JP3675839B2 - ミニ豚を用いる、イオンチャネルブロッカーの免疫抑制活性の分析方法 - Google Patents

Description

発明の背景
カリウムイオンチャネルは、正常細胞ホメオスタシス、並びに種々の疾患状態及び免疫応答との関連の可能性及びそれらに関する撹乱の可能性に関与する。
このようなチャネルに特別の関連性を有する疾患には、自己免疫疾患及び移植拒絶などがある。自己免疫疾患には、幾つかの名を挙げれば、リウマチ性関節炎、１型糖尿病（インスリン依存性）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリトマトーデス、シェーングレン症候群、混合型結合組織病、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）がある。
大部分の場合、自己免疫疾患は、直接殺すか又は自己抗体を産生することによって、標的組織を破壊する免疫系の自己反応性細胞から起ると考えられている。現在までの自己免疫疾患研究では、その疾患状態に明白な症状を引起す、ある特定の標的組織を破壊するか又は妨害する物質を産生する共通のパターンの異常免疫細胞が出現するように思われる。
同種移植片又は異種移植片は、移植抗原に対し急性リンパ球媒介免疫反応である（宿主対移植片反応）、拒絶のときに存在する抗原成分に対するレシピエントの細胞媒介免疫反応又は液性免疫反応によって拒絶されうる。
これらの反応及び疾患に対する現在の治療は経験的レベルに留まり、一般的な免疫抑制応答を引起すことに基づく。このような治療アプローチにはまた、関連する重大な副作用を含む他の問題が充満している。更に、それは、これらの自己免疫疾患の自然の進行を妨害するためにのみ役立つ。
いくつかのクラスのカリウムチャネルは、膜電位を維持し、多様な細胞型の細胞容量を調整し、更に神経系の電気興奮性を調整することに関与する［R.C.Lewis and M.D.Cahalan“Potassium and Calcium Channels in Lymphocytes”Ann.Rev.Immunol.13(1995)623-653;“Lymphocyte Ion Channels as a Target for Immunosuppression” G.J.Kaczorowski and G.C.Koo, Perspectives in Drug Discovery and Design 2(1994)233-248］。カリウムチャネルは、活動電位の再分極相及びニューロンと他の細胞を興奮させるパターンを制御することが報告された。カリウム電流は、ナトリウム又はカルシウム電流より多様であり、また外部の刺激に細胞が応答する方法を決定するのに中心的役割を果たすことが報告された。例えば、ニューロンがシナプスインプットに応答する順応速度又は遅延速度は、異なるクラスのカリウムチャネルの存在によって強く決定される。
Ｋ⁺イオンチャネルそれ自体が注目されている。薬理学的と電気生理学的に分類されたイオンチャネル型の２種の型が同定された。即ち電位活性化カリウムチャネル（Ｋ_v）及びカルシウム活性化Ｋ⁺チャネル（Ｋ_Ca）である。現在の目的のために末梢リンパ組織のＴ細胞は、関連する型：ＣＤ４⁺ＣＤ８^-、ＣＤ４^-ＣＤ８⁺、ＣＤ４^-ＣＤ８^-に特徴付けられる。これらの細胞は、これらのカリウムイオンチャネルの幾分か又は全部を発現する。マイトジェンによるなどの、活性の誘導を反映する正常免疫応答において、単一のイオンチャネル型は、活性化される細胞で１０倍以上増加する。従って、正常Ｔ細胞がマイトジェンによって刺激される場合、これらのイオンチャネル数において正常免疫応答上昇を示す。
これらの型のＫ⁺イオンチャネルの一つ、Ｋ_v１．３は、非活性化ヒトＴ細胞の膜電位を決定する。このＫ⁺イオンチャネルの遮断は、脱分極を引起し、マイトジェンによる活性化を防止するのに十分であることが結論された［“Lymphocyte Ion Channels as a Target Immunosuppression”,G.J.Kaczorowski and G.C.Koo,Perspectives in Drug Discovery and Design,2(1994)233-248］。
