DE69633635T2

DE69633635T2 - Spezifischer immunstimulierender factor mit hoher fluoreszens und verfahren für dessen verwendung

Info

Publication number: DE69633635T2
Application number: DE69633635T
Authority: DE
Inventors: M. Geoffrey THIELE; L. Thomas McDONALD; J. Dean TUMA; W. Lynell KLASSEN; F. Michael SORRELL
Original assignee: University of Nebraska
Current assignee: University of Nebraska
Priority date: 1995-10-27
Filing date: 1996-10-25
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2016-10-26
Also published as: AU726344B2; EP0873136A4; EP0873136A2; US6120777A; DK0873136T3; EP0873136B1; JP2000505056A; WO1997015324A1; AU7665496A; DE69633635D1; ATE279207T1; CA2235599A1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Immunologie im Allgemeinen und auf eine Methode zur Herstellung eines Immunverbesserungsfaktors sowie immunochemischen und zellulären Techniken, welche die einzigartigen Eigenschaften dieses Faktors einsetzen.
Die Erfindung betrifft eine Methode zur Herstellung einer Zusammensetzung, die als spezifischer Immunverbesserungsfaktor in der Therapie zur Impfung eingesetzt wird. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung ist in der Lage die spezifische Antikörperantwort auf Antigene, die eine geringe Immunogenität haben, in vivo zu potenzieren. Die Zusammensetzung kann als Lösung mit einem pharmakologisch annehmbaren Lösungsmittel verabreicht werden.
Antigene sind definiert als jede Substanz, die für einen lebenden Organismus fremd ist und die sobald sie mit dessen Immunsystem in Kontakt kommt, einen komplexen Mechanismus von zellulären Interaktionen aktiviert, welche darauf gerichtet sind das Antigen zu eliminieren und das vorherige Gleichgewicht wieder herzustellen. Der Begriff Antigen wie er hierin verwendet ist, soll Proteine, Lipide, DNA oder Kohlenhydrate einschließen. Charakteristische Merkmale eines Antigens sind die Fähigkeit die Produktion von spezifischen Antikörpern (Immunogenität) zu induzieren, wobei die spezifischen Antikörper in der Lage sind das Antigen selektiv zu binden (Antigenität) und zu inaktivieren. Einige Antigene haben jedoch eine geringe Immunogenität und lösen in vivo eine Antikörperantwort aus, welche nicht ausreicht, um dem Organismus eine wirksame Immunität zu geben oder genügend Antikörper zum Ernten und zur Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern bereit zu stellen. Beppu et al. (Chem. Pharm. Bull., 1988, 36(11): 4519–4526) analysierte die Interaktion von Malondialdehyd-modifiziertem bovinem Serumalbumin und peritonalen Mausmakrophagen. Tani et al. (Agric. Biol. Chem, 1990, 54(9): 2323–2330) beschreibt den verstärkenden Effekt einer Malondialdehyd Modifikation auf die IgE Antwort auf Proteinantigene bei der Maus. Die Immunantwort auf ein Antigen, welches dem Wirt verabreicht wurde, kann durch die Verwendung von Adjuvantien verstärkt werden. Ein Adjuvans ist jede Substanz, die die Immunantwort auf ein Antigen spezifisch verstärkt.
Die Immunantwort wird durch eine Vielfalt von Zellen des Immunsystems vermittelt. Es gibt zwei Typen von Immunantworten: die humorale Immunität, welche durch Antikörper vermittelt wird (spezifische Immunität) und die zelluläre Immunität, welche vorrangig durch zytotoxische T-Lymphozyten vermittelt wird. Antigen präsentierende Zellen haben und präsentieren Antigen sowohl zu B- wie auch T-Zellen. Die B-Zellen sezernieren als Ergebnis der Aktivierung spezifische Antikörper und T-Zellen (sowohl Helferzellen für die humorale Antwort als auch zytotoxische T-Zellen) antworten. Es konnte gezeigt werden, dass Adjuvantien beide Immunantworten erhöhen. Eine erstmalige Präsentation eines Antigens induziert sowohl IgM als auch IgG Antikörper als erste Antwort. Die Antikörperproduktion kann jedoch im Zeitverlauf abnehmen. Eine zweite Antwort, die grundsätzlich die Produktion von IgG Antikörpern einschließt, kann durch eine zweite oder im Zeitverlauf spätere Präsentation des Antigens eingeleitet werden. Diese Bildung einer spezifischen Immunantwort erfordert im Allgemeinen eine zweite Impfung mit Antigen oder sogar eine Reihe von Impfungen über mehrere Wochen. Dies trifft sogar für hoch immunogene Proteine zu und bei weniger immunogenen Verbindungen müssen zusätzliche Probleme in Kauf genommen werden. Eine sekundäre oder auch eine primäre Antwort sind jedoch nicht durch einfaches Primen des Wirtes mit einem Antigen garantiert.
