DE69634780T2 - Methode zur analyse der immunsuppressiven aktivität von ionenkanal-blockern mit hilfe des mini-schweins - Google Patents
Methode zur analyse der immunsuppressiven aktivität von ionenkanal-blockern mit hilfe des mini-schweins Download PDFInfo
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Description
- Hintergrund der Erfindung
- Der Kaliumionenkanal spielt eine Rolle bei der normalen zellulären Homöostase und deren möglicher Assoziation mit Störungen, die in Zusammenhang mit einer Vielfalt von Krankheitszuständen und Immunreaktionen stehen.
- Erkrankungen mit einem speziellen Bezug zu solchen Kanälen umfassen Autoimmunerkrankungen und Transplantatabstoßungen. Autoimmunerkrankungen umfassen rheumatoide Arthritis, Diabetes mellitus vom Typ 1 (insulinabhängig), multiple Sklerose, Myasthenia gravis, systemischer Lupus erythematodes, Sjorgran's Syndrom, gemischte Bindegewebserkrankung, experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE), um nur einige wenige zu nennen.
- In den meisten Fällen wird angenommen, dass Autoimmunerkrankungen das Ergebnis von autoreaktiven Zellen des Immunsystems sind, welche Zielgewebe zerstören, entweder durch direkte Abtötung oder durch Bildung von Autoantikörpern. Bei den bisher untersuchten Autoimmunerkrankungen scheint sich ein gemeinsames Muster von anomalen Immunzellen zu ergeben, welche Substanzen produzieren, die bestimmte Zielgewebe entweder zerstören oder hemmen und Symptome verursachen, die für diesen Krankheitszustand typisch sind.
- Allotransplantate oder Xenotransplantate können durch entweder eine zellvermittelte oder eine humorale Immunreaktion des Empfängers gegenüber antigenen Komponenten, die bei der Abstoßung vorliegen, abgestoßen werden, welches die akute lymphozyten-vermittelte Immunreaktion gegen Transplantationsantigene ist (Wirt-gegen-Transplantat-Reaktion).
- Die gegenwärtige Behandlung solcher Reaktionen und Erkrankungen bleibt auf empirischem Niveau und basiert auf der Veranlassung einer allgemeinen immunsuppressiven Reaktion. Ein solcher therapeutischer Ansatz ist auch mit anderen Problemen, einschließlich damit assoziierter schwerer Nebenwirkungen, verbunden. Ferner dient er lediglich zur Verlangsamung des natürlichen Fortschritts dieser Autoimmunerkrankungen.
- Mehrere Klassen von Kaliumkanälen sind an der Aufrechterhaltung des Membranpotentials und der Regulation des Zellvolumens in verschiedenen Zelltypen sowie der Modulation von elektrischer Anregbarkeit im Nervensystem beteiligt. [R. C. Lewis und M. D. Cahalan, "Potassium and Calcium Channels in Lymphocytes", Ann. Rev. Immunol. 13, (1995) 623-653 und "Lymphocyte Ion Channels as a Target for Immunosuppression", G. J. Kaczorowski und G. C. Koo, Perspectives in Drug Discovery and Design 2, (1994) 233-248.] Von Kaliumkanälen wurde gezeigt, dass sie die Repolarisationsphase von Aktionspotentialen und das Muster des Feuerns von Neuronen und anderen Zellen steuern. Es wurde gezeigt, dass Kaliumströme unterschiedlicher als Natrium- oder Calciumströme sind und auch eine zentrale Rolle bei der Bestimmung der Art und Weise, in der eine Zelle auf einen externen Stimulus reagiert, spielen. Beispielsweise wird die Geschwindigkeit der Adaptation oder die Verzögerung, mit der ein Neuron auf einen synaptischen Input anspricht, stark durch die Anwesenheit verschiedener Klassen von Kaliumkanälen bestimmt.
