DE69636074T2

DE69636074T2 - Isolierung der mikrodomänen von kaveolae und gpi verankerten proteinen

Info

Publication number: DE69636074T2
Application number: DE69636074T
Authority: DE
Inventors: E. Jan Boston SCHNITZER
Original assignee: Beth Israel Deaconess Medical Center Inc; Beth Israel Hospital Association
Current assignee: Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
Priority date: 1995-09-08
Filing date: 1996-09-05
Publication date: 2007-05-03
Anticipated expiration: 2016-09-06
Also published as: WO1997009055A1; AU705945B2; EP0848614B1; ATE324114T1; AU7013796A; DE69636074D1; EP0848614A1; JPH11514348A; JP2008189674A; US6255457B1; CA2228604A1

Description

Cholesterol und Glycolipide assoziieren sich selbst zur Bildung von organisierten, zusammengesetzten Mikrodomänen in Lipid-Doppelschichten (Thompson, T.E., et al., Annu. Rev. Biophys. Chem. 14: (1985), 361). Glycosyl-Phosphatidylinsositol (GPI)-verankerte Proteine und andere Lipid-vernetzte Proteine können sich vorzugsweise in Glycolipid Mikrodomänen teilen, die einer nicht ionischen Detergenz-Solubilisierung (Schroeder, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: (1994), 12130; Brown, D.A. and Rose, J.K., Cell: 68 (1992); Letarte-Murhead, M., et al., Biochem. J. 143: (1974); 51; Hoessli, D. and Runger-Brandle, E., Exp. Cell. Res. 166 (1985), 239; Hooper, N.M. and Turner, A.J., Biochem. J. 250: (1968), 865; Sargiacomo, M., et al., J. Cell. Biol. 122 (1993), 789; Lisanti, M.P., et al., J. Cell. Biol. 123: (1993), 595 widerstehen können. GPI-verankerte Proteine scheinen in dem Trans-Golgi Netzwerk in Glycolipid, Detergenz-resistente "Fundamente" (rafts) für eine polarisierte Lieferung zu der Zelloberfläche durch Caveolin-reiche glatte exocytoxische Trägervehikel (Brown, D.A. and Rose, J.K., Cell 68: (1992), 533; Sargiacomo, M. et al., J. Cell. Biol. 122: (1993), 789; Lisanti, M.P., et al., J. Cell. Biol. 123: (1993), 595; Brown, D., et al., Science 245: (1989), 1499; Simons, K. and van Meer, G., Biochemistry 27: (1988), 6197; Garcia, M., et al., J. Cell Sci. 104: (1993), 1281; Kurzchalia, T.V., et al., J. Cell Biol. 118: (1992), 1003; Dupree, P., et al., EMBO J. 12: (1993), 1597; Hannan, L.A., et al., J. Cell. Biol. 120: (1993), 353) aufgeteilt zu sein. Von Ihnen wird angenommen, auf der Zelloberfläche in ebenen Membran Invaginationen vorzuliegen, die als Caveolae (Rothberg, K.G., et al., J. Cell. Biol. 110: (1990), 637; Ying, Y., et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 57: (1992), 593; Ryan, U.S., et al. J. Appl. Physiol. 53: (1982), 914; Stahl, A. and Mueller, B.M. J. Cell Biol. 129: (1995), 335) bekannt sind, die offensichtlich ebenso reich an Glycolipiden, Cholestorol und Caveolin (Kurzchalia, T.V., et al., J. Cell Biol. 118: (1992), 1003; Dupree, P., et al., EMBO J. 12: (1993), 1597; Parton R.G., J. His tochem. Cytochem. 42: (1994), 155; Rothberg, K.G., et al., Cell 68: (1992), 673; Schnitzer, J.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: (1995), 1759; Montessano, R., et al., Nature 296: (1982), 651) sind. Ein Vernetzen von Zelloberflächen Glycolipiden mit Antikörpern (Thompson, T.E., et al., Annu. Rev. Biophys. Chem. 14: (1985), 361) und GPI-vernetzten Proteinen (Mayor, S., et al., Science 264 (1994), 1948) kann eine Sequestrierung in Cluster erhöhen und offensichtlich durch Lipid-verankerte nicht-Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (NRTKs) (Stefanova, I:, et al., Science 245: (1991), 1016; Shenoy-Scaria; A.M., et al., J. Immunol. 149: (1992), 3535; Thomas, P.M. and Samelson, L.E., J. Biol. Chem. 267: (1992), 12317; Cinek, T. and Horejsi, V., J. Immunol. 149: (1992), 2262) eine Zellaktivierung induzieren (Thompson, T.E., et al., Annu. Rev. Biophys. Chem. 14 (1985), 361; Thompson L.F., et al., J. Immunol 143: (1969), 1815; Korty, P.E., et al., J. Immunol. 146 (1991), 4092; Davies, L.S., J. Immunol. 141: (1988), 2246). Caveolae wurden nicht nur mit Signalisierung, aber ebenso mit Transport über Endocytose, Transcytose und Photocytose (Montessano, R., et al., Nature 296: (1982), 651; Schnitzer, J.E., Trends Cardiovasc. Med. 3: (1993), 124; Oh. P., et al., J. Cell Biol. 127: (1994), 1217; Schnitzer and Oh, P., J. Biol. Chem. 269: (1994), 6072); Millci, A.J., et al., J. Cell Biol. 105: (1987), 2603; Anderson, R.G.W., et al., Science 265: (1992), 410) in Verbindung gebracht. Triton-unlösliche Membranen von niedriger Dichte werden häufig mit Caveolae (Sargiacomo, M., et al., J. Cell. Biol. 122: (1993), 789; Lisanti, M.P., et al., J. cell. Biol. 123: (1993), 595; Chang, W.-J., et al., J. cell. Biol. 126: (1994), 127; Lisanti, M.P., et al., J. Cell. Biol. 126: (1994), 111) gleichgesetzt. Die physiologischen Funktionen von, und Zusammenhänge zwischen Caveolae, Detergenz-resistenten Mikrodomänen und verschiedenen Lipid-verankerten Molekülen verbleiben unbestimmt.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Mikrodomänen oder Komponenten der Zelloberfläche oder Plasmamembran; die resultierenden gereinigten Mikrodomänen und Komponenten (beispielsweise Proteine, Peptide, Lipide, Glycolipide); Antikörper gegen die gereinigten Domänen und Komponenten; und Verwendungen dafür. In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Reinigung von Mikrodomänen und Plasmamembranen und/oder Komponenten, einschließlich von Caveolae, Mikrodomänen von GPI-verankerten Proteinen (G-Domänen) und Membranfragmenten, die im Wesentlichen aus Caveolae und G-Domänen, Detergenz sensitiven (Detergenz löslichen) Mikrodomänen und Cytoskelett Komponenten bestehen; die resultierenden gereinigten Mikrodomänen und Komponenten und Verwendungen dafür.
Plasmamembran Komponenten, die durch Verfahren der vorliegenden Erfindung gereinigt wurden, sind beim direkten oder indirekten Transport von Molekülen, wie Plasmamembran Komponenten, die durch Verfahren der vorliegenden Erfindung gereinigt wurden, sind beim direkten oder indirekten Transport von Molekülen, wie beispielsweise Arzneimittel, DNA Moleküle oder Antikörpern in verschiedenen Zellen (beispielsweise Epithel-, Endothel- und Fettzellen) von Nutzen. Beispielsweise werden derartige Agenzien, die auf Caveolae in Endothelium gerichtet sind, durch die Caveolae in und/oder über das Endothelium transportiert, und sind daher beim Durchbrechen einer kritischen Barriere von Nutzen, die ein Eindringen von vielen Molekülen, einschließlich von Arzneimitteln, in die meisten Gewebe des zirkulierenden Bluts behindert. Caveolae und andere Plasmamembran Komponenten, wie hierin beschrieben identifiziert, können zu einer Identifizierung von Mechanismen oder Wegen verwendet werden, durch welche Moleküle in Zellen, insbesondere Endothelzellen, durch die Wirkung von Caveolae, G-Domänen und anderen Plasmamembran Domänen und Komponenten befördert werden können. Beispielsweise können in Caveolae angesiedelte Moleküle durch Antikörper oder natürliche Liganden auf caveolare Proteine oder Rezeptoren, wie beispielsweise der Insulinrezeptor, gezielt (targeted) werden, wodurch Agenzien, die an den Antikörper oder Liganden konjugiert sind in und/oder über das Endothelium gebracht wurden. Alternativ können gereinigte Caveolae modifiziert werden, um als Arzneimittel Liefervehikel zu dienen, wie beispielsweise durch deren Einbringen in ein Agens, wie beispielsweise ein Arzneimittel, einschließlich eines Peptids oder kleinen organischen Moleküls; ein Gen, das ein therapeutisches oder diagnostisches Peptid-Protein kodiert, oder ein Antikörper. Die erhaltenen, modifizierten, gereinigten Caveolae können in ein Individuum eingebracht werden, in welchem sie zu einer Lieferung des Agens wirken.
In dem vorliegenden Verfahren, werden Plasmamembranen von einem Zelltyp von Interesse gereinigt, wie beispielsweise Endothelzellen, unter Verwendung eines Verfahrens, wie beispielsweise jenem, das in U.S.S.N. 5,281,700 und Schnitzer, J.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92: (1995), 1759-1763 beschrieben ist.
Die gereinigten Plasmamembranen wurden anschließend in spezifische Komponenten oder Mikrodomänen subfraktioniert. Plasmamembran Mikrodomänen umfassen Caveolae, Mikrodomänen von GPI-verankerten Proteinen (G-Domänen) und Plasmamembran Mikrodomänen, die im Wesentlichen aus Caveolae bestehen, G-Domänen und Caveolae, die mit G-Domänen assoziiert sind bzw. zusammenhängen. Andere Mikrodomänen umfassen Detergenz lösliche Domänen und Domänen, die Cytoskelett Komponenten umfassen.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, wird eine Zell-Plasmamembran, wie beispielsweise eine Endothelzell-Plasmamembran, durch Ändern einer physikalischen Eigenschaft spezifisch markiert, wie beispielsweise durch Erhöhen ihrer Dichte; der Änderung einer physikalischen Eigenschaft der Membran, wie beispielsweise einer erhöhten Dichte, wird als eine Basis für ein Trennen der Plasmamembran von den anderen Zellbestandteilen (beispielsweise Reinigen der Plasmamembranen) verwendet. In einer Ausführungsform bedingt das vorliegende Verfahren der Reinigung von Caveolae oder G-Domänen, ein Siliziumbeschichten von Plasmamembranen und umfasst zwei wesentliche Phasen: Reinigen von Zell-Plasmamembranen und Reinigen von Subfraktionen oder Mikrodomänen der Plasmamembranen.
Die gereinigten Zell-Plasmamembranen werden subfraktioniert und die gewünschte Membrankomponente oder Mikrodomäne wird von der geeigneten Subfraktion isoliert, was zu einer Isolierung der gereinigten Plasmamembran Mikrodomäne oder Komponenten führt. In dieser Ausführungsform werden die luminalen Endothelzell-Plasmamembranen (für gewöhnlich dem zirkulierenden Blut ausgesetzt) mit einer Suspension von kationischen, kolloidalen, Silica-partikeln beschichtet, wie beispielsweise durch eine in situ Perfusion bzw. künstliche Durchblutung einer Lungenvaskulatur. Dieses Beschichtungsverfahren bildet eine stabile Membranpellikula (beispielsweise an der luminalen Endothelzell-Oberfläche angebracht), was nach einer Gewebe Disruption bzw. Aufschluss (beispielsweise durch Homogenisierung) zu mit Silica beschichteten Membran Blättern (sheets) führt, die von den verbleibenden Zellfragmenten oder Komponenten basierend auf Dichteunterschieden (beispielsweise durch Zentrifugation) getrennt werden, was zur Herstellung von mit Silica beschichteten Plasmamembran-Pellets führt (in diesem Fall Silica-beschichtete luminale Endothelzell-Plasmamembran-Pellets). Gemäß von sowohl biochemischen als auch morphologischen Kriterien, stellen diese Pellets gereinigte Plasmamembranen mit Caveolae dar, die immer noch angebracht sind, und keine, falls irgendeine, Verunreinigung von anderen Quellen aufweisen.
Gereinigte, Silica-beschichtete Endothel-Plasmamembranen werden gemäß der geeigneten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens prozessiert, um die gewünschte Plasmamembran-Mikrodomäne zu isolieren, wie beispielsweise Caveolae und/oder Mikrodomänen von GPI-verankerten Proteinen (G-Domänen).
Caveolae, die sich auf der Cytoplasmaseite der Plasmamembran befinden (entgegengesetzt zu der Silica-Beschichtung in den Silica-beschichteten Membran-Pellets) werden wie nachstehend isoliert: Silica-beschichtete Membran-Pellets werden einem Membran-Disruptionsverfahren unterzogen, wie beispielsweise einer Scherung oder Ultraschallbehandlung um die Caveolae von dem stabilisierten Silica-beschichteten Membran-Pellet strippen bzw. abzustreifen. Beispielsweise wird eine Membrandisruption, die ein selektives Entfernen von Caveolae von einer Silica-beschichteten Plasmamembran verursacht, durch eine Scherung während einer Homogenisierung durchgeführt und kann in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Detergenz auftreten. Caveolae werden von den verbleibenden Silica-beschichteten Membranen basierend auf Dichte gereinigt, wie beispielsweise durch eine Sucrose Dichtegradient-Zentrifugation. Die erhaltenen gereinigten Caveolae sind im Wesentlichen frei von GPI-verankerten Proteinen und stellen gereinigte Caveolae nach morphologischen und biologischen Kriterien dar.
Durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung werden G-Domänen getrennt von Caveolae isoliert, indem Silica-beschichtete Plasmamembranen bereits von Caveolae gestrippt einer hohen Salzkonzentration von ungefähr 1,0 molar unterzogen werden. Dies führt zu verringerten elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den kationischen Silicapartikeln und der polyanionischen Plasmamembran und verursacht daher eine Trennung der Plasmamembran von der Silica-Beschichtung. Dieses Material (die Plasmamembran die nicht länger an der Silica-beschichteten Pellicula haftet) wird in der Anwesenheit eines geeigneten Detergenz (beispielsweise Triton X-100) homogenisiert. Eine Membrandisruption tritt bei einer geeigneten Temperatur auf, die im Allgemeinen von 4°C bis ungefähr 8°C reicht. Eine niedrige Temperatur ist hauptsächlich notwendig, falls ein Detergenz verwendet wird, da Caveolae ausschließlich bei geringen Temperaturen Detergenz resistent sind. Die G-Domänen enthaltende Membran-Fraktion wird isoliert (von anderen Homogenatkomponenten gereinigt) basierend auf Dichte, wie beispielsweise durch Sucrose Dichtegradient-Zentrifugation. Die erhaltenen gereinigten G-Domänen sind reich an GPI-verankerten Proteinen und im Wesentlichen frei von Caveolae und Caveolae-Markern.
Plasmamembran-Mikrodomänen bestehen im Wesentlichen aus Caveolae und G-Domänen und werden zusammen durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert, indem die Silica-beschichteten Plasmamembran Pellets isoliert werden. Die Silica-beschichteten Plasmamembran-Pellets mit haftenden Caveolae werden wie vorstehend beschrieben einer hohen Salzkonzentration unterzogen, um die Plasmamembran von der Silica-Beschichtung zu trennen. Die getrennte Plasmamembran wird in der Anwesenheit eines geeigneten Detergenz (beispielsweise Triton X-100) homogenisiert und Detergenz resistente Membran-Domänen von geringer Dichte werden basierend auf Dichte getrennt, wie beispielsweise durch Sucrose Dichtegradient-Zentrifugation, und gereinigt. Diese Membran-Domänen bestehen im Wesentlichen aus Caveolae, G-Domänen und Caveolae, die mit G-Domänen zusammenhängen.
Die Erfindung betrifft weiterhin gereinigte Caveolae, die im Wesentlichen frei von anderen Plasmamembran Komponenten sind; gereinigte Mikrodomänen von GPI-verankerten Proteinen (gereinigten G-Domänen), die im Wesentlichen frei von anderen Membrankomponenten sind; und Membrandomänen, die im Wesentlichen aus Caveolae bestehen, die mit Mikrodomänen von GPI-verankerten Proteinen assoziiert sind, die im Wesentlichen frei von anderen Plasmamembran Komponenten sind.
