DE69738416T2

DE69738416T2 - Liposomale zubereitungen von indolocarbazol-derivaten

Info

Publication number: DE69738416T2
Application number: DE69738416T
Authority: DE
Inventors: Yasuki Sunto-gun KATO; Masahiro Sunto-gun YAMAUCHI; Kunio Sunto-gun ITO
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1996-06-18
Filing date: 1997-06-12
Publication date: 2008-12-11
Anticipated expiration: 2017-06-13
Also published as: US6045822A; WO1997048398A1; DK0850646T3; CA2229892A1; ATE381932T1; EP0850646A1; EP0850646B1; CA2229892C; ES2296311T3; AU718856B2; EP0850646A4; DE69738416D1; PT850646E; AU3106697A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Liposomenpräparat, das ein medizinisch nützliches Indolocarbazolderivat enthält.
ZUGRUNDELIEGENDE TECHNIK
Es ist bekannt, dass UCN-01 Proteinkinase C hemmende Wirksamkeit [J. Antibiotics, 40, 1782 (1987)] und tumorhemmende Wirksamkeit besitzt [Cancer Res., 51, 4888 (1991)]. Ferner wird in WO 89/07105 offenbart, dass das UCN-01-Derivat eine das Zellwachstum hemmende Wirksamkeit besitzt.
Wenn UCN-01 oder sein Derivat in vivo, insbesondere in Blutgefäße verabreicht wird, könnte unmöglich verhindert werden, dass UCN-01 oder sein Derivat mit Gefäßzellen und auch mit verschiedenen anderen normalen Zellen in Kontakt kommt. Weil das UCN-01-Derivat eine das Zellwachstum hemmende Wirksamkeit besitzt, kann der Kontakt von UCN-01 oder seinem Derivat mit normalen Zellen bestimmte nachteilige Wirkungen auf normale Zellen verursachen.
Wenn UCN-01 oder sein Derivat als solches in Blutgefäße verabreicht wird, kann die Verbindung im Blut abgebaut werden oder sich in anderen inneren Organen als dem Ziel ansammeln und sammelt sich so nicht unbedingt in Tumoren in wirksamer Weise an.
Es besteht ein Bedarf an einem UCN-01 oder sein Derivat enthaltenden Präparat, das in Blut stabilisiert wird und sich in hohen Konzentrationen in Tumoren ansammelt, ohne irgendeine Wirkung auf normale Zellen auszuüben.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Liposomenpräparat, das dadurch gekennzeichnet ist, dass Indolocarbazolderivate, die durch Formel (I) repräsentiert werden:
(worin R Wasserstoff oder niederes Alkyl repräsentiert) in ein Lipide umfassendes Liposom eingekapselt sind.
Nachfolgend wird die durch Formel (I) repräsentierte Verbindung als Verbindung (I) bezeichnet.
In der Definition für die Formel von Verbindung (I) bezeichnet das niedere Alkyl geradkettiges oder verzweigtkettiges C₁-C₆-Alkyl, zum Beispiel Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Hexyl, etc.
Die durch Formel (I) repräsentierten Indolocarbazolderivate können nach dem in der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 220,196/87 oder in WO 89/07105 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Spezielle Beispiele für solche Verbindungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1: Beispiele für Verbindungen, die durch Formel (I) repräsentiert werden

R Molekulargewicht: MS (m/z)