Die Immunogenität eines Antigens kann durch gleichzeitige Gabe eines Adjuvans wie z. B. abgetöteten Bakterien oder immunologisch inerten Substanzen, die in der Lage sind dem Immunsystem eine erhöhte Konzentration von Antigenen zu präsentieren, gesteigert werden. Adjuvantien erhöhen die Antwort des Immunsystems, wenn sie mit Antigenen verabreicht werden, indem höhere Antikörpertiter oder verlängerte Wirtsantworten ausgelöst werden. Das am häufigsten verwendete Adjuvans ist Freund's Adjuvans. Freund's inkomplettes Adjuvans umfasst eine Wasser-Öl Emulsion und Freund's komplettes Adjuvans umfasst das voran genannte sowie einen Zusatz von Mikrobakterium tuberkulosis und Alaun. Freund's Adjuvans hat jedoch mehrere Nachteile, da es häufig akuten Schmerz verursacht und dazu führen kann, dass der Empfänger Läsionen an der Injektionsstelle entwickelt.
Ein weiteres kommerziell erhältliches Adjuvans, welches weithin verwendet wird, ist Monophosphoryl-Lipid A (MLP)/Trehalosedicorynomycolat (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, Mont.). Alaun und Aluminiumhydroxid sind auch als Alternativen zu Freund's Adjuvans verwendet worden. Hierbei zeigen sich jedoch Probleme mit Blick auf die Effizienz gegenüber synthetischen Antigenen und thymusunabhängigen Antigenen. Weiterhin sind auch zahlreiche Adjuvantien bakteriellen oder chemischen Ursprungs im Stand der Technik vorgeschlagen worden, jedoch nur wenige haben sowohl eine hohe Effizienz und sind frei von Nebeneffekten. Keines wurde bislang gefunden, welches nur die spezifische Immunität verstärkt.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen Faktor bereit zu stellen, der die Immunantwort auf ein bestimmtes Antigen spezifisch verstärkt, wodurch hohe Antikörpertiter erzeugt werden und die Zeit für eine Antikörperproduktion verkürzt wird.
Darüber hinaus ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Hapten bereit zu stellen, welches an jeden Träger gebunden werden kann und diesen dadurch immunogen macht.
Noch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es einen hoch fluoreszierenden Faktor bereit zu stellen, der für das Markieren und den Nachweis von Antikörpern oder anderen komplexen Biomolekülen in einer Vielzahl von verfügbaren immunochemischen Techniken verwendet werden kann.
Weitere Aufgaben der Erfindung werden aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung offensichtlich werden.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines Immunverbesserungsfaktors gemäß Anspruch 1. Ein Reaktionsprodukt aus Acetaldehyd (AA) und Malondialdehyd (MDA), die zusammen eine neue Substanz bilden, ist hochreaktiv. Es wird einfach durch Inkubation der beiden Aldehyde mit dem Antigen an das Antigen, welches komplexe Proteine, Lipide, Kohlenhydrate oder DNA einschließt, angelagert. Das Zusammenführen von MDA und Acetaldehyd in Anwesenheit von verschiedenen Antigenen führt zur Bildung eines bestimmten neuen Produktes, welches ein hybrides Addukt aus MDA und Acetaldehyd, welches Malondialdehyd-Acetaldehyd-Addukt (MAA) benannt wurde, umfasst. Diese hybriden Addukte sind neu und ihre allgemeine chemische Formel wurde hierin beschrieben. Dies ist ein deutlicher Unterschied zu den meisten Addukten, die noch nicht derart beschrieben wurden, und eröffnet Möglichkeiten für eine unabhängige Synthese des Adduktes und die Herstellung von neuen antigenartigen Adduktkombinationen, sowie alternativen Untersuchungsmethoden.