- Die Aufmerksamkeit konzentrierte sich auf den K+-Ionenkanal selbst. Zwei Typen von Ionenkanälen, pharmakologisch und elektrophysiologisch klassifiziert, wurden identifiziert, die spannungsaktivierten Kaliumkanäle (Kv) und die calciumaktivierten K+-Kanäle (KCa). T-Zellen in den peripheren Lymphoidgeweben für die vorliegenden Zwecke werden in relevante Typen charakterisiert: CD4+CD8 -, CD4 -CD8 +, CD4 -CD8 -. Diese Zellen exprimieren einige oder alle dieser Kaliumionenkanäle. Bei der normalen Immunreaktion, welche eine Induktion von Aktivität reflektiert, wie z.B. bei Mitogenen, wird ein einzelner Ionenkanaltyp in den Zellen, die aktiviert werden, bis zu zehnfach erhöht. Somit zeigen normale T-Zellen, wenn sie durch Mitogene stimuliert werden, eine normale Immunreaktionserhöhung in der Anzahl dieser Ionenkanäle.
- Einer dieser Typen von K+-Ionenkanälen, Kv1.3, bestimmt das Membranpotential in nicht-aktivierten Human-T-Zellen. Es wurde festgestellt, dass die Blockade dieses K+-Ionenkanals ausreicht, um eine Depolarisierung zu verursachen und die Mitogenaktivierung zu verhindern. ["Lymphocyte Ion Channels as a Target for Immunosuppression", G. J. Kaczorowski und G. C. Koo, Perspectives in Drug Discovery and Design 2, (1994) 233-248.] Vor der Entdeckung des Minischweins als Tiermodell zum Testen von Kv1.3-Blockern in der gemischten Lymphozytenreaktion wurden mehrere andere Tiermodelle studiert, einschließlich der Maus, Ratte, dem Kaninchen und Meerschweinchen. Jedoch wird die gemischte Lymphozytenreaktion durch Margatoxin (MgTX), einem spezifischen Peptid-Inhibitor von Kv1.3-Kanälen, in diesen Tiermodellen nicht inhibiert. [Leonard et al., Selective blockers of voltage gated K+ channels depolarized human T lymphocytes: mechanism of the antiproliferative effect of Charybdotoxin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10094-10098.]
- Das Minischwein wurde kürzlich ausgewählt, um das Konzept zu validieren, dass die Blockierung der spannungsaktivierten K+-Kanäle (Kv1.3) ein Ziel für die Immunmodulation ist. Von dem Skorpion-Toxin Margatoxin (MgTX) wurde gezeigt, dass es die Kv1.3-Kanäle der Schweine-T-Zellen in elektrophysiologischen Analysen blockiert (unveröffentlichte Mitteilung von Reid Leonard). Margatoxin wurde auch befunden, die gemischte Lymphozytenreaktion im Schwein zu inhibieren, ähnlich seiner Wirkung in humanen mononukleären Zellen (MNC). Die durch PMA/Ionomycin (ION) induzierte Proliferation von mononukleären Schweinezellen wurde gleichermaßen inhibiert. Deshalb zeigen in vitro-Assays an, dass Schweine-Kv1.3-Kanäle mit humanen Kv1.3-Kanälen hinsichtlich ihrer Reaktionen auf Margatoxin vergleichbar sind.
- Die T-Zell-vermittelte Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ („delayed type hypersensitivity"; DTH) im Schwein wurde dann gewählt, um die Wirkung von Ionenkanalblockern in vivo zu testen. Aufgrund des Mangels einer spezifischen Verbindung, welche die Kv1.3-Kanäle blockiert, wurde Margatoxin für die DTH verwendet. Deshalb wurde eine pharmakokinetische (PK)-Studie von Margatoxin bei dem Minischwein durchgeführt. Neben der Feststellung der Konzentration an Margatoxin im Plasma entwickelten wir einen ex vivo-Assay, um die Reaktion der mononukleären Zellen auf die Induktion durch PMA und Ionomycin (ION) zu ermitteln. Dieser Assay wird derzeit zur Überprüfung der biologischen Wirkung von Margatoxin in vivo verwendet.
- Zusammenfassung der Erfindung
- Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Analyse der immunsuppressiven Aktivität von Kv1.3-Ionenkanalblockern unter Verwendung des Schweins als Tiermodell. Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse einer ex vivo-Wirkung eines Kv1.3-lonenkanalblockers, welcher in vivo einem Testschwein verabreicht wird, wobei die Analyse die folgenden Schritte umfasst:
- (a) Immunisieren des Testschweins und eines Kontrollschweins mit einem Antigen;
- (b) Messen der Immunreaktion des Testschweins und des Kontrollschweins;
- (c) Verabreichen des Kv1.3-Ionenkanalblockers an das Testschwein;
- (d) Verabreichen des Vehikels an das Kontrollschwein;
- (e) Messen der Immunreaktion des Testschweins und des Kontrollschweins;
- (f) Herausfordern des Testschweins und des Kontrollschweins mit dem Antigen;
- (g) Messen der Immunreaktion des Testschweins im Vergleich zur Immunreaktion des Kontrollschweins, und
- (h) Messen der Antigenreaktion des Testschweins und des Kontrollschweins im Vergleich zur Antigenreaktion des Kontrollschweins.
