DE69737290T2

DE69737290T2 - Substrat fangende protein tyrosin phosphatase

Info

Publication number: DE69737290T2
Application number: DE69737290T
Authority: DE
Inventors: Nicholas Huntington TONKS; J. Andrew Bothell FLINT
Original assignee: Cold Spring Harbor Laboratory
Current assignee: Cold Spring Harbor Laboratory
Priority date: 1996-07-25
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2017-07-25
Also published as: WO1998004712A2; DE69737290D1; CA2262440A1; ES2281915T3; AU728405B2; WO1998004712A3; ATE352625T1; EP0918867B1; US5912138A; US5951979A; JP2000515760A; AU5939598A; EP0918867A2

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Protein-Tyrosinphosphatase (PTP) Familie der Enzyme besteht aus mehr als 500 strukturell unterschiedlichen Proteinen, die gemeinsam die hoch konservierte, 250 Aminosäuren umfassende katalytische PTP-Domäne aufweisen, wobei jedoch beträchtliche Unterschiede in ihren nicht-katalytischen Segmenten (Charbonneau and Tonks, Annu. Rev. Cell Biol. 8 (1992), 463–493; Tonks, Semin. Cell Biol. 4 (1993), 373–453) auftreten. Diese strukturelle Vielfalt reflektiert wahrscheinlich die Vielfalt der physiologischen Aufgaben, beziehungsweise Rollen einzelner Mitglieder der PTP-Familien, von denen in bestimmten Fällen gezeigt werden konnte, dass sie beim Wachstum, der Entwicklung und der Differenzierung spezifische Funktionen aufweisen (Desai et al., Cell 84 (1996), 599–609; Kishihara et al., Cell 74 (1993), 143–156; Perkins et al., Cell 70 36 (1992), 225-2; Pingel and Thomas, Cell 58 (1989), 1055–1065; Schultz et al., Cell 73 (1993), 1445–1454).
Obwohl unlängst mit Untersuchungen weiter umfangreiche Information hinsichtlich der Struktur, Expression und Regulation von PTPs erlangt wurden, bleibt die Beschaffenheit der am Tyrosin phosphorylierten Substrate, durch welche die PTPs ihre Wirkung ausüben/ausführen, zu bestimmen. Untersuchungen mit einer begrenzten Anzahl an synthetischen Phosphopeptid-Substraten zeigten bei der Substratselektivität unterschiedlicher PTPs gewisse Unterschiede (Cho et al., Protein Sci. 2 (1993), 977–984; Dechert et al., Eur. J. Biochem. 231 (1995), 673–681), wobei sie Präferenzen für bestimmte Aminosäurereste an besonderen Positionen um den phosphorylierten Tyrosinrest zeigten (Ruzzene et al., Eur. J. Biochem. 211 (1993), 289–295; Zhang et al., Biochemistry 33 (1994), 2285–2290). Dies weist daraufhin, dass PTPs in vitro einen bestimmten Grad an Substratselektivität zeigen, obwohl die physiologische Relevanz der verwendeten Substrate in diesen Untersuchungen unklar ist.
In Protein Science, Vol, No.1 Jan 1996, 5–12 wird offenbart, dass an dem Reaktionsmechanismus von Protein-Tyrosinphosphatasen (PTPasen) und doppelt spezifischen Protein phosphatasen wahrscheinlich ein katalytischer Asparaginsäurerest beteiligt ist. Die Asparaginsäure 383 wird unter Verwendung von Sequenzangleichung, struktureller Information und ortsspezifischer Mutagenese als ein möglicher Kandidat für die katalytische Säure in der Cdc25A Proteinphosphatase des Menschen, beschrieben. Eine D383N Mutante zeigte eine 150-fach Verringerung in K_cat, mit einem mehr als verdoppelten K_m. Unter Verwendung einer Analyse mit Sequenz-Homologien, die auf der Ausrichtung katalytischer Reste und sekundärer Strukturelemente basierte, wird ein dreidimensionales Modell der Cdc25-Kernregion präsentiert wobei eine allgemeiner Aufbau der Proteinphosphatase-Kernregion vorgeschlagen wird, die das Schleifenmotiv HCXXXXXR der aktiven Stelle und den katalytischen Asparaginsäurerest umfasst.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Substratspezifität von Protein-Tyrosinphosphatasen (PTPs) wurde, wie hier beschrieben, unter Verwendung eines neuen Substrat-Binde-/-Einfang-Versuchs/-Ansatzes untersucht, bei dem mutierte oder veränderte Formen der menschlichen PTPs, die ebenfalls als Substrat-bindende PTPs bezeichnet werden, verwendet wurden, um ein oder mehrere Substrate der PTP zu binden (einzufangen). Bindung der Substrat-bindenden PTP mit einem Substrat der PTP führte zu der Bildung eines Komplexes, der einfach beobachtet, und falls erwünscht, isoliert und charakterisiert werden kann. Die mutierten Formen der PTPs weisen im Vergleich zu der Wildtyp-PTP eine attenuierte katalytische Aktivität auf (fehlende katalytische Aktivität oder verringerte katalytische Aktivität), wobei sie jedoch die Fähigkeit beibehalten, am Tyrosin phosphoryliertes Substrat(e) der Wildtyp-PTP zu binden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden speziell hier in Bezug auf die Phosphatasen PTP1B und PTP-PEST beispielhaft dargestellt, wobei jedoch klar sein sollte, dass die Erfindung nicht auf diese spezifischen PTPs beschränkt ist, sondern bei allen Mitgliedern der PTP-Familie eingesetzt werden kann. Um mögliche Substrate von PTP1B und PTP-PEST zu identifizieren, wurden mutierte (d.h. veränderte oder Substrat-bindende) Formen von PTP1B und PTP-PEST erzeugt, deren katalytische Wirkung verringert war, wobei sie jedoch die Fähigkeit zur Substratbindung beibehielten. Diese PTP-Mutanten assoziierten sich in stabilen Komplexen mit Proteinen, die durch Immunblotting als p210 bcr:abl beziehungsweise p130^cas identifiziert wurden. Diese Assoziationen wurden in Lysaten einiger Zelllinien und in transfizierten COS-Zellen beobachtet, was darauf hinweist, dass p210 bcr:abl und p130^cas die hauptsächlich physiologisch relevanten Substrate für PTP1B und PTP-PEST darstellen. Diese Ergebnisse liefern die erste Darstellung von PTPs, die in vivo eine inhärent begrenzte Substratspezifität aufweisen. Die zur Identifizierung von p210 bcr:abl und p130^cas als spezifische Substrate für PTP1B beziehungsweise PTP-PEST verwendeten Verfahren, sind allgemein auf alle Mitglieder der PTP-Familie anwendbar, von denen gegenwärtig ungefähr 500 beschrieben wurden und dazu verwendet werden können, die physiologioschen Substrate anderer Mitgliedern der PTP-Familie zu bestimmen.
Eine Ausführungsform betrifft neue PTP-Mutanten, in denen der invariante Aspartatrest durch eine Aminosäure ersetzt wurde, die keine signifikante Änderung des K_m des Enzyms hervorruft, die jedoch zu einer Verringerung im K_cat auf weniger als 1 pro Minute (weniger als 1 min^–1) führt. Diese PTPs behalten die Fähigkeit bei, mit deren am Tyrosin phosphorylierten Substraten einen Komplex zu bilden oder daran zu binden, wobei sie jedoch katalytisch geschwächt sind. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung die Phosphatase PTP1B, in der der invariante Aspartatrest bei Position 181 durch Alanin (D181A) ersetzt ist. In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Phosphatase PTP-PEST, in der der invariante Aspartatrest bei Position 199 mit einem Alanin (D199A) ersetzt wurde. Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine PTP-PEST Phosphatase, in der der Cysteinrest bei Position 231 mit einem Serin (C231S) ersetzt wurde. Die Erfindung betrifft ebenfalls andere Mutanten oder Substrat einfangende (substrate trapping) PTPs, in denen der invariante Aspartatrest durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist oder dazu verändert wird, wie beispielsweise Alanin. Der invariante Aspartatrest kann in anderen PTPs durch Ausrichtung der PTP-Nukleotidsequenz mit der Nukleotidsequenz einer PTP identifiziert werden, für die die Stelle des invarianten Aspartatrestes bekannt ist.
Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zum Identifizieren eines am Tyrosin phosphorylierten Substrats eines Tyrosinphosphatase-Proteins. Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein am Tyrosin phosphoryliertes Protein von Interesse mit einer oder mehreren PTP(s) kombiniert, in denen der invariante Aspartatrest durch eine Aminosäure ersetzt wurde, die keine signifikante Änderung des K_m des Enzyms hervorruft, jedoch zu einer Verringerung beim K_cat auf weniger als 1 pro Minute (weniger als 1 min^–1) führt, wobei die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Komplexes zwischen dem Protein und den PTP(s) bestimmt wird. Eine Anwesenheit eines Komplexes in der Kombination zeigt an, dass das am Tyrosin phosphorylierte Protein ein Substrat der PTP ist. Die PTP DA-Mutante bildet mit deren Substrat einen Komplex oder bindet daran, wobei dieses jedoch nicht dephosphoryliert wird (oder führt dies sehr langsam aus), wodurch der Komplex zu verzeichnen ist und wahlweise isoliert und identifiziert werden kann. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird der invariante Aspartatrest durch einen Alaninrest (eine PTP DA Mutation oder Änderung) ersetzt.
In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine PTP von Interesse, in der der invariante Aspartatrest durch eine Aminosäure ersetzt wird, die keine signifikante Änderung des K_m des Enzyms bewirt, die jedoch zu einer Verringerung im K_cat auf weniger als 1 pro Minute (weniger als 1 min^–1) führt, mit einem oder mehreren am Tyrosin phosphoryliert en Proteinen kombiniert, wobei die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Komplexes zwischen der Kombination anzeigt, dass das am Tyrosin phosphoryliert e Protein ein Substrat der PTP ist. Die PTP DA-Mutante bindet oder bildet mit deren Substrat einen Komplex, wobei es jedoch nicht dephosphoryliert (oder es sehr langsam ausführt) wird, wodurch der Komplex beobachtet und wahlweise isoliert und identifiziert werden kann. In einer Ausführungsform der Erfindung wird der invariante Aspartatrest durch einen Alaninrest (eine PTP DA-Mutante oder Änderung) ersetzt.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zum Identifizieren eines am Tyrosin phosphorylierten Substrats eines Tyrosinphosphatase-Proteins, wobei mehr als ein am Tyrosin phosphoryliertes Protein von Interesse mit mehr als einer PTP von Interesse kombiniert wird, in der der invariante Aspartatrest durch eine Aminosäure ersetzt wird, die keine signifikante Änderung des K_m des Enzyms hervorruft, die jedoch zu einer Verringerung im K_cat auf weniger als 1 pro Minute (weniger als 1 min–1) führt (so wird beispielsweise der invariante Aspartatrest durch einen Alaninrest ersetzt). In der Kombination gebildete Komplexe können isoliert und die Komponenten, PTP und Substrat, können identifiziert werden.
Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Reduzierung der Aktivität eines am Tyrosin phosphorylierten Proteins, welches umfasst, Verabreichen an einen Säuger einer PTP, in der der invariante Aspartatrest durch eine Aminosäure ersetzt wurde, die keine signifikante Änderung des K_m des Enzyms hervorruft, die jedoch zu einer Verringerung im K_cat auf weniger als 1 pro Minute (weniger als 1 min–1) (beispielsweise wird der invariante Aspartatrest durch einen Alaninrest ersetzt) führt, und die eine Komplex mit dem am Tyrosin phosphorylierten Protein bildet. Die PTP-Mutante bindet an das phosphorylierte Protein ohne es zu dephosphorylieren, wodurch die Aktivität des Proteins gehemmt wird und dessen stromabwärts Wirkungen verringert werden.
Die Erfindung betrifft beispielsweise ein Verfahren zur Verringerung der transformierenden Wirkungen von Oncogenen, die mit p130^cas, einem Substrat von PTP-PEST, assoziiert sind, umfassend, Verabreichen von Wildtyp PTP-PEST oder PTP-PEST, in dem der invariante Aspartatrest durch einen Alaninrest ersetzt wurde, an einen Säuger. Wildtyp PTP-PEST bindet und dephosphoryliert p130^cas, wodurch dessen stromabwärts Wirkungen negativ reguliert werden. DA-Mutanten von PTP-PEST binden p130^cas, wobei sie es jedoch nicht dephosphorylieren (oder dephosphorylieren es mit einer verringerten Geschwindigkeit), wobei das Substrat in dem Komplex mit der Substrat-fangenden Form von PTP-PEST gefesselt ist und seine stromabwärts Wirkungen nicht ausführen kann. In ähnlicher Weise betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Verringern der Ausbildung von Signal-Komplexen, die mit p130^cas assoziiert sind, insbesondere solchen Signal-Komplexen, die mitogene Wege indizieren, welches umfasst, Verabreichen von Wildtyp PTP-PEST oder PTP-PEST, in dem der invariante Aspartatrest durch einen Alaninrest ersetzt wird, an einen Säuger.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Assays zum Identifizieren von Mitteln, die die Wechselwirkung zwischen einer PTP und deren phosphorylierten Substrat ändern, beispielsweise erhöhen oder hemmen. Mittel, die durch diese Assays identifiziert wurden, können Agonisten (beispielsweise Mittel, die die Aktivität der PTP fördern oder erhöhen) oder Antagonisten (beispielsweise Mittel, die die Aktivität der PTP hemmen oder mindern) einer PTP-Aktivität sein. Die Mittel können eine endogene physiologische Substanz oder natürliche oder synthetische Arzneimittel, einschließlich kleiner organischer Moleküle, sein.