H 483 (M+1)⁺

CH₃ 497 (M+1)⁺

C₂H₅ 510 (M)⁺

i-C₃H₇ 524 (M)⁺

n-C₄H₉ 538 (M)⁺
Als Lipide zur Herstellung von Liposomen werden Phospholipide, Glyceringlycolipide und Sphingoglycolipide genannt, wovon Phospholipide bevorzugt verwendet werden. Beispiele für solche Phospholipide sind natürliche oder synthetische Phospholipide wie zum Beispiel Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidsäure, Phosphatidylglycerol, Phosphatidylinositol, Lysophosphatidylcholin, Sphingomyelin, Eigelblecithin und Sojalecithin sowie hydrierte Phospholipide etc.
Zu den Glyceringlycolipiden gehören Sulfoxyribosyldiglycerid, Diglycosyldiglycerid, Digalactosyldiglycerid, Galactosyldiglycerid, Glycosyldiglycerid, etc.
Zu den Sphingoglycolipiden gehören Galactosylcerebrosid, Lactosylcerebrosid, Gangliosid etc. Diese werden einzeln oder in Kombination verwendet. Gegebenenfalls können Sterole wie Cholesterol als Membranstabilisator, Tocopherol, etc. als Antioxidans, Stearylamin, Dicetylphosphat, Gangliosid, etc. als geladene Substanzen zusätzlich zu der Lipidkomponente verwendet werden.
Die Modifikation der Oberflächen von Liposomen mit einem nichtionischen Tensid, kationischen Tensid, anionischen Tensid, Polysacchariden und Derivaten davon, Polyoxyethylenderivaten etc. kann nach Belieben durchgeführt werden. Die weitere Modifikation der Oberflächen von Liposomen mit Antikörpern, Proteinen, Peptiden, aliphatischen Säuren etc. kann zum Zwecke des Targeting erfolgen. Die zum Suspendieren von Liposomen verwendete Lösung kann neben Wasser eine Säure, ein Alkali, verschiedene Puffer, physiologische Kochsalzlösung, Aminosäureinfusionen etc. sein. Ferner können auch noch Antioxidantien wie Zitronensäure, Ascorbinsäure, Cystein, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) etc. zugesetzt werden. Weiterhin können auch noch Konservierungsmittel wie Paraben, Chlorbutanol, Benzylalkohol, Propylenglycol etc. zugesetzt werden. Außerdem können auch noch Glycerin, Glucose, Natriumchlorid etc. als Mittel zum Isotonischmachen der Lösung zugesetzt werden.
Zur Herstellung des Liposomenpräparats der vorliegenden Erfindung kann ein Verfahren zur Herstellung eines bekannten Liposomenpräparats verwendet werden. Das bekannte Verfahren zur Herstellung eines Liposomenpräparats umfasst das Liposomenherstellungsverfahren von Bangham et al. (J. Mol. Biol., 13, 238 (1965)), das Ethanolinjektionsverfahren (J. Cell. Biol., 66, 621 (1975)), das French-press-Verfahren (FEBS Lett., 99, 210 (1979)), das Frier- und Tauverfahren (Arch. Biochem. Biophys., 212, 186 (1981)), das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 75, 4194 (1978)), und das pH-Gradientenverfahren (Biochem. Biophys. Acta, 816, 294 (1985); Japanische Offenlegungsschrift Nr. 165,560/95 ).
Unter diesen Verfahren hat das pH-Gradientenverfahren eine große Zahl von Vorteilen, wie zum Beispiel einen hohen Wirkungsgrad der Verkapselung von Verbindung (I) in dem Liposom, die einheitliche Größe der resultierenden Liposomen, eine geringere Menge an verbleibendem organischem Lösungsmittel in der Liposomensuspension. Das Verfahren zur Herstellung des Liposomenpräparats der vorliegenden Erfindung mit Hilfe des pH-Gradientenverfahrens wird wie folgt durchgeführt: Zum Beispiel werden die Lipide in einem Lösungsmittel wie zum Beispiel Ether, Ethanol etc. gelöst und dann in einen Rundkolben gegeben, und das Lösungsmittel wird zu einem Lipidfilm verdampft. Dann wird ein saurer Puffer zu dem Film gegeben und anschließend geschüttelt und gerührt, um größere multilamellare Liposomen zu bilden. Die Liposomenpartikel werden nach dem Extrusionsverfahren etc. hergestellt, so dass ihr durchschnittlicher Teilchendurchmesser z. B. etwa 100 nm beträgt. Nach Zugabe einer schwach sauren Lösung von Verbindung (I) zu dieser Liposomensuspension wird ein geeigneter Puffer zugesetzt, so dass der pH-Wert der Liposomensuspension auf etwa Neutralität angehoben wird (der Unterschied zwischen den pH-Werten der Liposomensuspension vor und nach dem Anstieg des pH-Werts beträgt vorzugsweise 3 oder mehr). Durch die obige Vorgehensweise kann Verbindung (I) in das Innere der Liposomen eingekapselt werden.