Entsprechend der Erfindung bildet die Kombination von MDA und AA in Anwesenheit eines Proteins oder eines Peptides zwei hybride Addukte, die auf der molekularen Ebene charakterisiert wurden und die nachfolgenden Formeln haben. Die hybriden Addukte können Abwandlungen an verschiedenen funktionellen Gruppen umfassen, die die Gesamtreaktivität des Produktes erwartungsgemäß nicht verändern. Die Formeln für diese Hybridaddukte werden nachfolgend aufgeführt, wobei Addukt 1 nicht zu der Erfindung gehört.
wobei X ein Antigen ist, welches aus der Gruppe bestehend aus einem Protein oder Peptid, einem Lipid, einem Kohlenhydrat mit einem reaktiven Aminosäurerest ausgewählt ist. Das Addukt, welches entsprechend der Erfindung hergestellt wird ist:
wobei R ein C₁ bis C₆ Alkyl, H, ein Benzyl oder eine Arylgruppe ist und X ein Antigen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Protein oder Peptid, einem Lipid, einem Kohlenhydrat mit einer reaktiven Aminosäuregruppe ist. Diese Hybridaddukte werden durch einfache Inkubation unter Standardbedingungen hergestellt.
Über die oben dargestellten Hybridaddukten hinaus, haben die Addukte der Erfindung mehrere wichtige immunologische Eigenschaften, die in chemischen und immunologischen Untersuchungsverfahren ausgenutzt werden können.
MAA ist hochreaktiv und bindet Antigene besser als Acetaldehyd oder Malondialdehyd alleine. Es bildet Addukte unter Standardbedingungen durch die bloße Kombination des Aldehyds und des Trägerantigens. Addukte wurden mit bovinem Serumalbumin, humanem Serumalbumin, Ovalbumin, Hühnereilysozym, Asialoglycoproteinrezeptor, Aktin, Rattenlebermikrosomen, Rattenleberzytosol, humanem-epidermalem Wachstumsfaktor, Maus-epidermalem Wachstumsfaktor, Transferrin, Antikörpern und Hämoglobin sowie zahlreichen anderen Leberproteinen hergestellt. Es sieht so aus, als gäbe es keine Einschränkung welche Proteine ein Addukt bilden. Die Addukte können dann als Immunogen entweder als Impfstoff gegen tierische oder menschliche Antigene oder zur Antikörperproduktion eingesetzt werden. MAA kann z. B. mit aus der Umwelt stammenden Antigenen zur Desensibilisierung von Allergiepatienten eingesetzt werden. MAA fungiert als spezifischer Immunverbesserungsfaktor, der eine Antikörperproduktion in kürzerer Zeit erlaubt und höhere Antikörpertiter ohne den Einsatz von Adjuvantien ermöglicht und so die Antikörpermenge, welche für eine Antwort benötigt wird, herabsetzt. Eine IgG Antwort kann schon drei Tage nach einer einmaligen Inokulation beobachtet werden.
MAA ist zusätzlich zu den hochspezifisch und immunogenen Eigenschaften auch hochfluoreszent. Es hat eine Anregungsfrequenz von 398 Nanometern und ein Absorbtionsvermögen von 460 Nanometern und kann auf pikomolarem Level nachgewiesen werden. Untersuchungen haben gezeigt, dass MAA-Addukte die verbundene Antikörper nicht deaktivieren und somit als allgemeines Fluoreszenzmarker für alle möglichen immunologischen Techniken, eingeschlossen der Identifikation und Visualisierung von Antigen-Antikörper Interaktionen mittels eines MAA Labelings, eingesetzt werden können. Es kann außerdem als genereller Marker zur Visualisierung von Proteininteraktionen oder zum Überwachen der Aufreinigungen von biologischen Reaktionen eingesetzt werden.
Beschreibung der Figuren
1 ist ein Diagramm, welches die synergistische Aktion von MDA und Acetaldehyd auf die Bindung mit bovinem Serumalbumin (BSA) darstellt. Das Diagramm bildet die verschiedenen Konzentrationen von MDA ab, die in der Anwesenheit von Acetaldehyd (1 mM) über 72 Stunden inkubiert wurden. MDA stimuliert die Bindung von Acetaldehyd an BSA merklich in konzentrationsabhängiger Art und Weise. Die Ergebnisse sind als Durchschnittswert aus fünf Experimenten ± Standardfehler ausgedrückt.