混合リンパ球培養反応においてＫ_v１．３ブロッカーを試験するために、動物モデルとしてミニ豚の発見に先立ち、マウス、ラット、ウサギ及びモルモットを含む他の幾つかの動物モデルを研究した。しかし、混合リンパ球培養反応は、これらの動物モデルで、Ｋ_v１．３チャネルの特異的ペプチド阻害剤であるマルガトキシン（ＭｇＴＸ）によって阻害されない［Leonardら、Selective blockers of voltage gated K ＋ channels depolarized human T lymphocytes:mechanism of the antiproliferatice effect of Charybdotoxin.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10094-10098］。
最近、ミニ豚を選択し、電位活性化Ｋ⁺チャネル（Ｋ_v１．３）の遮断は免疫調整の標的であるという概念が確かめられた。サソリ毒であるマルガトキシン（ＭｇＴＸ）が、電気生理学的分析で、豚Ｔ細胞のＫ_v１．３チャネルを遮断することが知見された［Reid leonardからの未発表私信］。マルガトキシンはまた、ヒト単核細胞（ＭＮＣ）における効果と同様に豚における混合リンパ球培養反応を阻害することも知見された。ＰＭＡ／イオノマイシン（ＩＯＮ）によって誘導される豚単核細胞の増殖がいずれも阻害された。それ故、インビトロアッセイで、マルガトキシンへの反応において、豚Ｋ_v１．３チャネルはヒトＫ_v１．３チャネルと同等であることが判る。
インビボでのイオンチャネルブロッカーの効果を試験するために、豚におけるＴ細胞媒介遅延型過敏性反応（ＤＴＨ）を選択した。Ｋ_v１．３チャネルを阻害する特異的化合物がないために、マルガトキシンはＤＴＨで使用されよう。それ故、マルガトキシンの薬動学（ＰＫ）研究をミニ豚で行った。血漿でのマルガトキシン濃度を決定することに加えて、本発明者らは、ＰＭＡとイオノマイシン（ＩＯＮ）による誘導に対する単核細胞の応答を評価するために、エクスビボアッセイを開発した。マルガトキシンのインビボ生物学的効果をモニターするために、このアッセイは広く使用される。
発明の概要
本発明は、動物モデルとしてミニ豚及びミクロ豚を用いる、Ｋ_v１．３イオンチャネルブロッカーの免疫抑制活性の分析方法に関する。本発明は、試験豚にインビボ投与したイオンチャネルブロッカーのエクスビボ効果の分析方法であって、
（ａ）試験豚と対照豚を抗原で免疫すること；
（ｂ）試験豚と対照豚の免疫応答を測定すること；
（ｃ）試験豚にイオンチャネルブロッカーを投与すること；
（ｄ）対照豚にビヒクルを投与すること；
（ｅ）試験豚と対照豚の免疫応答を測定すること；
（ｆ）試験豚と対照豚に抗原を投与（チャレンジ）すること；
（ｇ）対照豚の免疫応答と比較して試験豚の免疫応答を測定すること；及び
（ｈ）対照豚の抗原応答に比較して試験豚と対照豚の抗原応答を測定すること；
の各工程を含むことを特徴とする該方法に関する。
【図面の簡単な説明】
図１
マルガトキシンの薬動学：免疫抑制剤であるマルガトキシン２μｇ／ｋｇの注入によるエクスビボＰＭＡ／イオノマイシン誘導増殖の阻害。
図２
ミニ豚におけるツベルクリン（ＰＰＤ）に対する遅延型過敏性（ＤＴＨ）反応の阻害。
発明の詳細な説明
本発明は、
試験豚にインビボ投与したイオンチャネルブロッカーのエクスビボ効果の分析方法であって、
（ａ）試験豚と対照豚を抗原で免疫すること；
（ｂ）試験豚と対照豚の免疫応答を測定すること；
（ｃ）試験豚にイオンチャネルブロッカーを投与すること；
（ｄ）対照豚にビヒクルを投与すること；
（ｅ）試験豚と対照豚の免疫応答を測定すること；