Alternativ können Liposomen auch gebildet werden durch Lösen von Verbindung (I) und der Lipidkomponente in einem organischen Lösungsmittel wie zum Beispiel Ethanol etc., dann Abdampfen des Lösungsmittels und Zugabe von physiologischer Kochsalzlösung und anschließendes Schütteln und Rühren.
Das zum Beispiel nach den oben beschriebenen Verfahren erhaltene Liposomenpräparat der vorliegenden Erfindung kann als solches verwendet werden, kann aber auch nach Zugabe von Füllstoffen wie Mannitol, Lactose, Glycin etc. je nach dem Gebrauchsgegenstand, den Lagerungsbedingungen etc. lyophilisiert werden. Schützende Stabilisatoren wie Glycerin etc. können vor dem Lyophilisieren ebenfalls noch zugesetzt werden.
Das Liposomenpräparat der vorliegenden Erfindung wird allgemein als Injektion verwendet, kann aber auch als orale Darreichungsform, nasale Darreichungsform, Augentropfen, perkutane Darreichungsform, Zäpfchen, Inhalation etc. verwendet werden, indem das Präparat in diesen Formen hergestellt wird.
Nachfolgend sind die Beispiele und Testbeispiele der vorliegenden Erfindung dargestellt.
Aufgabe des Liposomenpräparats der vorliegenden Erfindung ist es, Verbindung (I) im Blut zu stabilisieren und seine Ansammlung in Tumoren zu erhöhen.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Beispiel 1
0,7 g Phosphatidylcholin wurden in 5 ml Ether gelöst, und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft, um einen Lipidfilm zu bilden. Dann wurden 10 ml von 20 mM Citratpuffer, pH 2,5, zugesetzt und mit einem Wirbelmischer geschüttelt und gerührt. Ferner wurde diese Suspension 5-mal durch ein Polycarbonat-Membranfilter von 0,4 μm geleitet. Das Filtrat wurde ferner 10-mal durch ein Polycarbonat-Membranfilter von 0,1 μm geleitet. Ein 20 mM Citratpuffer, pH 2,5, wurde zugesetzt, um eine Liposomensuspension herzustellen, die 50 mg/ml Phosphatidylcholin enthält. Getrennt wurden dann 200 mg Lactose, 56 mg Na₂HPO₄·12 H₂O und 12 mg wässrige Zitronensäure zu 10 mg UCN-01 gegeben, und die Mischung wurde in destilliertem Wasser gelöst, um 10 ml Lösung zu erhalten, die dann in ein Glasfläschchen geleitet und lyophilisiert wurde. Nach dem Lyophilisieren wurde das Glasfläschchen unter einem Stickstoffstrom wieder auf Normaldruck gebracht und verschlossen, um darin ein lyophilisiertes Produkt von UCN-01 zu erhalten. Diesem lyophilisierten Produkt wurden 2 ml der zuvor hergestellten Liposomensuspension zugesetzt. Ferner wurden 8 ml von 200 mM Na₂HPO₄-Lösung (Dinatriumphosphat) zugesetzt, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 2
Eine Liposomensuspension wurde in gleicher Weise hergestellt wie in Beispiel 1, außer dass die Konzentration von Phosphatidylcholin durch Andern der Menge von 20 mM Citratpuffer, pH 2,5, auf 40 mg/ml eingestellt wurde. Getrennt wurden dann 200 mg Lactose, 56 mg Na₂HPO₄·12 H₂O und 12 mg wässrige Zitronensäure zu 10 mg UCN-01 gegeben, und in gleicher Weise wie in Beispiel 1 wurde ein lyophilisiertes Produkt hergestellt. Diesem lyophilisierten Produkt wurden 2 ml der zuvor hergestellten Liposomensuspension zugesetzt. Ferner wurden 8 ml von 200 mM Na₂HPO₄-Lösung zugesetzt, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 3
Eine Liposomensuspension wurde in gleicher Weise hergestellt wie in Beispiel 1, außer dass die Konzentration von Phosphatidylcholin durch Ändern der Menge von 20 mM Citratpuffer, pH 2,5, auf 30 mg/ml eingestellt wurde. Getrennt wurden dann 200 mg Lactose, 56 mg Na₂HPO₄·12 H₂O und 12 mg wässrige Zitronensäure zu 10 mg UCN-01 gegeben, und in gleicher Weise wie in Beispiel 1 wurde ein lyophilisiertes Produkt hergestellt. Diesem lyophilisierten Produkt wurden 2 ml der zuvor hergestellten Liposomensuspension zugesetzt. Ferner wurden 8 ml von 200 mM Na₂HPO₄-Lösung zugesetzt, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 4