2 ist ein Diagramm, welches die Stabilität der Interaktion zwischen Acetaldehyd und MDA abbildet. Das Diagramm zeigt 0,1 mM Acetaldehyd, welches mit 1 mg/ml BSA bei 37°C mit und ohne MDA (0,2 bis 0,4 mM) über 72 Stunden inkubiert wurde. Es ist immer noch ein synergistischer Effekt zu sehen. Ergebnisse und Mittelwert ± Standardfehler für vier Experimente.
3a und 3b bilden die Intensität der Fluoreszenz des Reaktionsgemisches aus BSA mit Acetaldehyd und MDA ab.
3a stellt die relative Fluoreszenz von Acetaldehyd (1,0 mM) und BSA (1 mg/ml) mit verschiedenen Konzentrationen von MDA (0 bis 8,0 mM) bei 37°C über einen Zeitraum von 8 Stunden dar. Ergebnisse und Mittelwert + Standardfehler für fünf Experimente.
3b ist ein Diagramm, welches die Abhängigkeit von Acetaldehydbindung und Fluoreszenz in Abwesenheit (Viereck) und Anwesenheit (Kreis) von MDA abbildet. Reaktionsgemische mit MDA zeigen ein Absorbtionsmaximum bei 460 nm und ohne MDA ein Anregungs- und Emissionsmaximum bei 357 nm bzw. 440 nm.
4a und 4b zeigen einen direkten ELISA von polyklonalen Antikörpern eines Hasenplasmaproteins-MAA Konjugates gegen BSA-Aldehyd Konjugate an dem MA-BSA Addukt. 4a zeigt die Spezifität der Antikörper. BSA, welches für drei Tage mit Acetaldehyd alleine (1 mM) reagiert hat (Kreis); MDA alleine (1 mM) (Viereck); Acetaldehyd (1 mM) und MDA (1 mM) (Dreieck) und natives (unbehandeltes) BSA (umgekehrtes Dreieck).
4b zeigt im direkten ELISA die Affinität des polyklonalen Antikörpers in Anwesenheit einer Konzentration von 0,1 mM der Aldehyde getrennt und zusammen. Es zeigt sich, dass die Ergebnisse für einen ELISA typisch sind und die Spezifität eines affinitätsgereinigten Antikörpers gegen MAA-Addukte darstellen.
5a und 5b sind Diagramme, welche die Ergebnisse eines kompetitiven ELISA's für die kompetitive Inhibierung der BSA-MAA-Addukte sowie die Fähigkeit der verschiedenen MAA veränderten BSA-Addukte, die Antikörperbindung zu inhibieren, darstellen. BSA wurde mit verschiedenen Konzentrationen von MDA und [¹⁴C] Acetaldehyd derivatisiert und es wurden die stabilen Bindungen des Acetaldehyds quantifiziert. Das Ausmaß der Abänderungen bezogen auf nmol Acetaldehyd gebunden pro mg BSA war 28 (Raute); 15,4 (umgekehrtes Dreieck); 19,1 (Dreieck); 6,0 (Viereck); und 3,5 (Kreis). 5a ist eine grafische Darstellung der prozentualen Hemmung von MAA-Addukten bezogen auf die Proteinkonzentration. 5b stellt die identischen Daten als Funktion des gebundenen Aldehyds dar, wodurch gezeigt wird, dass der kompetitive ELISA das Level der MAA Abänderungen des Proteins angemessen abschätzt und dass die Zahl der MAA Epitope der entscheidende Faktor für die Hemmung der Antikörperbindung ist.
6 stellt die kompetitive Hemmung von zytosolischem Protein-MAA-Addukten in einem kompetitiven ELISA dar. Zytosolische Leberproteine wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von MDA und [¹⁴C] Acetaldehyd derivatisiert und das gebundenen Aldehyd quantifiziert. Das Ausmaß der Abänderungen bezogen auf nmol-Acetaldehyd gebunden pro mg zytosolisches Leberprotein war 28,3 (Raute); 16,0 (umgedrehtes Dreieck); 8,1 (Dreieck); 6,2 (Viereck); und 4,3 (Kreis). 6a zeigt die prozentuale Hemmung bezogen auf die Proteinkonzentration des gebundenen Acetaldehyds.