Das am Tyrosin phosphorylierte Substrat eines PTP kann durch die hier beschriebenen Verfahren identifiziert werden. Ein Enzymaktivitäts-Assay, bei dem die Wildtyp-PTP verwendet wird, kann in der Anwesenheit eines zu testenden Mittels ausgeführt werden, wobei die sich ergebende Rate einer Enzymaktivität mit der Rate einer Enzymaktivität in der Abwesenheit des zu testenden Mittels verglichen werden kann. Eine Verminderung der Enzymaktivität in der Anwesenheit des zu testenden Mittels zeigt an, dass das Mittel die Wechselwirkung zwischen der PTP und deren Substrat hemmt. Umgekehrt zeigt eine Erhöhung beziehungsweise Anstieg in der Enzymaktivität in der Anwesenheit des zu testenden Mittels an, dass das Mittel die Wechselwirkung zwischen der PTP und deren Substrat fördert/verstärkt.
Alternativ kann der Assay unter Verwendung der PTP-Mutanten in Anwesenheit eines zu testenden Mittels ausgeführt werden, wobei das sich ergebende Maß einer Bindung der PTP-Mutanten an deren Substrat mit dem Maß einer Bindung in der Abwesenheit des zu testenden Mittels verglichen werden kann. Eine Verminderung des Maßes einer Bindung in der Anwesenheit des zu testenden Mittels zeigt an, dass das Mittel die Wechselwirkung zwischen der PTP und deren Substrat hemmt. Dagegen zeigt ein Anstieg des Maßes einer Bindung in der Anwesenheit des zu testenden Mittels an, dass das Mittel die Wechselwirkung zwischen der PTP und deren Substrat fördert.
Folglich sind die hier beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren bei der Identifizierung der am Tyrosin phosphorylierten Substrate von Mitgliedern der PTP-Familie von Phosphatasen als auch bei der Regulierung der Aktivität von identifizierten Substraten nützlich. Die hier beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren sind weiter zum Identifizieren von am Tyrosin phosphorylierten Proteinen nützlich, die auf eine bestimmte Erkrankung oder Störung bezogen sind, und auf Verfahren zum Durchmustern für Modulatoren, die die PTP/Substrat-Wechselwirkung zur Verwendung bei therapeutischen Anwendungen, fördern oder hemmen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A–1E zeigen eine Mehrfachsequenzausrichtung der katalytischen Domänen von PTPs (SEQ ID NO: 1-35). Eukaryotische PTPS des Zytosols und Domäne 1 von PTPs werden in einer Gruppe, Domäne 2 der RPTPs werden in einer zweiten Gruppe und die Yersinia PTP in einer dritten Gruppe kombiniert. Die invarianten Reste, die unter allen drei Gruppen geteilt werden, sind in Kleinbuchstaben gezeigt. Invariante und hoch konservierte Reste innerhalb einer Gruppe sind kursiv beziehungsweise fett angegeben. Innerhalb der Yersinia PTP Sequenz werden die Reste kursiv beziehungsweise fett angegeben, die zwischen den Sequenzen der cytosolischen und RPTP-Domäne entweder invariant oder hoch konserviert sind. Die Position der Reste von PTP1B, die mit dem Peptid wechselwirken, werden mit einem kleinen Pfeilkopf angezeigt, und die Reste-Numerierung am unteren Rand der Ausrichtung entspricht der für PTP1B.
2 zeigt die V_max und K_m für verschiedene PTP1B-Mutanten auf RCML.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die PTP-Familie der Enzyme enthält ein gemeinsames, evolutionär konserviertes Segment von ungefähr 250 Aminosäuren, das als die katalytische PTP-Domäne bekannt ist. Innerhalb dieser konservierten Domäne befindet sich eine einzigartiges Signatursequenzmotiv, [I/V]HCXAGXXR[S/T]G/SEQ ID NO: 36), das unter allen PTPs invariant vorliegt. Der Cyteinrest in diesem Motiv ist in den Mitgliedern der Familie invariant und für die Katalyse wesentlich. Er funktioniert als ein Nukleophil, das den Phosphatrest des eintretenden Substrates angreift. Falls der Cyteinrest durch ortsspezifische Mutagenese zu einem Serin (CS-Mutanten) oder einem Alanin (CA-Mutanten) verändert wurde, dann ist die sich ergebende PTP katalytisch geschwächt, wobei sie jedoch die Fähigkeit beibehält, deren Substrat in vitro zumindest zu komplexieren oder zu binden. Diese Ergebnisse wurden in Bezug zu MKP-1, einem Mitglied der PTP-Familie (Sun et al., Cell 75:487–493 (1993)), als auch mit anderen PTPs bestätigt. Obwohl jedoch diese CS-Mutanten im allgemeinen Phosphotyrosyl-Substrate in vitro binden können, können in vielen Fällen keine derartigen Komplexe isoliert werden. Daher werden die CS-Mutanten auf deren Anwendbarkeit beschränkt und können nicht dazu verwendet werden, um alle Kombinationen von PTPs und Substraten zu isolieren.
Es wurden unlängst die Kristallstrukturen von PTP1B alleine (Barford, et al. Science 263 (1994), 1397–1404) und im Komplex mit einem ein Phosphotyrosin enthaltenden Peptid (Jia et al., Science 268 (1995), 1754–1758) bestimmt. Diese Strukturen zeigen 27 (Siebenundzwanzig) invariante Reste (Barford et al., 1994), von denen einer ein Aspartatrest ist. Dieser Aspartatrest liegt invariant über den katalytischen Domänen der Mitglieder der PTP-Familie. Das heißt, falls die Aminosäuresequenzen der Mitglieder der PTP-Familie ausgerichtet werden, dann liegt der Aspartatrest in jedem PTP an der entsprechenden Stelle, obwohl die Positionsnummern aufgrund der für eine maximale Ausrichtung erforderlichen Verschiebungen (siehe die Figur (von Barford et al., Nature Struc. Biol. 2 (1995), 1043–1053) für eine Ausrichtung von verschiedenen PTP-Sequenzen) unterschiedlich sein können. Sequenzen, für die die Ausrichtung noch nicht veröffentlicht wurde, können mit anderen bekannten PTP-Sequenzen, beispielsweise unter Verwendung verfügbarer Computer-Software, wie beispielsweise GENEWORKS, einfach ausgerichtet werden.
Folglich können andere als die hier spezifisch beschriebenen PTP-Mutanten einfach durch Ausrichten der Aminosäuresequenz der katalytischen Domäne der PTP mit den hier beschriebenen, Identifizieren des invarianten Aspartatrests und Ändern des Rests durch ortsspezifische Mutagenese, einfach hergestellt werden. Obwohl die hier beschriebenen spezifischen Beispiele von PTP-Mutanten Aspartat zu Alanin Mutanten (DA-Mutanten) sind, ist klar, dass die Erfindung nicht auf Änderungen von Aspartat zu Alanin beschränkt ist. Der invariante Aspartatrest kann beispielsweise durch ortsspezifische Mutagenese, zu jeder beliebigen Aminosäure verändert werden, die keine signifikante Änderung des K_m des Enzyms bewirkt, die jedoch zu einer Verringerung im K_cat auf weniger als 1 pro Minute (weniger als 1 min–1) führt. Der invariante Aspartatrest kann beispielsweise zu einem Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Methionin, Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin, Glutamin, Lysin, Arginin oder Histidine verändert oder mutiert werden.
Wie hier beschrieben, wurden mit Pervanadat behandelte Zellen als eine opulente Quelle von am Tyrosin phosphoryliertem Protein verwendet, um die Substratspezifität von PTP-PEST zu untersuchen. PTP-PEST ist eine im Zytosol befindliche PTP mit 88 kDa (Charest et al., Biochem. J. 308 (1995), 425–432; den Hertog et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 184 (1992), 1241–1249; Takekawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 189 (1992), 1223–1230; Yang et al., J. Biol. Chem. 268 (1993), 6622–6628; Yang et al., J. Biol. Chem. 268 (1993), 17650), das in Säugetiergeweben (Yi et al., Blood 78 (1991), 2222–2228) ubiquitär exprimiert wird, und hohe spezifische Aktivität zeigt, wenn es unter Verwendung künstlicher am Tyrosin phosphorylierten Substraten (Garton and Tonks, EMBO J. 13 (1994), 3763–3771) in vitro getestet wird. Es wurde vorher gezeigt, dass in vivo und in vitro PTP-PEST einer Regulation über eine Phosphorylierung von Ser 39 ausgesetzt ist. Diese Modifikation wird durch sowohl Proteinkinase C (PKC) als auch Proteinkinase A (PKA) katalysiert, und führt als Konsequenz eines Anstiegs des K_m der Dephosphorylierungsreaktion (Garton and Tonks, EMBO J. 13 (1994), 3763–3771) zu einer verringerten Enzymaktivität. Es erscheint möglich, dass weitere regulatorische Mechanismen für PTP-PEST vorhanden sind, da von diesem Enzym erwartet würde, dass es einen beträchtlichen negativen Einfluß auf den am Tyrosin phosphorylierten Zustand von cytosolischen Substraten der Tyrosin-Kinasen ausübt. Eine Möglichkeit besteht darin, dass dieser Einfluß durch die Substratspezifität von PTP-PEST beschränkt sein kann.
Die Substratspezifität von PTP1B wurde unter Verwendung der gleichen für PTP-PEST ausgeführten Verfahren untersucht, mit der Maßgabe, dass die Zellen nicht mit Pervanadat behandelt wurden. Es wurde eine Kombination von in vitro Dephosphorylierungs- und Substrat-Einfang-Experimenten verwendet, um die Substrat-Wechselwirkungen von PTP1B und PTP-PEST zu untersuchen. Die hier ausgeführten Substrat-Einfang-Verfahren sind aufgrund des geteilten invarianten Aspartatrestes auf eine beliebige PTP allgemein anwendbar, und sollten sich daher bei einem Abgrenzen beziehungsweise einem Skizzieren der Substratpräferenz anderer Mitglieder der PTP-Familie nützlich erweisen. Insbesondere wird die Verwendung von mutierten, katalytisch beeinträchtigten PTPs, um dadurch potentielle Substrate zu isolieren wird die Identifikation physiologisch wichtiger Substrate für einzelne PTPs stark fördern, was dazu führt, dass das Rollenverständnis dieser Enzyme bei der Regulation zellulärer Vorgänge verbessert wird.
Eine Ausführungsform der Erfindung betrifft neue PTPs, in denen der invariante Aspartatrest durch eine Aminosäure ersetzt wird, die keine signifikante Änderung des K_m des Enzyms hervorruft, die jedoch zu einer Verringerung im K_cat auf weniger als 1 pro Minute (weniger als 1 min–1) führt. Diese PTPs behalten die Fähigkeit einen Komplex mit deren am Tyrosin phosphorylierten Substraten zu bilden oder daran zu binden, wobei sie jedoch geringer katalytisch aktiv sind. Wie hier definiert, soll "geschwächte beziehungsweise verringerte" Aktivität bedeuten, dass die Phosphatase einen ähnlichen Km zu dem der Wildtyp-Phosphatase beibehält, wobei sie jedoch ein V_max aufweist, das durch einen Faktor von mindestens 10⁴ relativ zu dem Wildtyp-Enzym, verringert ist. Dies umfasst eine katalytische Aktivität, die entweder relativ zu der Wildtyp-PTP verringert oder aufgehoben beziehungsweise beseitigt ist. Der invariante Aspartatrest kann beispielsweise zu einem Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Proline, Phenylalanin, Tryptophan, Methionin, Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin, Glutamin, Lysin, Arginin oder Histidine verändert oder mutiert werden.
Die neuen hier beschriebenen PTPs, in denen der invariante Aspartatrest durch eine Aminosäure ersetzt wird, die keine signifikante Änderung des Km des Enzyms hervorruft, die jedoch zu einer Verringerung im K_cat auf weniger als 1 pro Minute (weniger als 1 min^–1) führt, kann ebenfalls andere Mutationen, insbesondere jene umfassen, die ein Stabilisieren des PTP/Substrat-Komplexes unterstützen. Eine Mutation des (Serin/Threonin)-Restes in dem Signaturmotiv beispielsweise zu einem Alaninrest ändert den die Geschwindigkeit bestimmenden Schritt der Phosphorylierungsreaktion von der Bildung des Übergangszustands bis zu dem Abbau des Übergangszustands, wodurch der PTP/Substrat-Komplex stabilisiert wird. Derartige Mutationen können mit der Ersetzung des invarianten Aspartatrestes vorteilhaft kombiniert werden, insbesondere indem ein Stabilisieren des Komplexes unterstützt und die Beobachtung und Isolation des Komplexes gefördert wird.
PTPs, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind umfassen ein beliebiges PTP, das einen invarianten Aspartatrest in einer entsprechend Position aufweist. Wie hier definiert, ist eine Phosphatase ein Mitglied der PTP-Familie, falls sie das Signaturmotiv [I/V]HCXAGXXR[S/T]G (SEQ ID NO: 36) beinhaltet. Doppelt spezifische PTPs, das heißt PTPs, die sowohl phosphoryliertes Tyrosin als auch phosphoryliertes Serin oder Threonin dephosphorylieren, sind ebenfalls für eine Verwendung in der Erfindung geeignet. Geeignete PTPs umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf PTP1B, PTP-PEST, PTP, MKP-1, DEP-1, PTPμ, PTPX1, PTPX10 und PTPH1.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung die Phosphatase PTP1B, in der der Aspartatrest bei Position 181 durch Alanin (D181A) ersetzt vorliegt. In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Phosphatase PTP-PEST, in der der invariante Aspartatrest bei Position 199 durch ein Alanin (D199A) ersetzt vorliegt. Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine PTP-PEST-Phosphatase, in der der Cysteinrest bei Position 231 durch ein Serin (C231S) ersetzt vorliegt.
Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zum Identifizieren eines am Tyrosin phosphorylierten Proteins, das ein Substrat eines besonderen Tyrosinphosphatase-Proteins ist. Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein am Tyrosin phosphoryliertes Protein von Interesse mit mindestens einer PTP kombiniert, in der der invariante Aspartatrest durch eine Aminosäure ersetzt wird, die keine signifikante Änderung des K_m des Enzyms hervorruft, die jedoch zu einer Verringerung im K_cat auf weniger als 1 pro Minute (weniger als 1 min–1) führt (beispielsweise einen Alaninrest), und wobei die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Komplexes zwischen dem Protein und der PTP bestimmt wird. Eine Anwesenheit eines Komplexes in der Kombination zeigt an, dass das am Tyrosin phosphorylierte Protein ein Substrat der PTP ist. Die PTP DA-Mutante (Substrat-Einfang-Mutante) bindet deren Substrat oder komplexiert damit, wobei es dieses jedoch nicht dephosphoryliert (oder es sehr langsam ausführt), wodurch der Komplex isoliert und identifiziert werden kann.
Das phosphorylierte Protein/PTP-Komplex kann, wie in der US-P-5,352,660 von Pawson beschrieben, durch herkömmliche Isolationsverfahren, einschließlich Aussalzen, Chromatographie, Elektrophorese, Gelfiltration, Fraktionierung, Absorption, Polyamidgel-Elektrophorese, Agglutination oder Kombinationen davon isoliert werden. Weiterhin können Antikörper gegen die PTP oder das phosphorylierte Protein als auch markierte PTPs und/oder markierte phosphorylierte Substrate verwendet werden, um die Bestimmung der Anwesenheit des Protein/PTP Komplexes zu fördern. Das PTP oder das phosphorylierte Protein können mit verschiedenen Enzymen, fluoreszenten Materialien, lumineszenten Materialien und radioaktiven Materialien markiert werden. Beispiele geeigneter Enzyme umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Meerrettichperoxidase, Biotin, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase und Acetylcholinesterase. Beispiele geeigneter fluoreszenter Materialien umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Umbelliferon, Fluorescein, Fluoresceinisothiacyanate, Rhodamin, Dichlorotriazinylaminfluorescein, Dansylchlorid und Phycoerythrin. Geeignete lumineszente Materialien umfassen Luminol, und geeignetes radioaktives Material umfasst radioaktiven Phosphor ³²P, Iod I¹²⁵, I¹³¹ oder Tritium.
Die Erfindung betrifft alternativ ein Verfahren zum Identifizieren eines am Tyrosin phosphorylierten Proteins, das ein Substrat einer PTP ist, umfassend, Kombinieren einer PTP von Interesse, in der der invariante Aspartatrest durch eine Aminosäure ersetzt ist, die keine signifikante Änderung des Km des Enzyms hervorruft, die jedoch zu einer Verringerung im K_cat auf weniger als 1 pro Minute (weniger als 1 min–1) (beispielsweise einen Alaninrest) mit mindestens einem am Tyrosin phosphoryliertes Protein führt, wodurch eine Kombination erzeugt wird, und wobei die Anwesenheit oder eine Abwesenheit eines Komplexes in der Kombination zwischen einem am Tyrosin phosphorylierten Protein und der PTP anzeigt, dass das am Tyrosin phosphorylierte Protein ein Substrat der PTP ist.
Die erfindungsgemäßen Substrat-Einfang-PTPs können weiter anstelle der Wildtyp-PTPs verwendet werden, um Phosphotyrosyl-Peptid-Bibliotheken für Peptide zu durchmustern, die, wie in Songyang et al. (Nature 373 (1995), 536–539; Cell 72 (1993), 767– 778) beschrieben, an die PTP binden. Peptide, die von derartigen Peptidbibliotheken isoliert wurden, können bewertet werden, um zu bestimmen, ob am Tyrosin phosphorylierte Proteine, die diese Peptide beinhalten in der Natur vorkommen.
Ein beliebiges, am Tyrosin phosphoryliertes Protein ist als ein mögliches Substrat in der vorliegenden Erfindung geeignet. Am Tyrosin phosphorylierte Proteine sind im Stand der Technik wohlbekannt. Spezifische Beispiele geeigneter Substrate umfassen ohne Beschränkung p130^cas, den EGF-Rezeptor, p210 bcr:abl, MAP-Kinase und den Insulin-Rezeptor. Von besonderem Interesse sind am Tyrosin phosphorylierte Proteine, die mit einer Erkrankung oder Störung in einem Säugetier in Zusammenhang gebracht wurden.
Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zum Verringern der Aktivität eines am Tyrosin phosphorylierten Proteins, umfassend, Verabreichen einer PTP, in der der inavriante Aspartatrest durch eine Aminosäure ersetzt wird, die keine signifikante Änderung des K_m des Enzyms hervorruft, die jedoch zu einer Verringerung im K_cat auf weniger als 1 pro Minute (weniger als 1 min–1) (beispielsweise einen Alaninrest) führt, und die mit dem am Tyrosin phosphorylierten Protein einen Komplex bildet. Die PTP DA-Mutante bindet das phosphorylierte Protein ohne es zu dephosphorylieren (oder bewirkt eine Dephosphorylierung bei einer sehr verringerten Geschwindigkeit), wodurch die Aktivität des Proteins gehemmt und dessen stromabwärts Wirkungen verringert werden. Wie hier verwendet, umfasst "verringern" sowohl eine Verringerung als auch eine vollständige Aufhebung, beispielsweise von einer oder mehrerer Aktivitäten oder Funktionen des phosphorylierten Proteins.
Die Erfindung betrifft beispielsweise ein Verfahren zum Verringern der transformierenden Wirkungen von Oncogenen, die mit p130^cas, einem Substrat von PTP-PEST, assoziiert ist, umfassend, Verabreichen von Wildtyp PTP-PEST oder PTP-PEST, in dem der invariante Aspartatrest durch einen Alaninrest ersetzt wurde. Die Wildtyp PTP-PEST bindet und dephosphoryliert p130^cas, wodurch dessen stromabwärts Wirkungen negativ reguliert werden. DA-Mutanten von PTP-PEST binden, dephosphorylieren jedoch nicht p130^cas (oder führen dies bei einer stark verringerten Geschwindigkeit aus), wobei das Substrat somit in dem Komplex mit der Substrat-Einfang Form von PTP-PEST gefesselt wird und wobei es nicht dessen stromabwärts Wirkungen ausführen kann. Auf ähnliche Weise betrifft die Erfindung ein Verfahren einer Verringerung der Bildung von Signalkomplexen, die mit p130^cas assoziiert sind, insbesondere jene Signalkomplexe, die mitogene Wege induzieren, um fassend, Verabreichen von Wildtyp PTP-PEST oder PTP-PEST, in dem der invariante Aspartatrest durch einen Alaninrest ersetzt wird. Die PTP bindet and und/oder dephosphoryliert p130^cas, wodurch die stromabwärts auftretenden Wirkungen von p130^cas negativ reguliert werden, wobei die Bildung von Signalkomplexen, die mit p130^cas assoziiert sind, verringert werden.
Die erfindungsgemäßen Substrat-Einfang-PTP-Mutanten können in nahezu jeder Anwendung anstelle von oder zusätzlich zu einer entsprechenden Wildtyp-PTP verwendet werden. Die Vorteile einer derartigen Verwendung liegt beispielsweise in der Fähigkeit des Wildtyp-Enzyms die Aktivität dessen am Tyrosin phosphoryliertem Substrat zu verringern ohne schädliche zytotoxische Wirkungen zu induzieren, die gewöhnlich mit der Verabreichung oder Überexpression der Wildtyp-PTP beobachtet wird. Die Erfindung betrifft daher ebenfalls ein Verfahren zum Verringern der zytotoxischen Wirkungen, die mit einer Verabreichung oder Überexpression von Wildtyp-PTPs assoziiert sind. Beispielsweise wurde gezeigt, dass CS-Mutanten von MKP-1 die gleiche funktionelle Wirkung aufweisen, wie Wildtyp MKP-1 ohne dass mögliche schädliche Nebenwirkungen hervorgerufen werden. Folglich können, die hier beschriebenen PTPs, in denen der invariante Aspartatrest durch eine Aminosäure ersetzt wird, die keine signifikante Änderung des K_m des Enzyms hervorruft, die jedoch in einer Verringerung im K_cat auf weniger als 1 pro Minute (weniger als 1 min–1) führt(beispielsweise einen Alaninrest), in zahlreichen Anwendungen anstelle des entsprechenden Wildtypenzyms verwendet werden. Wie hier verwendet, ist ein "entsprechendes" Enzym Eines, das das gleiche ist, wie die PTP-Mutante (beispielsweise PTP-PEST und PTP-PEST D199A) oder Eines, das verschieden ist von der PTP-Mutante, das jedoch das gleiche Substrat erkennt wie die PTP-Mutante.
Die hier beschriebenen PTP-Mutanten können weiter therapeutisch verwendet werden, um die Aktivität eines am Tyrosin phosphorylierten Proteins durch beispielsweise ein Gentherapieverfahren zu verringern, bei dem die hier beschriebene PTP-Mutante, oder ein funktioneller Bereich davon, der die Fähigkeit behalten hat, an ihr am Tyrosin phosphoryliertes Protein zu binden, in die Person eingebracht wird, und in dem die PTP-Mutante exprimiert wird. Die PTP-Mutante ersetzt das Wildtyp-Enzym, das normal hergestellt wird entweder teilweise oder vollständig, oder konkurriert mit der Wildtyp-PTP um Bindung an die Substrate. So kann beispielsweise ein spezifisches, am Tyrosin phosphoryliertes Protein identifiziert werden, das mit einer besonderen Erkrankung oder Störung (beispielsweise als eine Protein-Tyrosin-Kinase) in Zusammenhang steht. Es kann mindestens eine PTP durch die hier beschriebenen Verfahren identifiziert werden, die dahingehend wirkt, das ausgewählte, am Tyrosin phosphorylierte Protein zu dephosphorylieren. Die Wildtyp oder die mutante Form der PTP können einer Person, die eine Behandlung braucht, verabreicht werden, um das am Tyrosin phosphorylierte Substrat einzubinden (zu fesseln) oder zu binden, wodurch die Funktion des phosphorylierten Proteins gehemmt oder verringert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die PTP-Mutante anstelle des Wildtyp-Enzyms verabreicht, um die zytotoxischen Wirkungen zu verringern, die mit einer Überexpression des Wildtyp-Enzyms assoziiert sind. Es sind Verfahren für eine Gentherapie im Stand der Technik (siehe US-P-5,399,346 von Anderson et al.)) bekannt, und sie können durch Verfahren modifiziert werden, die im Stand der Technik bekannt sind, um die spezifische Mutante und die Wildtyp-PTPs der vorliegenden Erfindung geeignet zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter Assays zum Identifizieren von Mitteln, die die Wechselwirkung zwischen einer PTP und ihrem phosphorylierten Substrat ändert, beispielsweise verstärkt oder erhöht. Mittel, die durch diese Assays identifiziert wurden können Agonisten (beispielsweise Mittel, die die Aktivität der PTP verstärken oder erhöhen) oder Antagonisten (beispielsweise Mittel, die die Aktivität der PTP hemmen oder verringern) einer PTP-Aktivität sein. Das Mittel kann eine endogene physiologische Substanz sein oder kann ein natürliches oder synthetisches Arzneimittel, einschließlich kleiner organischer Moleküle sein.
So kann beispielsweise das am Tyrosin phosphorylierte Substrat einer PTP durch hier beschriebene Verfahren identifiziert werden. Ein Assays auf Enzymaktivität, der die Wildtyp-PTP verwendet, kann in der Anwesenheit eines zu testenden Mittels ausgeführt werden, wobei der sich ergebende Betrag einer Enzymaktivität mit dem Betrag einer Enzymaktivität in der Abwesenheit des zu testenden Mittels verglichen werden kann. Assays auf Enzymaktivität sind im Stand der Technik bekannt, beispielsweise Assays einer PTP-Aktivität, die ein am Tyrosin phosphorylierten 32P-markierten Substrats verwenden, werden in Flint et al. (EMBO J. 12:1937–1946 (1993) beschrieben. Eine Verringerung bei der Enzymaktivität in der Anwesenheit des zu testenden Mittels zeigt, dass das Mittel die Wechselwirkung zwischen der PTP und dessen Substrat hemmt. Umgekehrt zeigt eine Erhöhung bei der Enzymaktivität in der Anwesenheit des zu testenden Mittels, dass das Mittel die Wechselwirkung zwischen der PTP und dessen Substrat verstärkt.
Alternativ kann ein kompetitiver Bindungsassay, bei dem der die PTP-Mutante in der Anwesenheit eines zu testenden Mittels verwendet wird, ausgeführt werden, wobei das sich ergebende Ausmaß einer Bindung der PTP-Mutante an deren Substrat mit dem Ausmaß einer Bindung in der Abwesenheit des zu testenden Mittels verglichen werden kann. Kompetitive BindungsAssays sind im Stand der Technik bekannt beispielsweise, beschreibt die US-P-5,352,660 von Pawson, Verfahren, die zur Verwendung in dieser Erfindung geeignet sind. Eine Verringerung des Ausmaßes einer Bindung in der Anwesenheit des zu testenden Mittels zeigt, dass das Mittel die Wechselwirkung zwischen der PTP und deren Substrat hemmt. Umgekehrt zeigt eine Erhöhung des Ausmaßes einer Bindung in der Anwesenheit des zu testenden Mittels, dass das Mittel die Wechselwirkung zwischen der PTP und deren Substrat verstärkt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können am Tyrosin phosphorylierte Peptide, die mit mutierten PTPs aus Peptidbibliotheken durch die Verfahren von Songyang et al. (Nature 373 (1995), 536–539; Cell 72 (1993), 767–778) identifiziert wurden, hier anstelle des vollständig am Tyrosin phosphorylierten Proteins in kompetitiven Bindungsassays verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine PTP enthalten, in der der invariante Aspartatrest durch eine Aminosäure ersetzt ist, die keine signifikante Änderung des K_m des Enzyms hervorruft, die jedoch zu einer Verringerung im K_cat auf weniger als 1 pro Minute (weniger als 1 min–1) führt (beispielsweise einen Alaninrest). Die erfindungsgemäße PTP kann beispielsweise mit einem physiologisch verträglichen Medium formuliert sein, um eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen. Das bestimmte physiologische Medium kann umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, gepufferte Salzlösung, Polyole (beispielsweise Glycerol, Propylenglycol, flüssiges Polyethylenglycol) und Dextroselösungen. Die optimale Konzentration des (der) aktiven Bestandteils (e) in dem gewählten Medium kann, gemäß einem medizinischen Chemiker bekannten Verfahren, empirisch bestimmt werden, und werden von der erwünschten endgültigen pharmazeutischen Zusammensetzung abhängig sein. Verfahren zum Einführen exogener PTPs an den Behandlungsort umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, subkutan, oral und intranasal. Andere geeignete Verfahren einer Einführung können ebenfalls wiederaufladbare oder biologisch abbaubare Einrichtungen und langsam freisetzende polymere Einrichtungen umfassen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung können ebenfalls als Teil einer Kombinationstherapie mit anderen Mitteln verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung und sind nicht dazu gedacht, den Umfang dieser Erfindung zu beschränken. Die Lehren aller hier zitierten Dokumente werden hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
Beispiele
Material und Methoden
Im Folgenden werden die Materialien und Methoden, die hier in der Arbeit verwendet wurden, beschrieben.