Eine Liposomensuspension wurde in gleicher Weise hergestellt wie in Beispiel 1, außer dass die Konzentration von Phosphatidylcholin durch Ändern der Menge von 20 mM Citratpuffer, pH 2,5, auf 25 mg/ml eingestellt wurde. Getrennt wurden dann 200 mg Lactose, 56 mg Na₂HPO₄·12 H₂O und 12 mg wässrige Zitronensäure zu 10 mg UCN-01 gegeben, und in gleicher Weise wie in Beispiel 1 wurde ein lyophilisiertes Produkt hergestellt. Diesem lyophilisierten Produkt wurden 2 ml der zuvor hergestellten Liposomensuspension zugesetzt. Ferner wurden 8 ml von 200 mM Na₂HPO₄-Lösung zugesetzt, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 5
Eine Liposomensuspension wurde in gleicher Weise hergestellt wie in Beispiel 1, außer dass die Konzentration von Phosphatidylcholin durch Ändern der Menge von 20 mM Citratpuffer, pH 2,5, auf 25 mg/ml eingestellt wurde. 5 mg UCN-01 wurden gelöst durch Zugabe von 2 ml der hergestellten Liposomensuspension.
Ferner wurden 3 ml von 200 mM Na₂HPO₄-Lösung zugesetzt, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 6
Eine Liposomensuspension wurde in gleicher Weise hergestellt wie in Beispiel 1, außer dass die Konzentration von Phosphatidylcholin durch Ändern der Menge von 20 mM Citratpuffer, pH 2,5, auf 20 mg/ml eingestellt wurde. 5 mg UCN-01 wurden gelöst durch Zugabe von 2 ml der hergestellten Liposomensuspension. Ferner wurden 3 ml von 200 mM Na₂HPO₄-Lösung zugesetzt, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 7
Eine Liposomensuspension wurde in gleicher Weise hergestellt wie in Beispiel 1, außer dass die Konzentration von Phosphatidylcholin durch Ändern der Menge von 20 mM Citratpuffer, pH 2,5, auf 15 mg/ml eingestellt wurde. 5 mg UCN-01 wurden gelöst durch Zugabe von 2 ml der hergestellten Liposomensuspension. Ferner wurden 3 ml von 200 mM Na₂HPO₄-Lösung zugesetzt, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 8
Eine Liposomensuspension wurde in gleicher Weise hergestellt wie in Beispiel 1, außer dass die Konzentration von Phosphatidylcholin durch Ändern der Menge von 20 mM Citratpuffer, pH 2,5, auf 12,5 mg/ml eingestellt wurde. 5 mg UCN-01 wurden gelöst durch Zugabe von 2 ml der hergestellten Liposomensuspension. Ferner wurden 3 ml von 200 mM Na₂HPO₄-Lösung zugesetzt, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 9
5 mg UCN-01 und 100 mg Phosphatidylcholin wurden in 15 ml Ethanol gelöst. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft, wodurch ein Lipidfilm gebildet wurde. 1 ml von 5%iger Glucose wurden zugesetzt und mit einem Wirbelmischer geschüttelt und gerührt. Diese Liposomensuspension wurde 5-mal durch ein Polycarbonat-Membranfilter von 0,4 μm geleitet. Ferner wurde das Filtrat 10-mal durch ein Polycarbonat-Membranfilter von 0,1 μm geleitet, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Testbeispiel 1
Jedes der in Beispiel 1–8 hergestellten, UCN-01 verkapselnden Liposomen wurde durch ein Membranfilter von 0,45 μm gefiltert, um unlösliche Stoffe etc. zu entfernen. Im Falle der Liposomen von Beispiel 1 bis 4 wurde 1 ml Puffer aus 200 mM Dinatriumphosphat und 20 mM Citrat, pH 7,4, zugesetzt, und die Mischung wurde mit 1 ml Liposomensuspension gemischt. Diese Liposomen wurden bei 10°C ultrazentrifugiert (110.000 × g, 1 Stunde). Das Phospholipid vor und nach Filtration und das Phospholipid in dem Überstand nach Ultrazentrifugation wurden unter Verwendung von Determiner PL (Kyowa Medex Co., Ltd.) nach dem Enzymverfahren [Practical Clinical Chemistry (erweiterte Ausgabe), 580 (1982)] quantifiziert. Außerdem wurden UCN-01 vor und nach Filtration sowie UCN-01 in dem Überstand nach Ultrazentrifugation durch Hochleistungsflüssigchromatographie quantifiziert. Der Verkapselungswirkungsgrad wurde nach der folgenden Formel berechnet. Verkapselungswirkungsgrad (%) = [(A – B)/(C – D)]/(E/F) × 100