7 ist ein kompetitiver ELISA von geringfügig modifizierten BSA-MAA-Addukten, wobei Bedingungen wie bei 5 verwendet wurden. Die prozentuale Hemmung bezogen auf nmol gebundenes Acetaldehyd pro mg BSA wurde mit 1,25 (Sechseck); 1,0 (Kreis); 0,77 (Viereck); 0,70 (Raute); 0,54 (Dreieck); und 0,48 (umgekehrtes Dreieck) bestimmt. 7a stellt die prozentuale Hemmung bezogen auf die Proteinkonzentration und 7b die prozentuale Hemmung als Funktion des gebundenen Acetaldehyds dar.
8a ist ein Diagramm, welches einen kompetitiven ELISA von minimal veränderten zytosolischen Leberprotein-MAA-Addukten abbildet. Die Versuchsbedingungen entsprechen denen von 6. Die prozentuale Hemmung bezogen auf nmol des gebundenen Acetaldehyd pro mg Protein: 5,0 (umgekehrtes Dreieck); 2,5 (Dreieck); 1,1 (Viereck); und 0,49 (Kreis). In 8a wird die prozentuale Hemmung als Funktion der Proteinkonzentration grafisch dargestellt. 8b stellt die Daten als Funktion des gebundenen Acetaldehyds grafisch dar.
9a bildet einen kompetitiven ELISA für den Nachweis von MAA-Addukten im Leberzytosol zweier mit Ethanol gefütterter Ratten ab. Die prozentuale Hemmung des Zytosols der Ethanol gefütterten Ratten (gefülltes Dreieck und Kreis) und des entsprechenden Kontrollpaares (offener Kreis und Dreieck), 9b repräsentiert die Daten von 9a, wobei die Kontrollwerte der Hemmung abgezogen sind.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Untersuchungen über die Chemie von Acetaldehyd-Protein-Adduktbildung haben gezeigt, dass Acetaldehyd sowohl instabile wie stabile Addukte bildet, und dass die α-Aminogruppe des Lysins an der Ausbildung der Addukte beteiligt ist. Es zeigte sich außerdem, dass Proteine Lysinreste mit unterschiedlicher Reaktivität gegenüber Acetaldehyd-Adduktbildung haben und dass bestimmte Proteine ausgewählte Zielobjekte für die Adduktbildung im zellulären System sind, da sie einen speziell reaktiven Schlüssel-Lysinrest haben.
Auf der anderen Seite wird Malondialdehyd (MDA) durch Peroxidation mehrfach ungesättigter Fettsäuren und durch den oxidativen Abbau von Deoxyribose mittels eines Hydroxyradikals gebildet. Die Natur und/oder chemische Struktur dieser Addukte, die in vitro und in vivo gebildet werden, wurde nicht charakterisiert und in der Literataur finden sich widersprechende Ergebnisse bezüglich der natürlichen intrazellulären Verteilung und Identität der Addukte. Siehe Tuma, DJ, "The Roll of Acetaldehyde Adducts in Liver Injury", Hall P. editors, Alcoholic Liver Disease: Pathology and Pathogenesis, ed. II, London: Edward Arnold, 1995, 89–99. Diese Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung von neuen Addukten, welche Hybride aus Malondialdehyd und Acetaldehyd sind. Diese beiden Produkte verbinden sich, um ein hochimmungenes Antigen-Addukt zu bilden, wobei das eine als Malondialdehyd-Acetaldehyd-Addukt oder (MAA) bezeichnet wird und das zweite ein wenig stabiles Addukt (I) ist.
Die Hybridaddukte werden bei neutralen Standardbedingungen sowohl in vitro wie in vivo gebildet. Die Addukte sind entsprechend der nachfolgenden Formeln aufgebaut, wobei X ein lösliches Protein in einer biologischen Probe ist und R ein C₁ bis C₆ Alkyl, ein Benzyl, eine Arylgruppe oder ein Hydrogen ist.
Die Anmelder haben gezeigt, dass die Anwesenheit von AA und MDA mit Protein in einer dramatischen Zunahme einer Proteinadduktbildung resultiert, sogar bei Konzentrationen von nur 0,1 mM Acetaldehyd und 0,2 mM Malondialdehyd. Malondialdehyd und Acetaldehyd zusammen erhöhen die Proteinadduktbildung 13-fach verglichen mit Acetaldehyd alleine. Aminogruppen der Antigene, insbesondere die α-Aminogruppe der eingebetteten Lysine, sind die vorrangige funktionelle Gruppe, welche in der MAA-Adduktbildung partizipiert. Die Adduktbildung findet mit zahlreichen Aminogruppenquellen wie Lipiden, DNA, RNA, Kohlenhydrate, usw. statt.