- Kurzbeschreibung der Zeichnungen
-
1 . Pharmakokinetik von Margatoxin: Inhibierung der PMA/Ionomycin-induzierten ex vivo-Proliferation durch Infusion von 2 μg/kg des Immunsuppressivums Margatoxin. -
2 . Inhibierung der verzögerten Hypersensitivitäts(DTH)-Reaktion auf Tuberculin (PPD) im Minischwein. - Detaillierte Beschreibung der Erfindung
- Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse einer ex vivo-Wirkung eines Kv1.3-Ionenkanalblockers, welcher in vivo einem Testschwein verabreicht wird, wobei die Analyse die folgenden Schritte umfasst:
- (a) Immunisieren des Testschweins und eines Kontrollschweins mit einem Antigen;
- (b) Messen der Immunreaktion des Testschweins und des Kontrollschweins;
- (c) Verabreichen des Kv1.3-Ionenkanalblockers an das Testschwein;
- (d) Verabreichen des Vehikels an das Kontrollschwein;
- (e) Messen der Immunreaktion des Testschweins und des Kontrollschweins;
- (f) Herausfordern des Testschweins und des Kontrollschweins mit dem Antigen;
- (g) Messen der Immunreaktion des Testschweins im Vergleich zur Immunreaktion des Kontrollschweins, und
- (h) Messen der Antigenreaktion des Testschweins und des Kontrollschweins im Vergleich zur Antigenreaktion des Kontrollschweins.
- Eine Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren wie oben angegeben, wobei die Messung der Immunreaktion die folgenden Schritte umfasst:
- (a) Gewinnen von heparinisiertem Vollblut von dem Schwein;
- (b) Verdünnen des heparinisierten Vollbluts mit einem gleichen Volumen an RPMI;
- (c) Zentrifugieren der RPMI-verdünnten Blutlösung über Ficoll-Hypaque;
- (d) Isolieren der Fraktion mononukleärer Zellen aus der zentrifugierten RPMI-verdünnten Blutlösung;
- (e) Einstellen der Konzentration der Fraktion mononukleärer Zellen auf etwa 2 Millionen Zellen pro ml;
- (f) Umsetzen von 100 μl einer Lösung von PMA mit 0,1 bis 0,5 ng/ml und Ionomycin mit 200 ng/ml auf den Mikrotitermulden mit 100 μl der mononukleären Zellen;
- (g) Inkubieren der PMA-Ionomycin-Reaktion für etwa 24 h;
- (h) Inkubieren der inkubierten PMA-Ionomycin-Reaktion für weitere 24 h mit 3H-Thymidin;
- (i) Ernten der mononukleären Zellen nach Inkubation mit 3H-Thymidin;
- (j) Zählen der 3H-Thymidin-Inkorporation in die mononukleären Zellen.
- Das obige Verfahren wird verwendet, um die immunsuppressive Aktivität des Ionenkanalblockers in mononukleären Zellen, die aus Blut zu verschiedenen Zeitintervallen während des Experiments isoliert wurden, relativ zu einer Kontrolle zu messen. Die Proben wurden ohne den Waschschritt vorbereitet, welcher typischerweise bei der Isolierung der mononukleären Zellen aus heparinisiertem Vollblut verwendet wird, welches einen schnellen Nachweis des Immunreaktionsvermögens nach in vivo-Verabreichung eines Ionenkanalblockers erlaubte.
- Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Analyse einer ex vivo-Wirkung eines Kv1.3-Ionenkanalblockers, welcher in vivo einem Testschwein verabreicht wird, wobei die Analyse die folgenden Schritte umfasst:
- (a) Immunisieren des Testschweins und eines Kontrollschweins mit einem Antigen;
- (b) Messen der Immunreaktion des Testschweins und des Kontrollschweins, umfassend die Schritte: (i) Gewinnen einer Probe von heparinisiertem Vollblut von dem Testschwein und Kontrollschwein; (ii) Verdünnen der Testproben und Kontrollenproben von heparinisiertem Vollblut mit einem gleichen Volumen an RPMI; (iii) Zentrifugieren der Test- und Kontrollproben von RPMI-verdünnter Blutlösung über Ficoll-Hypaque; (iv) Isolieren der Testproben und Kontrollproben der mononukleären Zellfraktion von der zentrifugierten RPMI-verdünnten Blutlösung; (v) Einstellen der Konzentration der Fraktion mononukleärer Zellen der Testproben und Kontrollproben auf etwa 2 Millionen Zellen pro ml; (vi) Umsetzen von 100 μl einer Lösung von PMA mit 0,1 bis 0,5 ng/ml und Ionomycin mit 200 ng/ml auf den Mikrotitermulden mit 100 μl der Testproben und Kontrollproben der mononukleären Zellen; (vii) Inkubieren der Testproben und Kontrollproben der PMA-Ionomycin-Reaktion für etwa 24 h; (viii) Inkubieren der Testproben und Kontrollproben der inkubierten PMA-Ionomycin-Reaktion für weitere 24 h mit 3H-Thymidin; (ix) Ernten der Testproben und Kontrollproben der mononukleären Zellen nach Inkubation mit 3H-Thymidin; (x) Zählen der 3H-Thymidin-Inkorporation in die Test- und Kontrollproben der mononukleären Zellen zur Etablierung einer Basislinie;
- c) Verabreichung einer Lösung des Kv1.3-Ionenkanalblockers in die Vene des Testschweins mit einer täglichen Dosis von 2 μg/kg bis 100 mg/kg unter Verwendung einer Infusionspumpe, die mit einer Rate von 2,0 bis 12 ml/h dosiert;
- d) Messen der Immunreaktion des dosierten Testschweins wie oben in Schritt (b) angegeben;
- (e) Herausfordern des Testschweins und des Kontrollschweins mit dem Antigen;
- (f) Messen der Immunreaktion des mit Antigen herausgeforderten Testschweins und des Kontrollschweins wie oben in Schritt (b) angegeben;
- (g) Messen der Antigenreaktion des Testschweins und des Kontrollschweins.
- Eines Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Analyse einer ex vivo-Wirkung eines Kv1.3-Ionenkanalblockers, welcher in vivo einem Schwein verabreicht wird, wobei für die Analyse das Schwein mit Bacillus-Calmette-Guerin immunisiert wird und später mit gereinigtem Protein-Derivat-Tuberculin (PPD) herausgefordert wird.
- Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff Schwein umfasst das Minischwein und das Mikroschwein, wobei die Schweine in einem Gewichtsbereich von etwa 2 kg bis etwa 15 kg liegen. Das bevorzugte Tiermodell ist das Yucatan-Minischwein oder das Yucatan-Mikroschwein. Andere Stämme von Minischweinen sind die Hanford-, NIH- und Minnesota-Varietäten. Die Yucatan-Minischweine und Yucatan-Mikroschweine wurden von Charles River, Windham, ME, erhalten.
- Der Ionenkanalblocker wird dem Schwein entweder intravenös, oral, intramuskulär oder subkutan verabreicht. Die bevorzugte Verabreichungsroute ist aus intravenös oder oral ausgewählt.
- Die tägliche Dosis des Ionenkanalblockers liegt zwischen etwa 2 μg/kg bis etwa 100 mg/kg. Die bevorzugte Tagesdosis eines Ionenkanalblockers beträgt etwa 0,1 mg/kg bis etwa 100 mg/kg bei oraler Verabreichung und etwa 2 μg/kg bis etwa 15 mg/kg bei intravenöser Verabreichung. Margatoxin wurde als effektiv in einem Bereich von etwa 4 μg/kg bis etwa 8 μg/kg befunden.