Die gereinigten Caveolae, G-Domänen, und co-isolierten Caveolae und G-Domänen sind für die Identifizierung von Molekülen und Proteinen nützlich, die in intra- oder transzellulären Transport und Zelloberfläche Signalübertragung und Kommunikation einbezogen sind. Sie erlauben es daher, neue Mittel zu identifizieren, durch welche Moleküle an Plasmamembran geliefert werden können und, falls gewünscht, in die Zelle eintreten, über einer Seite der Zelle zu der anderen Seite oder der Zelle ein Signal bereitstellen, das ihre Funktion ändert. Die gereinigten Caveolae und die gereinigten G-Domänen können beispielsweise verwendet werden, um spezifische Sonden oder Antikörper herzustellen. Antikörper, die für die Caveolae oder die gereinigten G-Domänen spezifisch sind, können als Vektoren verwendet werden, um auf die Caveolae oder G-Domänen abzuzielen und den Transport von Molekülen über die Plasmamembran zu beeinflussen. Derartige Vektoren können als LieferAgenzien in und/oder über die Zelle, wie beispielsweise Arzneimittel, Gene oder Antikörper verwendet werden und insbesondere zur Lieferung von Agenzien in und/oder über das Endothelium.
Die gereinigten Caveolae und die G-Domänen der vorliegenden Erfindung können zusätzlich für eine Lieferung von Agenzien in und/oder über die Zelle verwendet werden, wie beispielsweise Arzneimittel, Gene oder Antikörper und insbesondere für eine Lieferung von Agenzien in und/oder über das Endothelium. Diese Domänen können ebenso als Transfervehikel verwendet werden. Lipid-verankerte Moleküle, die zu den gereinigten Caveolae oder gereinigten G-Domänen hinzu gegeben wurden oder natürlich vorgefunden werden, können beispielsweise bei einem Einbringen in die periphere Blutzirkulation mit Blutgefäß Endothelium wechselwirken und auf jenes Endothelium, einschließlich direkt in die Plasmamembran, übertragen werden.
Die 1 ist eine schematische Darstellung einer Isolierung von hoch gereinigten Plasmamembran Caveolae.
Die 2 ist eine schematische Darstellung einer Isolierung von GPI-verankerten Protein-Mikrodomänen von Plasmamembranen.
Die 3 ist eine schematische Darstellung einer Isolierung von Caveolae, die mit GPI-verankerten Protein-Mikrodomänen assoziiert sind.
Die 4 ist eine graphische Darstellung der prozentualen Verteilung von spezifischen Proteinen in Plasmamembran Subfraktionen.
Die vorliegende Erfindung betrifft gereinigte Plasmamembran Mikrodomänen und Komponenten; Verfahren zur Herstellung der gereinigten Plasmamembran-Mikrodomänen und Komponenten; Antikörper, die für die gereinigten Plasmamembran-Mikrodomänen und Komponenten spezifisch sind; und Verwendungen für diese gereinigten Plasmamembran-Mikrodomänen und Komponenten, einschließlich ein Identifizieren von Molekülen, die in intra- oder transzellulären Transport oder Zelloberflächen Signalübertragung und Kommunikation einbezogen sind und Abzielen auf das Endothelium (beispielsweise für ein Liefern eines Agens oder zur Gentherapie). Das vorliegende Verfahren kann an irgendeinem Zelltyp (beispielsweise Endothel-, Epithel- und Fettzellen) durchgeführt werden, deren Plasmamembran die gewünschte Komponente beinhaltet. Komponenten, die mit dem vorliegenden Verfahren isoliert werden können, umfassen Caveolae, G-Domänen, Membran-Fragmente, die im Wesentlichen aus Caveolae bestehen, die mit G-Domänen, Detergenz-löslichen Komponenten und Cytoskelett Komponenten assoziiert sind.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Caveolae, die von Plasmamembranen durch das hierin beschriebene Verfahren gereinigt wurden, wie beispielsweise Endothelzell-Plasmamembranen. Wie detailliert in Beispielen 1 und 2 beschrieben und systematisch in 1 dargestellt werden hoch gereinigte Caveolae von isolierten luminalen Endothelzell-Plasmamembranen erhalten. Die Caveolae der Erfindung werden basierend auf sowohl morphologischen als auch biologischen Kriterien gereinigt. Sie sind im Wesentlichen frei von Mikrodomänen von GPI-verankerten Proteinen und Rab5 (ein Guanosin Triphosphat (GTP)-Bindeprotein, welches in Detergenz-resistenten Komplexen wie nachstehend beschrieben gefunden wird). Im Elektronenmikroskop enthält diese Fraktion eine eher homogene Population von Vesikeln überwiegend < 1000Å im Durchmesser, und weisen ein morphologisch verschiedenes Erscheinen der Caveolae auf (Schnitzer, J.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: (1995), 1759). Gereinigte Caveolae wurden durch Beschichten der Oberfläche von Zellen (wiebeispielsweise Endothelzellen) mit kationischen kolloidalen Silicapartikeln erhalten; Trennen der Silica-beschichteten Zell-Plasmamembranen von dem Rest der Zelle und irgendeinem assoziiertem Gewebe, um Silica-beschichtete Zell-Plasmamembranen herzustellen; Strippen der Caveolae (vorliegend auf der Seite der Membran entgegengesetzt zu jener, auf der die Silicapartikel anhaften) von der Membran durch ein Membran-Disruptionsverfahren (wie beispielsweise ein Scheren oder Ultraschallbehandlung); und Trennen der Caveolae von den anderen Plasmamembran Komponenten (welche die verbleibenden Silica-beschichteten Plasmamembranen beinhalten, die reich and GPI-Proteinen aber ohne Caveolae und Caveolin sind). Diese Trennung wird basierend auf Dichte durchgeführt, wie beispielsweise durch Sucrose Dichtegel-Zentrifugation. In einer Ausführungsform werden Endothel-Plasmamembranen einem Scheren in der Anwesenheit eines Detergenz (beispielsweise Triton X-100) während Homogenisierung bei einer geeigneten Temperatur (beispielsweise ungefähr 4°C–8°C) unterzogen. Eine niedrige Temperatur ist bei einer Verwendung eines Detergenz notwendig, da Caveolae ausschließlich bei geringen Temperaturen Detergenz-resistent sind. Caveolae werden bei einer physiologischen Temperatur (37°C) durch ein Detergenz solubilisiert. Ein Detergenz scheint die Entfernung von Caveolae von ihrem Anhaftungspunkt auf der Plasmamembran zu erleichtern, und daher den Strippprozess zu erleichtern, ist allerdings nicht wesentlich oder notwendig für den Prozess. In einer zweiten Ausführungsform werden Endothel-Plasmamembranen einem Scheren durch Homogenisierung in der Abwesenheit eines Detergenz unterzogen.
In beiden Ausführungsformen wird eine Trennung der Caveolae von anderen Zellmembrankomponenten und eine Isolierung von gereinigten Caveolae erzielt. Charakterisierung der gereinigten Caveolae zeigte, dass sie sehr an Caveolin angereichert sind; dem Glycolipid GM₁; der Plasmalemma Ca²⁺-abhängigen Adenosin Triphosphatase; und dem Insositol 1,4,5-Adenosin-Triphosphat Rezeptor. Diese vier Moleküle wurden alle durch unabhängige Mittel (Lokalisierung durch Elektronenmikroskopie) gezeigt sich auf der Zelloberfläche beinahe ausschließlich in Caveolae (Dupree, P., et al., EMBO J. 12: (1993) 1597; Parton, R.G., J. Histochem. Cytochem. 42: (1994), 155; Rothberg, K.G., et al., Cell 68: (1992), 673; Montessano, R., et al., Nature 296 : (1982), 651; Fujimoto, T., et al., J. Cell. Biol. 119: (1992), 1507; Fujimoto, T., J. Cell. Biol. 120: (1993), 1147) zu befinden und stellen daher Schlüsselmarker der Caveolae dar. Diese vier caveolaren Marker, die alle in dem Silica-beschichteten Plasmamembran Pellet reichlich vorliegen, fraktionieren beinahe gesamt in die gereinigten Caveolae. Wenig, wenn überhaupt, verbleibt in den anderen Membran-Fraktionen. Im Gegensatz sind Angiotensin umsetzendes Enzym, Bande 4.1 und β-Actin, die alle in der Silica-beschichteten Plasmamembran Fraktion (P) reichlich vorliegen, beinahe vollständig von den gereinigten Caveolae ausgeschlossen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Mikrodomänen von GPI-verankerten Proteinen (G-Domänen), die von Plasmamembranen, wie beispielsweise Endothelzell-Plasmamembranen, gereinigt wurden. Die Mikrodomänen der GPI-verankerten Proteine werden gereinigt, so dass sie im Wesentlichen frei von Caveolae, Caveolin und GM₁ sind (einem Lipid-verankerten Cholera-Toxin-Bindegangliosid, das mit Goldmarkierung in den Caveolae wie nachstehend beschrieben lokalisiert wurde). Wie in Beispiel 3 beschrieben und schematisch in 2 dargestellt wurden G-Domänen von Zell-Plasmamembranen (beispielsweise Endothelzell-Plasmamembranen) isoliert, die ursprünglich von den Zellen (beispielsweise durch Verwendung einer Silica-Beschichtung, wie in Beispiel 1 beschrieben) isoliert wurden und von Caveolae gestrippt. Die isolierten Silica-beschichteten Plasmamembranen von Caveolae gestrippt wurden einer Salzkonzentration ausreichender Höhe unterzogen, um elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den Silicapartikeln und Plasmamembran zu reduzieren/minimieren, was zu einer Trennung der Plasmamembranen von den Partikeln führt. Die erhaltenen nicht beschichteten Plasmamembranen (vorher von Caveolae gestrippt) wurden einem Membran-Disruptionsverfahren (beispielsweise Scheren) in der Anwesenheit eines Detergenz (beispielsweise Triton X-100) und anschließend einem Trennverfahren unterzogen, das Komponenten basierend auf Dichte (beispielsweise Sucrose Dichtegradient-Zentrifugation) trennt, was zu einer Isolierung von intaktem G-Domänen führt die alle Detergenz unlösliche (resistente) Membran-Mikrodomänen von geringer Dichte sind; reich an GPI-verankerten Proteinen sind; und im Wesentlichen frei von Caveolae sind.
Die Daten hierin zeigen, dass GPI-verankerte Proteine in diffusionsbeschränkte Mikrodomänen teilen, wobei einige von Ihnen mit Caveolae als ein kreisförmiger Bereich bei der Öffnung oder Einschnürung der Caveolae assoziiert sein können. Da sowohl Caveolae als auch G-Domänen gegenüber einer Detergenz-Solubilisierung resistent sind, wurde der für gewöhnlich flache Membranbereich, der die Öffnung der Caveolae umgibt, von Plasmalemma ausgeschnitten, um ein intaktes großes Vehikel mit einer Caveolae zu bilden, die noch angeheftet und bei einer Detergenzextraktion für gewöhnlich in aber manchmal außerhalb des Vesikels lokalisiert ist. Die Silica-Beschichtung verhindert die Co-Isolierung dieser Mikrodomäne mit den Caveolae und ermöglicht eine getrennte Isolierung von Caveolae und der G-Domäne.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Plasmamembran Domänen, die im Wesentlichen aus Caveolae, G-Domänen (einige von ihnen sind miteinander assoziiert) bestehen und werden beispielsweise von Endothelzell-Plasmamembranen gereinigt. Der Ausdruck "assoziiert mit" wie hierin verwendet, zeigt, dass einige der Caveolae eher als getrennt zu werden an die G-Domänen anhaften. Wie in Beispiel 4 beschrieben und schematisch in 3 dargestellt, bestehen die Plasmamembran Domänen im Wesentlichen aus Caveolae, G-Domänen und Caveolae, die mit G-Domänen assoziiert sind, und werden durch ein Isolieren von Silica-beschichteten Zellmembranen mit Caveolae hergestellt, die immer noch, wie vorstehend beschrieben, anhaften; Unterziehen der Silica-beschichteten Zell-Plasmamembranen einer hohen Salzkonzentration, um die Silica-Beschichtung von den Membranen zu trennen, und Unterziehen der Membranen einem Membran-Disruptionsverfahren, wie beispielsweise einem Scheren oder Ultraschallbehandlung, in der Anwesenheit eines geeigneten Detergenz, wie beispielsweise Triton X-100. Dies führt zu einer Trennung der Membran in verschiedenen Komponenten, einschließlich von Caveolae, die mit G-Domänen assoziiert sind. Domänen bestehen im Wesentlichen aus Caveolae, G-Domänen, zusammen mit Caveolae, die mit G-Domänen assoziiert sind, sind Detergenz-resistent und können von anderen Komponenten beruhend auf Dichte wie beispielsweise Sucrose Dichtegradient-Zentrifugation, getrennt werden.
In einer anderen Ausführungsform können andere Komponenten der Zell-Plasmamembran isoliert werden. Derartige Komponenten umfassen Detergenz-lösliche Komponenten oder Cytoskelett Komponenten, die nach einer Isolierung von Caveolae, G-Domänen oder Caveolae mit G-Domänen wie vorstehend beschrieben assoziiert verbleiben. Diese anderen Komponenten sind im Wesentlichen frei von Caveolae und/oder G-Domänen. Nach einer Isolierung von G-Domänen, die wie vorstehend beschrieben, im Wesentlichen frei von Caveolae sind, können beispielsweise die verbleibenden Detergenz-löslichen Komponenten isoliert und gereinigt werden.
Als ein Ergebnis von diesen Entdeckungen sind jetzt Verfahren verfügbar, um Caveolae zu isolieren, die im Wesentlichen frei von Mikrodomänen von GPI-verankerten Proteinen oder anderen Zellkomponenten sind; G-Domänen, die im Wesentlichen frei von Caveolae und anderen Zellkomponenten sind; und Co-isolierten Plasmamembran-Mikrodomänen, im Wesentlichen aus Caveolae, die Domänen und Caveolae, die mit G-Domänen assoziiert sind, bestehen. Die Caveolae, G-Domänen und/oder co-isolierten Plasmamembran-Mikrodomänen können von irgendeiner Endothelzell-Plasmamembran von irgendeinem Gewebe isoliert werden. Gewebe, von denen Endothelzell-Plasmamembranen verwendet werden können, umfassen vaskuläres, pulmonares, Herz-, cerebrales, Nieren-, Leber- und endokrines Gewebe, einschließlich des vaskulären Systems, Lunge, herz, Leber, Niere, Gehirn und andere Organe. Caveolae, G-Domänen und/oder Co-isolierte Plasmamembran Domänen können durch Perfusion durch die Blutgefäße von vaskulärem Endothelium isoliert werden, oder intestinales Endothelium durch Perfusion durch den Darm. Caveolae, G-Domänen und/oder co-isolierte Plasmamembran Domänen können zusätzlich ebenso von einer Vielzahl von Zellen, wie beispielsweise jenen, die in Kulturen gezüchtet werden, isoliert wurden.
In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung werden spezifische Mikrodomänen von Endothelzell-Plasmamembranen isoliert, indem zuerst die Zellmembranen isoliert werden, indem eine Beschichtung eines Anhaftenden gebildet wird, zuerst ionisches Material auf eine luminale Oberfläche der Endothelzell-Plasmamembran durch Perfusion des ionischen Materials in eine luminale Kavität nahe der Endothelzell-Membran; Vernetzen der Beschichtung, um eine Pellicula zu bilden, die an der Endothelmembran (als ein Pellicula-Endothel-Membrankomplex bezeichnet) anhaftet, indem die luminale Oberfläche des ionischen Materials in Kontakt gebracht wird, Beschichten mit einem entgegengesetzt geladenen ionischen Material, das mit dem ersten ionischen Material reaktionsfähig ist; und Trennen des Komplexes von anderen Gewebeelementen durch ein Verfahren basierend auf Unterschiede in Größe oder Dichte (beispielsweise durch Zentrifugation), daher Erzeugen von beschichteten Membran-Pellets. Anschließend können spezifische Mikrodomänen isoliert werden. Caveolae können beispielsweise durch ein Strippen von Caveolae von den beschichteten Membranen durch ein Scheren während einer Homogenisierung in der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Detergenz isoliert werden; und Isolieren der Caveolae von anderen Komponenten basierend auf Dichte, wie beispielsweise durch Sucrose Dichtegradient-Zentrifugation. Durch dieses in destinales Endothelium Verfahren isolierte Caveolae sind im Wesentlichen frei von G-Domänen. Alternativ können G-Domänen durch Isolieren der beschichteten Membranen nach Isolieren und Entfernen der Caveolae isoliert werden; Unterziehen der beschichteten Membranen einer hohen Salzkonzentration, um die Silica-Beschichtung zu entfernen; und Isolieren der Membranen. Diese durch dieses Verfahren isolierten Membranen bestehen im Wesentlichen aus G-Domänen.