Acetaldehyd und Malondialdehyd zusammen können in der Anwesenheit eines antigenen Substrates und unter neutralen Bedingungen ein Produkt bilden, welches wenigstens 10-mal mehr modifiziert ist als MDA alleine. MDA und AA reagieren daher zusammen in synergistischer Art und Weise und führen unter neutralen Bedingungen zu einer höheren Ausbeute an Antigen-Addukten. Diese neuen Addukte besitzen einige einzigartige immunologische und chemische Eigenschaften, welche gemäß der Erfindung ausgenutzt werden können.
In einem Ausführungsbeispiel umfasst die Erfindung die Verwendung von MAA-Antigen-Addukten als Immunogen. MAA bildet mit nahezu jedem Antigen ein stabiles Addukt, eingeschlossen bovines Serumalbumin, humanes Transferrin, humanes Hämoglobin, weitere Leberproteine und Plasmaproteine. Ein solches kann verwendet werden, um Tiere mit umweltbedingten, tierischen oder menschlichen Antigenen zu inokulieren, um eine Resistenz auf eine Krankheit zu erwirken oder eine allergische Reaktion zu hemmen.
Diese MAA-Addukte sind hochimmunogen und agieren als spezifische Immunverstärker. Antikörperreaktionen auf MAA-Protein-Addukte in autologen Systemen führen zu hohen Antikörperlitern nur gegen MAA, jedoch nicht gegen das Protein. Verglichen mit vielen Haptenkonjugaten verursacht MAA daher keine Autoimmunkrankheit. Normales Plasmaprotein generiert in autologen Tieren keine Antikörperreaktion. MAA-Protein-Addukte, welche in ein heterologes System injiziert werden, führen in diesen Tieren ohne Adjuvans zu hohen Titern von Antikörpern sowohl gegen das Protein wie das MAA. Die T-Helferzellantworten in autologen Systemen führen zu keinen T-Helferzellen gegen MAA, jedoch ist eine T-Helferzellantwort gegen normales Plasmaprotein nachweisbar. Im heterologen System in Mäuse injizierte Proteine bilden keine T-Helferzellantwort, wenn sie jedoch an ein MAA gebunden sind, bilden sie eine T-Helferzellantwort gegen den Träger, jedoch nicht gegen MAA (Hapten).
MAA induziert ohne Adjuvans hohe Titer von Antikörpern und sogar bei Injektionen mit nur 10 μg des Konjugates können Antikörper nachgewiesen werden. Es bewirkt insbesondere, dass das konjugierte Protein immunogen wird und das keine unspezifische, polyklonale Aktivierung, sondern eine spezifische Antikörperantwort mit nahezu keinen Kreuzreaktivitäten zu nahe verwandten Antigenen generiert wird. Eine IgG Antwort zeigt sich in nur drei Tagen.
Eine Methode zur immunologischen Quantifizierungen involviert die Ausnutzung der Immunogenität von MAA Konjungaten bei der Entwicklung von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern gegen jegliche Art von Trägerproteinen. Grundsätzlich sind alle gängigen Immunoassays, wie Radioimmunoassay, enzymatische Immunoassay, Fluorenzimmunoassay, usw. für die immunologischen Methoden und Bestimmungen geeignet. Zusätzlich sind auch alle Varianten der Verfahren wie kompetitive Immunoassays anwendbar.
Da MAA ein spezifischer Immunverstärkungsfaktor ist, verlieren traditionelle Methoden der polyklonalen Antikörperherstellung, welche aus nahe verwandten Antikörpern mit hoher Kreuzreaktivität bestehen, an Bedeutung.