（ｆ）試験豚と対照豚に抗原を投与（チャレンジ）すること；
（ｅ）対照豚の免疫応答と比較して試験豚の免疫応答を測定すること；及び
（ｇ）対照豚の抗原応答に比較して試験豚と対照豚の抗原応答を測定すること；
の各工程を含むことを特徴とする該方法に関する。
本発明の一実施例は、
免疫応答の測定が、
（ａ）豚からヘパリン添加全血を集めること；
（ｃ）ヘパリン添加全血を等容量のＲＰＭＩで希釈すること；
（ｄ）フィコール−ハイパックでＲＰＭＩ−希釈血液溶液を遠心分離すること；
（ｅ）遠心分離したＲＰＭＩ−希釈血液溶液から単核細胞分画を単離すること；
（ｆ）単核細胞分画の濃度を約２百万細胞／ｍＬに調整すること；
（ｇ）約０．１〜０．５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡと２００ｎｇ／ｍＬのイオノマイシンの溶液約１００μＬを、単核細胞１００μＬを有するマイクロタイターウエルと反応させること；
（ｈ）約２４時間ＰＭＡ−イオノマイシン反応液をインキュベートすること；
（ｉ）インキュベートしたＰＭＡ−イオノマイシン反応液を、³Ｈ−チミジンと共に更に２４時間インキュベートすること；
（ｊ）³Ｈ−チミジンとのインキュベーション後、単核細胞を採取すること；
（ｋ）単核細胞への³Ｈ−チミジンの導入を計測すること；
の各工程を含むことを特徴とする上記方法である。
上記方法を用いて、対照と比較して、実験中の種々の時間間隔で血液から単離された単核細胞中のイオンチャネルブロッカーの免疫抑制活性を測定する。
イオンチャネルブロッカーのインビボ投与後、ヘパリン添加全血からの単核細胞を単離するときに、典型的に用いられる洗浄工程無しにサンプルを調製した。そのことによって、免疫応答性の急速検出が可能となった。
本発明はまた、
試験豚にインビボ投与したイオンチャネルブロッカーのエクスビボ効果の分析方法であって、
（ａ）試験豚と対照豚を抗原で免疫すること；
（ｂ）以下の工程を含む、試験豚と対照豚の免疫応答を測定すること：
（ｉ）試験豚と対照豚からヘパリン添加全血のサンプルを集めること；
（ii）ヘパリン添加全血の試験サンプルと対照サンプルを、等容量のＲＰＭＩで希釈すること；
（iii）ＲＰＭＩ−希釈血液溶液の試験サンプルと対照サンプルをフィコール−ハイパックで遠心分離すること；
（iv）遠心分離したＲＰＭＩ−希釈血液溶液から単核細胞分画の試験サンプルと対照サンプルを単離すること；
（ｖ）単核細胞分画の試験サンプルと対照アンプルの濃度を約２百万細胞／ｍＬに調整すること；
（vi）約０．１〜０．５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡと２００ｎｇ／ｍＬのイオノマイシンの溶液約１００μＬを、単核細胞の試験サンプルと対照サンプル１００μＬを有するマイクロタイターウエルと反応させること；
（vii）ＰＭＡ−イオノマイシン反応液の試験サンプルと対照サンプルを約２４時間インキュベートすること；
（viii）インキュベートしたＰＭＡ−イオノマイシン反応液の試験サンプルと対照サンプルを、³Ｈ−チミジンと共に更に２４時間インキュベートすること；
（ix）³Ｈ−チミジンとのインキュベーション後、単核細胞の試験サンプルと対照サンプルを採取すること；
（ｘ）単核細胞の試験サンプルと対照サンプルへの³Ｈ−チミジンの導入を計測し、ベースラインを決定すること；
（ｃ）速度約１２ｍＬ／時間で注入ポンプを用いて、イオンチャネルブロッカーの溶液を投与量約２μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇで試験豚の静脈に投与すること；
（ｄ）工程（ｂ）で記載のように、投与された試験豚の免疫応答を測定すること；
（ｅ）試験豚と対照豚に抗原を投与（チャレンジ）すること；
（ｄ）工程（ｂ）に記載のように、抗原投与の試験豚と対照豚の免疫応答を測定すること；
（ｆ）試験豚と対照豚の抗原応答を測定すること；
の各工程を含むことを特徴とする該方法に関する。
