolumineszenz-Bilderzeugung
  • Liposomen (CTP-10) aus Phosphatidylcholin und Phosphatidylserin in einem Molverhältnis von 10 : 1 wurden durch Extrusion durch gestapelte 1-μm-Porengröße-Filter unter Druck hergestellt. Diese Liposomen wurden in einer Lösung hergestellt, welche 400 mg/ml Iodixanol, ein iodiertes, lösliches Röntgenkontrastmittel, enthielt. Somit enthielt jedes Liposom eine signifikante Menge an iodiertem Kontrastmittel innerhalb des internen wäßrigen Pools des Liposoms. Diese Formulierung von Liposomen-eingekapseltem CT-Röntgenkontrastmittel (d. h. Iodixanol) wurde an Kaninchen als Einzelbolus von 150 mg Iod/kg, ein unterteilter Bolus von 2 × 75 mg Iod/kg und eine 10 Minuten lange Infusion von 80 mg I/Minute (Gesamtdosis = 800 mg I oder ungefähr 265 mg Iod/kg bei 1 ml/min) verabreicht. Die Röntgenstrahl-Bilderzeugung wurde auf einem GE-Spiral-CT-Scanner am Paol Verans Hospital, Palo Alto, CA, ausgeführt. Weder der Einzelbolus noch der unterteilte Bolus ergaben signifikante Blut-Opazifizierung jenseits von einer Minute nach der Verabreichung. Die Infusion liefert jedoch eine nützliche Opazifizierung des Blutes während der Infusion sowie eine Leberverstärkung. Selbst nach 5 Minuten Infusion, beträgt der Kontrast in der Aorta ungefähr 125 HU, mindestens 50 HU über den Hintergrund-Opazifizierungs-Spiegeln.
  • Die CT-Daten zeigen deutlich die Spiegel von Kontrastmittel, welche innerhalb der verschiedenen Strukturen (d. h. Leber, Blut) vorhanden sind. Die derzeitige Kenntnis im Fachgebiet besteht darin, daß alle 30 HU ungefähr 1 mg/g Iod oder noch besser genährt 2 mg Kontrastmittel/g Gewebe entsprechen. Somit werden Kontrastmittelspiegel bis zu 8 bis 10 mg/g Gewebe in den oben stehenden Dosierungs-Zeitplänen erzielt.
  • Diese Liposomen können gefriergetrocknet und bei 5°C bis zur Verwendung aufbewahrt werden. Bei Rekonstitution mit Wasser zur Injektion werden diese Liposomen ohne weiteres resuspendiert, wobei Luftblasen innerhalb der Liposomen-Pools eingeschlossen werden. Bei Bestrahlung mit Ultraschall werden diese Blasen einen Sonolumineszenzeffekt hervorrufen.
  • Beispiel 13
  • Herstellung einer stabilen Emulsion von Perfluorbutan, einem Gasblasenvorläufer
  • Perfluorbutan ist sehr wasserunlöslich, aber in Sesamöl, einem gutbekannten Öl für parenterale Öl-in-Wasser-Emulsionen (z. B. Intralipid, Liposyn, etc.), löslich. Somit wurde eine Emulsion von Perfluorbutan wie folgend hergestellt: Eine gesättigte Lösung von Perfluorbutan in Sesamöl wurde hergestellt durch sanftes Umdrehen des Behälters während eines Wochenendes (ungefähr 72 Stunden). Die Öl-Lösung wurde dann durch einen 5-Mikrometer-Spritzenfilter filtriert, gefolgt von einem 0,8-Mikrometer-Filter, um jedwede unerwünschten festen Teilchen zu entfernen. Die resultierende gesättigte Lösung wurde dann in Wasser bei einem Verhältnis von 10% "Öl" zu 90% wäßriger Tensidlösung (d. h. Lecithin oder Lecithin + P79) unter Verwendung von Ultraschallenergie, gefolgt von Mikrofluidisierung bei ungefähr 14000 PSI, emulgiert, bis eine konstante Tröpfchengröße erzielt wurde. Die Tröpfchengröße wurde durch Lichtstreuung unter Verwendung einer Horiba 910-Lichtstreuungs Vorrichtung und eines Volumengewichteten Durchschnitts gemessen.