A:: Konzentration von UCN-01 in dem Filtrat nach Filtration (mg/ml)
B:: Konzentration von UCN-01 in dem Überstand nach Ultrazentrifugation (mg/ml)
C:: Konzentration des Phospholipids in dem Filtrat nach Filtration (mg/ml)
D:: Konzentration des Phospholipids in dem ultrazentrifugierten Überstand (mg/ml)
E:: Konzentration von UCN-01 in der Suspension vor Filtration (mg/ml)
F:: Konzentration des Phospholipids in der Suspension vor Filtration (mg/ml)

Analysebedinungen für Hochleistungsflüssigchromatographie

Säule: Kapselfüllung PAK C18 UG120 (Shiseid Co., Ltd.) S-5, 4,6 mm × 250 mm
Mobile Phase: 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 9,0:Acetonitril:Tetrahydrofuran = 60:22:18 (Volumenteile).
Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min
Säulentemperatur: 25°C
Erfassungswellenlänge: 285 nm

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: Verkapselungswirkungsgrad von UCN-01

Probe Verkapselungswirkungsgrad von UCN-01 (%)

Beispiel 1 108,3

Beispiel 2 98,1

Beispiel 3 81,8

Beispiel 4 68,4

Beispiel 5 101,6

Beispiel 6 91,8

Beispiel 7 78,7

Beispiel 8 56,8
Testbeispiel 2
Um den Austritt von UCN-01 aus Liposomen zu ermitteln, wurde eine in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellte, UCN-01 verkapselnde Liposomensuspension in ein Fläschchen geleitet und mit einem Gummistopfen verschlossen. Die erhaltenen Proben wurden bei verschiedenen Temperaturen von 5°C, 25°C bzw. 37°C gelagert, und die zeitliche Änderung des Verkapselungswirkungsgrads von UCN-01 wurde ermittelt. Das Verfahren zur Ermittlung des Verkapselungswirkungsgrads wurde in gleicher Weise wie in Testbeispiel 1 durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3: Zeitliche Änderung des Verkapselungswirkungsgrads beim Einschluss von UCN-01

Zeit Verkapselungswirkungsgrad (%)