Erzeugung, Expression und Aufreinigung der PTP-Mutantenproteine
Es wurden unter Verwendung des Muta-Gene^TM invitro Mutagenese-Kits (Bio-Rad, Richmond, CA) durch ortsspezifische Mutagenese Punktmutationen in die katalytischen Domänen von PTP-PEST (D199A, C231S) und PTP1B (D181A, C231S) eingeführt. Die Regionen, die die erforderlich Punktmutation beinhalteten, wurden dann mit gegen die Wildtyp-Sequenz innerhalb geeigneter Expressionsvektoren ausgetauscht, wobei die ersetzten mutierten Regionen in deren Gesamtheit sequenziert wurden, um die Abwesenheit zusätzlicher Mutationen zu überprüfen.
Unter Verwendung eines rekombinanten Baculovirus (BaculoGoldTM, Pharmingen, San Diego, CA) wurden Volllängen-PTP-PEST-Proteine (Wildtyp und Mutanten-Proteine, die entweder Asp 199 zu Ala oder Cys 231 zu Ser Mutationen beinhalteten) in Sf9-Zellen exprimiert und wie in Garton and Tonks (EMBO J. 13 (1984), 3763–3771) beschrieben gereinigt. Es wurden ebenfalls verkürzte Formen des Wildtyps und Mutanten-PTP-PEST-Proteine, die die Aminosäurereste 1-305 von PTP-PEST umfassen, in E. coli als Fusionsproteine von GST exprimiert, folgend auf ein Subklonieren von PTPT-PEST-DNA im Leseraster stromabwärts von GST in pGEX-Vektoren (Pharmacia Biotech Inc., Uppsala, Schweden). 25 ml von mit dem geeigneten Vektor transformierten E. coli wurden bis zur Log-Phase (OD₆₀₀ ungefähr 0,5) gezüchtet. Die Fusionsproteinexpression wurde dann durch Zugabe von 0,2 mM Isopropyl-1-thio-b-D-galactopyranosid ausgelöst, und die Zellen wurden für 2–4 Stunden bei 30°C gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, mit 50 mg/ml Lysozym in 3 ml Puffer inkubiert, der 50 mM Tri-HCl, pH-Wert 7,4, 5mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM Benzamidin, 5 mg/ml Leupeptin, 5 mg/ml Aprotinin, 0,1 % TritonX-100 und 150 mM NaCl beinhaltet, anschließend durch Ultraschall (3 × 10s) lysiert. Nach Entfernen unlöslichen Materials durch Zentrifugation (20 Minuten bei 300.00 × g) wurden die Fusionsproteine durch Inkubation für 30 Min. bei 4°C mit 100 ml Glutathion-Sepharose-Kügelchen (Pharmacia Biotech Inc., Uppsala, Schweden) isoliert, und die Kügelchen wurden dann durch Zentrifugation gesammelt und dreimal mit Puffer A (20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM Benzamidin, 1 mg/ml Leupeptin, 1 mg/ml Aprotinin, 10 % Glycerol, 1 % TritonX-100 und 100 mM NaCl) gewaschen. Dieses Verfahren ergab im Wesentlichen ein homogenes Fusionsprotein mit einer Konzentration von 1 mg Protein/ml Glutathion-Sepharose-Kügelchen. Die PTP1B-Proteine (Wildtyp und mutante Formen), die die Aminosäuren 1–321 umfassen, wurden in E. coli exprimiert und, wie durch Barford et al. (J. Mol. Biol. 239 (1994), 726–730) beschrieben, bis zur Homogenität gereinigt.
Zellkultur, Transfektion, Präparation von Lysaten und Fraktionierung
HeLa und COs-Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) gezüchtet, das 5 % fötales Rinderserum (FBS) beinhaltete; Wi38, C2C12 und MvLu-Zellen wurden in DMEM gezüchtet, das 10 % FBS beinhaltete, 293-Zellen wurden in DMEM gezüchtet, das 10 % Kälberserum beinhaltete, MCF10A-Zellen wurden in 50 % DMEM, 50 % Ham's F-12 gezüchtet, das 5 % Pferdeserum, 20 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor, 10 mg/ml Insulin, 0,5 mg/ml Hydrocortison und 0,25 mg/ml Fungizon beinhaltete.
Alle Medien beinhalteten Penicillin und Streptomycin mit 100 E/ml beziehungsweise 100 mg/ml, und alle Zellen wurden bei 37°C gezüchtet. Es wurde eine Calciumphosphat vermittelte Transfektion verwendet, um cDNA, die Wildtyp und mutante PTP-PEST-Proteine codiert, in COS-Zellen einzuführen. Diese wurden durch PTP-PEST cDNA codiert, die in dem Plasmid PMT2 subkloniert wurde, dessen Expression durch einen Adenovirus späten Haupt-Promotor angetrieben wurde. Für die Transfektion wurden 20 mg DNA für jede 10 cm Platte mit Zellen verwendet. Der Expressionsgrad der PTP-PEST-Konstrukte war in allen Fällen ähnlich.
Vor der Zelllyse wurden die 70–90 % konfluenten Zellkulturen für 30 Minuten mit 0,1 mM Pervanadat (20 ml einer frischen Lösung, die 50 mM Natriummetavanadat (NaVO3) und 50 mM H₂O₂ beinhaltete, wurde zu 10 ml Medium zugegeben) behandelt. Die Behandlung der Zellen mit H₂O₂ und Vanadat führt wahrscheinlich aufgrund einer Hemmung intrazellulärer PTPs durch Vanadat zu einem/einer synergistischen Anstieg/Erhöhung im Phosphotyrosingehalt. Es wurde unlängst vorgeschlagen, dass, wenn verglichen zu Vanadat selbst dieser Synergismus zwischen H₂O₂ und Vanadat sich aus der verbesserten Akkumulation des sich ergebenden oxidierten Vanadats (Pervanadat) innerhalb der Zellen ergibt (Heffetz etal., J. Biol. Chem. 265 (1990), 2896–2902). Es ist wichtig anzumerken, dass während der Präparation der Zelllysate eine Verdünnung auftritt, so dass die hemmende Wirkung von Vanadat auf die PTP-Wirkung verloren geht. Die Pervanadatbehandlung führte in allen Zelltypen zu dem Auftreten von mindestens 50 prominenten Phosphotyrosin-Proteinbanden, während unbehandelte Zellen nahezu nicht nachweisbare Mengen von Phosphotyrosin (Daten nicht gezeigt) aufwiesen.
Die Zellen wurden in Puffer A lysiert, der 5 mM Iodessigsäure zur irreversiblen Hemmung zellulärer PTPs beinhaltete. Nach Inkubation bei 4°C für 30 Minuten wurden 10 mM DTT zugegeben, um jegliche nicht reagierte Iodessigsäure zu inaktivieren. Unlösliches Material wurde anschließend durch Zentrifugation für 20 Minuten bei 300.000 × g entfernt. Die erhaltenen Lysate waren bezüglich deren Phosphotyrosingehalts während einer Langzeitlagerung (mehrere Monate) bei –70°C und während ausgedehnter (mindestens 20 Stunden) Inkubation bei 4°C in der Abwesenheit exogen zugegebener PTPs stabil.
Die mit Pervanadat behandelten HeLa-Zelllysate wurden durch eine Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer Mono Q FPLC Säule (Pharmacia) fraktioniert. Die Probe (50 mg Gesamtprotein mit 3 mg/ml in Puffer A) wurde vor dem Laden/Aufbringen in drei Volumen Puffer B (20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM Benzamidin, 1 mg/ml Leupeptin, 1 mg/ml Aprotinin und 0,1 % Triton X-100) verdünnt. Die Proteine wurden mit einer Flussrate von 1 ml/min mit einem linearen Gradienten von 0–0,5 M NaCl in Puffer B über 20 Fraktionen (1 ml Fraktionsvolumen), gefolgt durch einen zweiten Gradienten von 0,5–1,0 M NaCl n Puffer B über 5 Fraktionen eluiert. Es wurden entsprechend eines Immunblottings mit Anti-Phosphotyrosin Phosphotyrosin beinhaltende Proteine wurden in den Fraktionen 7–21 erfasst. Es wurden für PTPT1B die gleichen Verfahren ausgeführt, ausgenommen, dass die Zellen nicht mit Pervanadat behandelt wurden.
Dephosphorylierungsreaktion
Die Lysate von HeLa-Zellen, die mit Pervanadat behandelt wurden (1–2 mg Protein/ml), die am Tyrosin phosphorylierte Proteine enthielten, wurden in Anwesenheit oder Abwesenheit gereinigter aktivier PTPs mit einer Konzentration von 2 nM auf Eis inkubiert. Die Dephosphorylierung wurden durch Entnehmen von Aliquots (30 mg Protein) in SDS-PAGE Proben-Puffer gestoppt, und das Ausmaß der Dephosphorylierung wurde durch Immunblotting unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers G104 erfaßt. Es wurden, wie durch Flint et al. (EMBO J. 12 (1993), 1937–1946) beschrieben, Assays einer PTP-Aktivität unter Verwendung von am Tyrosin phosphorylierten ³²P-markiertem RCM-Lysozym als Substrat ausgeführt.
Antikörper und Immunblotting
Der monoklonale Antikörper AG25 gegen PTP-PEST wurde gegen von Baculovirus exprimiertes gereinigtes Volllängen PTP-PEST gezüchtet. Der monoklonale Anti-Phosphotyrosin-Antikörper G104 wurde unter Verwendung von Phosphotyrosin, Alanin und Glycin als Antigen in einem 1:1:1 Verhältnis erzeugt, polymerisiert in der Anwesenheit von Keyhole-Hämocyanin der Napfschnecke mit 1-Ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, einem Verfahren, das ursprünglich in Kamps and Sefton (Oncogene 2:305–315 (1988)) beschrieben wurde. Der p130^cas monoklonale Antikörper war von Transduction Laboratories (Lexington, Ky). Der monoklonale Antikörper FG6, der gegen PTP1B gerichtet ist, wurde durch Dr. David Hill (Calbiochem Oncogen Research Products, Cambridge, MA) bereitgestellt. Die Sichtbarmachung der Proteine durch Immunblotting wurde durch verstärkte Chemilumineszenz (ECL) unter Verwendung von mit HRP konjugierten sekundären Antikörpern (Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, I1) und dem SuperSignal^TM CL-HRP Substrat-System (Pierce) erreicht.
Immunpräzipitation und Substrat-Einfangen
Aus transfizierten COS-Zellen wurde eine Immunpräzipitation von PTP-PEST ausgeführt, nachdem der monoklonale Antikörper AG25 an die Protein A-Sepharose-Kügelchen (Pharmacia Biotech Inc., Uppsala, Schweden) unter Verwendung des Vernetzungsmittels Mittels Dimethylpimelimidat (Schneider et al., J. Biol. Chem. 257:10766–10769 (1982)) kovalent gekoppelt war. Zuerst wurde der Antikörper an die Protein A-Sepharose mit einer Konzentration von 1 mg/ml Kügelchen-Volumen gebunden, wobei anschließend nicht gebundenes Material durch drei Waschgänge mit 0,2 M Natriumborat, pH-Wert 9, entfernt wurde. Die kovalente Kopplung wurde durch eine Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten in Anwesenheit von 20 mM Dimethylpimelimidat in 0,2 M Natriumborat, pH-Wert 9, erreicht. Die Kügelchen wurden anschließend für 1 Stunde mit einem Überschuß von 0,2 M Ethanolamin, ph-Wert 8, inkubiert, um nicht umgesetztes Vernetzungsmittel zu blockieren, worauf dreimal mit PBS vor der Lagerung bei 4°C gewaschen wurde. 10 ml der AG25 Kügelchen wurden verwendet, um transfiziertes PTP-PEST aus Lysaten zu präzipitieren, die ungefähr 0,375 mg Protein enthielten.
Substrat-Einfangen wurde unter Verwendung verschiedener PTP-Affinitätsmatrizen ausgeführt. Bei der Volllängen PTP-PEST Matrize wurden kovalent gekoppelte AG25-Protein A-Sepharose Kügelchen verwendet, an die von Baculovirus exprimiertes PTP-PEST Protein gebunden war. Es wurden Aliquots (10 ml) von AG25 Kügelchen für 2 Stunden bei 4°C in 100 ml Puffer A in Anwesenheit von 5 mg gereinigtem PTP-PEST (Wildtyp oder Mutante Form) inkubiert, worauf anschließend nicht gebundenes PTP-PEST durch dreimaliges Waschen mit 1 ml Puffer A entfernt wurde. Die so erhaltenen PTP-PEST-AG25-Protein A-Sepharose-Kügelchen beinhalteten ungefähr 2 mg PTP-PEST pro 10 ml Aliquot. Substrat-Einfangen wurde auch mit Glutathion-Sepharose-Kügelchen ausgeführt, an die von Baculovirus exprimierte GST Fusionsproteine, das die katalytische Domäne von PTP-PEST enthielt, gebunden waren.