In den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das erste ionische Material kolloidales Silica und das zweite ionische Material ein Acrylpolymer. Eine von vielen Alternativen besteht darin, magnetische Partikel zu verwenden, um die Membranen zu beschichten, die anschließend unter Verwendung von gewöhnlichen magnetischen Verfahren isoliert werden können.
Die gereinigten Caveolae, die gereinigten Mikrodomänen von GPI-verankerten Proteinen und die gereinigten co-isolierten Plasma Mikrodomänen umfassen Caveolae, die mit G-Domänen assoziiert sind, und sind für die Identifizierung von Molekülen und Proteinen von Nutzen, die in intra- oder transzellulären Transport einbezogen sind. Die Caveolae und die G-Domänen sind weiterhin gereinigt, und können daher verwendet werden, um Proteine zu unterscheiden und zu identifizieren, die entweder nur in den Caveolae oder den Mikrodomänen, aber nicht in beiden vorliegen. Gereinigte Caveolae können beispielsweise verwendet werden, um Antikörper, entweder monoklonal oder polyklonal unter Verwendung von Standardverfahren, zu erzeugen. Der Ausdruck "Antikörper", wie hierin verwendet, umfasst sowohl monoklonale wie auch polyklonale Antikörper, ebenso wie Mischungen von einem oder mehr als einem Antikörper, der mit Caveolae reaktionsfähig ist (beispielsweise ein Cocktail von verschiedenen Typen von monoklonalen Antikörpern, die mit den Caveolae reaktionsfähig sind). Der Ausdruck Antikörper ist weiterhin vorgesehen ganze Antikörper und/oder biologisch, funktionelle Fragmente davon, chimäre Antikörper, die Abschnitte von mehr als einer Spezies umfassen, humanisierte Antikörper und bifunktionelle Antikörper zu umfassen. Biologisch funktionelle Antikörper-Fragmente, die verwendet werden können, sind jene Fragmente, die für ein Binden des Antikörper-Fragments an gereinigte Caveolae ausreichend sind. Sobald die Antikörper erzeugt sind, werden sie auf ihre Fähigkeit bewertet, an gereinigte Caveolae zu binden. Herkömmliche Verfahren können verwendet werden, um diese Bewertung durchzuführen.
Die chimären Antikörper können Abschnitte umfassen, die von zwei verschiedenen Spezies (beispielsweise ein konstanter Bereich von einer Spezies und variable oder bindende Bereiche von einer anderen Spezies) abgeleitet sind. Die Abschnitte, die von zwei verschiedenen Spezies abgeleitet sind, können miteinander chemisch durch herkömmliche Verfahren verbunden werden, oder können als einzelne zusammenhängende Proteine unter Verwendung von genetischen Konstruktionsverfahren hergestellt werden. Die DNA, die Proteine von sowohl der leichten Ketten- als auch schwere Ketten-Abschnitte des chimären Antikörpers kodiert, kann als zusammenhängende Proteine exprimiert werden.
Monoklonale Antikörper (mAb), die mit gereinigten Caveolae reagieren können, können unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren, wie beispielsweise von somatischen Zellhybridisierungsverfahren (Kohler and Milstein, Nature 256: (1975) 495-497), in situ Verfahren und Phagen Bibliotheksverfahren hergestellt werden. Gereinigte Caveolae können beispielsweise als das Immunogen verwendet werden. Alternativ können synthetische Peptide, die Abschnitte von in den Caveolae gefundenen Proteinen entsprechen, als Immunogene verwendet werden. Ein Tier wird mit einem derartigen Immunogen immunisiert, um Antikörper erzeugende Milzzellen zu erhalten. Die Spezies des immunisierten Tiers wird in Abhängigkeit der Spezifizität des gewünschten mAb variieren. Die Antikörper erzeugende Zelle wird mit einer immortalisierenden Zelle (beispielsweise einer Myelom-Zelle) fusioniert, um ein Hybridom zu erzeugen, das Antikörper sekretieren kann. Die nicht fusionierten verbleibenden Antikörper erzeugenden Zellen und immortalisierenden Zellen werden beseitigt. Gewünschte Antikörper erzeugende Hybridoma werden unter Verwendung herkömmlicher Verfahren ausgewählt und die ausgewählten Hybridoma werden kloniert und kultiviert.
Polyklonale Antikörper können durch Immunisieren eines Tieres auf eine ähnlich Art wie vorstehend beschrieben für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern hergestellt werden. Das Tier wird unter Bedingungen gehalten, unter denen Antikörper, die mit gereinigten Caveolae reagieren können, erzeugt werden. Bei Erreichen eines bestimmten Titers von Antikörpern wird Blut von dem Tier gesammelt. Das die polyklonalen Antikörper (Antisera) enthaltende Serum wird von den anderen Blutkomponenten getrennt. Das Polyklonoale Antikörper enthaltene Serum kann optional weiterhin in Fraktionen bestimmter Typen von Antikörpern (beispielsweise IgG, IgM) getrennt werden.
Alternativ können gereinigte G-Domänen oder gereinigte Silica-beschichtete Membranen ebenso für eine Erzeugung von Antikörpern verwendet werden, wie es irgendeine Membranfraktion kann, die wie hierin beschrieben erhalten wird. Synthetische Peptide, die Abschnitten von Proteinen von irgendeiner der Fraktionen entsprechen, können ebenso verwendet werden. Gereinigte Caveolae können ebenso für eine Identifizierung jener Antikörper verwendet werden, welche Caveolae binden. Alternativ können gereinigte G-Domänen verwendet werden, um jene Antikörper zu Identifizieren, die G-Domänen binden.
Antikörper, wie vorstehend beschrieben, können verwendet werden, um weiterhin die Proteine zu identifizieren die mit intra- und transzellulärem Transport assoziiert sind: Die Antikörper können beispielsweise auf Endothelium angewendet werden, um zu bestimmen, ob sie in einen Transport im Endothelium einwirken. Antikörper können zusätzlich als Vektoren verwendet werden, um Agenzien in und/oder über das Endothelium zu liefern. Wie in Beispiel 8 nachstehend beschrieben, wurden beispielsweise monoklonale Antikörper erzeugt, die Antigene erkennen, die hauptsächlich in gereinigten Caveolae gefunden wurden. Die meisten der Antikörper erkennen Endothelium; wobei wenige für durchgängiges Endothelium spezifisch sind. Weiterhin können Antikörper erzeugt werden, die gewebespezifisch sind. Zwei der in Beispiel acht beschriebenen Antikörper erkennen Lungengewebe. Gewebespezifische Antikörper können als Transportagenzien verwendet werden, um Agenzien, wie beispielsweise Antikörper, Arzneimittel, Gene, diagnostische Agenzien, oder andere Moleküle zu einem spezifischen Gewebe, und insbesondere zu den Caveolae eines spezifischen Gewebe, zu liefern, so dass die Agenzien zu und/oder über das Endothelium geliefert werden können.
Die gereinigten Caveolae oder G-Domänen der vorliegenden Erfindung können ebenso auf ein Abzielen des Endothelium verwendet werden, wie beispielsweise für eine Lieferung eines Agens oder zur Gentherapie. Agenzien, die auf Caveolae oder G-Domänen zielen, können einfacher zu der Zelle geliefert werden und, falls gewünscht, in die Zellen eindringen, über von einer Seite der Zelle zu der anderen, oder ein Signal für die Zelle bereitstellen, welche ihre Funktion ändert. Agenzien, wie beispielsweise Antikörper, Arzneimittel, oder andere Moleküle, die beispielsweise an G-Domänen oder an Proteine in Caveolae (beispielsweise die Insulin-Rezeptoren) binden, Zielen beispielsweise auf die Caveolae oder G-Domänen und können dadurch in und/oder über das Epithelium bewegt werden. Durch Konjugieren eines anderen Agens (wie beispielsweise eines Arzneimittels oder eines Gens) an das Agens, welches auf die Caveolae oder G-Domänen zielt, können derartige Antikörper, Arzneimittel, oder andere Moleküle ebenso als Transportagenzien verwendet werden. Auf diese Art sind die gereinigten Caveolae und die gereinigten Mikrodomänen von GPI-verankerten Proteinen ebenso als Transportvehikel nützlich, um Agenzien über die Endothelschicht zu bewegen. Die körperliche Assoziierung von G-Domänen mit Caveolae legt ein funktionelles Wechselspiel zwischen ihnen nahe; daher können diese Strukturen eine Plattform für eine Ligandenprozessierung bereitstellen, indem Signaltransduktion mit Membrantransport integriert wird. Ein Binden von natürlichen Liganden oder Antikörpern an GPI-verankerte Proteine kann Clusterbildung induzieren (Schroeder, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: (1994) 12130; Mayor, S., et al., Science 264: (1994), 1948); Internalisierung durch Caveolae-Photocytose (Anderson, R.G.W., et al., Science 255 (1992), 410; Rothberg G., et al., J. Cell. Biol. 111: (1990), 2931) oder Endocytose (Keller, E.-A., et al., EMBO J., 3: (1992) 863; Bamezai, A., et al., Eur. J. Immunol. 22: (1992), 15; Parton R.G., et al., J. Cell. Biol. 127: (1994), 1199) und sogar Zellaktivierung (Thompson L.F., et al., J. Immunol. 143: (1989) 1815; Korty, P.E., et al., J. Immunol. 146: (1991), 4092; Davies, L.S., J. Immunol. 141 (1988), 2246) ein Signalübertragung kann caveolares Prozessieren regulieren (Parton R.G., et al., J. Cell. Biol. 127: (1994), 1199; Smart, E.J., et al., J. Cell. Biol.124: (1994), 307) und verschiedene Mediatoren einer Signalübertragung können sich in Caveolae befinden (Schnitzer, J.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 92: (1995), 1759; Fujimoto, T., et al., J. Cell. Biol. 119: (1992), 1507; Fujimoto, T., J. Cell. Biol. 120 (1993), 1147; Schnitzer, J.E., et al., J. Biol. Chem. 270: (1995), 14399). Schließlich werden oberflächengebundene Moleküle durch Caveolae in Endothelium endocytisiert oder transcytosiert (Montessano, R., et al., Nature 296: (1982), 651; Schnitzer, J.E., Trends Cardiovasc. Med. 3: (1993), 124; Oh, P., et al., J. Cell. Biol. 127: (1994)1217; Schnitzer and Oh, P., J. Biol. Chem. 269 (1994), 6072; Millci, A.J., et al., J. Cell. Biol. 105: (1987), 2603; Schnitzer, J.E., et al., J. Biol. Chem. 264: (1992) 24544; Schnitzer, J.E., and Bravo, J., J. Biol. Chem. 268: (1993), 7562). Ein Abbau von Caveolae verhindert einen derartigen Transport (Oh, P., et al., J. Cell. Biol. 127 (1994), 1217), wobei molekulares Kartieren von gereinigten Caveolae die Anwesenheit von SNARE Fusionsproteinen und Guanosin Triphosphatasen deutlich macht, die für einen regulierten N-Ethylmaleimid-sensitiven vesicularen Transport (Schnitzer, J.E., et al., J. Biol. Chem. 270: (1995), 14399; Schnitzer, J.E., et al., Am. J. Physiol. 37: (1995), 1148) notwendig sind. Als ein Ergebnis der Reinigung der Endothelcaveolae wie hierin beschrieben, wurde es daher offensichtlich, das Caveolae in der Tat vesiculare Träger sind und die molekulare Maschinerie enthalten, um eine Signalübertragung mit Trägertransport zu integrieren. Ein dynamisches Ligandenprozessieren mittels Clusterbildung, Signalübertragung und vesicularen Transport kann durch die Assoziierung der GPI-verankerten Protein-Mikrodomänen mit Caveolae auftreten oder ist sogar über eine caveolare Bildung möglich. Derartige spezialisierte verschiedene Mikrodomänen können getrennt oder assoziiert miteinander vorliegen, nicht nur um signalübertragende Moleküle zu organisieren, aber ebenso um oberflächengebundene Liganden differenziell zu prozessieren.
Caveolae (und assoziierte Membrankomponenten), wie beispielsweise GPI-verankerte Proteine) spielen daher eine Schlüsselrolle bei dem Transport von Molekülen in und über viele Typen von Zellmembranen und sind insbesondere bei Transportmolekülen in und/oder über das Endothelium eingebunden und daher über die Endothelbarriere. Dies ist von beträchtlichem Interesse und Wert, da die Rolle des Endothels in vielen Geweben indem Körper als eine Barriere für eine Passage von Substanzen fungiert, wie beispielsweise Arzneimittel oder andere Agenzien, die einen nützlichen Effekt aufweisen, wenn sie dem zugrunde liegenden Gewebe zur Verfügung gestellt werden. Die hierin beschriebene Arbeit macht es möglich, Mittel zu identifizieren, durch welche ein Transport über Zellmembranen, insbesondere Endothel-Zellmembranen, erleichtert werden kann und falls gewünscht, auf eine gewebespezifische Art (beispielsweise gerichtet auf einen bestimmten Gewebetyp oder Typen durch Caveolae und/oder GPI-verankerte Proteine, die Zelltyp spezifisch sind) bewerkstelligt wird. Zusätzlich zu einem Übermitteln, Steuern und/oder Regulieren des Transports von verschiedenen Molekülen einschließlich von Ionen, kleinen Molekülen, Proteinen, und sogar Wasser in Zellen, wie beispielsweise Endothelzellen, weisen Caveolae eine Rolle bei einer Zelloberflächentransduktion und Kommunikation auf. Jüngste Arbeiten haben gezeigt, dass Caveolae ebenso bei Wechsel wirkungen zwischen Zellen und umgebenden Geweben und Fluiden wirken können, und dass sie dadurch Boten-Moleküle (beispielsweise CAMP, Calcium) lagern und prozessieren und Phosphorylierungskaskaden durch Verwenden von Kinasen, wie beispielsweise nicht-Rezeptor Tyrosinkinasen initiieren. (Siehe beispielsweise Anderson, R.G.W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: ((1993), 10909-10913; Anderson, R.G.W., Current Opinion in Cell Biology 5: (1993), 647-652).
Als ein Ergebnis macht die Verfügbarkeit gereinigter Caveolae, G-Domänen und Membrandomänen die im Wesentlichen aus Caveolae und G-Domänen bestehen, ebenso wie Antikörper, die spezifisch für gereinigte Caveolae, G-Domänen oder Membrandomänen sind, die im Wesentlichen aus Caveolae und G-Domänen bestehen, es möglich Moleküle, wie beispielsweise Arzneimittel und diagnostischen Agenzien an und/oder über Zellmembranen, wie beispielsweise Endothel-Zellmembranen, zu liefern und eine Zellsignalübertragung und Kommunikation zu ändern, wie beispielsweise durch Wechselwirken mit Molekülen von denen gezeigt wurde in oder assoziiert mit Caveolae und/oder G-Domänen vorzuliegen, und eine Rolle bei einer Signalübertragung und Kommunikation aufzuweisen. Gereinigte Caveolae der vorliegenden Erfindung wurden beispielsweise charakterisiert als einen Teil von Proteinen oder anderen Komponenten zu bilden und können weiterhin für ein Identifizieren von Komponenten bewertet werden, die Schlüsselrollen bei Transport oder Signalübertragung und Kommunikation entweder in einer Vielzahl von Zelltypen (um eine Allgemeine Wirkung auf Zellen zu ermöglichen) oder in einem spezifischen Zelltyp (um eine selektive Wirkung zu ermöglichen) innehaben. Beispielsweise können Plasmamembran Komponenten identifiziert werden, die einen Transport eines Arzneimittels, wie beispielsweise einem Immunotoxin (das an einen Tumor oder eine andere Malignanz geliefert werden soll) für eine Krebstherapie oder ein selektives Stimulans (um an Herzgewebe und insbesondere über die Herzendothelbarriere zu den zugrunde liegenden und für gewöhnlich weniger zugänglichen Cardiomyocyten geliefert zu werden) für eine Behandlung von Herz-Zuständen.