5°C 25°C 37°C

0 108,2 108,2 108,2

1 93,0 99,3 102,8

3 114,9 96,2 101,5

6 99,2 95,1 100,8

24 93,2 96,5 88,6
Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, haben die Liposomenpräparate der vorliegenden Erfindung einen hohen Wirkungsgrad der Verkapselung von UCN-01. Außerdem geht aus Tabelle 3 hervor, dass die Liposomenpräparate der vorliegenden Erfindung stabile Liposomenpräparate mit weniger Austritt von UCN-01 sind.
Beispiel 10
1 g Phosphatidylcholin wurde in 5 ml Ether gelöst, und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft, um einen Lipidfilm zu bilden. 10 ml von 20 mM Citratpuffer, pH 4,0, wurden zugesetzt und mit einem Wirbelmischer geschüttelt und gerührt. Ferner wurde diese Suspension 5-mal durch ein Polycarbonat-Membranfilter von 0,4 μm geleitet. Ferner wurde das Filtrat 10-mal durch ein Polycarbonat-Membranfilter von 0,1 μm geleitet. Ein 20 mM Citratpuffer, pH 4,0, wurde zugesetzt, um eine Liposomensuspension herzustellen, die 50 mg/ml Phosphatidylcholin enthält. Getrennt wurden 200 mg Lactose, 56 mg Na₂HPO₄·12 H₂O und 12 mg wässrige Zitronensäure zu 10 mg UCN-01 gegeben, und sein lyophilisiertes Produkt wurde in der gleichen Weise hergestellt wie in Beispiel 1. Diesem lyophilisierten Produkt wurden 2 ml der zuvor hergestellten Liposomensuspension zugesetzt. Ferner wurden 8 ml von 28,2 mM wässrigem Natriumhydroxid zugesetzt, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen eingeschlossen wurde.
Beispiel 11
UCN-01 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 10 in Liposomen verkapselt, außer dass 1,2 g Phosphatidylcholin und 0,3 g Cholesterol als Ausgangsmaterialien des Lipidfilms verwendet wurden.
Beispiel 12
UCN-01 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 10 in Liposomen verkapselt, außer dass 1,2 g Phosphatidylcholin, 0,4 g Cholesterol und 0,4 g PEG-DSPE (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[poly-(ethylenglycol)2000], ein Produkt von Avanti Polar Lipids Inc.)) als Ausgangsmaterialien des Lipidfilms verwendet wurden.
Beispiel 13
Eine Liposomensuspension wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 10 hergestellt, außer dass die Konzentration von Phosphatidylcholin in der Liposomensuspension durch Ändern der Menge von 20 mM Citratpuffer, pH 4,0, auf 35 mg/ml eingestellt wurde. Getrennt wurde ein lyophilisiertes Produkt von UCN-01 in gleicher Weise wie in Beispiel 10 hergestellt. Diesem lyophilisierten Produkt wurde die zuvor hergestellte Liposomensuspension zugesetzt, so dass UCN-01 auf 0,5 mg/ml eingestellt wurde. 8 ml von 10,4 mM wässrigem Natriumhydroxid wurden zu 2 ml dieser Lösung gegeben, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 14
Eine Liposomensuspension und ein lyophilisiertes Produkt von UCN-01 wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 13 hergestellt. Die Liposomensuspension wurde diesem lyophilisierten Produkt zugesetzt, um UCN-01 auf 0,05 mg/ml einzustellen. 8 ml von 9,0 mM wässrigem Natriumhydroxid wurden zu 2 ml dieser Lösung gegeben, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 15
Eine Liposomensuspension und ein lyophilisiertes Produkt von UCN-01 wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 13 hergestellt. Die Liposomensuspension wurde diesem lyophilisierten Produkt zugesetzt, um UCN-01 auf 0,005 mg/ml einzustellen. 8 ml von 9,0 mM wässrigem Natriumhydroxid wurden zu 2 ml dieser Lösung gegeben, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 16
UCN-01 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 13 in Liposomen verkapselt, außer dass ein Polycarbonat-Membranfilter von 0,2 μm anstelle des Polycarbonat-Membranfilters von 0,1 μm verwendet wurde, um eine Liposomensuspension herzustellen.
Beispiel 17
Eine Liposomensuspension und ein lyophilisiertes Produkt von UCN-01 wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 16 hergestellt. Die Liposomensuspension wurde diesem lyophilisierten Produkt zugesetzt, um UCN-01 auf 0,05 mg/ml einzustellen. 8 ml von 9,0 mM wässrigem Natriumhydroxid wurden zu 2 ml dieser Lösung gegeben, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 18
Eine Liposomensuspension und ein lyophilisiertes Produkt von UCN-01 wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 16 hergestellt. Die Liposomensuspension wurde diesem lyophilisierten Produkt zugesetzt, um UCN-01 auf 0,005 mg/ml einzustellen. 8 ml von 9,0 mM wässrigem Natriumhydroxid wurden zu 2 ml dieser Lösung gegeben, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 19