Das PTP1B wurde ebenfalls bei Substrat-Einfang-Experimenten eingesetzt. In diesem Fall wurde der monoklonale Antikörper FG6 vorher an die Protein-A-Sepharose in der Abwesenheit des Vernetzungsmittels (2 mg Antikörper/10 ml Kügelchen) gekoppelt, anschließend wurden die gereinigten PTP1B-Proteine im Überschuß zugegeben und bei 4°C für 2 Stunden inkubiert. Nach Entfernung von nicht gebundenem PTP1B enthielten 10 ml Kügelchen ungefähr 2 mg PTP1B.
Mit Pervanadat behandelte Zelllysate oder Säulenfraktionen wurden bei Substrat-Einfang-Experimenten als Quelle von Phosphotyrosin enthaltenden Proteinen verwendet. So wurden allgemein Lysate, die 0,25–0,5 mg Protein in 0,5 ml Puffer A (einschließlich 5 mM Iodessigsäure, 10 mM DTT) beinhalteten, bei 4°C für 2 Stunden in der Anwesenheit von 10 ml einer Affinitätsmatrix inkubiert, die ungefähr 2 mg des geeigneten PTP-Proteins enthielt. Nicht gebundenes Protein wurde anschließend durch dreimaliges Waschen mit 1 ml Puffer A aus der Probe entfernt, wobei gebundenes Material durch Zugabe von 50 ml SDS-PAGE Proben-Puffer gefolgt durch Erhitzen bei 95°C für 5 Minuten gesammelt wurde, wobei die an die Kügelchen gebundenen Proteine anschließend durch SDS-PAGE, gefolgt von Immunblotting analysiert wurden.
Ergebnisse
Das Nachfolgende führt die Ergebnisse der hier beschriebenen Arbeit aus, die wie vorstehend beschrieben ausgeführt wurde.
PTP1B und p210 bcr:abl
Chronisch myeloische Leukämie ist eine klonale Störung der hämatopoietische Stammzelle, in der das c-Abl Proto-Oncogen auf Chromosom 9, das eine PTK codiert, mit dem bcr-Gen auf Chromosom 2 verbunden wird. Dies führt zu der Erzeugung eines bcr.abl Fusionsproteins, p210 bcr:abl, in dem die PTK-Aktivität relativ zu der von c-Abl erhöht ist. Gegenwärtig verfügbare Daten zeigen, dass diese zytogenetische Abnormität das primäre und einzige ursächliche Ereignis bei der CML darstellt. Die Expression von p210 bcr:abl erzeugt ein abnormes Muster der Tyrosinphosphorylierung, die zu der fehlerhaften Reifung der hämatopoietischen Stammzelle führt, die für die CML charakteristisch ist.
Die Expression von PTP1B-mRNA und -Protein ist als Konsequenz der p210 bcr:abl Expression in Rat1-, Mo7- und BaF3-Zellen erhöht. Änderungen der PTP1B-Aktivität, die proportional zu der Änderung beim Enzymprotein waren, wurden ebenfalls beobachtet. Diese Änderungen sind für PTP1B spezifisch und werden nicht bei dem nahen verwandten Homolog (65 % Identität) TC-PTP oder in anderen getesteten PTPs, einschließlich SHP-1, SHP-2 und PTP-PEST, gesehen. Der Anstieg der Expression von PTP1B wurde ebenfalls in Ph+ B- lymphoiden Zellen, die aus einem CML-Patienten abgeleitet waren, relativ zu Ph-Zellen aus dem gleichen Patienten beobachtet.
Die Änderungen in PTP1B-Pegeln wurden spezifisch durch p210 bcr:abl hervorgerufen und wurden nicht in Zellen beobachtet, die andere PTKs einschließlich v-abl, v-src oder andere Oncoproteine, wie beispielsweise myc exprimieren. Die PTK-Aktivität von p210 war für den Anstieg der Expression von PTP1B erforderlich, da die Expression einer inaktiven Lysin zu Arginin mutanten-Form von p210 bcr:abl in Ratl-Zellen die PTP1B-Spiegel nicht ändert. Der Anstieg in den PTP1B-Pegeln stellt eine schnelle Antwort auf die Induktion von p210 bcr:abl. Werden BaF3-Zellen, die eine Temperatur-empfindliche Mutanten-Form von p210 bcr:abl exprimieren, auf die erlaubte beziehungsweise tolerierte Temperatur für die PTK umgeschaltet, dann wurden innerhalb 12–24 Stunden übereinstimmend mit dem Auftreten der aktiven Form des Proteins ansteigende PTP1B-Pegel beobachtet. Diese Daten zeigen, dass die Änderung der PTP1B-Pegel eine relativ schnelle Antwort auf das Anftreten von p210 bcr:abl darstellt, als vielmehr eine langfristige Antwort der Zelle.
Bei transienten Co-Transfektionsexperimenten in COS-Zellen dephosphoryliert PTP1B p210 bcr:abl, jedoch nicht v-abl. Wurde die PTP1B D181A-Mutante als ein GST-Fusionsprotein exprimiert, gereinigt und mit Lysaten von Mo7-p210-Zellen (die p210 bcr:abl überexprimieren) inkubiert, dann wurde ein Komplex der PTP-Mutanten und p210 bcr:abl isoliert. Dagegen band am Tyrosin phosphoryliertes c-abl, das ebenfalls in dem Lysat vorhanden ist, nicht an die PTP-Mutante. Die Wechselwirkung zwischen PTP1B D181A und p210 bcr-abl wurde durch Vanadat blockiert, was nahe legt, dass die Wechselwirkung die aktive Stelle des PTP einbezog.
Nach transienter Coexpression in COS-Zellen bildete PTP1B D181A mit p210 bcr:abl einen Komplex. Vorläufige Daten zeigen, dass die Y177F Mutenten-Form von p210 bcr:abl nicht mit PTP1B D181A interagiert, was darauf hinweist, dass dieser Tyrosinrest in p210 bcr:abl in vivo phosphoryliert wird, und von dem gezeigt wurde, dass er als eine Andockstelle für GRB2 dient. Eine direkte Wechselwirkung des pTyr in p210 bcr:abl und der SH2-Domäne in GRB2 ist für die transformierende Aktivität der PTK wesentlich. Die Wechselwirkung von PTP1B D181A mit p210 bcr:abl beeinträchtigt die Assoziation der PTK mit GRB2. Zusammengefasst, legen diese Ergebnisse nahe, dass p210 bcr:abl ein physiologisches Substrat der Oncoprotein PTK in vivo darstellt. Das V_max, K_m und K_cat der PTP1B-Mutanten in Richtung RCML, werden in 2 gezeigt.
PTP1B und der EGF-Rezeptor
Die Expression von PTP1B D181A in COS-Zellen führt zu erhöhter Phosphorylierung von Tyrosylresten in einem 180 kDa Protein und in Proteinen von 120 und 70 kDa. Wird ein GST-PTP1B D181A Fusionsprotein in COS-Zellen exprimiert und an Glutathion-Sepharose präzipitiert, dann werden das 180 kDa und kleinere Mengen von p120 und p70 copräzipitiert. Das p180 Protein wurde durch Immunblotting als der epidermale Wachstum- Faktor(EGF)-Rezeptor identifiziert. Die Identität der p120 und p70 Proteine is unklar, wobei jedoch das letztere weder src, p62 oder Paxillin ist.
Die Expression von PTP1B D181A in COS-Zellen induziert eine Tyrosinphosphorylierung des EGF-Rezeptors in der Abwesenheit dessen Liganden EGF, was darauf hindeutet, dass die PTP-Mutante deren Wirkungen in der intakten Zelle ausübt und nicht nach der Lyse. Die äquivalente D199A PTP-PEST-Mutante interagiert nicht mit dem EGF-rezeptor, was auf die Spezifität dieser Substratwechselwirkung hindeutet.
Für die Wechselwirkung mit PTP1B D181A ist eine Auto-Phosphorylierung des EGF-Rezeptors erforderlich. Mutanten des Rezeptors, die entweder Kinase-Tot sind oder in denen die Auto-Phosphorylierungsstellen entfernt wurden, interagieren nicht mit PTP1B D181A. In v-src-exprimierenden Zellen wurde eine Fülle von am Tyrosin phosphorylierten Proteinen beobachtet, wobei jedoch eine Phosphorylierung des EGF-Rezeptors nicht nachgewiesen wurde. Unter diesen Bedingungen wurde von PTP1B D181A hauptsächlich ein am Tyrosin phosphoryliertes 70 kDa Protein gebunden.
Als ein Ergebnis dieser Arbeit tritt hervor, dass PTP1B den von EGF induzierten Signalweg, möglicherweise einschließlich der Wege zahlreicher Krankheiten, einschließlich Brustkrebs, modulieren kann.
Bevorzugte Dephosphorylierung eines 130 kDA Phosphotyrosin enthaltenden Proteins durch PTP-PEST
Aliquots von Pervanadat-behandelten HeLa Zelllysaten wurden auf Eis inkubiert, wobei 50–100 verschiedene Phosphotyrosin enthaltende Proteine erhalten wurden, wie es unter Verwendung des monoklonalen Anti-Phosphotyrosin Antikörpers G104 durch Immunoblotten des Zelllysats bestimmt wurde, um die Substratspezifität von PTP-PEST in vitro festzustellen. Gereinigtes Volllängen PTP-PEST (unter Verwendung von rekombinanten Baculovirus in Sf9 Zellen exprimiert), PTP-PEST katalytische Domäne, oder PTP1B katalytische Domäne (37 kDa Form) wurde anschließend zu dem Lysat hinzugegeben und Aliquots wurden zu verschiedenen Zeitpunkten für eine Analyse mittels SDS-PAGE entfernt, gefolgt von Anti-Phosphotyrosin Immunoblotten.
Überraschenderweise wurde eine bedeutende 130 kDa Anti-Phosphotyrosin Bande (p130) durch PTP-PEST innerhalb von 10 Minuten selektiv dephosphorylisiert, wohingegen die Intensität all der anderen Banden selbst nach 60 Minuten Inkubation mit PTP-PEST im Wesentlichen unverändert war. Lange Inkubationen mit höheren Konzentrationen an PTP-PEST (größer als 100-fach) führten zu der vollständigen Entfernung aller Phosphotyrosinbanden von dem Lysat. Bei all den getesteten Bedingungen wurde allerdings p130 gefunden schneller als alle anderen vorliegenden Banden dephosphorylisiert zu werden.
Die selektive Dephosphorylierung von p130 durch PTP-PEST wurde ebenso unter Verwendung einer trunkierten Form der Phosphatase (Aminosäurereste 1–305) beobachtet, welche im Wesentlichen ausschließlich die katalytische Domäne des Enzyms enthielt. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die beachtliche Substratbevorzugung, welche durch PTP-PEST in dieser Analyse gezeigt wird, eine inhärente Eigenschaft der Phosphatase katalytischen Domäne ist, wohingegen die C-terminalen 500 Aminosäurereste eine wenig unterscheidbare Wirkung auf die Substratspezifizität des Enzyms aufweisen.
Die Spezifizität der Wechselwirkung zwischen PTP-PEST und p130 wurde unter Verwendung der katalytischen Domäne von PTP1B (Aminosäurereste 1–321) in Dephosphorylisierungsreaktionen behandelt. Falls bei einer ähnlichen molaren Konzentration zu jener hinzugegeben, welche für PTP-PEST verwendet wurde, wurde von PTP1B gefunden (innerhalb von 15 Minuten) die meisten der Phosphotyrosin enthaltenden Proteine vollständig und schnell zu dephosphorylieren, welche in dem Pervanadat-behandelten HeLa Lysat vorliegen. Darüber hinaus war der zeitliche Verlauf einer Dephosphorylierung von p130 nicht signifikant schneller als jener der anderen Phosphotyrosinbanden, welche durch PTP1B dephosphoryliert wurden. Es sollte allerdings angemerkt werden, dass diese in vitro Dephosphorylierungsergebnisse für die Substratspezifität von PTP1B in vivo aus mehreren Gründen nicht wahrhaftig illustrativ sind. Zuerst wurde ausschließlich die isolierte katalytische Untereinheit in diesem bestimmten Versuch verwendet. Darüber hinaus kann eine in vivo Substratspezifität aufgrund der intrazellulären Verteilung sowohl dem PTP als auch den möglichen Substraten ziemlich verschieden sein. Das heißt, dass bei in vitro Dephosphorylierungsversuchen Substrate verwendet werden können, welche durch das PTP dephosphoryliert werden können, zu welchen es allerdings keinen Zugang in vivo aufweist. Das Phänomen einer unterschiedlichen Substratspezifität in Abhängigkeit von verschiedenen physiologischen Zusammenhängen wird durch einen Vergleich dieser Daten mit der vorstehend beschriebenen in vivo PTP1B Arbeit illustriert, worin PTP1B eine Spezifizität für ausschließlich drei Proteine zeigte.
Identifikation von Phosphotyrosin enthaltenden p130 Protein als p130^cas durch Substratfangen(trapping)
Pervanadat-behandeltes HeLa-Zelllysat wurde mittels Anionen Austausch Chromatographie fraktioniert und Aliquots der Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert, gefolgt durch Immunoblotten mit Anti-Phosphotyrosin oder Anti-p130^cas Antikörpern. Aliquots von allen analysierten Proben wurden anschließend mit einer Affinitätsmatriz inkubiert, welche ein Substrat fangende PTP-PEST Mutante enthielt, umfassend Volllängen PTP-PEST, in welchen Asp199 zu Alanin (D199A) geändert ist, gebunden an kovalent gebundene Protein A-Sepharose/Antikörper (AG25) Kügelchen. Mit PTP-PEST assoziierte Proteine wurde anschließend durch SDS-PAGE analysiert, gefolgt von Immunoblotten mit Anti-Phosphotyrosin oder Anit-p130^cas Antikörpern.