Alternativ können Plasmamembran Komponenten identifiziert werden, die eine Genlieferung in Zellen erleichtert wird, wie beispielsweise Epithelzellen, in welchen das Gen prozessiert werden wird, um ein therapeutisches oder diagnostisches Protein oder Peptid oder eine Antisense-Nukleinsäure zu erzeugen. Falls das Ziel beispielsweise darin besteht, ein Gen in Blutgefäße einzufügen, um ein Antikoagulanz- oder blutverdünnendes Protein zu erzeugen und zu sekretieren, wird das geeignete Ziel das Endothelium, insbesondere im Herzgewebe, sein. Caveolae und/oder GPI-verankerte Proteine, die in (und möglicherweise einzigartig für) Endothelzell-Plasmamembranen im Herz und/oder Blutgefäßen vorliegen können, unter Verwendung von gereinigten Caveolae und/oder G-Domänen wie hierin beschrieben identifiziert werden; und verwendet werden, um ein Gen Liefervehikel (wie beispielsweise ein Plasmid oder Viralvektor, oder Protein- oder Peptid-DNA Konjugat) auf Herz-Gewebe und/oder Blutgefäße zu zielen oder richten.
Alternativ können Antikörper auf Caveolae und/oder GPI-verankerte Proteine, die in oder einzigartig für spezifische Gewebe vorliegen, verwendet werden, um ein Gen Liefervehikel auf das spezifische Gewebe zu zielen oder zu richten. Ähnlich dazu können Lipid-verankerte Moleküle, die in Caveolae oder G-Domänen gefunden werden, in die periphere Blutzirkulation eingefügt werden, wo sie mit dem Epithel der Blutgefäße wechselwirken und in das Blutgefäßepithel übertragen werden können. Das Endothel antwortet weiterhin auf viele physikalische und chemische Faktoren in seiner lokalen Mikroumgebung und spielt eine primäre oder sekundäre Rolle bei vielen vaskulären und extravaskulären Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs, Atherosclerose, Diabetes, Mikroangiopathien und Herzischemie (Folkman, J., Nature Medicine 1: (1995) 27-30). In Tumorblutgefäßen vorliegende Proteine können daher in einer direkten Therapie durch ein direktes Liefern eines Agens gezielt werden, dass auf das Tumorendothelium für eine selektive Zerstörung zielt, während nebenstehendes nicht-krebsartiges Gewebe vermieden wird.
Liefern eines Arzneimittels oder eines anderen Agens zu richten, welche in eine Zelle durch die Wirkung von Caveolae, GPI-verankerten Proteinen oder anderen Plasmadomänen eindringen soll, kann durchgeführt werden, indem als eine "Sonde" oder transportierendes Molekül ein Molekül (beispielsweise ein Antikörper, ein Peptid, ein Virus, ein Ligand) verwendet wird, welcher eine vergleichsweise hohe Affinitäts-Wechselwirkung mit einer Komponente von Caveolae, G-Domänen oder anderen Plasmamembran Domäne aufweist. Die Sonde oder das Transportmolekül können selbst das Arzneimittel oder Agens sein, deren Eindringen in Zellen, wie beispielsweise Endothelzellen, gewünscht ist oder kann an ein zweites Molekül gebunden werden, dessen Eintritt in Zellen gewünscht ist. Das Transportmolekül und das gebundene Molekül werden von dem Blut extrahiert und indem gezielten Gewebe durch Wirkung der Caveolae akkumuliert. Ein Antikörper oder ein anderes Molekül beispielsweise, welcher/welches ein Protein erkennt, das ausschließlich in Lungencaveolae, wie beispielsweise die in Beispiel 8 beschriebenen Antikörper, kann verwendet werden, um ein Arzneimittel, welches der Antikörper oder ein anderes Molekül sein kann, zu richten oder kann durch ihre Wirkung auf Lungengewebe für therapeutische, diagnostische Zwecke geliefert werden. Das Agens wird über Lungencaveolae in dem Lungengewebe akkumuliert werden und daher für das Gewebe für den gewünschten Effekt verfügbar werden. Ähnlich dazu können derartige Sonden oder Transportmoleküle (welche Caveolae in einen spezifischen Gewebetyp zielen oder im Allgemeinen Caveolae auf vielen Gewebetypen binden) verwendet werden, um Arzneimittel oder andere Agenzien in eine Vielzahl von Gewebetypen einzufügen.
Proteine und andere Komponenten von Caveolae oder G-Domänen, welche Ziele für die Sonden oder Transportmoleküle sein können, können durch Verwenden gereinigter Caveolae oder G-Domänen der vorliegenden Erfindung identifiziert werden. Umgekehrt können Sonden oder Transportmoleküle ebenso durch Verwenden gereinigter Caveolae oder G-Domänen, wie hierin beschrieben, identifiziert werden. Für ein Identifizieren derartiger Moleküle können Standardassays verwendet werden, die umfassen: zwei dimensionale Gelanalyse gefolgt von Mikrosequenzierung, Westernblotting mit Antikörpern für bekannte Proteine (wie hierin beschrieben) oder Blotten mit Antikörpern wie vorstehend beschrieben.
Es ist ebenso möglich gereinigte Caveolae, G-Domänen und Membranfragmente, die im Wesentlichen aus Caveolae und G-Domänen bestehen, als Liefervehikel zu verwenden. Beispielsweise können gereinigte Caveolae modifiziert werden, um ein Arzneimittel oder ein anderes Agens (beispielsweise ein chemotherapeutisches) zu enthalten, um in ein Gewebe von Interesse geliefert zu werden. Die modifizierten gereinigten Caveolae werden in ein Individuum bei Bedarf des Agens mittels einer geeigneten Route, wie beispielsweise intravenös, intravaskulär, topisch, oder durch Inhalationsspray, eingefügt. Beispielsweise können modifizierte, ein Agens enthaltende, Caveolae in die Lungen eines Individuums bei Bedarf eines chemotherapeutischen Agens für Lungenkrebs durch ein Aerosol oder Inhalationsspray verabreicht werden. In dem Lungengewebe wirken die Caveolae als Liefervehikel und das Agens wird zu den betroffenen Zellen geliefert.
Die Erfindung wird weiterhin durch die nachstehenden Beispiele beschrieben.
Beispiele
Sofern Zellen von Geweben isoliert werden und in Kultur gezüchtet werden, kann ein wesentlicher Verlust von Caveolae auf der Zelloberfläche, insbesondere für Endothelzellen vorliegen (J.E. Schnitzer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 199: (1994), 11). Derartige Verluste (häufig > 100-fach) stellen eine wesentliche Änderung bei Plasmamembran Organisation dar und können eine hauptsächliche Störung bei caveolarer Funktion und sogar GPI-verankerter Protein Clusterbildung widerspiegeln. Das Verhältnis zwischen GPI-verankerten Proteinen der Caveolae wurde daher unter Bedingungen erforscht, um mögliche Einwirkungen auf Zellkulturen zu vermeiden und um ebenso Antikörper Effektoren und Kontaminierung von intrazellulären Kompartimenten zu vermeiden.
All die hierin beschriebenen Membransubfraktionen wurden nach Aussetzen an ein Detergenz isoliert, um konsistent zu sein und die Zahl von Variablen im Vergleich zu den Subfraktionen zu begrenzen. Caveolae können jedoch von Silica-beschichteten Membran-Pellets ohne Detergenz geschert und isoliert werden obgleich weniger effizient. Wie in Kurzhalia, T.V., et al. (Trends Cell Biol. 5: (1995), 187-189) beschrieben, wurde dem gewöhnlichen Protokoll für eine Caveolae Isolierung gefolgt, mit der Ausnahme, dass Triton X-100 weggelassen wurde, und für Scherzwecke die Zahl von Homogenisierungshüben von 12 auf 48 oder 60 erhöht wurde.
Die nachstehenden Verfahren und Materialien wurden für eine selektive Isolierung des luminalen Endothel-Plasmalemma mit ihren gegenüberliegenden Caveolae von Rattenlungenmikrovaskulatur verwendet und um Caveolae von der Plasmalemmafraktion zu reinigen.
Verfahren
Antikörper
Maus monoklonaler Antikörper für Caveolin war von Zymed oder Transduction Laboratories (Lexington, KY); Kaninchen monoklonaler Antikörper für Angiotensin umsetzendes Enzym (ACE) war von R. Skidgel (University of Illinois); Kaninchen polyklonaler Antikörper für Bande 4.1 von V. Marchesi (Yale University); Maus monoklonaler Antikörper für CA²⁺-ATPase, von Affinity BioReagents (Neshanic Station, NJ); Maus monoklonaler Antikörper für β-Actin von Sigma; und Ziegen polyklonaler Antikörper für IP₃ Rezeptor, von Solomon H. Snyder und Alan Sharp (Johns Hopkins University). Quellen für andere Reagenzien waren wie zuvor (Schnitzer, J.E., et al. J. Cell. Biol. 127: (1994) 1217; Schnitzer J.E. und Bravo, J., J. Biol. Chem. 268: (1993), 7562; Schnitzer, J.E. and Oh, P., J. Biol. Chem. 269: (1994), 6072; and Jacobsen, B.S., et al., Eur. J. Cell Biol. 58: (1992), 296).
In Situ Perfusion von Rattenlungen für eine Silica-Beschichtung der luminalen Endothel-Zelloberfläche.
Die Lungen von anästhesierten männlichen Sprague-Dawley Ratten wurden nach Tracheo tomie belüftet und anschließend wie beschrieben künstlich durchblutet (Schnitzer, J.E. and Oh, P., J. Biol. Chem. 269: (1994), 2072; Jacobsen, B.S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 199: (1994), 11). In Kürze wurden 0,5ml Ringer's Lösung bei pH 7,4 (111mM NaCl/2,4 mM KCl/1 mMMgSO₄/5,5 mM Glucose/5 mM Hepes/0,195 mM NaHCO₃) enthaltend 30μM Nitroprussiat und 175 Einheiten Heparin vor einer Kannulierung der Pulmonärarterie in das rechte Herzventrikel injiziert. Die Lungen wurden bei 8–10 mm Hg (1mm Hg = 133 Pa) mit den folgenden Lösungen (alle bei 10–12°C mit Ausnahme wie angemerkt in der Reihenfolge künstlich durchblutet: (I) oxigenierte Ringer's Lösung, die 30μM Nitroprussiat enthält für 90 Sek. bei Raumtemperatur und anschließend für 3,5 Min. bei 10–12°C; (II) MBS (125 mM NaCl/20 mM Mes, pH 6,0) für 90 Sek.; (III) 1 % koloidales Silica in MBS; (IV) MBS für 90 Sek., um Silica von den Blutgefäßen loszulösen; (V) 1 % Natriumpolyacrylat in MBS für 90 Sek., um Membran-gebundenes Silica zu vernetzen und zu schützen; und (VI) 8–10 ml Hepesgepufferte Sucrose mit Protease Inhibitoren [HBS+, pH 7, enthaltend 0,25 M Sucrose, 25 mM Hepes, Leupeptin (10 μg/ml), Pepstatin A (10 μg/ml), o-Phenanthrolin (10 μg/ml), 4-(2-Aminoethyl)benzensulfonyl Fluorid (10 μg/ml); und trans-Epoxysuccinyl-L-leucinamido(4-guanidono)butan (50 μg/ml)]. Die Lungen wurden entfernt und in kaltes HBS+ eingetaucht.
Reinigung von Luminal-Endothelial-Zellmembranen
Die gekühlten Rattenlungen wurden gewogen, in einem Plastgefäß auf einem in zerstoßenem Eis eingebetteten Aluminiumblock mit einer Rasierklinge zerkleinert und anschließend zu 20 ml kaltem HBS+ für eine Homogenisierung (12 Hübe) in einem Typ C Teflon Pistill/Glas Homogenisierer mit einem Hochgeschwindigkeitsrotor bei 1810 Upm betrieben. Nach Filtration durch ein 0,53 μm Nytexnetz gefolgt von einem 0,3μm Netz wurde das Homogenat mit 102 % (Gewicht/Volumen) Nycodenz (Accurate Chemical and Scientific) mit 20 mM KCl gemischt, um eine 50 % End-Lösung zu erhalten, und wurde über einen 55–70 % Nycodenz kontinuierlichen Gradient, der 20 mM KCL plus HBS enthielt, überschichtet. Nach Zentrifugation in einem Beckman SW28 Rotor bei 15000 Upm bei 30 Min. bei 4°C wurde das Pellet in 1 ml MBS suspendiert und mit P bezeichnet.
Reinigung von Caveolae von Silica-beschichteten Endothel-Zellmembranen
Kaltes 10 % (Vol./Vol.) Triton X-100 wurde wie vorstehend beschrieben zu dem suspendierten Membran Pellet (P) hinzugegeben, um eine Endkonzentration von 1 % zu erhalten. Nach Nutation für 10 Min. bei 4°C wurde die Suspension in einem Typ AA Teflon Pistill/Glas Homogenisierer (10 Hübe) homogenisiert und anschließend in 40 % Sucrose und 20 mM KCl überführt. Ein 35–0 % Sucrose-Gradient in 20 mM KCl wurde über das Homogenat in einem Beckman SW55 Rotor Röhrchen überschichtet und anschließend bei 4°C bei 30000 Upm übernacht zentrifugiert. Eine Membranschicht, die eindeutig zwischen 10 % und 16 % Sucrose zu sehen war, wurde gesammelt, mit V bezeichnet und schließlich vor einer Zentrifugation 2 Stunden bei 13000 × g bei 4°C mit MBS 3-fach verdünnt. Das erhaltene Pellet wurde entweder für Elektronenmikroskopie weiter verarbeitet oder für eine weitere Analyse. Bei Versuchen die Bedingungen zur Isolierung von Caveolae zu optimieren, wurde gefunden, dass die caveolare Fraktion geringer Dichte nicht geändert wurde durch (i) die Anwesenheit von Triton X-100 über den Sucrose Gradienten während Zentrifugation hinweg, und (ii) die Abwesenheit von Triton X-100 während einer Homogenisierung mit Ausnahme, dass die Ausbeute an Caveolae verringert war. Triton X-100 scheint das Scheren der Caveolae weg von der Plasmamembran zu erleichtern.
ELISA.
Nach der vorstehend beschriebenen Sucrose Dichte-Zentrifugation wurden 33 Fraktionen von 150 μl gesammelt und das Pellet wurde in 150μl MBS (Fraktion 34) suspendiert. Aliquots von jeder Fraktion (50–100 μl) wurden in einzelnen Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen zum Trocknen über Nacht platziert. Nach Waschen wurden die Vertiefungen für 1 Stunde mit ELISA Waschpuffer (EWB: 2 % Ovalbumin/2mM CaCl₂/164 M NaCl/57 mM Phosphat, pH 7,4) blockiert, für 1 Stunde mit EWB inkubiert, das Antikörper (1:200) entweder gegen Caveolin oder ACE enthielt inkubiert, für 1 Minute in EWB dreimal gewaschen, mit einem Reporter Antikörper inkubiert, der an Meerrettich Peroxidase (1:500 in EWB) konjugiert war und wiederum gewaschen. Substratlösung (50 mM Na₂HPO₄/25 mM Zitronensäure/0,12 % o-Phenylenediamindihydrochlorid/0,03 % H₂O₂) wurde hinzu gegeben und bevor das Signal mit einem Molecular Devices Thermomax Mikroplattenlesegerät gelesen wurde, wurde die Reaktion mit 4 M H₂SO₄ gestoppt.
SDS/PAGE und Immunoblotting
Wie berichtet (Sargiacomo, M., et al., J. Cell. Biol. 122: (1993) 789; Lisanti, M.P., et al., J. Cell. Biol. 123: (1993), 595; Montessano, R., et al., Nature 296: (1982), 651) wurden die Proteine von mehreren Gewebefraktionen solubilisiert und für eine direkte Analyse durch Silber färbung oder Elektrotransfer auf Nitrocellulose oder Poly(vinyliden Difluorid) (Immobilon; Millipore) Filter für Immunoblotten unter Verwendung von primären Antikörpern gefolgt von geeigneten ¹²⁵I-markierten Reporter Antikörpern durch SDS/PAGE in 5–15 % Gelen getrennt. Bandintensitäten wurden durch einen Phosphorimager (Molecular Dynamics) quantifiziert, Densitometrie von Autoradiogrammen und/oder direktes Zählen von γ-Radioaktivität. Proteinassays wurden mit dem Bio-Rad BCA Kit durchgeführt.