0,9 g Phosphatidylcholin und 0,1 g Phosphatidylethanolamin wurden in 5 ml Chloroform verdampft und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abdestilliert, wodurch ein Lipidfilm gebildet wurde. 10 ml von 20 mM Citratpuffer, pH 4,0, wurden zugesetzt und mit einem Wirbelmischer geschüttelt und gerührt. Diese Suspension wurde 5-mal durch ein Polycarbonat-Membranfilter von 0,4 μm geleitet. Ferner wurde das Filtrat 10-mal durch ein Polycarbonat-Membranfilter von 0,1 μm geleitet. Ein 20 mM Citratpuffer, pH 4,0, wurde zugesetzt, um eine Liposomensuspension herzustellen, die 45 mg/ml Phosphatidylcholin enthält. Getrennt wurde ein lyophilisiertes Produkt von UCN-01 in gleicher Weise wie in Beispiel 10 hergestellt. Diesem lyophilisierten Produkt wurde die zuvor hergestellte Liposomensuspension zugesetzt, so dass UCN-01 auf 0,5 mg/ml eingestellt wurde. 8 ml von 10,4 mM wässrigem Natriumhydroxid wurden zu 2 ml dieser Lösung gegeben, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 20
Eine Liposomensuspension und ein lyophilisiertes Produkt von UCN-01 wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 19 hergestellt. Die Liposomensuspension wurde diesem lyophilisierten Produkt zugesetzt, um UCN-01 auf 0,05 mg/ml einzustellen. 8 ml von 9,0 mM wässrigem Natriumhydroxid wurden zu 2 ml dieser Lösung gegeben, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 21
Eine Liposomensuspension und ein lyophilisiertes Produkt von UCN-01 wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 19 hergestellt. Die Liposomensuspension wurde diesem lyophilisierten Produkt zugesetzt, um UCN-01 auf 0,005 mg/ml einzustellen. 8 ml von 9,0 mM Natriumhydroxid wurden zu 2 ml dieser Lösung gegeben, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 22
0,7 g Phosphatidylcholin und 0,3 g Phosphatidylglycerol wurden in 5 ml Chloroform gelöst und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft, wodurch ein Lipidfilm gebildet wurde. 10 ml von 20 mM Citratpuffer, pH 4,0, wurden zugesetzt und mit einem Wirbelmischer geschüttelt und gerührt. Diese Suspension wurde 5-mal durch ein Polycarbonat-Membranfilter von 0,4 μm geleitet. Ferner wurde das Filtrat 10-mal durch ein Polycarbonat-Membranfilter von 0,1 μm geleitet. Ein 20 mM Citratpuffer, pH 4,0, wurde zugesetzt, um eine Liposomensuspension herzustellen, die 35 mg/ml Phosphatidylcholin enthält. Getrennt wurde ein lyophilisiertes Produkt von UCN-01 in gleicher Weise wie in Beispiel 10 hergestellt. Diesem lyophilisierten Produkt wurde die zuvor hergestellte Liposomensuspension zugesetzt, so dass UCN-01 auf 0,5 mg/ml eingestellt wurde. 8 ml von 10,4 mM wässrigem Natriumhydroxid wurden zu 2 ml dieser Lösung gegeben, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 23
Eine Liposomensuspension und ein lyophilisiertes Produkt von UCN-01 wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 22 hergestellt. Die Liposomensuspension wurde diesem lyophilisierten Produkt zugesetzt, um UCN-01 auf 0,05 mg/ml einzustellen. 8 ml von 9,0 mM wässrigem Natriumhydroxid wurden zu 2 ml dieser Lösung gegeben, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 24
Eine Liposomensuspension und ein lyophilisiertes Produkt von UCN-01 wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 22 hergestellt. Die Liposomensuspension wurde diesem lyophilisierten Produkt zugesetzt, um UCN-01 auf 0,005 mg/ml einzustellen. 8 ml von 9,0 mM wässrigem Natriumhydroxid wurden zu 2 ml dieser Lösung gegeben, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 25
UCN-01 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 22 in Liposomen verkapselt, außer dass 0,7 g Phosphatidylcholin und 0,3 g Cholesterol als Ausgangsmaterialien des Lipidfilms verwendet wurden.
Beispiel 26
Eine Liposomensuspension und ein lyophilisiertes Produkt von UCN-01 wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 25 hergestellt. Die Liposomensuspension wurde diesem lyophilisierten Produkt zugesetzt, um UCN-01 auf 0,05 mg/ml einzustellen. 8 ml von 9,0 mM wässrigem Natriumhydroxid wurden zu 2 ml dieser Lösung gegeben, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Beispiel 27
Eine Liposomensuspension und ein lyophilisiertes Produkt von UCN-01 wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 25 hergestellt. Die Liposomensuspension wurde diesem lyophilisierten Produkt zugesetzt, um UCN-01 auf 0,005 mg/ml einzustellen. 8 ml von 9,0 mM wässrigem Natriumhydroxid wurden zu 2 ml dieser Lösung gegeben, um den pH-Wert auf 8,0 einzustellen, so dass UCN-01 in Liposomen verkapselt wurde.
Testbeispiel 3
Die in Beispiel 10 bis 12 hergestellten, UCN-01 verkapselnden Liposomen wurden in gleicher Weise wie in Testbeispiel 1 behandelt und der Verkapselungswirkungsgrad von UCN-01 in jedem Liposom wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4: Verkapselungswirkungsgrad von UCN-01 (%)