Anti-Phosphotyrosin Immunoblotten der Säulenfraktionen zeigte, dass die p130 Phosphotyrosinbande als ein einzelner Peak in Fraktionen 11–14 (ungefähr 0,3 M NaCl) eluierte. Aufgrund der Menge bzw. Häufigkeit von Tyrosinphosphoryliertem p130 in HeLa Lysaten, erschien es wahrscheinlich, dass p130 ein zuvor identifiziertes Phosphotyrosinenthaltendes 130 kDa Protein darstellt. Mehrere mögliche Kandidaten wurden in der Literatur identifiziert, einschließlich der fokalen Adhäsionskinase p125^FAK, ras-GAP, gp130 und p130^cas. Von diesen Kandidaten wurden p130^cas als eine besonders bedeutende Phosphotyrosinbande in einer großen Varietät von Systemen identifiziert, einschließlich v-crk (Mayer and Hanafusa, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990) 2638–2642; Mayer et al., Nature, 332 (1988) 272–275) und src (Kanner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990) 3328–3332; Reynolds et al., Mol. Cell. Biol., 9 (1989) 3951–3958) transformierte Fibroblasten, Integrinmediierte Zelladhäsion (Nojima et al., J. Biol. Chem., 270 (1995) 15398–15402; Petch et al., J. Cell Science, 108 (1195) 1371–1379; Vuori und Ruoslahti, J. Biol. Chem., 270 (1995) 22259–22262) und PDGF stimulierte 3T3 Zellen (Rankin und Rozengurt, J. Biol. Chem., 269 (1994) 704–710).
Daher wurde durch Immunoblotten der Mono Q Fraktionen unter Verwendung eines Antikörpers gegen p130^cas die Möglichkeit getestet, das die p130 Phosphotyrosinbande p130^cas entspricht. Die 130 kDa Bande, welche p130^cas entspricht, eluierte in den gleichen Fraktionen wie die p130 Tyrosinphosphorylierte Bande und zeigte ein ähnlich scheinendes Molekulargewicht, was nahelegt, dass sie das gleiche Protein darstellen könnten. Darüber hinaus wurde von p130^cas gefunden, welches von diesen Fraktionen Immunopräziptiert wurde, auf Tyrosinreste phosphoryliert zu sein.
Eine Mutantenform von PTP-PEST (D199A) wurde mittels stellengerichteter Mutagenese erzeugt, und das Mutantenenzym wurde gereinigt, gefolgt einer Expression unter Verwendung von rekombinantem Baculovirus. Falls unter Verwendung von Tyrosinphosphoryliertem RCM-Lysozym Substrat geprüft, zeigte das gereinigte Mutantenenzym eine spezifische Aktivität auf, welche ungefähr 10,000fach geringer als jene des Wildtypenzyms war (Garton und Tonks, unveröffentlichte Daten). Dieses gereinigte Protein wurde an eine Affinitätsmatriz gebunden, welche einen anti-PTP-PEST monoklonalen Antikörper (AG25) umfasste, welcher an Protein A-Sepharose Kügelchen kovalent gebunden war, und anschließend mit jeder der Mono Q Fraktionen inkubiert wurde. Nach 45 Minuten Inkubation wurden mit der Mutanten-PTP-PEST assoziierte Proteine durch Zentrifugation gesammelt, die Kügelchen wurden gewaschen und SDS-PAGE Probenbuffer wurde hinzugegeben. Assoziierte Proteine wurden anschließend durch Immunoblotten unter Verwendung des monoklonalen Anti-Phosphotyrosin Antikörpers G104 analysiert.
Von dem Mutant-PTP-PEST Protein wurde gefunden, mit einem einzelnen Phosphotyrosin enthaltenden Protein zu assoziieren, wobei das Molekulargewicht (130 kDa) und Mono Q Elutionsstelle (Fraktionen 11–14) davon mit jenen von p130^cas übereinstimmten. Immunoblotten der PTP-PEST assoziierten Proteine unter Verwendung des p130^cas Antikörpers zeigte, dass das 130 kDa Tyrosinphosphorylierte Protein, welches durch das Mutant-PTP-PEST gefangen ist, in der Tat p130^cas ist. Diese Daten unterstützen weiterhin die Annahme, dass p130^cas ein möglicherweise physiologisch bedeutendes Substrat für PTP-PEST darstellt.
Bestimmen der strukturellen Eigenschaften von PTP-PEST, welches in die spezifische Wechselwirkung mit Tyrosinphosphoryliertem p130^cas eingebunden ist
Die Wechselwirkung zwischen p130^cas und PTP-PEST wurde weiterhin in Substrat Fang Versuchen unter Verwendung verschiedener gereinigter Formen von PTP-PEST untersucht, um Proteine von Pervanadat-behandelten HeLa Lysaten zu präzipitieren. Mehrere Affinitätsmatrizen wurden mit Pervanadat-behandelten HeLa Zelllysat inkubiert und Proteine, welche mit den Kügelchen assoziiert sind, wurden durch SDS-PAGE analysiert, gefolgt durch Immunoblotten mit Anti-Phosphotyrosin oder Anti-p130^cas Antikörpern.
Von der Wildtyp Volllängen Phosphatase wurde gefunden, keine stabile Assoziation mit Tyrosinphosphoryliertem p130^cas zu bilden, wohingegen sowohl das PTP-PEST (D199A) Mutantenprotein als auch eine Mutante, welche den aktiven Stelle Cysteinrest (C231S) nicht aufwies, p130^cas von dem Lysat spezifisch präziptierte. Die Unfähigkeit der Wildtyp Phosphatase Tyrosinphosphoryliertes p130^cas zu präziptieren, widerspiegelt vermutlich die transiente Beschaffenheit der gewöhnlichen Wechselwirkung zwischen PTP-PEST und Tyrosinphosphorylierte p130^cas wieder, auf welche wahrscheinlich geschlossen werden kann, sobald p130^cas durch PTP-PEST dephosphoryliert ist.
Da die C-terminalen 500 Aminosäuren von PTP-PEST mehrere Prolinreiche Bereiche umfassen, welche an src Homologie-3 (SH3) Domäne Bindesequenzen erinnern, erschien es plausibel, dass die Spezifizität der Wechselwirkung zwischen PTP-PEST und p130^cas zu einem gewissen Grad von einer Assoziierung dieser Segmente mit der SH3 Domäne von p130^cas abhängen könnte. Der mögliche Beitrag des C-terminalen Segments von PTP-PEST in der beobachteten spezifischen Wechselwirkung von PTP-PEST mit p130^cas wurde daher im weiteren Substrat Fangversuchen unter Verwendung von GST Fusionsproteinen behandelt, welche die katalytische Domäne von PTP-PEST sowohl in Wildtyp als auch Mutant (D199A) Formen alleine enthielten. Die Mutant-katalytische Domäne von PTP-PEST fusioniert an GST wurde gefunden die p130^cas Phosphotyrosinbande spezifisch zu präzipitieren, wohingegen sowohl das Wildtypfusionsprotein als auch GST alleine p130^cas nicht präzipitierten. Die spezifische Wechselwirkung zwischen PTP-PEST und p130^cas, welche in diesen Versuchen beobachtet wurde, scheint daher eine intrinsische Eigenschaft der katalytischen Domäne von PTP-PEST zu sein, welche der beobachteten Vorliebe der aktiven PTP-PEST katalytischen Domäne für eine Dephosphorylierung von p130^cas in vitro nacheifert.
Spezifizität einer Wechselwirkung zwischen Mutant-PTP-PEST und am Tyrosin phosphoryliertem p130^cas
Hinsichtlich der relativen Menge von am Tyrosin phosphoryliertem p130^cas in dem Pervanadat-behandelten HeLa-Zelllysat, wurde die Möglichkeit, dass das beobachtete selektive Binden von PTP-PEST inaktiven Mutant-Proteinen an p130^cas Substrat gerichtet (was die Menge dieses potentiellen Substrats relativ zu anderen Phosphotyrosin enthaltenden Proteinen reflektiert, welche in dem Lysat vorliegen) eher als enzymgerichtet war (was eine wirkliche Substratbevorzugung von PTP-PEST reflektiert) in Betracht gezogen; wobei diese Möglichkeit auf zwei Arten in Betracht gezogen wurde. Zuerst wurden inaktive Mutantformen der katalytischen Domäne von PTP1B verwendet, um potentielle Substrate für dieses Enzym von den Pervanadat-behandelten HeLa-Zelllysaten zu fangen. Es wurde wiederum gefunden, dass die Wildtyp Phosphatase zu einer stabilen Wechselwirkung mit irgendeinem Phosphotyrosin enthaltendem Protein nicht in der Lage war, wohingegen Mutantvarianten der PTP1B Phosphatasedomäne (welche Cys oder Asp Mutationen analog zu jenen umfassten, welche vorstehend für PTP-PEST beschrieben wurden) mit vielen Tyrosinphosphoryliertem Proteinen assoziiert waren. Dies war besonders für die Asparaginsäure Mutante von PTP1B (D181A) offensichtlich, von welcher es schien, im Wesentlichen alle Phosphotyrosin enthaltenden Proteine von dem Lysat mit ähnlicher Effizienz zu präziptieren. Diese Daten unterstreichen die spezifische Beschaffenheit der Wechselwirkung zwischen PTP-PEST und p130^cas, welche eine Eigenschaft zu sein scheint, welche der PTP-PEST katalytischen Domäne eher als eine Eigenschaft eigen ist, welche von allen PTP katalytischen Domänen geteilt wird.
Die Spezifizität der Wechselwirkung zwischen PTP-PEST und p130^cas wurde weiterhin folgend einer Pervanadat-Behandlung von mehreren verschiedenen Zelllinien (Wi38, 293, COS, MCF10A, C2C12, MvLu) behandelt, was eine verschiedene Anordnung von Tyrosinphosphorylierten Proteinen in jedem Fall ergab; die erhaltenen Lysate wurden mit SDS-PAGE analysiert, gefolgt von Anti-Phosphotyrosin Immunoblotten. Aliquots wurden mit PTP-PEST (D199A) Affinitätsmatriz oder Kontrollmatriz inkubiert, und mit PTP-PEST assoziierende Tyrosinphosphorylierte Proteine wurden durch SDS-PAGE und Immunoblotten mit Anti-Phosphotyrosin oder Anti-p130^cas Antikörpern wie vorstehend beschrieben analysiert.
In jedem Fall präziptierte das D199A Mutant-PTP-PEST Protein eine einzelne breite Phosphotyrosinbande mit einem ersichtlichen Molekulargewicht zwischen 120 und 150 kDa in verschiedenen Zelllinien, wohingegen die Affinitätsmatriz alleine kein Phosphotyrosin enthaltendes Protein präziptierte. Immunoblotten der Präziptate mit einem p130^cas Antikörper zeigte, dass das Protein, welches von allen Zelllysaten präziptierte, p130^cas entspricht; wobei die beobachtete Molekulargewichtsvariation zwischen verschiedenen Zelllinien vermutlich entweder Speziesunterschiede in dem Molekulargewicht von p130^cas oder eine Expression verschieden alternativ gespleißter Formen widerspiegelt (Sakai et al., EMBO J., 13 (1994) 3748–3756).
Die relative Menge von Tyrosinphosphoryliertem p130^cas in den PTP-PEST Präziptaten schien näherungsweise mit der Menge von p130^cas Protein in den Lysaten (Daten nicht gezeigt) zu korrelieren.
Ohne Berücksichtigung der Menge an Tyrosinphosphoryliertem p130^cas in den Lysaten war überraschenderweise p130^cas ausnahmslos das ausschließliche Phosphotyrosin enthaltende Protein in den Präzipitaten, sogar in 293 Zellen Lysaten, welche sehr wenig p130^cas Protein enthielten, welche aber eine große Varietät von anderen häufig Tyrosinphosphorylierten Proteinen zeigten. Ähnlich dazu trat keine sichtbare Phosphorylierung in irgendeiner Phosphotyrosinbande auf (Garton und Tonks, nicht veröffentlichte Daten), falls Lysate von pervanadat behandelten 293 Zellen (welche Tyrosinphosphoryliertes p130^cas in Mengen enthalten, welche durch Anti-Phosphotyrosin Immunoblotten des Lysats nicht nachweisbar sind), mit aktivem PTP-PEST inkubiert wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Affinität von PTP-PEST für p130^cas wesentlich größer als für irgendein anderes vorliegendes Substrat ist und betont weiterhin die bemerkenswerte Substrat Selektivität von PTP-PEST für p130^cas.
Vanadat-Inhibierung von am Tyrosin phosphorylierter p130^cas Assoziation mit Mutant-PTP-PEST
Eine beständige Beobachtung dieser Arbeit war, dass, im Gegensatz zu dem inaktiven Mutant-PTP-PEST, das Wildtyp Enzym nicht in einen stabilen Komplex mit am Tyrosin phosphoryliertem p130^cas assoziierte, was nahe legt, dass die beobachtete Assoziation auf eine aktive Stelle gerichtet ist. Um diese Möglichkeit zu untersuchen wurde Mutant-PTP-PEST (D199A) mit dem PTP-Inhibitor Vanadat zu verschiedenen Konzentrationen vor einer Zugabe von Pervandat behandelten HeLa Zelllysat inkubiert. Das Ausmaß einer Assoziation von p130^cas mit PTP-PEST wurde anschließend analysiert. PTP-PEST Affinitätsmatriz, welche Volllängen PTP-PEST (D199A) umfasste, welches an kovalent gebundene Protein A-Sepharose/Antikörper (AG25) Kügelchen gebunden war, wurde für 10 Minuten auf Eis in der Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von Natriumorthovanadat inkubiert. Die Proben wurden anschließend mit Aliquots des Pervanadat behandelten HeLa Zellen Lysats inkubiert; assoziierte Proteine wurden durch SDS-PAGE und Immunoblotten mit Anti-Phosphotyrosin oder Anti-p130^cas Antikörpern analysiert. Die Aktivität des Wildtyp PTP-PEST wurde ebenso unter den gleichen Bedingungen bestimmt, wobei Tyrosinphosphoryliertes ³²P markiertes RCM-Lysozym als Substrat verwendet wurde.