Beispiel 1 Isolierung von beschichteten Membran Pellets (P)
Eine Isolierung von Caveolae, die mit der Endothel-Zelloberfläche assoziiert sind, weist viele Schwierigkeiten auf. Das Endothelium stellt nur einen geringen Prozentsatz einer unterschiedlichen Population von Zellen in irgendeinem Organ dar. Unglücklicherweise verursacht ein Isolieren von Endothelzellen von Geweben als einer primären Quelle oder sogar für Wachstum in einer Kultur morphologische Änderungen, die einen äußerst bedeutsamen Verlust in Zelloberflächen Caveolae einschließen (Schnitzer, J.E., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 199: (1994), 11). Nicht beschichtete Vesikel, die Plasmalemma Caveolae sehr ähnlich in Größe und Dichte sind und sogar das caveolare Markerprotein Caveolin enthalten können (Dupree, P., et al., EMBO J. 12: (1993), 1597; Kurzchalia, T.V., et al., J. Cell Biol. 118 (1992), 1003), können ebenso in anderen zellulären Kompartimenten, wie beispielsweise dem trans-Golgi Netzwerk, gefunden werden. Darüber hinaus können sich Caveolae auf Grund des Zelltyps unterscheiden (Izumi, T. et al., J. Electron Microsc. 38: (1989), 47). Um die vorstehenden Schwierigkeiten zu lösen, besteht eine Strategie darin, zuerst die luminalen Endothel-Plasmamembranen in hoher Ausbeute und Reinheit zu isolieren, wobei assoziierte Caveolae von Rattenlungen in situ verwendet wurden. Die Caveolae wurden anschließend entfernt und von dieser Membranfraktion isoliert.
Reinigung von luminalen Endothel-Zellmembranen von Rattenlungen, die in situ künstlich durchblutet sind
Die Rattenlungen Mikrovaskulatur wurde durch die Pulmonararterie mit einer positiv geladenen kolloidalen Silica-Lösung künstlich durchblutet, um die luminale Endothel-Zellmembran zu beschichten, die für gewöhnlich dem zirkulierenden Blut ausgesetzt ist, und eine stabil haftende Silica-Pellicula zu erzeugen, die diese spezifische Membran von Interesse markiert (Jacobsen, B.S., et al., Eur. J. Cell. Biol. 58:(1992), 296). Eine derartige Beschichtung erhöht die Membrandichte und haftete so stark an die Plasmamembran, dass nach einer Gewebehomogenisierung große Blätter von Silica-beschichteter Membran mit anhaftenden Caveolae von anderen Zellularmembranen und Debris bzw. Rückstand durch Zentrifugation durch ein Hochdichte Medium (Jacobsen, B.S., et al., Eur. J. Cell. Biol. 58:(1992), 296) bereits isoliert waren. Die Silica-beschichteten Membranen zeigten eine ausgiebige Anreicherung für Endothelzell-Oberflächenmarker und eine geringe Verunreinigung durch andere Gewebekomponenten. Wie in vorgehender Arbeit gezeigt, (Jacobsen, B.S., et al., Eur. J. Cell. Biol. 58:(1992), 296), wies das gewöhnlich isolierte Membranblatt an einer Seite haftende Caveolae und eine Silica-Beschichtung auf der anderen Seite auf. Durch SDS/PAGE wiesen die Silica-beschichteten Membranen ein Proteinprofil auf, das von dem des anfänglichen Lungenhomogenats ziemlich verschieden war. Darüber hinaus zeigte ein quantitatives Immunoblotten bis zu 30-fache Anreicherungen bei den Silica-beschichteten Membranpellets relativ zu dem anfänglichen Gewebehomogenat für mehrere Proteine von denen bekannt ist, auf der Endotheloberfläche, wie beispielsweise Caveolin (Dupree, P., et al., Science 191: (1993), 1597) und ACE (Caldwell, P.R.B., et al., Science 191: (1976), 1050) exprimiert zu sein. Umgekehrt waren Proteine von intrazellulären Organellen (Cytochrom Oxidase und Ribophorin) und sogar die Plasmamembranen von anderen Lungengewebezellen (Fibroblast-Oberflächenantigen) von dieser Membranfraktion ausgeschlossen.
Detergenzresistenz von Caveolin als ein Marker für Caveolae
Caveolin wurde als ein biochemischer Marker für Caveolae verwendet; wobei gefunden wurde, dass das Caveolin in den Silica-beschichteten Membranen übermäßig exprimiert, einer Solubilisierung durch Homogenisierung bei 4°C-8°C unter Verwendung von Triton X-100 oder 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-Propansulfonat aber nicht anderen Detergenzien, einschließlich von Octyl β-D-Glucosid, SDS, Deoxycholat und Nonidet P-40, resistent war. SDS/PAGE zeigte, dass viele Proteine in Silica-beschichteten Membranen durch Triton X-100 solubilisiert waren, wohingegen andere es nicht waren und mittels Zentrifugation sedimentiert werden konnten. Immunoblotten zeigte, dass Caveolin und Cytoskelett ProteinBande 4.1 in die Triton-unlösliche Fraktion sedimentierten, wohingegen ACE hauptsächlich in der Triton-löslichen Fraktion gefunden wurde.
Beispiel 2
Isolierung von gereinigten Caveolae (V)
Caveolae, die der cytoplasmischen Seite der Plasmamembranen anhafteten, der Silica-Beschichtung in den Silica-beschichteten Membran-Pellets (P) gegenüber gelegen, wurden durch Scheren während Homogenisierung bei 4°C in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Triton X-100 von den Membranen gestrippt. Sie wurden anschließend durch einen Sucrose Dichtegradient-Zentrifugation isoliert, um eine homogene Population von biochemisch und morphologisch verschiedenen Caveolar-Vesikeln (V) zu erhalten. Dieses Verfahren ist in 1 schematisch dargestellt.
Isolierung von Vesikeln, die von Silica-beschichteten Membranen gestrippt werden
Die Silica-beschichteten Membranen (P) in Triton X-100 wurden von vorragenden Caveolae durch Scheren in einem Homogenisierer gestrippt und für eine Isolierung der Caveolae anschließend einer Sucrose Dichtegradient-Zentrifugation unterzogen. Eine Analyse von 34 Fraktionen des Sucrose Gradienten zeigte ein Spitzen-Signal für Caveolin, das von jenem für ACE gut getrennt war. Wenig Caveolin wurde in der Silica-beschichteten Membran nach Entfer nung der Vesikel (P-V) nachgewiesen. Das meiste davon befand sich in der sichtbaren Membranbande bei 10–16 % Sucrose (Fraktionen 6–10) die gesammelt wurde, für Vesikel mit V bezeichnet wurde, und durch Elektronenmikroskopie, SDS/PAGE und Immunoblotten untersucht wurde.
Charakterisierung von isolierten Vesikeln als Caveolae.
Eine Elektronenmikroskopie wurde auf 3 Hauptmembranfraktionen durchgeführt (wie in Dvorak, A.M., J. Electron. Microsc. Tech. 6: (1987), 255): ursprüngliche Silica-beschichtete Membran (P), isolierte Vesikel (V) und das Silica-beschichtete Membran-Pellet nach Entfernung von Vesikeln (P-V). In P waren kleine Membran-gebundene Elektronen-durchsichtige Öffnungen oder Fenster bzw. fenestrae in vielen Vesikeln in günstigen Schnitten sichtbar und waren eindeutig kein Teil der Ostia der Caveolae direkt an der Zellmembranoberfläche. Diese Fenster, wie vor vielen Jahren beschrieben (Palade, G.E. and Bruns, R.R., J. Cell. Biol. 37: (1968) 633), sind für Endothel-Caveolae charakteristisch und zeigen wahrscheinlich eine vorherige Haftung an ein anderes Vesikel als Teil einer Kette von Vesikeln. Die P-V Fraktion enthielt Silica-beschichtete Membranen ohne anhaftende Caveolae. Die V-Fraktion enthielt eine ziemlich einheitliche Verteilung von kleinen nicht-beschichteten Vesikeln hauptsächlich mit Durchmessern von 50–100nm. Eine höhere Vergrößerung zeigte für Caveolae in vivo gewöhnliche vaskuläre Strukturen. Einzelne Plasmalemma Vesikel und Ketten von Membran gebundenen Vesikeln lagen vor. Die für Caveolae unverkennbaren Fenster waren in vielen der Vesikel leicht zu erkennen. Einige Vesikel behielten immer noch ihre eingeengte Einschnürung wie in Caveolae bei, die an das Plasmalemma von Endothelium in vivo anheften. Eine höhere Vergrößerung zeigte zentrale Membran-gebundene Fenster in den isolierten Caveolae. Zentrale dichte, abgerundete Beulen, wie ursprünglich in vivo beschrieben (Palade, G.E. and Bruns, R.R., J. Cell. Biol. 37: (1968) 633), konnten in einigen dieser Fenster gefunden werden (nicht veröffentlichte Beobachtungen).
Eine biochemische Analyse zeigte ein eindeutiges Proteinprofil für die isolierten Vesikel, nicht nur mit einer äußerst eindeutigen Anreicherung von verschiedenen Proteinen relativ zum anfänglichen Membran-Pellet, aber ebenso einen Ausschluss von anderen Proteinen. Immunoblotten zeigte eine signifikante Anreicherung in V für Caveolin, Plasmalemma Ca²⁺-ATPase und IP3 Rezeptor mit bis zu 13-facher Anreicherung für Caveolin und IP3 Rezeptor relativ zur ursprünglichen Membran (siehe die nachstehende Tabelle). Nachdem die Caveolae entfernt wurden, verblieb weiterhin wenig Signal für diese Proteine in der Silica-beschichteten Membran (P-V) zurück. Immunoblots, die quantifiziert wurden, zeigten, dass diese drei Wesentlichen Membranproteine einer Triton-Solubilisierung resistent waren und in den gereinigten Caveolae (4) konzentriert sind. Achtzig bis 95 % des Signals für die Ca²⁺ Pumpe (Ca²⁺ATPase), IP₃ Rezeptor (IP₃R) und Caveolin waren der Caveolarfraktion. Dem gegenüber waren Bande 4.1 und ACE ausgeschlossen. Diese gereinigten Caveolae stellten eine Mikrodomäne der Plasmamembran mit mindestens drei ansässigen Proteinen dar, die nicht nur über die gesamte Zellober fläche frei verteilt aber vorzugsweise in dieser Organelle lokalisiert waren.
Das Ausmaß einer Aufreinigung von Caveolae wird durch die relativen Anreicherungen für Caveolin (siehe die nachstehende Tabelle) angezeigt. Soweit wie Ausbeuten, wurde vorher gezeigt, dass > 90 % der Mikrovasculatur in situ mit Silica beschichtet war und mindestens 80 der Silica-beschichteten Membran von den Rattenlungen Homogenat (Jacobsen, B.S., et al., Eur. J. Cell. Biol. 58: (1992), 296) pelletiert war. Die Ausbeute an Caveolin indem Membranpellet (P) betrug 10 % des gesamt indem anfänglichen Homogenat nachgewiesenen, was mit dem Konzept übereinstimmte, dass nur die Plasmalemma Untermenge von Caveolin enthaltenden Vesikeln von der luminalen Seite des Endothels isoliert wurde. Die Ausbeute an Plasmalemma Caveolae, die direkt von den ursprünglichen Silica-beschichteten Membranen (P) abgeleitet waren, reichte von 53 % bis 60 % über vier getrennte Versuche, wie durch ELISA und Immunoblotten für Caveolin angezeigt. Insgesamt wurden ungefähr 5μg Gesamtprotein isoliert, was ungefähr 5–6 % der Caveolae in den anfänglichen Lungenhomogenaten darstellt.
Tabelle: Relative Verteilung von vershiedenen Proteinen in Rattenlungenfraktionen
Die Daten stellen eine Zusammenfassung von neun Versuchen/Antigenen und zuvor berichteten Ergebnissen (Jacobsen, B.S., et al., Eur. J. Cell. Biol. 58:(1992), 296) dar. Quantifizierte Bandenintensitäten von Immunoblots wurden pro Einheit Protein normalisiert bevor Verhältnisse als ein Durchschnitt von mindestens zwei Bestimmungen berechnet wurden. Der Wert 0 zeigt an, dass Antigen nicht in P nachgewiesen allerdings in H gefunden wurde; -- zeigt nicht durchgeführt an.
Beispiel 3 Isolierung von Mikrodomänen von GPI-verankerten Proteinen (G)
Die Silica-Beschichtung der äußeren Membranoberfläche ändert den Weg, indem die GPI-verankerten Proteine mit verschiedenen Detergentien wechselwirken und daher die Trennung von nicht-caveolaren Detergenz-resistenten Mikrodomänen von den Zellmembranen verhindern. Kationische Silicapartikel wechselwirken mit der anionischen Zelloberfläche, um sie gegen Gefäßbildung oder laterale Wiederanordnung durch immobilisierende Membranmoleküle zu stabilisieren (Chaney, C.K. and Jacobson, B.S., J. Biol. Chem. 258: (1983) 10062; Patton, W.F., et al., Electrophoresis 11: (1990) 79). Es ist wahrscheinlich (Schnitzer, J.E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: (1995) 1759; Jacobson, B.S., et al., Eur. J. Cell Biol. 58: (1992) 296), dass die Plasmamembran stabilisiert war, indem sie fest auf einer Seite bis zu den meisten, wenn nicht allen, nicht Gefäß-bildenden Bereichen anhaftet, da die Silicapartikel die Zelloberfläche einheitlich beschichteten, aber aufgrund ihrer Größe selten mit den Caveolae assoziiert waren oder im Innern vorlagen. Diese anhaftende Pellicula ermöglicht den Caveolae auf der gegen gesetzten Seite der Membran durch Homogenisierung mit geringer Verunreinigung durch andere Membranen, einschließlich anderer Detergenz-resistenter Domänen, weggeschert zu werden. Umgekehrt, ohne Silica-Beschichtung, wurden sowohl caveolare als auch nicht-caveolare Detergenz-resistente Membranen co-isoliert.
Da die Silica-Beschichtung die Freisetzung von den Detergenz-unlöslichen Membranen, die reich an GPI-verankerten Proteinen sind, verhindert, war es möglich, diese Domänen getrennt von den Caveolae zu isolieren. Ein Verfahren durch welches dies bewerkstelligt wurde, wird schematisch in 2 gezeigt. Silica-beschichtete Membranen, die von Caveolae gestrippt waren (P-V), wurden mit 2 M KH₂PO₄ inkubiert, gefolgt durch Homogenisierung in Triton X-100 bei 4°C. Dieses Verfahren ermöglichte die Isolierung durch Sucrose Dichtegradient-Zentrifugation einer Membranfraktion (G), die Vesikel von > 150 nm im Durchmesser ohne Caveolae gemäß morphologischen und biochemischen Kriterien (Daten nicht gezeigt) enthielt.
Beispiel 4 Isolierung einer Membranfraktion, die Caveolae in Mikrodomänen von GPI-verankerten Proteinen (TI) umfasst
Ähnliche Verfahren zu jenen, wie vorstehend beschrieben, wurden verwendet, um eine Membranfraktion zu isolieren, die Caveolae, G-Domänen und Caveolae, die mit G-Domänen assoziiert sind, zu isolieren, wie schematisch in 3 gezeigt. Die Salzkonzentration wurde während der Isolierung der Silica-beschichteten Membranpellikula erhöht, was elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den kationischen Silicapartikeln und der polyanionischen Zelloberfläche ausreichend verringerte, um die Plasmamembran von der Silica-beschichteten Membranpellikula in (P) zu lösen. Unter diesen Bedingungen wurden intakte Membranen getrennt und wurden Detergenz-resistente Membranen (TI) geringer Dichte durch Sucrose Dichtegradient-Zentrifugation, wie vorstehend beschrieben, isoliert.
Beispiel 5 Proteinanalyse von verschiedenen Membran Unterfraktionen
Unterschiedliche Detergenzextraktion wurde auf Silica-beschichteten endothel-Zellmembranen (P) durchgeführt. Gleiche Teile resuspendiertes P wurden mit Drehung für 1 Stunde bei 4°C mit verschiedenen Detergentien (β-OG, β-Octylglucosid; Natrium Deoxycholat; Triton X-100) vor einer Zentrifugation bei 13000g für 2 Stunden inkubiert. Die löslichen Proteine (S) und die sedimentierten unlöslichen Proteine (I) wurden durch SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (10μg/Spur) fraktioniert, auf Nitrocellulose oder Immobilon (Millipore) Filter übertragen und einer Immunoblotanalyse mit äquivalenten Mengen an spezifischen Antikörpern für Caveolin, 5'-NT, Bande 4.1, GM und μPAR und den geeigneten 125-I-markierten sekundären Antikörpern wie beschrieben (Schnitzer, J.E. and Oh, P., J. Biol. Chem. 269: (1994), 6072; Milci, A.J., et al., J. Cell. Biol. 105: (1987), 2603) unterzogen. Andere getestete Proteine umfassten Angiotensin umsetzendes Enzym, was durch all diese Detergentien solubilisiert war, und Carboanhydrase, die ähnlich zu 5'-NT solubilisiert war (nicht veröffentlichte Daten). Proteine von Rattenlungen Homogenat (H), die durch Sucrose Dichtegradient-Zentrifugation (TI) isolierten Triton X-100 unlöslichen Membranen und das sedimentierte Pellet (R) wurden ebenso einer Immunoblotanalyse wie vorstehend unterzogen, mit der Ausnahme, dass die sekundären Antikörper an Meerrettich Peroxidase (HRP) konjugiert waren und ein Binden mit ECL chemolumineszierendem Substrat (Amersham) nachgewiesen wurde.