  • P79, beschrieben in Beispiel 2k von PCT/GB 95/02109, ist ein PEG-Doppelester mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 und der Formel CH3(CH2)13COO(CH2)15COO-((CH2)2O)11CH3. P79 ist ein polymeres Tensid, welches in großem Maße zu der Fähigkeit beizutragen scheint, ein kleines Emulsionströpfchen von Sesamöl, gesättigt mit Perfluorbutan, herzustellen. Die resultierende Emulsion ist bei Lagerung bei Raumtemperatur stabil.
  • Es wird erwartet, daß bei Injektion in den Körper, das Perfluorkohlenstoffgas oberhalb der Verdampfungstemperatur vorliegen wird und daher Gasblasen innerhalb der Öltröpfchen innerhalb des Gefäßsystems bilden wird. Diese Gasblasen werden fähig zur Sonolumineszenz nach Ultraschallbestrahlung an verschiedenen Stellen innerhalb des Körpers sein, abhängig vom Oberflächencharakter der Öltröpfchen. Mit der Zugabe von P79 werden diese Tröpfchen eine gewisse Zeit lang zirkulieren, wodurch eine Sonolumineszenz aus dem Gefäßsystem gestattet wird, welches mit dem Ultraschallsignal bestrahlt wird. Andere Emulsionströpfchen können verschiedene Körpergewebe anzielen, wie die Leber, die Milz, das Gehirn etc. Die Bestrahlung von spezifischen Geweben mit Ultraschall kann den sonolumineszenten Effekt in geeigneter Weise gewähren.
  • Beispiel 14
  • Sonolumineszenz aus Luftblasen welche in einem porösen festen Partikel eingeschlossen sind
  • Teilchen von porösen, festen iodierten Röntgenkontrastmitteln, wie offenbart in US 5 741 522 (Violante et al., 21. April 1998) werden ebenfalls nützlich für Sonolumineszenz sein, wenn sie das Gas eine gewisse Zeit lang nach der Injektion innerhalb der Poren beibehalten. Somit wird es beabsichtigt, daß diese Teilchen hergestellt, gefriergetrocknet, rekonstituiert und in den Körper injiziert werden können, um Teilchen innerhalb des Gefäßsystems zu ergeben, oder auf ein spezifisches Gewebe zielgelenkt werden können, welches bei Bestrahlung mit Ultraschall den sonolumineszenten Effekt gewähren wird. Dieses Material könnte auch in der akustooptischen Bilderzeugung verwendet werden.
  • Beispiel 15
  • Gasgefüllte Mikroteilchen (A)
  • Eine Mikroblasensuspension, gefüllt mit einer Mischung aus 90% Stickstoff und 10% Xenon, mit einer Teilchengröße von 1 bis 12 μm kann mit Ölsäure und humanem Serumalbumin als dem Mikroblasen-Hüllenmaterial hergestellt werden.
  • Eine 216 ml große Probe einer 0,5%igen wäßrigen Lösung von Natriumoleat wird so mit 0,1 N HCl titriert, daß der letztendliche pH-Wert im Bereich von 3,9 bis 4,0 liegt. Die Lösung wird aufgrund der Bildung einer Ölsäure-Suspension sehr turbid bzw. trübe. Die Teilchengröße, wie gemessen durch optische Mikroskopie, wird im 0,1 μm-Bereich liegen.
  • Die Suspension wird unter Druck gesetzt, um die Löslichkeit des Gases in der Ölsäure-Suspension zu erhöhen. Die Suspension wird in einen 500 ml großen Rührautoklaven (Zipperclave, hergestellt von Autoclave Engineers, Inc.), ausgestattet mit einem 6-Blatt-Turbinen-Typ-Impeller (Dispersimax), gegeben. Das Gefäß wird verschlossen und mit der Stickstoff/Xenon-Gasmischung auf 1000 psig gebracht. Die Suspensionen werden eine Stunde lang bei Raumtemperatur (23–25°C) bei 1000 U/min gerührt. Das Bewegen wird eingestellt, das Gefäß wird entlüftet und die Suspension wird 30 Minuten vor der Verwendung stehengelassen.