Von der Assoziation wurde gefunden durch Vanadat wirksam unterbrochen zu werden, mit einer Konzentrationsabhängigkeit ähnlich zu einer Vanadat Inhibierung des Wildtyps PTP-PEST, wobei eine vollständige Unterbrechung bei 10mM Vanadat beobachtet wird. Da eine PTP Inhibierung durch Vanadat vermutlich von einer direkten Wechselwirkung von Vanadat mit dem aktiven Stellen Cysteinrest des Enzyms (Denu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93 (1996) 2493–2498) herrührt, stützt dieses Ergebnis die Hypothese, dass die stabile Assoziierung von Mutant-PTP-PEST mit Tyrosinphosphoryliertem p130^cas durch direkte Wechselwirkungen zwischen aktiven Stellenresten in PTP-PEST, insbesondere der aktive Seiten Cysteinrest und Phosphotyrosin Reste in p130^cas, mediiert wird.
Assoziation von endogenem p130^cas mit transfiziertem Mutant-PTP-PEST in COS Zellen
Die vorliegend beschriebene Arbeit legt nachhaltig nahe, dass p130^cas ein mögliches, physiologisch bedeutendes Substrat für PTP-PEST darstellt. Um festzustellen, ob PTP-PEST mit p130^cas in intakten Zellen wechselwirkt, wurden COS Zellen mit Plasmiden transfiziert, welche Wildtyp oder Mutantformen von PTP-PEST (D199A oder C215S) kodieren. Die Zellen wurden 30 Minuten vor einer Lyse mit Pervanadat behandelt, PTP-PEST Proteine wurden Immunopräzipitiert, und assoziierte Tyrosinphosphorylierte Proteine wurden durch Anti-Phosphotyrosin Immunoblotten der erhaltenen Präzipitate analysiert. Lysate wurden ebenso mit kovalent gebundenen Protein A-Sepharose/Anti-PTP-PEST (AG25) Kügelchen inkubiert und assoziierte Proteine wurden durch SDS-PAGE und Immunoblotten mit Anti-Phosphotyrosin Antikörper analysiert.
Unter diesen Bedingungen war die p130^cas entsprechende Phosphotyrosin enthaltende Bande wiederum als einzige befähigt mit dem C231S PTP-PEST Protein zu assoziieren, was anzeigt, das p130^cas durch PTP-PEST als ein Substrat in einem intrazellulären Zusammenhang in der Anwesenheit einer großen Anzahl von alternativ möglichen Substraten spezifisch ausgewählt werden kann. Weder die Wildtyp noch die D199A Form von PTP-PEST konnte eine stabile Wechselwirkung mit Tyrosinphosphoryliertem p130^cas in mit Pervanadat-behandelten COS Zellen eingehen.
Das Binden von sowohl Wildtyp als auch D199A PTP-PEST an Tyrosinphosphoryliertes p130^cas unter diesen Bedingungen ist sehr wahrscheinlich durch die Anwesenheit von Pervanadat verhindert, welches an den aktiven Stellen Cysteinrest von PTP-PEST gebunden ist (Denu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93 (1996) 2493–2498), was das Binden von Phosphotyrosin Resten von p130^cas wirksam ausschließt. Die Befähigung des C231S Mutant-PTP-PEST in einen stabilen Komplex mit p130^cas in der Anwesenheit von Pervanadat zu assoziieren, legt nahe, dass dieses Mutantenprotein durch Pervanadat größtenteils nicht beeinträchtigt wird, was anzeigt, dass der gewöhnliche Inhibierungsmodus von PTPs durch Vanadationen von direkten Wechselwirkungen zwischen Vandadat und dem Thiolatanion des PTP aktiven Stelle Cysteinrests kritisch abhängt. Diese Beobachtungen stützen daher weiterhin das Vorliegen einer exklusiven Wechselwirkung zwischen PTP-PEST und p130^cas, welches gänzlich auf die aktive Stelle gerichtet zu sein scheint und daher die wirkliche, inhärente, hoch beschränkte Substrat Bevorzugung von PTP-PEST für p130^cas widerspiegelt.
Die hier beschriebenen Ergebnisse implizieren p130^cas als ein physiologisch relevantes Substrat für PTP-PEST. Darüber hinaus legt die beobachtete Stringenz und Ausschließlichkeit der Wechselwirkung zwischen PTP-PEST und p130^cas in einer großen Varietät von Zelllinien nahe, dass p130^cas ein Substrat einzigartig hoher Affinität für PTP-PEST sein kann, obgleich die Möglichkeit, dass andere wesentliche PTP-PEST Substrate existieren können, derzeit nicht ausgeschlossen werden kann. Es ist insbesondere unklar, ob Pervanadat behandelte Zellen ein komplettes Spektrum aller möglichen Tyrosinphosphorylierten Protein zeigen; in der Tat scheint dies unwahrscheinlich, da eine Behandlung mit Pervanadat vermutlich nur in einer Zunahme bei einer Tyrosin phosphorylierung von Proteinen führt, welche zu einem gewissen Grad konstitutiv phosphoryliert sind, welche allerdings für gewöhnlich in der Zelle schnell dephosphoryliert werden. Mögliche Substrate, welche von Pervanadat behandelten Zellen fehlen, umfassen daher vermutlich Substrate von Protein Tyrosin Kinasen (PTKs), welche für gewöhnlich in einem inaktiven Zustand vorliegen, wie beispielsweise Ligand-stimulierte Rezeptor PTKs und die jüngst beschriebene Kalzium regulierte Kinase PYK2 (Lev et al., Nature 376 (1995) 737–745). Ohne Berücksichtigung dieser Betrachtungen zeigt die Befähigung von PTP-PEST p130^cas ausschließlich als ein Substrat von Lysaten von mehreren verschiedenen Zelllinien auszuwählen, welche eine kombinierte Gesamtheit von zumindest 100 verschiedenen möglichen Substraten enthalten (wobei viele von denen vermutlich Multipel-Phosphorylierungsstellen enthalten), eindeutig, dass die Substratspezifität von PTP-PEST hoch beschränkt ist.
Viele intrazelluläre PTPs sind in ihrer Substrat Verfügbarkeit aufgrund einer starken Beschränkung in einer bestimmten subzellullaren Lokalisierung begrenzt; Beispiel umfassen PTP1B, welches an dem cytoplasmatischen Äußeren des endoplasmatischen Reticulums (Frangioni et al., Cell 68 (1992) 545–560) lokalisiert ist, und TCTPT, welches weder nuklear (Tillmann et al., Mol. Cell. Biol., 14 (1994) 3030–3040) oder an dem endoplasmatischen Reticulum lokalisiert vorliegt, in Abhängigkeit von welcher alternativ gespleißten Form exprimiert wird (Lorenzen et al., J. Cell. Biol. 131 (1995) 631–643). Alternativ dazu scheinen bestimmte PTPs hoch reguliert zu sein, was eine Aktivierung benötigt bevor eine nennenswerte Aktivität gezeigt werden kann. Beispielsweise zeigen die SH2 Domänen enthaltenen PTPs, SHP1 und SHP2, eine relativ geringe Aktivität in vitro, wobei sie allerdings durch mehrere Mechanismen, einschließlich einer C-terminalen Trunkation (Zhao et al., J. Biol. Chem., 268 (1993) 2816–2820), durch Zugabe von bestimmten Phospholipiden (Zhao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USa, 90 (1993) 4251–4255) oder SH2 Domänen mit Binden von geeigneten Phosphotyrosin enthaltenden Peptiden (Lechleider et al., J. Biol. Chem., 268 (1993) 21478–21481), beträchtlich aktiviert werden können.
PTP-PEST weist jedoch eine hohe spezifische Aktivität in vitro auf (35.000 E/mg), und ist überwiegend (90 %–95 %) ein lösliches PTP in Zellen (Garton und Tonks, nicht veröffentlichte Daten); grundsätzlich kann es daher auf irgendein Substrat wirken, welches dem Cytoplasma zugänglich ist. Diese Zugänglichkeit kann die Notwendigkeit von PTP-PEST teilweise unterstreichen eine inhärent beschränkte Substratspezifität aufzuweisen. Das Aufzeigen, dass Mutant-PTP-PEST mit p130^cas in einem intrazellulären Zusammenhang in der Anwesenheit von vielen anderen Tyrosinphosphorylierten Proteinen ausschließlich assoziieren kann, ist eine Anzeige, dass die enge Substratspezifität des Enzyms zu einem PTP-PEST führen kann, das einen geringfügigen Einfluss auf den Phosphorylierungszustand der Mehrheit von Tyrosinphosphorylierten Proteine in der Zelle aufweist, obgleich jene Substrate zum großen Teil PTP-PEST zugänglich sind.
Die Rolle von p130^cas in zellulärer Transformation durch v-crk und c-src Onkogene ist unklar, obgleich eine allgemeine Korrelation zwischen dem Niveau einer Tyrosin Phosphorylierung von p130^cas und dem Grad einer Transformation in Zellen besteht, welche verschiedene Formen von crk oder src exprimieren (Kanner et al., EMBO J., 10 (1991) 1689–1698; Mayer und Hanafusa, J. Virol., 64 (1990) 3581–3589). Darüber hinaus wurde eine erhöhte Tyrosin Phosphorylierung von p130^cas ebenso in Zellen beobachtet, welche durch c-Ha-ras und durch Ornithin-Decarboxylase Überexpression transformiert sind (Auvinen et al., Mol. Cell. Biol., 15 (1995) 6513–6525). Eine Expression von p130^cas in diesen Zellen kodierender antisense cDNA führt zu einer teilweisen Umkehr bzw. Rückartung des transformierten Phänotyps. Diese Beobachtungen legen nahe, dass eine fehlerhafte Tyrosinphosphorylierung von p130^cas eine gemeinsame Eigenschaft von Zellen ist, welche durch mehrere ungleiche Mechanismen transformiert werden, und dass p130^cas für eine vollständige Manifestation des transformierten Zustands erforderlich sein kann. Dephosphorylierung von p130^cas durch PTP-PEST stellt daher einen möglicherweise wichtigen regulatorischen Mechanismus für ein Entgegenwirken der transformierenden Wirkungen vieler Onkogene dar.
Tyrosin-Phosphorylierng von p130^cas wurde in Fibroblasten nach Integrin vermittelter zell-Adhäsion an extrazelluläre Matrixproteine beobachtet (Nojima et al., J. Biol. Chem. 270 (1995), 15398–15402; Petch et al., J. Cell Science 108 (1995), 1371–1379; Vuori and Ruoslahti, J. Biol. Chem. 270 (1995), 22259–22262). Unter diesen Bedingungen, unter Verwendung eines Antikörpers (4F), der hauptsächlich am Tyrosin-phosphoryliertes p130^cas erkennt, (Kanner et al., EMBO J. 10 (1991), 1689–1698; Petch et al., J. Cell Science 108 (1995), 1371–1379) wurde gezeigt, dass phosphoryliertes p130 an fokalen Adhäsionen lokalisiert ist (Petch et al., J. Cell Science 108 (1995), 1371–1379), während Fraktionierungsstudien zeigten, dass die normale zelluläre Lokalisierung der Hauptmenge des nicht phosphorylierten p130 das Cytosol ist (Sakai et al., EMBO J. 13 (1994), 3748–3756). Darüber hinaus wird das am Tyrosin-phosphorylierte p130 in crk-transformieren Fibroblasten nur in unlöslichen Fraktionen aufgefunden (Sakai et al., EMBO J.13 (1994), 3748–3756), was darauf hindeutet, dass die Zell-Adhäsions- und Transformations-vermittelte Phosphorylierung von p130^cas mit der Umverteilung des Proteins aus dem Zytosol zu fokalen Adhäsionen assoziiert ist.
Es ist wahrscheinlich, dass die Umverteilung des am Tyrosin-phosphorylierten p130 durch dessen Assoziierung mit FAK betrieben wird, das aufgrund seiner C-terminalen fokalen Adhäsions-Zieldomäne konstitutiv mit fokalen Adhäsionen assoziiert ist (Hildebrand et al., J. Cell Biol. 123 (1993), 993–1005; Schaller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5192-5196). Die Sequestrierung des am Tyrosin-phosphorylierten p130^cas in fokalen Adhäsionen in transformierten Zellen und auch nach einer Integrin-vermittelten Zell-Adhäsion weist stark darauf hin, dass p130^cas eine Rolle bei Signalisierungsabläufen in diesem Bereich der Zelle wahrnimmt. Eine Konsequenz der Umverteilung von am Tyrosinphosphorylierte p130^cas besteht wahrscheinlich darin, dass zusätzlich zu der Lokalisierung von p130^cas in einem Bereich der Zelle mit starker Tyrosinkinase-Aktivität, das phosphorylierte Protein für zytosolische Phosphatase PTP-PEST relativ unzugänglich ist. Dies eröffnet die Möglichkeit, dass die Rolle von PTP-PEST bei der Dephosphorylierung von p130^cas darin bestehen kann, dass eine unzweckmäßige Tyrosin-Phosphorylierung des cytosolischen p130^cas-Pools verhindert wird, so dass die Bildung von Signal-Komplexen, die sich um am Tyrosin-phosphoryliertes p130^cas anordnen, an nicht-geeigneten zellulären Orten verhindert wird.