- Eine ambulante Infusionspumpe (Pharmacia-Delta) oder eine tragbare Infusionspumpe wurde zur Abgabe des Ionenkanalblockers, z.B. Margatoxin, mit einer vorprogrammierten Rate an das Schwein verwendet. Das Reservoir innerhalb der Pumpe wurde täglich mit einer Lösung des Ionenkanalblockers gefüllt, wenn die Verbindung jeden Tag verabreicht wurde. Die gewählte Dosis des Ionenkanalblockers wurde in 30 ml von Salzlösung und PBS, 1:1, enthaltend die 5 % autologes Serum, verdünnt. Die Tiere wurden mit Kathetern an der Jugularvene und -arterie mehrere Tage von dem Assay versehen. Zum Zeitpunkt der Behandlung wurde die ambulante Infusionspumpe in die Tasche einer maßgeschneiderten Weste aus einem Polyesternetzmaterial (Fabric Expression, Seattle, WA) montiert oder das Schwein wird während der Dauer der Studie in einer Schlinge gehalten und der intravenöse Katheter mit einer tragbaren Infusionspumpe verbunden. Die Margatoxin-Lösung wurde mit einer Infusionspumpe mit einer Rate von etwa 2 bis etwa 12 ml/h abgegeben. Die Margatoxin-Lösung wurde dreimal am Tag mit einer Dosierung über einen vierstündigen Zeitraum infundiert und entweder an den 8 Tagen nach der Immunisierung oder am Tag der Herausforderung abgegeben. Die Schweine wurden dann mit 1 mg Bacillus-Calmette-Guerin (Connaugh) intradermal und subkutan an etwa 4 bis etwa 6 verschiedenen Stellen am Rumpf immunisiert. Am Tag (7-10 Tage nach der Immunisierung) der Herausforderung wurde 0,1 ml Tuberculin (PPD) (25 Einheiten, Connaugh) intradermal injiziert, wobei das Schwein mit Telazol und/oder Isofluran sediert wurde. Siehe die nachstehend angegebene Zeitlinie. Die Induration wurde 48 h später gemessen. Blut wurde zu verschiedenen Zeitpunkten während und nach der Infusion für biochemische Bestimmungen und biologische Assays wie nachstehend beschrieben gewonnen.
- PROTOKOLL FüR EINE VERZÖGERTE HYPERSENSITIVITÄT GEGENÜBER PPD-TUBERCULIN MIT i.v.-BEHANDLUNG VON MARGATOXIN
- Zuerst wurde MgTX am Tag der Bacillus-Calmette-Guerin (BCG)-Immunisierung bis zum Tag nach der Tuberculin-Herausforderung gegeben und 50-80 % Suppression der Reaktion wurde beobachtet. Als jedoch Experimente durchgeführt wurden um die Reaktion durch Verabreichung von MgTX nur am Tag der Herausforderung zu unterdrücken, wurde dieselbe Wirkung beobachtet.
- Heparinisiertes Vollblut wurde gewonnen, mit einem gleichen Volumen an RPMI (GIBCO) verdünnt und über Ficoll-Hypaque (LSM, Organo Technika Co., Durham, NC) zentrifugiert. Die mononukleäre Zellfraktion wurde isoliert und auf eine Konzentration von etwa 2 × 106/ml eingestellt. Dann wurden 100 μl der verdünnten mononukleären Zellfraktion jeder Mulde einer Flachboden-96-Mulden-Mikrotiterplatte zugegeben. 100 μl mit PMA (Endkonzentration von 0,1-0,5 ng/ml) und Ionomycin (Endkonzentration von 200 ng/ml) wurde zugegeben. Bei einigen Assays wurde, als die suppressive Wirkung von Margatoxin in vitro getestet wurde, 50 μl Medium oder Margatoxin (Endkonzentration 50-200 nM) zugegeben. Die Zellen wurden dann zwei Tage lang bei 37° C und 7 % CO2 kultiviert. [3H]Thymidin wurde für die letzten 24 h zugegeben. Die Zellen wurden geerntet und die Thymidininkorporation wurde mit dem LKB-Betaplattensystem gezählt.
- Vor der Durchführung der pharmakokinetischen Studien haben wir Vollblut mit Margatoxin versetzt und eine signifikante Suppression der proliferativen Reaktion auf PMA/ION, getestet unter den hier beschriebenen Bedingungen, beobachtet. In den pharmakokinetischen Studien wurden Blutproben zu den vorbestimmten Zeiten genommen und 1 ml heparinisiertes Blut wurde zentrifugiert und die Plasmaspiegel an Margatoxin wurden bestimmt. 2 ml Blut wurden über Ficoll-Hypaque aufgetrennt und die MNC wurden auf PMA/ION-Induktion getestet wie oben beschrieben.