本発明の一実施態様は、豚にインビボ投与されたイオンチャネルブロッカーのエクスビボ効果の分析方法であって、豚をバチルス−カルメッテ−グエリン（Bacillus-Calmette-Guerin）で免疫し、後に、精製タンパク質誘導体−ツベルクリン（ＰＰＤ）を投与することを特徴とする該方法である。
本発明で使用する豚という用語は、体重が約２ｋｇ〜約１５ｋｇの範囲のミニ豚及びミクロ豚を含む。好適な動物モデルはユカタンミニ豚又はユカタンミクロ豚である。ミニ豚の他の系統は、Ｈａｎｆｏｒｄ亜種、ＮＩＨ亜種及びミネソタ亜種である。ユカタンミニ豚又はユカタンミクロ豚は、Charles River,Windham,MEから得た。
イオンチャネルブロッカーは、豚に静脈内、経口、筋肉内、又は皮下で投与する。好適投与経路は静脈内又は経口から選択される。
イオンチャネルブロッカーの一日投与量は約２μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである。イオンチャネルブロッカーの好適一日投与量は経口投与の場合、約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇであり、静脈内投与の場合、約２μｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇである。マルゴトキシンは約４μｇ／ｋｇ〜約８μｇ／ｋｇの範囲で有効であることが知見された。
歩行用注入ポンプ（Pharmacia-Delta）又は携帯用注入ポンプを用いて、イオンチャネルブロッカー、例えばマルガトキシンを、予めプログラムした速度で豚に投与する。化合物を毎日投与する場合には、ポンプ内の貯蔵器を一日一回イオンチャネルブロッカー溶液で充填した。イオンチャネルブロッカーの選択した投与は、５％自己血清を含む、１：１生理食塩水とＰＢＳ３０ｍＬで希釈した。アッセイの数日前に、頚部静脈と頚部動脈で豚にカテーテルを取付けた。処置時に、歩行用注入ポンプを、ポリエステルネット材料（Fabric Exprssion,Seattle,WA）から作られたカスタムメイドのベストのポケットに装着した。あるいは研究中、豚を吊り綱で拘束し、静脈カテーテルを携帯用注入ポンプに連結する。マルガトキシン溶液を速度約２〜約１２ｍＬ／時間で注入ポンプで投与した。マルガトキシン溶液を、４時間かけての投与を一日３回投与し、免疫化後８日間、又は抗原投与（チャレンジ）の日に注入する。次に、豚の臀部の異なる部位約４〜約６部位で皮膚内及び皮下にBacillus-Calmette-Guerin(Connaugh)１ｍｇで、豚を免疫化する。抗原投与（チャレンジ）の日（免疫後７〜１０日）に、豚をテラゾール及び／又はイソフランで鎮静化させ、ツベルクリン（ＰＰＤ）（２５単位,Connaugh）０．１ｍＬを皮膚内注射した。以下の時間経過図を参照されたい。硬結部を、４８時間後に測定した。注入中又は注入後、種々の時間に、生化学的測定及び生物学的定量のために、以下に記載のように血液を集めた。

最初に、Bacillus-Calmette-Guerin（ＢＣＧ）免疫化の日からツベルクリン投与の翌日まで、ＭｇＴＸを投与したが、応答の５０−８０％抑制が観察された。しかし、ツベルクリン投与の日だけＭｇＴＸを投与して、応答を抑制する実験を行う場合に、同一の結果が観察された。
ヘパリン添加全血を集め、等量のＲＰＭＩ（ＧＩＢＣＯ）で希釈し、フィコール−ハイパック（LSM,Organo Technika Co.,Durham,NC）で遠心分離した。単核細胞分画を単離し、濃度約２×１０⁶／ｍＬに調整した。次に、平底９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに、希釈単核細胞分画１００μＬを加えた。ＰＭＡ（最終濃度０．１〜０．５ｎｇ／ｍＬ）とイオノマイシン（最終濃度２００ｎｇ／ｍＬ）を含む１００μＬを加えた。マルガトキシンをインビトロで試験する幾つかのアッセイで、培地又はマルガトキシン（最終濃度５０−２００ｎＭ）５０μＬを加えた。次に、３７℃、７％ＣＯ₂で２日間細胞を培養した。［³Ｈ］チミジンを最後の２４時間加えた。細胞を採取し、チミジン取込みを、ＬＫＢベータプレートシステムで計測した。