Auf P durchgeführte Detergenzextraktion Studien zeigten Unterschiede bei der Möglichkeit verschiedener Detergenzien Caveolin und 5'-Nucleotidase (5'-NT) zu solubilisieren. Caveolin wurde durch β-Octyl Glucoside, CHAPS, Deoxycholat, NP-40 und SDS (aber nicht Triton X-100) teilweise solubilisiert, wohingegen 5'-NT ausschließlich durch SDS und Deoxycholat (Daten nicht gezeigt) löslich gemacht wurde. Isolierungen mit Rattenlungengewebe, durchgeführt wie in Lisanti, M.P., et al. (J. cell. Biol. 126: (1994) 11) zeigten, dass Caveolin und GPI-verankerte Proteine (in diesem Beispiel 5'-NT) beide in den isolierten Triton X-100 unlöslichen Membranen (TI) vorlagen (Daten nicht gezeigt), was mit früheren Studien übereinstimmt (Sargiacomo, M., et al., J. Cell. Biol. 122: (1993), 769; Lisanti, M.P., et al., J. Cell. Biol. 123: (1993), 595; Change, W.J., et al., J. Cell Biol. 126: (1994), 127; und Lisanti, M.P., et al., J. Cell Biol. 126: (1994), 111). Die auf TI ausgeführten unterschiedlichen Detergenz Extraktionsstudien zeigten, dass GPI-verankerte Proteine durch β-octyl- Glucosid, CHAPS, Deoxycholat und SDS, wie erwartet effektiv solubilisiert wurden (Brown, D.A. and Rose, J.K., Cell 68: (1992), 533; Letarte-Murhead, M., et al., Biochem. J. 143: (1974), 51; Hoessli, D. and Runger-Brandle, E., Exp. Cell. Res. 166: (1985) 239; Hooper, N.M. and Turner, A.J., Biochem. J. 250: (1988), 865); Sargiacomo, M., et al., J. Cell. Biol. 122: (1993), 789; Lisanti, M.P., et al., J. Cell. Biol. 123: (1993),595). Dieses Muster war von dem löslichkeits-Muster für 5'-NT in P verschieden, aber ähnlich zu jenem für Caveolin in P.
Der Mangel an GPI-verankerten Proteinen in den gereinigten Caveolae angereichert an Caveolin und Gangliosid GM₁, wurde ebenso gezeigt. Das Lipid-verankerte Cholera Toxin-bindende Gangliosid GM₁ wurde in den Caveolae mit Goldmarkierung lokalisiert (Parton R.G., J. Histochem. Cytochem. 42: (1994)155; Montessano, R., et al., Nature 296: (1982), 651) und wurde daher als ein caveolarer Marker verwendet. Gesamtlungenhomogenat (H), Silica-beschichtete luminale Endothel-Membranen (P), gereinigte Caveolae (V) und die wieder sedimentierten Silica-beschichteten Membranen nach Strippen der Caveolae (P-V) wurden wie vorstehend einer Immunoblotanalyse unterzogen. GM₁ wurde nicht nur durch Immunoblot aber ebenso durch direktes Blotten mit HRP-konjugiertem Cholera Toxin nachgewiesen. Gereinigte Caveolae angereichert mit Caveolin und Gangliosid GM₁ fehlt es an GPI-verankerte Proteinen: V enthielt > 90 % GML. Die verbleibende Membran ohne Caveolae wies kein nachweisbares GM₁ auf, obgleich sie an GPI-verankerten Proteinen reich war. Weiterhin, wie Caveolin, waren 5'-NT und Urokinase-Plasminogen Aktivator Rezeptor (μPAR) in P relativ zu dem anfänglichen Rattenlungenhomogenat (H) angereichert. Unähnlich zu Caveolin waren jedoch diese Proteine nicht in V angereichert; sie verblieben beinahe gesamt mit den wieder sedimentierten Silica-beschichteten Membranen, die von dem Caveolin (P-V) gestrippt waren, assoziiert, die wenig, falls überhaupt, verbleibende Caveolae enthielten. Mehr als 95 % des Signals für Caveolin wurde in V nachgewiesen, mit < 4 % verbleibend in P-V. Umgekehrt verblieben > 95 % von 5'NT und μPAR in P-V, mit < 3 % in V vorliegend. Diese GPI-verankerten Proteine waren daher weder an Caveolin gekoppelt oder in den isolierten Caveolin angereicherten Caveolae konzentriert. Wie mit den Caveolae, die auf der Endothelzell-Oberfläche in vivo vorliegen (Kurzchalia, T.V., et al., J. Cell Biol 118: (1992) 1003; Dupree, P.L., et al., EMBO J. 12: (1993) 1597; Rothberg, K.G., et al., Cell 68: (1992), 673; Fujimoto, T., et al., J. Cell. Biol. 119: (1992), 1507; Fujimoto, T., J. Cell. Biol. 120: (1993), 1147) waren daher die gereinigten Caveolae (V) in Caveolin Plasmalemma Ca²⁺-abhängige Adenosin-Triphosphatase und dem Inositol 1,4,5-Triphosphatase Rezeptor angereichert. Im Gegensatz dazu waren andere Marker, die häufig in P, einschließlich Angiotensin umsetzendes Enzym, Bande 4.1, und β-Actin vorlagen häufig von V ausgeschlossen.
Das GPI-verankerte Protein, dass von den Silica-beschichteten Membranen getrennt isoliert wurde, wurde ebenso einer Immunoblotanalyse unterzogen, die wie vorstehend beschrieben durch geführt wurde, mit P-V von dem Silica und RP (das wieder sedimentierte Pellet des Silica-enthaltenden Materials). Das bereits Caveolae (P-V) gestrippte Silica-beschichtete Membran-Pellet wurde in 20 mM 2-IN-Morpholino Ethansulfonat und mit 125 mM NaCl und einem gleichen Volumen an 4M K₂HPO₄ und 0,2 % Polyacylat (pH 9,5) gelöst. Die Lösung wurde unter Kühlung mit Ultraschall behandelt (10 10-sPulse), auf einem Rotator für 8 Stunden bei Raumtemperatur (20°C) gemischt und wiederum mit Ultraschall behandelt (fünf 10-s Pulse). Triton X-100 wurde zu 1 % hinzu gegeben und die Präparation wurde anschließend für 10 Min. bei 4°C gemischt und mit einem Typ AA Teflongewebe Mahlwerk (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ) homogenisiert. Irgendwelche intakten fließenden Detergenz resistenten Membranen wurden durch Sucrose Dichtegradient-Zentrifugation wie vorstehend von diesem Homogenat getrennt und isoliert. Das Caveolin in P-V stellt das geringe verbleibende Signal nach Strippen der Caveolae dar (vergleiche V und P-V). GM₁ konnte in P-V nicht nachgewiesen werden, auch nicht wie erwartet, in G oder P (Daten nicht gezeigt). G ist reich an GPI-verankerten Proteinen (5'-NT, μPAR und CA) mangelt aber an Caveolin und GM₁. Kontrollexperimente, die identisch aber ohne hohe Salzkonzentration durchgeführt wurden, erbrachten keine nachweisbaren Membranen in dem Sucrose Gradienten (Daten nicht gezeigt). G fehlte es an Caveolin, war aber an mehreren GPI-verankerten Proteinen angereichert: 5'-NT, μPAR und Carboanhydrase (CA). Diese Ergebnisse zeigten, dass verschiedene Detergenz-resistente Plasmamembranen, reich an GPI-verankerten Proteinen aber mangelnd an Caveolin von den Caveolae getrennt isoliert wurden. Ähnlich dazu wurden Detergenz-resistente Membranen, die aus großen Vesikeln bestehen reich an GPI-verankerten Proteinen aber ohne Caveolin, ebenso von Lymphozyten und Neuroblastomzellen isoliert, die beide keine Caveolae aufweisen und Caveolin exprimieren (Frau, A.M., et al., J. Biol. Chem. 269: (1994)30745; Gorodinsky, A. and Harris, D.A., J. Cell Biol. 129: (1995), 619).
Immunoblotanalyse von Caveolae, die ohne Triton X-100 isoliert wurden, wurde ebenso durchgeführt. Caveolae wurden gereinigt ohne irgendwie einem Detergenz auszusetzen. Wie vorstehend angemerkt, können Caveolae ohne Aussetzen an Triton X-100 isoliert werden, allerdings weniger effizient. Dem gewöhnlichen Protokoll für Caveolae Isolierung wurde gefolgt, mit der Ausnahme, dass Triton X-100 weggelassen wurde und für Scherzwecke die Anzahl der Homogenisierungshübe von 12 auf 48 bis 60 angehoben wurde.
Diese Caveolae (V') und die von ihnen gestrippte Membran (P'-V') wurden wie vorstehend beschrieben einer Immunoblotanalyse unterzogen. Die Ergebnisse stimmten mit jenen überein, die von Caveolae erhalten wurde, die ohne Detergenz gereinigt wurden: Caveolin und GM₁ waren in V' angereichert, wohingegen GPI-verankerte Proteine beinahe vollständig von Detergenz-freien gereinigten Caveolae (V') ausgeschlossen waren.
Andere Studien, die eine Membrandiffusion durch Fluoreszenzausbeute nach Fotobleichung untersuchten, haben eine größere Fraktion von GPI-verankerten Proteinen nachgewiesen (20–60 %), die in einer unbeweglichen Fraktion vorlagen (Hannan, L.A., et al., J. Cell. Biol. 120: (1993), 353; Brown, D.A. and Rose, J.K. Cell 68: (1992), 533-544; Zhang, F., et al., J. Cell. Biol. 115: (1991), 75; Zhang, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: (1992), 5231). Durch Untersuchung von Detergenzsolubilität wurden für die GPI-verankerten Proteine in den Detergenz-resistenten Mikrodomänen ähnliche Prozentzahlen nachgewiesen, was die Äquivalenz dieser Fraktion mit der unbeweglichen Fraktion nahe legt, die in den Diffusionsstudien nachgewiesen wurde. Spezialisierte Glycolipiddomänen sind gegenüber einer Detergenzextraktion resistent und sind notwendig um Detergenz-resistente Cluster von GPI-verankerten Proteine beizubehalten (Schroeder, R., et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 91: (1994), 12130; Brown, D.A: and Rose, J.K:, Cell 68: (1992), 533; Letarte-Murhead, M., et al., Biochem. J. 143: (1974) 51; Hoessli, D. and Runger-Brandle, E., Exp. Cell. Res. 166: (1985), 239; Hooper, N.M. and Turner, A.J., Biochem. J. 250: (1988), 865; Sargiacomo, M., et al., J. Cell. Biol. 122: (1993), 789; Lisanti, M.P., et al., J. Cell. Biol. 123: (1993) 595). Entfernen von Cholestorol von Plasmamembranen kann die Bildung von derartigen Clustern trennen bzw. dissoziieren oder verhindern, und eine zufällige freie Verteilung von GPI-verankerten Proteinen gewährleisten (Rothber, K.G. et al., J. Cell. Biol. 111: (1990) 2931). Wie erwartet, reduziert eine Entfernung von Cholestorol die Resistenz von GPI-verankerten Proteinen auf eine Detergenzsolubilisierung (Sargiacomo, M., et al., J. Cell. Biol. 122: (1993), 789; Lisanti, M.P., et al., J. Cell. Biol. 123: (1993) 595), was mit der Vorstellung übereinstimmt, dass die frei diffundierenden GPI-verankerten Proteine in der Tat bereitwilliger durch Detergenz solubilisiert werden, als die weniger beweglichen GPI-verankerte Proteine in den Glycolipiddomänen. Darüber hinaus sind GPI-verankerte Proteine in der Abwesenheit von Glycolipiden ohne weiteres durch kaltes Triton X-100 von Membranen solubilisiert; wobei eine Solubilität mit der Zugabe von geeigneten Glycolipiden abnimmt (Schroeder, R., et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 91: (1994), 12130). Daher sollten GPI-verankerte Proteine die zufällig auf der Zelloberfläche verteilt sind, gegenüber einer Detergenzextraktion empfänglich sein; wobei in der Tat die Prozentzahlen, die hierin gezeigt sind, mit jenen von Diffusionsstudien übereinstimmen. In Homogenaten nicht Silica-beschichteter Rattenlunge sind ungefähr 60 % von CA und 75 % von 5'-NT durch Triton X-100 bei 4°C solubilisiert. Darüber hinaus zeigten Massengleichgewichte (mass balances), die auf die Silica-beschichteten Membranen durchgeführt wurden, dass ungefähr 20 % von 5'-NT und 40 % von CA in der intakten Detergenz-resistenten Membranfraktion TI isoliert werden konnte.
Es scheint daher, dass eine wesentliche aber änderliche Fraktion von GPI-verankerten Proteinen auf der Zelloberfläche vorliegt, die dynamisch in Detergenz-resistente Glycolipidmikrodomänen unterteilt ist, von denen es nicht wahrscheinlich ist, einfach nur eine Folge einer Detergenzextraktion zu sein und das die Größe dieser Fraktion vom Zelltyp, Kultur und Ligand oder Antikörperaussetzungen abhängen kann.
Lipidanker, wie beispielsweise GPI, können dem Befähigung von Proteinen kontrollieren, in den spezialisierten Mikrodomänen selektiv aber reversibel zu teilen und können daher einer Zielfunktion dienlich sein. Der GPI-Anker beeinflusst direkt eine Assoziierung mit den Detergenz-resistenten Membranen (Rodgers, W., et al., Mol. Cell. Biol. 14: (1994) 5364), Membrandiffusion (Hannan, L.A., et al., J. Cell. Biol. 120: (1993) 353; Zhang, F., et al., J. cell. Biol. 115: (1991) 75; Zhang, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1992) 5231), polarisierte Lieferung an Zelloberflächen (Brown, D., et al., Science 245: (1989), 1499; Simons, K. and van Meer, G., Biochemistry 27: (1988), 6197; Garcia, M. et al., J. Cell Sci. 104: (1993), 1281), Zellaktivierung (Su, B., et al., J. Cell. Biol. 112: (1991), 377) und die Rate und Weg einer Internalisierung (Keller, E.-A., et al. EMBO J., 3: (1992), 863). Andere Lipid-assoziierte Proteine, einschließlich NRTKs und Guanosin triphosphat (GTP)-Bindeproteine, wie beispielsweise Rab5, werden in den Detergenz-resistenten Komplexen gefunden (Sargiacomo, M., et al., J. Cell. Biol. 122: (1993), 789; Lisanti, M.P., et al., J. Cell. Biol. 123: (1993), 595; Chang, W.-J., et al., J. Cell. Biol. 126: (1994) 127; Lisanti, M.P., et al., J. Cell. BIol. 126: (1994), 111; Rodgers, W., et al., Mol. Cell. Biol. 14: (1994), 5364; Arreza, G., et al., J. Biol. Chem. 269: (1994), 19123; Shenoy-Scaria, A.M., et al., J. Cell Biol. 126: (1994), 353). Die vorliegende Analyse zeigt, dass mehrere NRTKs (Yes and Lyn, unveröffentlichte Daten) heterotrimere GTP-bindende Proteine (α und βγ Untereinheiten) (Schnitzer, J.E., et al., J. Biol. Chem. 270: (1995), 14399); und ebenso nicht identifizierte GTP-Bindeproteine, aber nicht Rab5 (Schnitzer, J.E., et al., J. Biol. Chem. 270: (1995), 14399), in der Tat in gereinigten Caveolae vorliegen.
Beispiel 6 Elektronenmikroskopie von V und TI Präparationen
Die Präparationen V und TI wurden mittels Elektronenmikroskopie untersucht, um zu bestimmen, ob Caveolae zu Triton-unlösliche Membranen von geringer Dichte äquivalent sind. Die Elektronenmikroskopie wurde auf Membranisolate, wie beschrieben in Schnitzer, J.E. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92: (1995), 1759-1763) durchgeführt, wobei die Lehren davon mittels Bezug eingefügt sind.