  • Eine Lösung von 2 g humanem Serumalbumin (HSA) in 6 g Wasser wird zu 28 g Wasser und 20 g der obenstehend beschriebenen Emulsion zugesetzt. Die turbide Lösung wird auf 65°C erwärmt, während Sauerstoffgas eingeblasen wird. Die Lösung wird dann mit einem Omni-Rührer (Homogenisator) 5 Minuten lang im mittleren Einstellbereich gerührt. Die schaumige Mischung wird in einen Trenntrichter gegossen und 30 Minuten lang stehengelassen. Die Flüssigkeit wird vom Boden entfernt, und 10 ml frische 1%ige HSA-Lösung wird dem Schaum zugesetzt. Nach 30 Minuten wird die Flüssigkeit entfernt, und 10 ml frische 5%ige HSA-Lösung wird so zugesetzt, daß der Schaum in die Lösung resuspendiert wird. Die Flüssigkeit wird rasch vom Boden abgesammelt.
  • Beispiel 16
  • Gasgefüllte Mikroteilchen (B)
  • Eingekapselte Gas-Mikrokügelchen können hergestellt werden gemäß der WO-A-95/01187 durch Mischen einer wäßrigen Lösung von humanem Serumalbumin mit einer Gasmischung aus 90% Stickstoff und 10% Xenon.
  • Die empfohlene Dosis für die Bilderzeugung beträgt 10 bis 200 μl/kg der Flüssigkeit für resuspendierte Teilchen.
  • Beispiel 17
  • Sonolumineszenz-Bilderzeugung
  • Die Sonolumineszenz in der Flanke einer Laborratte wird auf die Weise von Leighton et al. (Ultrasonics, 1990, 28, 181) mit einem rotempfindlichen Photomultiplier-Rohr (EMI 9658R), welches bei 20°C betrieben wird, um das Rauschen zu verringern, detektiert. Die Ausgabe aus dem Photomultiplier wird durch ein 5Cl-Photonen-Zählsystem und einen 5C14-Pulshöhen-Analysator (EG & G Brookdeal Electronics Ltd.) quantifiziert. Ein Strahl von einer kontinuierlichen 1 MHz-Ultraschallwelle wird bei Leistungen von bis zu 2 W/cm durch eine Ultraschallquelle Therasonic 1030 (Electro Medical Supplies) erzeugt.
  • Die Sonolumineszenz wird vor der intravenösen Injektion von Kontrastmittel gemessen, um eine experimentelle Grundlinie vorzusehen. Das Kontrastmittel wird dann in die Schwanzvene der Ratte injiziert, und die Sonolumineszenz wird innerhalb von 10 Minuten nach der Injektion erneut gemessen. Die Herstellung von geeigneten Kontrastmitteln für Sonolumineszenz-Bilderzeugung wird in den obenstehenden Beispielen 1, 2, 4–7 und 11–16 beschrieben. Andere zur Verwendung in Sonolumineszenz geeignete Kontrastmittel werden in den Beispielen 5–7 unserer gleichzeitig anhängigen PCT-Patentanmeldung Nr. PCT/GB 98/01245 mit dem Titel "Method of Demarating Tissue", eingereicht am 29. April 1988, mit der Veröffentlichungs-Nr. WO 98/48845, beschrieben.
  • Beispiel 18
  • Akusto-optische Bildgewinnung
  • Die akusto-optische Bilderzeugung von in Nacktmäusen implantierten Tumoren erfolgt durch die Vorgehensweise von Mark et al. (SPIE, Bd. 1888, S. 500). Eine geeignete Zellinie ist HT 29. Die implantierten Tumoren werden etwa 4 Wochen lang vor der Untersuchung wachsen gelassen.