薬動学研究を行う前に、全血にマルガトキシンを加えたが、本明細書記載の条件下で試験して、ＰＭＡ／ＩＯＮに対する増殖応答の顕著な抑制が観察された。薬動学研究では、血液サンプルを指定時に採取し、ヘパリン添加血液１ｍＬを遠心分離し、マルガトキシンの血漿レベルを測定した。血液２ｍＬをフィコール−ハイパックで分離し、上記のように、ＰＭＡ／ＩＯＮ誘導の場合のＭＮＣを試験した。
代表的実験を図１に示す。ユカタンミニ豚に、ビヒクル（生理食塩水対ＰＢＳ溶液１：１中の５％自己血清）３０ｍＬ中のマルガトキシン２５μｇを２．５時間かけて投与した。注入の間に血圧又は心臓速度に顕著な上昇はなかった。この研究での血漿レベルは、注入の最後に６００ｐＭでピークに達し、半減期約２時間で、注入後４．５時間で１００ｐＭまで降下した。２４時間で血漿中にマルガトキシンを検出できなかった。ＭｇＴＸの血漿レベルを、単離形質膜に存在するＫ_v１．３チャネルへの¹²⁵Ｉ−標識ＭｇＴＸ結合の阻害による競合結合アッセイで測定した。ＰＭＡ／ＩＯＮに対する非応答性も、注入の最後で最大であり、注入後４．５時間非応答性は維持された。同様の薬動学研究を６回行ったが、マルガトキシンの高血漿レベルとＰＭＡ／ＩＯＮに対する低い応答との間に良好な相関が観察された。ビヒクルを投与したユカタンミニ豚はＰＭＡ／ＩＯＮに対する応答の顕著な変動を示さなかった。それ故、このエキスビボ試験は、マルガトキシンのインビボ生物学的効果の評価を提供し、他のイオンチャネルブロッカーの免疫抑制効果を研究するためにも使用できる。
ＰＰＤ−ツベルクリンに対する遅延型過敏性反応のマルガトキシンによる阻害の代表的グラフを図２に示す。ＰＰＤ−ツベルクリン（ＰＰＤ）投与前８日目（−８ｄ）に、ユカタンミニ豚をＢＣＧで免疫処置した。ＰＰＤ投与前８日間、又はＰＰＤ投与日（０ｄ）にＭｇＴＸを投与した。ＰＰＤ−ツベルクリンを、豚の脇腹の４〜６個所に皮内注射した。対照として、ＰＰＤの希釈剤であるＰＢＳを４〜６個所に注射した。抗原応答、詳細には発赤と硬結の測定を、ＰＰＤ投与後約４４〜４８時間で試験注射部位と対照注射部位の両方で記録した。

Claims (6)

1. 試験豚にインビボ投与したＫｖ１．３チャネルブロッカーのエクスビボ効果の分析方法であって、
   （ａ）試験豚と対照豚を免疫抗原で免疫すること；
   （ｂ）試験豚と対照豚の免疫応答を測定すること；
   （ｃ）試験豚にＫｖ１．３チャネルブロッカーを投与すること；
   （ｄ）対照豚にビヒクルを投与すること；
   （ｅ）試験豚と対照豚の免疫応答を測定すること；
   （ｆ）試験豚と対照豚にチャレンジ抗原を投与すること；
   （ｇ）対照豚の免疫応答と比較して試験豚の免疫応答を測定すること；及び
   （ｈ）試験豚と対照豚の抗原応答を測定すること；
   の各工程を含み、試験豚及び対照豚がユカタンミニ豚である前記方法。
2. 請求項１に記載のｂ、ｅ、ｇに採用される免疫応答の測定方法として、
   （ａ）豚からヘパリン添加全血を集めること；
   （ｂ）ヘパリン添加全血を等容量のＲＰＭＩで希釈すること；
   （ｃ）単核細胞画分が生成されるように、フィコール−ハイパックでＲＰＭＩ−希釈血液溶液を遠心分離すること；
   （ｄ）遠心分離したＲＰＭＩ−希釈血液溶液から単核細胞画分を単離すること；
   （ｅ）単核細胞画分の濃度を２×１０ ⁶ 細胞／ｍＬに調整すること；
   （ｆ）０．１〜０．５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡと２００ｎｇ／ｍＬのイオノマイシンの溶液１００μＬを、単核細胞１００μＬと反応させること；
   （ｇ）２４時間ＰＭＡ−イオノマイシン反応液をインキュベートすること；