Elektronenmikroskopie der Vesikel (V), die von den Silica-beschichteten Rattenlungen Endothel-Membranen gereinigt wurden, zeigte, dass das V Isolat eine homogene Population kleiner Vesikel (≤ 100nm) von gewöhnlicher caveolarer Morphologie zeigt. Ungeachtet des Isolierungsverfahrens, behielten viele Caveolae ihre charakteristische Flaschenform bei.
Die Detergenz-resistenten Membranen (TI), die ohne Silica-Beschichtung isoliert wurden, bestanden aus vielen größeren Vesikeln (> 150 und < 700 nm im Durchmesser), waren durchsetzt mit kleineren caveolaren Vesikeln (< 100 nm) und einigen nicht-vesikulierten linearen Membranblättern. Von einer gewöhnlichen Caveolae war es offensichtlich, im Innern eines größeren Vesikels anzuhaften. In vielen guten Querschnitten, war eine charakteristische flaschenförmige Caveolae offensichtlich, die an ein größeres kugelförmiges Vesikel anhaftete, was nahe legt, dass diese beiden Detergenz-resistenten Membrandomänen miteinander als eine Einheit vor einer Fraktionierung in der Membran assoziiert waren.
Beispiel 7 Immunomarkierung mit kolloidalem Gold
Detergenz-resistente Membranisolate (TI) wurden für eine Goldmarkierung von CA oder GM₁ in Agarose eingebettet. Das Lipid-verankerte Molekül, das Cholera Toxin-bindende Gangliosid GM₁, wurde mittels Goldmarkierung in den Caveolae lokalisiert (Parton, R.G., J. Histochem. Cytochem. 42: (1994), 155; Montesano, R., et al., Nature 296: (1982), 651) und wurde daher als ein Marker für Caveolae verwendet. Insgesamt war ein Größenkriterium bei Unterscheiden der caveolaren Vesikel von den nicht-caveolaren Vesikel offensichtlich. Daher wurden die Vesikel, die in den Elektrogefügeaufnahmen eindeutig beobachtet wurden in zwei Gruppen unterteilt: jene mit Durchmessern von < 80 nm und jene mit Durchmessern von > 150 nm. Dieses Größenkriterium kann nicht als absolut bei einer Trennung von Caveolae von nicht-caveolaren Vesikeln betrachtet werden, da beispielsweise einige Caveolae aneinander haftend bleiben können und ein größeres Vesikel bilden. Nichtsdestotrotz unterstützen die Ergebnisse der Immunomarkierung die Verwendung von GM₁ als einen caveolaren Marker und erhärteten das Größenkriterium.
Bei einer geringen Vergrößerung, lokalisierte eine Immunogoldmarkierung von TI, CA hauptsächlich auf der Oberfläche der größeren Vesikel und linearen Membranen aber nicht auf den kleineren Caveolae. Das gesamte Gold haftet auf den Membranen mit wenig, falls überhaupt, Hintergrundmarkierung an. Bei größerer Vergrößerung zeigten Bilder nicht-markierte Caveolae, die offensichtlich an große Vesikel anhafteten, die mit Gold markiert waren oder mit markierten Membransträngen assoziierten, die an die Einschnürung der Caveolae anhafteten. Kontrollversuche mit nicht-immunem Serum zeigten eine geringe Markierung von Membranen; nur ein gelegentliches Goldpartikel wurde pro untersuchtes Feld nachgewiesen und schien zu einer Hintergrundmarkierung von Agarose allein äquivalent zu sein. Im Gegensatz zeigten Mikrogefügeaufnahmen von größerer Vergrößerung, dass Immunogoldmarkierung für GM₁ häufig in den Caveolae nachgewiesen wurde, mit geringer Markierung für die Caveolae-assoziierten größeren Vesikel oder restlichen Membranen. Dieses Ergebnis stimmte mit den biochemischen Daten und mit Goldlokalisierung von GM₁, durchgeführt auf Zellen, überein (,R.G., J. Histochem. Cytochem.42: (1994), 155; Montesano, R., et al., Nature 296: (1982), 651). Kontrollversuche, die mit Konjugaten plus einem 10-fachen Konjugatüberschuss von monomerem Cholera-Toxin durchgeführt wurden, zeigten eine beinahe vollständige Abwesenheit von Gold.
Obgleich mehrere vorherige Studien, die die Immunolokalisierung von GPI-verankerten Proteinen in kultivierten Zellen untersuchten, zum Schluss kamen, dass diese Proteine in Caveolae verbleiben (Rothberg, K.G., et al., J. Cell. Biol. 110: (1990), 637; Ying, Y., et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 57: (1992), 593; Ryan, U.S., et al., J. Appl. Physiol. 53: (1982), 914; Stahl, A. and Mueller, B.M:, J. Cell. Biol. 129: (1995), 335), zeigte eine wiederholte Untersuchung der veröffentlichten Elektronrnmikrogefügeaufnahmen eine geringfügige Goldmarkierung direkt im innern der Caveolae. Beinahe die gesamte Markierung ist übrigens den Caveolae benachbart auf der ebenen Plasmamembran direkt angebracht, ist aber kein Teil der Einschnürung der Caveolae. Das geringfügige Ausmaß einer Markierung, das im Innern der Caveolae offensichtlich ist, und das Ausmaß einer beobachteten Clusterbildung kann über Artefakte durch Antikörpervernetzung induziert sein (Mayor, S., et al., Science 264: (1994), 1948). Die hierin bereitgestellten Daten bestätigen, dass GPI-verankerte Proteine nicht in den Caveolae vorliegen, sondern an einer Membran anhaften, die sich neben den Caveolae befindet.
Das soll nicht unterstellen, dass GPI-verankerte Proteine niemals in die Caveolae eindringen können. Antikörper-vernetzte alkalische Phosphatase Cluster treten langsam in die Caveolae für eine Endocytose von Endosomen und Lysosomen ein (Parton, R.G., et al., J. Cell. Biol. 127: (1994), 1199), was mit Studien einer Internalisierung von modifizierten Albuminen durch Caveolae übereinstimmt, mit der Ausnahme, das der Vorgang eines Bindens, Clusterbildung, Iternalisierung und Abbau viel schneller zu dem Albumin auftrat (Oh, P., et al., J. Cell Biol. 127: (1994), 1217; Schnitzer, J.E., et al., J. Biol. Chem. 264: (1992), 24544; Schnitzer J.E. and Bravo, J., J. Biol. Chem. 268: (1993), 7562. Es scheint, dass zumindest für GPI-verankerte Proteine, ein Zelloberflächenprozessieren wahrscheinlich drei verschiedene bzw. eindeutig aufeinander folgende Schritte umfasst: (i) induzierte Bewegung von GPI-verankerten Proteinen (wahrscheinlich durch einen Liganden) in Mikrodomänen nahe den Caveolae, wodurch die lokale Konzentration von GPI-verankerten Proteinen durch direkte Sequestration von zuvor freien Molekülen oder möglicherweise durch Zusammenbau mehrerer kleinen Cluster erhöht wird; (ii) schließlich Bewegung in die Caveolae; und (iii) Fusion oder Knospen (budding) der Caveolae von der Membran zur Photocytose oder Endocytose.
Beispiel 8 Monoklonale Antikörper, die auf Plasmamembranen und Caveolae von Endothelium in situ erzeugt werden
Die luminale Endothel-Zelloberfläche stellt die kritische Schnittstelle dar, die direkt mit dem zirkulierenden Blut wechselwirkt, um cardiovaskuläre Homeostase beizubehalten, indem ein Vermitteln vieler Funktionen, einschließlich vaskulären Tonus, Kapillarpermabilität; Entzündung und Gerinnung unterstützt werden. Diese Oberfläche ist für intravenös injizierte Arzneimittel direkt zugänglich und kann nützliche organspezifische Endothelziele für eine selektive Arzneimittel- und Genlieferung enthalten. Weiterhin stellen Caveolae, die häufig auf der Oberfläche von vielen Endothelia vorgefunden werden, einen vesikulären Weg zum Handeln bzw. Leiten von Blutmolekülen und möglicherweise vaskulär-zielenden Arzneimitteln in und über das Endothelium bereit.
Luminale Endothelzell-Plasmamembran wurde zusammen mit ihren Caveolae direkt von Rattenlungengewebe durch in situ Beschichtungsverfahren gereinigt (Science 269: (1995), 1435-1439), um spezifische monoklonale Antikörper (mAbs) zu erzeugen. Monoklonale Antikörper wurden unter Verwendung von 100 μg P als Immunogen durch Standardverfahren erzeugt. Über 100 Hybridoma wurden erzeugt, die mittels ELISA die Silica-beschichteten luminalen Endothelzell-Plasmamembranen erkennen, die auf Platten mit 96 Vertiefungen adsorbiert sind. 20 stabile Klone wurden erzeugt und ihre mAbs wurden durch Westernblotting und Gewebeimmunocytochemie analysiert.
Zwei der Antikörper wurden von weiteren Studien ausgeschlossen, da sie während Westernblotting nicht erfolgreich waren, wahrscheinlich als eine Folge einer Proteindenaturierung, da sie kein Antigen in den Silica-beschichteten Plasmamembranen durch ELISA und in Gewebeschnitten durch Immunomikroskopie erkannten.
Drei der Antikörper (167, 278, 461) erkannten keine Moleküle in Caveolae, da ihr Signal ausschließlich in (P) und (P-V) gefunden wurde. Sieben mAbs (833, 472, 154, 228, 302, 309 und ein anderer mAb) erkannten Antigene, die hauptsächlich in gereinigte Caveolae (V) gefunden wurden, basierend auf ihrer Anreicherung (V) aber bei einer beinahe vollständigen Abwesenheit von (P-V). Zwei dieser Antikörper (833 und 472) reagierten mit der Oberfläche von mikrovaskulärem Endothelium in Lungengewebe, wie sowohl durch Immunoblotten und Gewebeimmunofärbung bewertet. Die Antikörper 833 und 472 schienen nicht spezifisch für Proteine in P von jeweils ungefähr 80 und 90 kDa zu sein. Densitometrie zeigte, dass beide Antigene in P über das anfängliche Lungenhomogenat (H) sehr angereichert waren (78-fach für 833 und 23-fach für 472) und ebenso in gereinigten Caveolae (V) über die Caveolae gestrippte Silica-beschichtete Membran (P-V) (60-fach für 833 und 7-fach für 472). Darüber hinaus wurde eine signifikante Co-Lokalisierung auf der Zelloberfläche des Signals von 833 und 472 mit jenem von Caveolin gefunden, das durch kommerziell erhältliche Antikörper erkannt wurde.
Die ganzen anderen Antikörper erkannten spezifische Proteine, die in den Silica-beschichteten Endothelzell-Plasmamembranen (P) über die anfänglichen Lungenhomogenaten (H) angereichert sind. Es war in vielen Fällen schwierig das Antigen in den anfänglichen Lungenhomogenaten nachzuweisen, wobei das Antigen allerdings leicht in P sichtbar war, was eine signifikante Anreicherung zeigt, die durch die Reinigung bereitgestellt wird.
Westernanalyse wurde auf Gesamtgewebelysaten wie vorstehend beschrieben unter Verwendung von 20 μg Proteinen, die von den angezeigten Geweben solubilisiert wurden (Schnitzer, J.E. et al., Science 269: (1995), 1435-1439; Schnitzer, J.E. et al., J. Biol. Chem. 270: (1995) 14399-14404; Schnitzer, J.E: and Oh, P., J. Biol. Chem. 269: (1994), 6071-6082), durchgeführt. Da es wahrscheinlich ist, dass einige der Antigene, insbesondere jene die ausschließlich in Endothelium exprimiert werden, nicht durch Westernanalyse von Gesamtgewebelysaten nachgewiesen werden könnten, wurden verschiedene Rattengewebe ebenso durch Immunohistochemie und Mikroskopie durchmustert. Rattenorgane wurden von Blut frei gewaschen und anschließend durch Perfusion von kaltem 4 % Paraformaldehyd in PBS fixiert, um eine Immunofärbung durchzuführen. Das Lungenparenchym wurde durch Füllen der Bronchien mit OCT-Verbindung (Miles; Elkhart; IN) vergrößert. Kleine Gewebeproben wurden in Paraformaldehyd für 2–3 Stunden fixiert, mit kalter 30 % Sucrose über Nacht infiltriert und anschließend in OCT bei –70°C gefroren. Gefrorene 5μm Schnitte wurden geschnitten und auf Poly-1-lysin beschichteten Glasobjektträgern platziert. Bei Raumtemperatur, wurden die Schnitte für 30 Minuten getrocknet, für 10 Minuten in PBS gewaschen, mit 0,6 % Wasserstoffperoxid in Methanol behandelt, wiederum gewaschen, für 30 Minuten mit 5 % Schafserum blockiert, und anschließend für 1 Stunde mit 1 μg/ml gereinigtem IgG inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Gewebeschnitte für 30 Minuten mit 10μg/ml Biotin-markiertem Schaf- anti-Maus IgG (The Binding Site; Biurmingham, UK) in Blocker inkubiert, gewaschen, für 20 Minuten mit 1 μg/ml Streptavidin inkubiert, das an Meerrettich-Peroxidase (Biogenex; San Roman, CA) in Blocker konjugiert war. Nach dem Waschen, wurde das Gewebe für 3–5 Minuten mit Enzymsubstrat 3-Amino-9-ethylcarbazol (Zymed, South San Francisco, CA) inkubiert, bevor das Substrat mit destilliertem Wasser weggewaschen wurde. Das Gewebe wurde mit Hematoxylin gegengefärbt, gewaschen, getrocknet und unter Verwendung eines Aufspanngels (Biomeda; Foster, CA) mit einem Deckbelag (cover slip) bedeckt.
Basierend auf den anfänglich getesteten Geweben (Lunge, Herz, Gehirn, Leber, Niere, Nebenniere, Hoden, Darm, skelettaler Muskel, und Milz) zeigten sowohl Westernblotting von Gesamtgewebelysaten und immunohitochemisches Färben von Formaldehyd-fixierten Gewebeschnitten eine gute Lungenspezifizität für sowohl 833 und 472. Sie reagierten mit dem Endothelium ausschließlich in Lungengewebe und färbten keine größeren Blutgefäße, was eine mikorvasculare Spezifität nahe legt. Die Lungenepithelzellen, insbesondere in den Bronchien offensichtlich, waren ebenso nicht reaktiv. Im Gegensatz färbten viele der anderen monoklonalen Antikörper Endothelium in vielen verschiedenen Geweben und sowohl in großen als auch kleinen Blutgefäßen. Ein Durchmustern von Rattenorganen zeigte an, dass die meisten dieser mAbs alle Endothelia erkannten, wohingegen wenige für beständiges bzw. durchgehendes Endothelium spezifisch waren. Da mAb 167 mit durchmusterten Serum durch ELISA reaktiv war, wurde es von weiterer sofortiger Untersuchungen ausgeschlossen.
Die Organ- und Caveolae-spezifischen Antikörper (833, 472, 154, 228, 302 und 309) wurden weiterhin untersucht, ebenso wie 881, der alle Gewebeendothelia erkennt und als eine Positivkontrolle wirkt. Die zwei lungenspezifischen Antikörper, mAb 833 und 472, wurden verwendet, um ein Immunzielen in vivo zu bewerten. mAb 833 und 472 IgG wurden gereinigt, und mit Iodogen radiodiert und zur Entfernung von freiem ¹²⁵I entsalzt. 500 μl enthalten 10μg von markiertem IgG verdünnt in 10 mg/ml Rattenserumalbumin (Sigma; St. Louis; MO) wurden in die Schwanzvenen von männlichen Sprague-Dawley Ratten (150–200 g) injiziert, um ein Immunozielen in vivo zu bewerten. Ein negativ Kontrollantikörper wurde ebenso verwendet, der Vinculin erkennt, ein nicht auf der Endothel-Zelloberfläche ausgesetztes Antigen. nach 30 Minuten und vor einer Thorakotomie und Blutentfernung (1 ml) durch Herzpunktion, wurden die Ratten schließlich unter Verwendung von 300 U Ketamin und 10 mg Xylazin anästhesiert. Die angezeigten Gewebe wurden entfernt und gewogen bevor Gamma Radioaktivität gezählt wurde. Die Menge an Antikörper pro Gramm Gewebe wurde unter Verwendung der spezifischen Aktivität von jedem Antikörper berechnet. Im ersten Satz von untersuchten Ratten wurden ebenso ⁵¹Cr-markierte rote Blutzellen injiziert, um eine augenblickliche Gewebeaufnahme durch Bestimmen und anschließendes Abziehen von Gewebeblutvolumen zu bestimmen (Bernareggi, A. and Rowland, M., J. Pharmacokin. Biopharm. 19: (1991) 21–50). Aufgrund der geringen Blutkonzentrationen, war diese Korrektur relativ zu den in den Geweben nachgewiesenen mAb 833 und 472 vernachlässigbar. Daher wurde diese Tätigkeit eingestellt.