  • Ein VIS-NIR-Modell 260-Leitwellen-Spektrophotometer mit Fernablesung wird in Verbindung mit einer 7 : 7-Faserbündel-Reflexionssonde in den optischen Untersuchungen der Tumoren eingesetzt. Die Reflexionsspektren werden über den Wellenlängenbereich von 350–1000 nm in 1 nm-Schritten aufgezeichnet. Die Reflexionssonde führt ca. 9 mW weißes Licht durch sieben Fasern an die Tumoren zu. Das reflektierte Licht wird mit sieben weiteren Fasern aufgefangen und wird durch einen Monochromator mit einem 0,5-mm-Schlitz zu einem Silicium-Detektor geleitet. Der Durchmesser des Faserbündels sollte 2 m oder weniger sein.
  • Die optische Reflexion wird gemessen durch Pressen der Sonde gegen die Tumoren mit einem festen Druck. Eine Grundlinienmessung wird vor der Injektion von Kontrastmittel durch geführt. Dann wird das Mittel in eine Schwanzvene injiziert und das Signal wird erneut aufgezeichnet. Das Signal wird bis zu zwei Stunden lang im Anschluß an die Injektion überwacht. Die Herstellung von geeigneten Kontrastmitteln zur akusto-optischen Bilderzeugung wird in den obenstehenden Beispielen 1–10 und 14–16 beschrieben. Andere zur Verwendung in der akustooptischen Bilderzeugung geeignete Kontrastmittel werden in den Beispielen 1–4, 9–23, 26–34, 36–41, 43 und 44 unserer gleichzeitig anhängigen PCT-Patentanmeldung Nr. PCT/GB 98/01245 mit dem Titel "Method of Demarcating Tissue", eingereicht am 29. April 1998, mit der Veröffentlichungs-Nr. WO 98/48845, beschrieben.

Claims (6)

  1. Verfahren zum Erzeugen von Informationen aus einem lebenden menschlichen oder nichtmenschlichen tierischen Körper, welchem vorausgehend ein physiologisch annehmbares Material zugeführt worden ist, das zum Absorbieren, Streuen oder Emittieren von Licht bei einer Wellenlänge im Bereich von 300 bis 1.300 nm fähig ist, wobei das Verfahren umfasst: – Aussetzen mindestens eines Teils des Körpers einer Ultraschallbestrahlung; – falls genanntes Material nicht sonolumineszent ist, Aussetzen mindestens des Teils des Körpers Licht im Wellenlängenbereich von 300 bis 1.300 nm; – Detektieren von Licht im Wellenlängenbereich von 300 bis 1.300 nm, ausgehend von dem Teil des Körpers; und – Manipulieren des detektierten Lichtes, um genannte Informationen zu erzeugen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Wellenlänge des Lichts im Bereich 600 bis 1.300 nm liegt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das physiologisch annehmbare Material ein löslicher Farbstoff ist, eingeschlossen in ein Liposom, wobei die Liposomen unter dem Einfluss des Ultraschalls zerbrechen und sich neu bilden, sodass Farbstoff selektiv an genanntem Teil des Körpers freigesetzt wird.
  4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das physiologisch annehmbare Material ein Vorläufer eines farbigen freien Radikals ist, wobei dieser Vorläufer fähig ist, mit irgendeinem freien Radikal, welches unter dem Einfluss des Ultraschalls erzeugt wird, zu kombinieren, um optisch detektierbare Marker an genanntem Teil des Körpers zu erzeugen.
  5. Verwendung eines physiologisch annehmbaren Materials, das zum Absorbieren, Streuen oder Emittieren von Licht bei einer Wellenlänge im Bereich von 600 bis 1.300 nm fähig ist, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verabreichung an den menschlichen oder tierischen Körper in einem darauf basierenden Diagnoseverfahren welches beinhaltet: – Aussetzen eines Teils des Körpers einer Ultraschallbestrahlung; – falls genanntes Material nicht sonolumineszent ist, Aussetzen mindestens des Teils des Körpers Licht im Wellenlängenbereich von 300 bis 1.300 nm; – Detektieren von Licht im Wellenlängenbereich von 300 bis 1.300 nm, ausgehend von genanntem Teil; und – Manipulieren des detektierten Lichtes, um räumliche und/oder funktionelle Informationen im Bezug auf den Teil vorzusehen.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Wellenlänge des Lichts im Bereich von 600 bis 1.300 nm liegt.
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