   （ｈ）インキュベートしたＰＭＡ−イオノマイシン反応液を、³Ｈ−チミジンと共に更に２４時間インキュベートすること；
   （ｉ）³Ｈ−チミジンとのインキュベーション後、単核細胞を採取すること；
   （ｊ）単核細胞への³Ｈ−チミジンの取込みを計測すること；
   の各工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の、試験豚にインビボ投与したＫｖ１．３チャネルブロッカーのエクスビボ効果の分析方法。
3. 試験豚にインビボ投与したＫｖ１．３チャネルブロッカーのエクスビボ効果の分析方法であって、
   （ａ）試験豚と対照豚を免疫抗原で免疫すること；
   （ｂ）以下の工程を含む、試験豚と対照豚の免疫応答を測定すること：
   （ｉ）試験豚と対照豚からヘパリン添加全血のサンプルを集めること；
   （ii）ヘパリン添加全血の試験サンプルと対照サンプルを、等容量のＲＰＭＩで希釈すること；
   （iii）単核細胞画分が生成されるように、ＲＰＭＩ−希釈血液溶液の試験サンプルと対照サンプルをフィコール−ハイパックで遠心分離すること；
   （iv）遠心分離したＲＰＭＩ−希釈血液溶液から単核細胞画分の試験サンプルと対照サンプルを単離すること；
   （ｖ）単核細胞画分の試験サンプルと対照サンプルの濃度を２×１０ ⁶ 細胞／ｍＬに調整すること；
   （vi）０．１〜０．５ｎｇ／ｍＬのＰＭＡと２００ｎｇ／ｍＬのイオノマイシンの溶液１００μＬを、単核細胞の試験サンプルと対照サンプル１００μＬと反応させること；
   （vii）ＰＭＡ−イオノマイシン反応液の試験サンプルと対照サンプルを２４時間インキュベートすること；
   （viii）インキュベートしたＰＭＡ−イオノマイシン反応液の試験サンプルと対照サンプルを、³Ｈ−チミジンと共に更に２４時間インキュベートすること；
   （ix）³Ｈ−チミジンとのインキュベーション後、単核細胞の試験サンプルと対照サンプルを採取すること；
   （ｘ）単核細胞の試験サンプルと対照サンプルへの³Ｈ−チミジンの取込みを計測し、相対的免疫応答を測定すること；
   （ｃ）速度２．０〜１２ｍＬ／時間で注入ポンプを用いて、Ｋｖ１．３チャネルブロッカーの溶液を一日投与量約２μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇで試験豚の静脈内に投与すること；
   （ｄ）工程（ｂ）で記載のように、投与された試験豚の免疫応答を測定すること；
   （ｅ）試験豚と対照豚にチャレンジ抗原を投与すること；
   （ｆ）工程（ｂ）に記載のように、抗原投与試験豚と対照豚の免疫応答を測定すること；
   （ｇ）試験豚と対照豚の抗原応答を測定すること；
   の各工程を含み、試験豚及び対照豚がユカタンミニ豚である前記方法。
4. 用いる免疫抗原がバチルス−カルメッテ−グエリン（Bacillus-Calmette-Guerin）であり、用いるチャレンジ抗原がＰＰＤ−ツベルクリンであることを特徴とする、請求項３に記載のインビボで試験豚に投与したＫｖ１．３チャネルブロッカーのエクスビボ効果の分析方法。
5. Ｋｖ１．３チャネルブロッカーを、一日投与量が０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであるように経口投与することを特徴とする、請求項４に記載のインビボで試験豚に投与したＫｖ１．３チャネルブロッカーのエクスビボ効果の分析方法。
6. Ｋｖ１．３チャネルブロッカーを、一日投与量が２μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇであるように静脈内投与することを特徴とする、請求項４に記載のインビボで試験豚に投与したＫｖ１．３チャネルブロッカーのエクスビボ効果の分析方法。

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