In gerade 30 Minuten erschienen sehr verschiedene Bioverteilungen für jeden Antikörper. Jeder verschiedene Antikörper wurde in drei verschiedene Ratten mit nahezu identischen Ergebnissen injiziert. Der nichtzielende negativ Kontrollantikörper wies eine geringe Reaktivität auf und verblieb hauptsächlich intravaskulär, wie durch sehr hohe Zahlen im Blut angezeigt. Wie erwartet wies die Leber die am meisten signifikante Aufnahme von diesem Antikörper auf. Im Gegensatz wiesen sowohl 472 als auch 833 sehr geringe Blutzählungen (> 10-fach weniger als die Kontrolle für 833) und eine äußerst signifikante Gewebeaufnahme in die Lunge auf (> 50-fach für 833 über die Kontrolle). Beide zeigten ähnlich geringe Aufnahmeniveaus in die Leber, vergleichbar zu dem Kontrollantikörper, wie es für alle Antikörper erwartet werden würde, die kein alternatives Ziel in der Leber erkennen. Am wichtigsten, mAb 833 schien sich am schnellsten und signifikantesten in der Lunge spezifisch zu akkumulieren, wobei wenig in anderen Organen nachgewiesen wurde. Eine Massegleichgewichtsanalyse zeigte, das ein Mittelwert von 75 ± 6,4 % (833; im Bereich von 67–87 %) und 16 ± 1,1 % (472) der injizierten Dosis (10μg jeweils) auf das Lungengewebe in gerade 30 Minuten gezielt wird. Beide Ergebnisse stehen im deutlichen Gegensatz zu den 1,4 % des nicht-gezielten Antikörpers, der in dem Lungengewebe gefunden wird. Beide dieser zielenden Antikörper überschritten Teilreporte signifikant, die verschiedene zielende monoklonale Antikörper verwendeten, die mehr als eine Woche benötigten, um eine maximale Gewebeaufnahme von 0,2–4 % der injizierten Dosis zu erhalten (Tomlinson, E., Advanced Drug Delivery Reviews 1: (1987) 87-198; Ranney, D.F., Biochem. Pharmacol. 35: (1986) 1063-1069); Holton, O.D. et al., Immunol. 139: (1987) 3041-3049; und Pimm, M.V. and Baldwin, R.W., Eur. J. Clin. Oncol. 20: (1984), 515-524). Sogar 24 Stunden nach Injektion verblieben immer noch 46 % der injizierten Dosis mAb 833 in dem Lungengewebe, was mit dem erwarteten Transport in oder über das Endothelium durch die Caveolae übereinstimmt (Schnitzer, J.E., Trends in cardiovasc. Med. 3: (1993) 124-130; Schnitzer, J.E. and Oh, P., J. Biol. Chem. 269: (1994) 6072-6082; Schnitzer, J.E. et al., J. Cell. Biol. (1994) 1271217-1232).
Um die Ergebnisse in das rechte Licht zu rücken, ist das angenommene pharmazeutische Kriterium für ein Bewerten einer Arzneimittellokalisierung und Zielen, dass der therapeutische Index um eine halbe Log-Einheit ungefähr 3-fach ansteigen muss. Daher sollte ein wahrhaftiges Zielverfahren die gewöhnlichen Niveaus in nicht-gezielten Organen erzeugen, um weniger als ein Drittel des Lungenzuwachs anzusteigen (Ranney, D.F., Biochem. Pharmacol. 35: (1986) 1063-1069). Für mAb 833 änderte sich die Aufnahme in den nicht-Lungenorganen minimal oder nahm von dem Kontroll-IgG sogar ab, während die Lungenaufnahme um das 50-fache anstieg. Eine stringentere Bewertung durch Berechnung des Gewebezielindexes (TTI) (Antikörper in Gewebe/g Gewebe/Antikörper in Blut/g oder Blut) und Gewebeselektivitätsindex (TSI) (TTI für den zielenden IgG in Gewebe durch TTI für nichtzielendes Kontroll-IgG in dem gleichen Gewebe) zeigte ein hervorragendes Zielen durch 833 mit herausragender Selektivität für die Lunge mit einem mittleren TTI von 56 und einem mittleren TSI von 150. mAb 472 ergab einen herausragenden TTI für Lunge (34), zielte aber ebenso auf mehrere andere Gewebe (Milz, TTI = 8,2, Niere, TTI = 4,1 und Nebenniere, TTI = 4,6). Im Gegensatz mangelte dem Kontroll-IgG ein signifikantes Zielen mit IgG < 1 für alle untersuchten Organe und einem maximalen Wert für Leber bei 0,36. Zuletzt erforderte das mit 833 beobachtete schnelle selektive Gewebezielen keine intravenöse Injektion und konnte bei arterieller Injektion einfach nachgewiesen werden, so dass ein Durchtritt durch die systemische Zirkulation früher auftrat, bevor die Lungen erreicht wurden. Vergleiche von Injektionen von mAb 833 direkt in die rechte oder linke ventrikularen Kammern in einer Thorakotomie unterzogenen Ratten zeigte, dass sogar nach ausschließlich 15 Minuten in der Zirkulation der TTi für beide Injektionen bereits 10 überstieg (11 für die linke ventrikulare Kammer und 16 für die rechte ventrikulare Kammer), während > 1 für alle anderen untersuchten Gewebe einschließlich der Leber. Dieses Niveau an Gewebespezifizität, Zielen und Schnelligkeit einer Aufnahme ist beispiellos.
Hinsichtlich der in vivo Ergebnisse wurden weitere Gewebe Immunofärbestudien durchgeführt, um die nicht-Lungengewebe einzuschließen, die eine Aufnahme von 472 aufwiesen. Ein schwaches Signal wurde in mit Formaldehyd fixierter Milz aber nicht in anderen Geweben nachgewiesen. Wenn Proben unter milderen Bedingungen mit Aceton fixiert wurden, war es offensichtlich, dass mAb 472 Blutmikrogefäße in Lunge, Niere, Nebenniere und Milz färbte, aber nicht Herz, Leber, Darm, Gehirn, Muskel und Hoden. Diese Gewebeverteilung unterstützt die vorstehenden in vivo Ergebnisse. Wiederum färbte mAb 833 mikrovasculäres Endothelium ausschließlich in der Lunge.
Diese Organ-spezifischen Antikörper zeigen, dass auf der Endothel-Zelloberfläche in vivo zugängliche, Organ-spezifische Ziele vorliegen, und Stellen ein Mittel für eine Lokalisierung oder Zielen von Agenzien auf spezifische Organe oder Gewebe, einschließlich von Zielen in gewöhnlichen oder erkrankten Geweben, bereit.

Claims

Verfahren zum Isolieren oder Reinigen von Plasmamembran-Mikrodomänen und/oder von Komponenten, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) Bereitstellen gereinigter Plasmamembranen, die Caveolae und G-Domänen aufweisen, und die mit kolloidalen Silikapartikeln bedeckt sind, wobei die Partikel auf der Seite der Plasmamembranen vorliegen, die der, auf der die Caveolae auftreten abgewandt ist; b) Unterwerfen der Plasmamembranen einem Membran-Disruptionsverfahren, wobei das Membran-Disruptionsverfahren Scherung ist und in der Abwesenheit eines Detergens ausgeführt wird; c) Unterwerfen der Produkte von b) einer auf Dichte basierenden Trennungstechnik; und d) Entfernen der Plasmamembran-Mikrodomänen und/oder Komponenten, die zu isolieren oder reinigen sind, von anderen Plasmamembran-Fragmenten.
Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung gereinigter Caveolae, wobei: a) in Schritt b) das Membran-Disruptionsverfahren auf die gereinigten, mit kolloidalen Silikapartikeln bedeckten Plasmamembranen angewendet wird, wodurch Caveolae von gereinigten Plasmamembranen abgelöst und gereinigte Plasmamembran-Fragmente hergestellt werden, die Caveolae umfassen, die nicht länger an den gereinigten Plasmamembranen und G-Domänen haften; b) in Schritt c) Caveolae von anderen gereinigten Plasmamembranfragmenten getrennt werden; und c) in Schritt d) die Caveolae, die in Schritt c) von den anderen gereinigten Plasmamembran-Fragmenten getrennt wurden, entfernt werden, wodurch gereinigte Caveolae hergestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung gereinigter G-Domänen, wobei: a) in Schritt b), als ein Ergebnis des Membran-Disruptionsverfahrens Caveolae von gereinigten Plasmamembranen abgelöst werden, wodurch mit Silikapartikel-bedeckte Plasmamembranen, die frei von Caveolae sind, hergestellt werden; b) nach Schritt b): (i) die mit Silikapartikel-bedeckten Plasmamembranen, die frei von Caveolae sind, Hochsalzbedingungen unterworfen werden, die zu einer Trennung von Silikapartikeln von Plasmamembranen führen, wodurch Plasmamembranen hergestellt werden, die frei von Caveolae sind; (ii) die Plasmamembranen, von denen Caveolae abgelöst wurden, einem weiteren Membran-Disruptionsverfahren in der Gegenwart eines Detergens und bei einer Temperatur von etwa 4 °C bis 8 °C unterworfen werden, wodurch Plasmamembran-Fragmente hergestellt werden; c) in Schritt c) G-Domänen von anderen Plasmamembran-Fragmenten getrennt werden; und d) in Schritt d) die G-Domänen, die in c) von den anderen Plasmamembran-Fragmenten getrennt wurden, entfernt werden, wodurch gereinigte G-Domänen hergestellt werden.
Gereinigte G-Domänen, die durch das Verfahren nach Anspruch 3 hergestellt wurden.
Zelluläre Plasmamembranen, die im Wesentlichen aus Caveolae und Mikrodomänen von GPI-verankerten Proteinen bestehen, die durch das Verfahren nach Anspruch 1 hergestellt wurden, wobei a) auf Schritt a) der Schritt folgt: (i) Unterwerfen der gereinigten Plasmamembranen unter Bedingungen, die zur Trennung von Silikapartikeln von Plasmamembranen führen, wodurch Plasmamembranen hergestellt werden; b) in Schritt b) das Membran-Disruptionsverfahren auf die Plasmamembranen von Schritt (i) angewendet wird, wodurch gereinigte Plasmamembran-Fragmente hergestellt werden; c) in Schritt c) Plasmamembran-Domänen, die im Wesentlichen aus Caveolae bestehen, die mit Mikrodomänen von GPI-verankerten Proteinen assoziiert sind, von den gereinigten Plasmamembranfragmenten getrennt werden; und d) in Schritt d) die Plasmamembrandomänen, die im Wesentlichen aus Caveolae bestehen, die mit Mikrodomänen von GPI-verankertem Protein assoziiert sind, von anderen gereinigten Plasmamembranfragmenten entfernt werden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die gereinigten Plasmamembranen Endothelzell-Plasmamembranen sind.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Membran-Disruptionsverfahren Scherung ist.
Monoklonaler Antikörper, der für gereinigte Caveolae spezifisch ist.
Monoklonaler Antikörper, der für Lungen-Caveolae spezifisch ist.
Vektor für Liefern oder gezieltes Zuführen eines Mittels in und/oder über die Plasmamembran, umfassend, einen Antikörper, der für Caveolae oder gereinigte G-Domänen ist spezifisch.
Vektor nach Anspruch 10, wobei das Mittel ist: (a) ein Arzneimittel (beispielsweise ein Peptid oder kleines organisches Molekül); (b) ein Gen, das ein therapeutisches oder diagnostisches Peptid/Protein codiert; (c) ein Antikörper; oder (d) ein Chemotherapeutikum.
Monoklonaler Antikörper, der für gereinigte Caveolae (beispielsweise Lungen-Caveolae) spezifisch ist, zur Verwendung in einer Therapie (beispielsweise beim Zuführen von Molekülen zu und/oder über Zellmembranen).
Antikörper nach Anspruch 12, der Gewebe-spezifisch ist.
Verwendung eines Mittels, das an eine Mikrodomäne der Lumenoberfläche des Gefäßendothels bei Kontakt mit der Lumenoberfläche bindet und daran lokalisiert, wobei die Mikrodomäne ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Caveolae, G-Domänen und Caveolae, die mit G-Domänen assoziiert sind, zur Herstellung eines Medikaments zum Zuführen eines Mittels von Interesse an eine Gefäßendothel-Lumenoberfläche.
Verwendung eines Mittels, das an eine Mikrodomäne der Gefäßendothel-Lumenoberfläche bei Kontakt mit der Lumenoberfläche bindet und daran lokalisiert, und das an einem Transport in und/oder über die Lumenoberfläche beteiligt ist, wobei die Mikrodomäne ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Caveolae, G-Domänen und Caveolae, die mit G-Domänen assoziiert sind, zur Herstellung eines Medikaments zum Zuführen eines Mittels von Interesse in und/oder über eine Gefäßendothel-Lumenoberfläche.
Verwendung eines Mittels, das an eine Mikrodomäne der Gefäßendothel-Lumenoberfläche bei Kontakt mit der Lumenoberfläche bindet und daran lokalisiert, und das an einem Transport über die Lumenoberfläche und von einer Seite einer zugrunde liegenden Zelle zu einer anderen Seite beteiligt ist, wobei die Mikrodomäne ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Caveolae, G-Domänen, und Caveolae, die mit G-Domänen assoziiert sind, zur Herstellung eines Medikaments zum Zuführen eines Mittels von Interesse über eine Gefäßendothel-Lumenoberfläche und von einer Seite einer zugrundeliegenden Zelle zu einer anderen Seite.
Verwendung nach Anspruchs 14, 15 oder 16, wobei das Mittel von Interesse (a) in Anspruch 14 umfasst, eine aktive Mittel-Komponente und eine Transport-Mittel-Komponente, wobei die Transport-Mittel-Komponente an eine Mikrodomäne der Lumenoberfläche des Gefäßendothels bindet und daran lokalisiert; (b) in Anspruch 15 umfasst, eine aktive Mittel-Komponente und eine Transport-Mittel-Komponente, wobei die Transport-Mittel-Komponente an eine Mikrodomäne der Lumenoberfläche des Gefäßendothels bindet und daran lokalisiert und an einem Transport in und/oder über die Lumenoberfläche beteiligt ist; (c) in Anspruch 16 umfasst, eine aktive Mittel-Komponente und eine Transport-Mittel-Komponente, wobei die Transport-Mittel-Komponente an eine Mikrodomäne der Lumenoberfläche des Gefäßendothels bindet und daran lokalisiert und an einem Transport über die Lumenoberfläche und von einer Seite einer zugrundeliegenden Zelle zu einer anderen Seite beteiligt ist.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die aktive Mittel-Komponente ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Antikörper, einem Gen, einer Arzneimittel, einem Toxin und einem diagnostischen Agens.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die aktive Mittel-Komponente und die Transport-Mittel-Komponente die gleiche Komponente sind.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die aktive Mittel-Komponente ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Antikörper, einem Arzneimittel, einem Toxin und einem diagnostischen Agens.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Transport-Mittel-Komponente an ein Molekül, das auf der Lumenoberfläche einer Mikrodomäne der Lumenoberfläche des Gefäßendothels vorliegt, bindet und daran lokalisiert.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Transport-Mittel-Komponente ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Antikörper, einem Peptid, einem Virus, einem Rezeptor, einem Ligand und einem Gen-Zuführungsvehikel.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei die Transport-Mittel-Komponente ein Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 14, 15 oder 19, wobei das Agens von Interesse einer Lumenoberfläche des Gefäßendothels eines Gewebes in einer Gewebe-spezifischen Weise zugeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Gefäßendothel eines Gewebes ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: vaskulares, pulmonales, kardiales, zerebrales, Nieren-, hepatisches, endokrines und intestinales Gewebe.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Gewebe maligne ist.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Mittel von Interesse ein Gen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Mittel von Interesse ein Immunotoxin umfasst.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei das Gefäßendothel eines Gewebes ein Gefäßendothel von kardialem Gewebe ist, und wobei das Agens von Interesse ein selektives Stimulans umfasst.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei das Gefäßendothel eines Gewebes ein Gefäßendothel eines Blutgefäßes ist, und wobei das Mittel von Interesse ein Anticoagulans umfasst.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei das Gefäßendothel eines Gewebes ein Gefäßendothel eines Blutgefäßes ist, und wobei das Mittel von Interesse ein Gen umfasst, das für ein Anticoagulans kodiert.