Mehrere mitogene Faktoren stimulieren stark eine Phosphorylierung von p130^cas am Tyrosin. Diese Mittel wirken durch heterotrimere, mit G-Protein gekoppelte Rezeptoren, wie Lysophosphatidsäure (Seufferlein and Rozengurt, J. Biol. Chem. 269 (1994), 9345–9351), Bradykinin (Leeb-Lundberg et al., J. Biol. Chem. 269 (1994), 24328–24344), und Bombesin (Zachary et al., J. Biol. Chem. 267 (1992), 19031–19034), sowie Wachstumsfaktoren, die Rezeptor-Tyrosinkinasen aktivieren, d.h. PDGF (Rankin and Rozengurt, J. Biol. Chem. 269 (1994), 704–710), EGF und NGF (Ribon and Saltiel, J. Biol. Chem. 271 (1996), 7375–7380). Diese Beobachtungen suggerieren eine Beteiligung von p130^cas bei den mitogenen Signalwegen, welche wahrscheinlich einen Aufbau von Signalkomplexen beinhalten, die auf am Tyrosin-phosphorylierten p130^cas beruhen. Die Identitäten der in diesen Komplexen vorhandenen Proteine ist nicht bekannt, beinhalten jedoch wahrscheinlich SH2-Domänen enthaltende Adaptor-Proteine, wie crk (Ribon und Saltiel, J. Biol. Chem. 271 (1996), 7375–7380), und deren assoziierte Proteine (Feller et al., Oncogene 10 (1995), 1465–1473; Hasegawa et al., Mol. Cell. Biol. 16 (1996), 1770–1776; Knudsen et al., J. Biol. Chem. 269 (1994), 32781–32787; Matsuda et al., Mol. Cell. Biol. 14 (1994), 5495–5500; Tanaka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3443–3447). Tyrosin-Phosphorylierung und Tyrosin-Dephosphorylierung von p130^cas spielt daher möglicherweise eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Bildung derartiger Komplexe, was stromabwärts auftretende Vorfälle bei der mitogenen Signalübertragung beeinflußt. SEQUENCE LISTING

Claims

Mutiertes Tyrosinphosphatase-Protein, worin der invariante Aspartat-Rest mit einer Aminosäure ersetzt wurde, welche: a) zu einer attenuierten katalytischen Aktivität der Phosphatase und zu einer Reduktion des K_cat auf weniger als eine Minute führt, und b) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin Phenylalanin, Tryptophan, Methionin, Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Glutamin, Lysin, Arginin und Histidin, worin die mutierte Phosphatase die Fähigkeit beibehält, an ein Substrat mit phosphoryliertem Tyrosin zu binden, und worin der zu ersetzende invariante Aspartat-Rest identifiziert wird durch (i) Ausrichten der Aminosäuresequenz der katalytischen Phosphatasedomäne der Phosphatase mit der Aminosäuresequenz von mindestens einer katalytischen Domäne eines Tyrosinphosphatase-Proteins in den 1A bis 1E, und (ii) Lokalisieren des invarianten Aspartat-Restes der Phosphatase in einer Position, welche der Position des invarianten Aspartat-Restes in der mindestens einen katalytischen Domäne des Tyrosinphosphatase-Proteins in den 1A bis 1E entspricht.
Mutiertes Tyrosinphosphatase-Protein nach Anspruch 1, welches entweder (I) ausgewählt ist unter: PTB1B, worin der invariante Aspartat-Rest in Position 181 lokalisiert ist, PTP-PEST, worin der invariante Aspartat-Rest in Position 199 lokalisiert ist, PTPγ, MKP-1, DEP-1, PTPμ, PTPX1, PTPX10, und PTPH1, oder (II) eine PTP-PEST Phosphatase ist, worin der invariante Aspartat-Rest in Position 199 lokalisiert wurde und worin die Aminosäure in Position 231 mit einem Serin-Rest ersetzt wurde.
Mutiertes Tyrosinphosphatase-Protein nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der invariante Aspartat-Rest mit einem Alanin-Rest ersetzt wurde.
Verfahren zur Identifizierung eines am Tyrosin phosphorylierten Proteins, welches ein Substrat eines Tyrosinphosphatase-Proteins ist, welches die Schritte umfasst: a) Kombinieren von mindestens einem am Tyrosin phosphorylierten Protein mit mindestens einem mutierten Tyrosinphosphatase-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 unter Bedingungen, welche zur Bildung eines Komplexes zwischen dem am Tyrosin phosphorylierten Protein und dem mutierten Tyrosinphosphatase-Protein geeignet sind, wodurch eine Kombination gebildet wird, und b) Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Komplexes in der Kombination, worin die Anwesenheit eines Komplexes in der Kombination zeigt, dass das am Tyrosin phosphorylierte Protein ein Substrat des Tyrosinphosphatase-Proteins ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das am Tyrosin phosphorylierte Protein ausgewählt ist unter: p130_cas, dem EGF Rezeptor, p210 bcr:abl, der MAP-Kinase und dem Insulinrezeptor.
Kit zur Identifizierung eines am Tyrosin phosphorylierten Proteinsubstrats eines Tyrosinphosphatase-Proteins umfassend: a) mindestens ein mutiertes Tyrosinphosphatase-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, und b) Hilfsreagenzien, welche zur Verwendung beim Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Komplexes zwischen dem mutierten Tyrosinphosphatase-Protein und einem am Tyrosin phosphorylierten Protein geeignet sind.
Verfahren zur Identifizierung eines Mittels, welches die Interaktion zwischen einem Tyrosinphosphatase-Protein und einem am Tyrosin phosphorylierten Protein ändert, welches die Schritte umfasst: a) Identifizieren eines am Tyrosin phosphorylierten Proteins, welches ein Substrat eines Tyrosinphosphatase-Proteins ist, gemäß dem Verfahren nach Anspruch 4 oder 5. b) Kombinieren des am Tyrosin phosphorylierten Proteins und des Wildtyp-Tyrosin phosphatase-Proteins und eines zu untersuchenden Mittels unter Bedingungen, welche zur Interaktion zwischen dem am Tyrosin phosphorylierten Protein und dem Wildtyp-Tyrosinphosphatase-Protein geeignet sind, wodurch eine Kombination gebildet wird. c) Bestimmen der Menge an enzymatischer Aktivität in der Kombination, und d) Vergleichen der Menge an in (c) bestimmter enzymatischer Aktivität mit der Menge an enzymatischer Aktivität in Abwesenheit des zu untersuchenden Mittels, unter Bedingungen, welche zur Interaktion zwischen dem am Tyrosin phosphorylierten Protein und dem Wildtyp-Tyrosinphosphatase-Protein geeignet sind, worin ein Unterschied an enzymatischer Aktivität anzeigt, dass das Mittel die Interaktion zwischen dem Wildtyp-Tyrosinphosphatase-Protein und dem am Tyrosin phosphorylierten Protein ändert.
Verfahren zur Identifizierung eines Mittels, welches die Interaktion zwischen einem Tyrosinphosphatase-Protein und einem am Tyrosin phosphorylierten Protein, welches ein Substrat des Tyrosinphosphatase-Proteins ist, ändert, welches die Schritte umfasst: a) Identifizieren eines am Tyrosin phosphorylierten Proteins, welches ein Substrat eines Tyrosinphosphatase-Proteins ist, gemäß dem Verfahren von Anspruch 4 oder 5, b) Kombinieren des am Tyrosin phosphorylierten Proteins, eines mutierten Tyrosinphosphatase-Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und eines zu untersuchenden Mittels unter Bedingungen, welche zur Interaktion zwischen dem am Tyrosin phosphorylierten Protein und dem mutierten Tyrosinphosphatase-Protein geeignet sind, wodurch eine Kombination gebildet wird, c) Bestimmen des Ausmaßes an Bindung zwischen dem am Tyrosin phosphorylierten Protein und dem mutierten Tyrosinphosphatase-Protein in der Kombination, und d) Vergleichen des Ausmaßes der in (c) bestimmten Bindung mit dem Ausmaß an Bindung in Abwesenheit des zu untersuchenden Mittels, unter Bedingungen, welche zur Interaktion zwischen dem am Tyrosin phosphorylierten Protein und dem mutierten Tyrosinphosphatase-Protein geeignet sind, worin ein Unterschied im Ausmaß der Bindung zeigt, dass das Mittel die Interaktion zwischen dem Tyrosinphosphatase-Protein und dem am Tyrosin phosphorylierten Protein ändert.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, worbei die Menge an enzymatischer Aktivität oder das Ausmaß der Bindung jeweils ist: a) in Anwesenheit des zu untersuchenden Mittels größer als in Abwesenheit des zu untersuchenden Mittels, wobei dann das Mittel die Interaktion zwischen dem Tyrosinphosphatase-Protein und dem am Tyrosin phosphorylierten Protein erhöht, oder b) in Anwesenheit des zu untersuchenden Mittels kleiner als in Abwesenheit des Mittels, wobei dann das Mittel die Interaktion zwischen dem Tyrosinphosphatase-Protein und dem am Tyrosin phosphorylierten Protein inhibiert.
Mutiertes Tyrosinphosphatase-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung in der Therapie, Prophylaxe oder bei der Diagnose.
Mutiertes Tyrosinphosphatase-Protein nach Anspruch 10 zur Verwendung in einem von a) der Reduzierung der Aktivität eines am Tyrosin phosphorylierten Proteins, das ein Substrat des Tyrosinphosphatase-Proteins ist und/oder b) einem Verfahren zur Reduzierung der Aktivität eines am Tyrosin phosphorylierten Proteins, das ein Substrat des Tyrosinphosphatase-Proteins ist, welches umfasst, Verabreichen eines mutiertes Tyrosinphosphatase-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 an einen Säuger, wodurch die Bildung eines Komplexes zwischen dem am Tyrosin phosphorylierten Protein und dem mutierten Tyrosinphosphatase-Protein die Aktivität des am Tyrosin phosphorylierten Proteins reduziert und/oder c) der Reduzierung von Transformierungs-Effekten von Onkogenen, welche mit einer Phosphorylierung von p130_cas assoziiert sind, und/oder d) einem Verfahren zur Reduzierung von Transformierungs-Effekten von Onkogenen, welche mit der Phosphorylierung von p130_cas assoziiert sind, welches umfasst, Verabreichen eines Tyrosinphosphatase-Protein (PTP), welches PTP-PEST ist oder ein mutiertes PTP-PEST nach Anspruch 2 ist an einen Säuger, wodurch das PTP an P130_cas bindet und/oder dieses dephosphoryliert, wodurch die Transformierungs-Effekte von Onkogenen, welche mit der Phosphorylierung von P130_cas assoziiert sind, reduziert werden, und/oder e) der Behandlung, Therapie, Diagnose oder Prophylaxe von Krebs, einschließlich Krebsarten, welche mit der Phosphorylierung von P130_cas assoziiert ist und/oder f) der Reduzierung der Bindung von Signalkomplexen, welche mit P130_cas assoziiert sind, und/oder g) einem Verfahren zur Reduzierung der Bildung von Signalkomplexen, welche mit P130_cas assoziiert sind, welches umfasst, Verabreichen eines Tyrosinphosphatase-Proteins (PTP), welches PTP-PEST ist oder mutiertes PTP-PEST nach Anspruch 2 an einen Säuger, wobei das PTP an P130_cas bindet oder dieses dephosphoryliert, wodurch die Bildung von Signalkomplexen, welche mit P130_cas assoziiert sind, abnimmt, und/oder h) der Verhinderung der Induzierung des mitogenen Weg, und/oder i) der Reduzierung der cytotoxischen Auswirkung, die mit der Verabreichung oder Überexpression von Tyrosinphosphatase-Protein assoziiert sind, und/oder j) ein Verfahren zur Reduzierung der cytotoxischen Auswirkungen, die mit der Verabreichung oder Überexpression von Tyrosinphosphatase-Protein assoziiert sind, umfassend, Vrabreichen eines mutierten Tyrosinphosphatase-Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 an einen Säuger, anstelle des entsprechenden Wildtyp-Tyrosinphosphatase-Protein.
Verwendung eines Tyrosinphosphatase-Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung, Prophylaxe oder Diagnose.
Verwendung nach Anspruch 12 zur Behandlung von Krebs, wobei die Behandlung: a) Verabreichen eines mutierten Tyrosinphosphatase-Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 an einen Säuger umfasst, wobei die Bildung eines Komplexes zwischen dem mutierten Tyrosinphosphatase-Protein und einem am Tyrosin phosphorylierten Protein, welches ein Substrat des Tyrosinphosphatase-Proteins ist, wodurch die Aktivität des am Tyrosin phosphorylierten Proteins reduziert wird, oder b) die transformierenden Effekte von Onkogenen, welche mit P130_cas Phosphorylierung assoziiert sind, reduziert, und umfasst, Verabreichen eines Tyrosinphosphatase-Protein (PTP), welches PTP-PEST oder mutiertes PTP-PEST nach Anspruch 2 ist an einen Säuger, wobei das PTP an P130_cas bindet oder dieses dephosporyliert, wodurch die strom abwärts gelegenen Effekte von P130_cas negativ reguliert werden, und wodurch die transformierenden Effekte von Onkogenen, welche mit der Phosphorylierung von P130_cas assoziiert sind, reduziert werden, oder c) die Bildung von Signalkomplexen, welche mit P130_cas assoziiert sind, reduziert, und umfasst, Verabreichen eines Tyrosinphosphatase-Proteins (PTP), welches PTP-PEST oder mutiertes PTP-PEST nach Anspruch 2 ist an einen Säuger, wodurch das PTP an P130_cas bindet oder dieses dephosporyliert, wodurch die stromabwärts gelegenen Effekte von P130_cas negativ reguliert werden und wodurch die Bildung von Signalkomplexen, welche mit P130_cas assoziiert sind, reduziert werden, oder d) die cytotoxischen Auswirkungen, welche mit der Verabreichung oder Überexpression von Tyrosinphosphatase-Protein assoziiert sind, reduziert, und umfasst, Verabreichen eines mutierten Tyrosinphosphatase-Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 an einen Säuger anstelle eines entsprechenden Wildtyp-Tyrosinphosphatase-Proteins.
Verwendung nach Anspruch 13(a), wobei das am Tyrosin phosphorylierte Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: P130_cas, dem EGF Rezeptor, p210 bcr:abl, der MAP-Kinase und dem Insulinrezeptor und/oder wobei das Tyrosinphosphatase-Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus PTP1B, PTP-PEST, PTPγ, MKP-1, DEP-1, PTPμ, PTPX1, PTPX10 und PTPH1.
Verwendung nach Anspruch 13(b), wobei das Onkogen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: v-crk, v-src und c-Ha-ras.
Verwendung nach Anspruch 13(c), wobei die Behandlung die Induktion des mitogenen Wegs verhindert.
Verwendung nach Anspruch 11 oder 13 bis 16, wobei der Säuger ein Mensch ist.