Probe Verkapselungswirkungsgrad von UCN-01 (%)

Beispiel 10 100,0

Beispiel 11 85,7

Beispiel 12 82,9
Testbeispiel 4
Die in Beispiel 13 bis 27 hergestellten, UCN-01 verkapselnden Liposomen wurden bei 10°C ultrazentrifugiert (110.000 × g, 2 Stunden). UCN-01 vor Ultrazentrifugation und UCN-01 im Überstand nach Ultrazentrifugation wurden durch Hochleistungsflüssigchromatographie quantifiziert. Der Verkapselungswirkungsgrad wurde durch die folgende Formel berechnet: Verkapselungswirkungsgrad von UCN-01 (%) = (B – A) × 100/B

A:: Konzentration von UCN-01 in dem ultrazentrifugierten Überstand (mg/ml)
B:: Konzentration von UCN-01 in der Suspension vor Ultrazentrifugation (mg/ml)

Analysebedingungen für Hochleistungsflüssigchromatographie

Säule: YMC AM-312, 6,00 mm Durchmesser × 150 mm Länge (hergestellt von YMC Co., Ltd.).
Mobile Phase: 0,05 M Phosphatpuffer (plus 0,1% Triethylamin), pH 7,3:Acetonitril = 1:1 (Volumenteile).
Strömungsgeschwindigkeit: 1,0 ml/min
Säulentemperatur: 25°C
Erfassung: Anregungswellenlänge 310 nm, Emissionswellenlänge 410 nm.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5: Verkapselungswirkungsgrad von UCN-01

Probe	Verkapselungswirkungsgrad von UCN-01 (%)
Beispiel 13	98,7
Beispiel 14	99,0
Beispiel 15	96,8
Beispiel 16	99,2
Beispiel 17	99,2
Beispiel 18	94,0
Beispiel 19	99,9
Beispiel 20	99,7
Beispiel 21	88,5
Beispiel 22	98,9
Beispiel 23	99,4
Beispiel 24	100,0
Beispiel 25	99,6
Beispiel 26	99,4
Beispiel 27	92,0

INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Liposomenpräparat bereitgestellt, in das ein medizinisch nützliches Indolocarbazolderivat eingeschlossen wurde.

Claims

Liposomenpräparat, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Indolcarbazolderivate, das durch Formel (I) repräsentiert sind:
(worin R Wasserstoff oder C₁-C₅-Alkyl repräsentiert) in ein oder mehrere Lipide umfassendes Liposom eingekapselt sind.
Liposomenpräparat nach Anspruch 1, wobei das eine oder mehrere Lipide Phospholipide sind.