- Ein repräsentatives Experiment ist in
1 gezeigt. Ein Yucatan-Minischwein erhielt 25 μg Margatoxin in 30 ml Vehikel (5 % autologes Serum in einer Lösung von 1:1 Salzlösung zu PBS) über 2,5 h. Es gab keinen signifikanten Anstieg des Blutdrucks oder der Herzfrequenz während der Infusion. Die Plasmaspiegel in dieser Studie wiesen einen Peak bei 600 pM am Ende der Infusion auf und fielen auf 100 pM 4,5 h nach der Infusion mit einer Halbwertszeit von etwa 2 h. Margatoxin war in dem Plasma nach 24 h nicht nachweisbar. Der Plasmaspiegel von MgTX wurde in einem Konkurrenz-Bindungsassay durch dessen Inhibierung von 125I-markierter MgTX-Bindung an Kv1.3-Kanäle, die in isolierten Plasmamembranen vorlagen, bestimmt. Mangelndes Reaktionsvermögen auf PMA/ION war ebenfalls am Ende der Infusion maximal und hielt für 4,5 h nach der Infusion an. Eine ähnliche pharmakokinetische Studie wurde sechsmal durchgeführt, mit guten Korrelationen zwischen hohen Plasmaspiegeln an Margatoxin und der niedrigeren Reaktion auf PMA/ION. Yucatan-Minischweine, die Vehikel erhielten, wiesen keine signifikante Schwankung der Reaktionen auf PMA/ION auf. Deshalb liefert dieser ex vivo-Test eine Beurteilung der biologischen in vivo-Wirkung von Margatoxin und kann auch zur Untersuchung der immunsuppressiven Wirkungen anderer Ionenkanalblocker verwendet werden. - Ein repräsentatives Diagramm der Inhibierung der verzögerten Hypersensitivitätsreaktion auf PPD-Tuberculin durch Margatoxin ist in
2 gezeigt. Das Yucatan-Minischwein wurde mit BCG 8 Tage (-8 Tage) vor der Herausforderung mit PPD-Tuberculin (PPD) immunisiert. MgTX wurde an den 8 Tagen vor der Herausforderung oder am Tag der Herausforderung (Tag 0) gegeben. PPD-Tuberculin wurde intradermal an 4-6 Stellen an der Flanke des Schweins injiziert. Als Kontrolle wurde PBS, das Verdünnungsmittel für PPD, an 4-6 Stellen injiziert. Die Messung der Antigenreaktion, insbesondere die Röte und Induration, wurden für sowohl die Test- als auch Kontrollinjektionsstellen etwa 44 bis 48 h nach der Herausforderung aufgezeichnet.
Claims (8)
- Verfahren zur Analyse einer ex vivo-Wirkung eines Kv1.3-Ionenkanalblockers, welcher in vivo einem Testschwein verabreicht wird, wobei die Analyse die folgenden Schritte umfasst: (a) Nicht-therapeutisches Immunisieren des Testschweins und eines Kontrollschweins mit einem Antigen; (b) Messen der Immunreaktion des Testschweins und des Kontrollschweins; (c) Nicht-therapeutisches Verabreichen des Kv1.3-Ionenkanalblockers an das Testschwein; (d) Verabreichen des Vehikels an das Kontrollschwein; (e) Messen der Immunreaktion des Testschweins und des Kontrollschweins; (f) Herausfordern des Testschweins und des Kontrollschweins mit dem Antigen; (g) Messen der Immunreaktion des Testschweins im Vergleich zur Immunreaktion des Kontrollschweins, und (h) Messen der Antigenreaktion des Testschweins und des Kontrollschweins im Vergleich zur Antigenreaktion des Kontrollschweins.
- Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Analyse die folgenden Schritte umfasst: (a) Verdünnen von heparinisiertem Vollblut, das von dem Schwein gewonnen wurde, mit einem gleichen Volumen an RPMI; (b) Zentrifugieren der RPMI-verdünnten Blutlösung über Ficoll-Hypaque; (c) Isolieren der Fraktion mononukleärer Zellen aus der zentrifugierten RPMI-verdünnten Blutlösung; (d) Einstellen der Konzentration der Fraktion mononukleärer Zellen auf etwa 2 Millionen Zellen pro mL; (e) Umsetzen von 100 μL einer Lösung von PMA mit 0,1 bis 0,5 ng/mL und Ionomycin mit 200 ng/mL auf den Mikrotitermulden mit 100 μL der mononukleären Zellen; (f) Inkubieren der PMA-Ionomycin-Reaktion für etwa 24 Stunden; (g) Inkubieren der inkubierten PMA-Ionomycin-Reaktion für weitere 24 Stunden mit 3H-Thymidin; (h) Ernten der mononukleären Zellen nach Inkubation mit 3H-Thymidin; (i) Zählen der 3H-Thymidin-Inkorporation in die mononukleären Zellen.
- Verfahren zur Analyse einer ex vivo-Wirkung eines Kv1.3-Ionenkanalblockers, welcher in vivo einem Testschwein verabreicht wird, wobei die Analyse die folgenden Schritte umfasst: (a) Nicht-therapeutisches Immunisieren des Testschweins und eines Kontrollschweins mit einem Antigen; (b) Messen der Immunreaktion des Testschweins und des Kontrollschweins, umfassend die Schritte: (i) Verdünnen der Test- und Kontrollproben von heparinisiertem Vollblut, das von den Test- und Kontrollschweinen gewonnen wurde, mit einem gleichen Volumen an RPMI; (ii) Zentrifugieren der Test- und Kontrollproben von RPMI-verdünnter Blutlösung über Ficoll-Hypaque; (iii) Isolieren der Test- und Kontrollproben der Fraktion mononukleärer Zellen aus der zentrifugierten RPMI-verdünnten Blutlösung; (iv) Einstellen der Konzentration der Test- und Kontrollproben der Fraktion mononukleärer Zellen auf etwa 2 Millionen Zellen pro mL; (v) Umsetzen von 100 μL einer Lösung von PMA mit 0,1 bis 0,5 ng/mL und Ionomycin mit 200 ng/mL auf den Mikrotiter-Mulden mit 100 μL der Test- und Kontrollproben der mononukleären Zellen; (vi) Inkubieren der Test- und Kontrollproben der PMA-Ionomycin-Reaktion für etwa 24 Stunden; (vii) Inkubieren der Test- und Kontrollproben der inkubierten PMA-Ionomycin-Reaktion für weitere 24 Stunden mit 3H-Thymidin; (viii) Ernten der Test- und Kontrollproben der mononukleären Zellen nach Inkubation mit 3H-Thymidin; (ix) Zählen der 3H-Thymidin-Inkorporation in die Test- und Kontrollproben der mononukleären Zellen, um die relative Immunreaktion zu bestimmen; (c) Nicht-therapeutisches Verabreichen einer Lösung des Kv1.3-Ionenkanalblockers in eine Vene des Testschweins mit einer täglichen Dosis von 2 μg/kg bis 100 mg/kg unter Verwendung einer Infusionspumpe mit einer Dosisrate von 2,0 bis 12 mL/Stunde; (d) Messen der Immunreaktion des dosierten Testschweins wie oben in Schritt (b) angegeben; (e) Herausfordern der Test- und Kontrollschweine mit dem Antigen; (f) Messen der Immunreaktion des mit Antigen herausgeforderten Testschweins und Kontrollschweins wie oben in Schritt (b) angegeben; (g) Messen der Antigenreaktion des Testschweins und des Kontrollschweins.
- Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei für die Analyse das verwendete Schweinemodell ein Yucatan-Minischwein oder ein Yucatan-Mikroschwein ist.
- Verfahren nach Anspruch 4, wobei für die Analyse das verwendete Schweinemodell ein Yucatan-Minischwein ist.
- Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei für die Analyse das zur Immunisierung des Schweins verwendete Antigen Bacillus-Calmette-Guerin ist und das zur Herausforderung des Schweins verwendete Antigen PPD-Tuberculin ist.
- Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei für die Analyse der Kv1.3-Ionenkanalblocker oral verabreicht wird und die tägliche Dosis des Ionenkanalblockers 0,1 mg/kg bis 100 mg/kg beträgt.
- Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei für die Analyse der Kv1.3-Ionenkanalblocker intravenös verabreicht wird und die tägliche Dosis des Ionenkanalblockers 2 μg/kg bis 15 mg/kg beträgt.
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