Polyklonale Antikörper gegen das MAA-Addukt werden im Allgemeinen in Tieren durch mehrfache subkutane (sc) oder intraperitonale (ip) Injektionen des MAA-Protein-Addukts und eines Adjuvans generiert. Wie hierin gezeigt wird, ist das MAA-Addukt hochimmunogen und kann als spezifischer Immunverstärkungsfaktor, der dazu führt, dass das Trägerprotein immunogen wird, agieren. Tatsächlich funktioniert das MAA-Addukt als spezifischer Immunverstärkungsfaktor besser als unspezifische Adjuvantien bei der Generierung von hohen Titern von Antikörpern, sodass ein IgG Titer bereits nach weniger Injektionen beobachtet werden kann. Viele Antigene müssen von Proteinen, Peptiden oder Konjugaten aufgereinigt werden und mit einem zweiten Protein, welches in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z. B. Napfschnecken Hämocyanin, Serumalbumin, bovines Thyroglobulin, Sojabohnen Typsininhibitor, welcher ein bifunktionales oder derivatisiertes Agens verwendet z. B. Maleimidobenzoyl-Sulfosuccinimid Ester (konjugiert über den Cysteinrest), N-Hydroxysuccinimid (über Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂, oder R¹N=C=NR, wobei R und R¹ verschiedene Alkylgruppen sind, verbunden werden. Überraschender Weise sind diese Protokolle für MAA-Addukte nicht erforderlich, da MAA selbst hochimmunogen ist.
Gewöhnlich werden Tiere gegen Zellen oder immunogene Konjugate des MAA's mit Monophosphoryl-Lipid A (MPL)/Trehalosedicorynomycolat (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, Mont.) durch intradermale Injektion der Lösung an zahlreichen Stellen immunisiert. Zwei Wochen später werden die Tiere mit der ursprünglichen Menge des Konjugates in MLP/TDM geboostet. 7–14 Tage später wird den Tieren Blut entnommen und das Serum auf einen Anti-MAA Titer untersucht. Die Tiere werden geboostet bis der Titer ein Plateau erreicht. Aggregierende Agenzien wie Alaun werden oft verwendet, um die Immunantwort zu erhöhen. Das MAA-Addukt ist jedoch so immunogen, dass es eine IgG Antwort in nur drei Tagen erzeugen kann und Adjuvantien wie MPL/Trehalosedicorynomycolat (TDM) oder Freund's nicht nötig sind.
Monoklonale Antikörper werden erzeugt durch die Gewinnung von Milzzellen aus immunisierten Tieren und das Immortalisieren der Zellen gemäß üblicher Praxis, z. B. durch Fusion mit Myelomzellen oder eine Transformation mit Epstein-Barr(EB)-Virus sowie anschließendem Screening der Klone auf Expression des erwünschten Antikörpers. Die Hybridomtechnik wurde ursprünglich von Köhler und Milstein, Eur. J. Immunol., 6: 511 (1976) und auch von Hammerling et al., in "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas", Elsevier, N.Y., S. 563–681 (1981) beschrieben und wurde weithin angewendet, um Hybridzelllinien zu etablieren, die hohe Titer von monoklonalen Antikörpern gegen viele spezifische Antigene sezernieren.
Die Hybridzelllinien können in vitro im Zellkulturmedium erhalten werden. Die Zelllinien, welche Antikörper produzieren, können im Medium welches Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (HAT) enthält, selektiert und/oder erhalten werden. Tatsächlich kann die Hybridomzelllinie, sobald sie etabliert ist, in einer Vielzahl von im Nährwert ähnlichen Medien erhalten werden. Weiterhin können die Hybridzelllinien auf herkömmliche Art und Weise in beliebiger Menge aufbewahrt und konserviert werden, eingeschlossen Verfahren zum Einfrieren und Lagerung im flüssigen Stickstoff. Gefrorene Zelllinien können wiederbelebt werden und unbegrenzt kultiviert werden, wobei sie die Synthese und Sekretion der monoklonalen Antikörper Wiederaufnehmen.
Die sezernierten Antikörper werden vom Zellkulturüberstand oder aus der Aszitesflüssigkeit durch konventionelle Methoden wie Immunpräzipitation, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie wie Protein A/G Säulenchromatographie oder ähnlichem gewonnen. Die hierin beschriebenen Antikörper können auch von Hybridomzellkulturen durch herkömmliche Methoden wie der Fällung mit 50% Ammoniumsulfat gewonnen werden. Die gereinigten Antikörper können dann steril filtriert werden.
Der Begriff "monoklonale Antikörper" wie er hierin verwendet wird, betrifft einen Antikörper aus einer im wesentlichen homogenen Antikörperpopulation, d. h. die einzelnen Antikörper aus der Population sind identisch ausgenommen möglicher natürlich vorkommender Mutationen, die in geringen Mengen auftreten können. Monoklonale Antikörper sind hochspezifisch und gegen eine einzige Antigendeterminante gerichtet. Weiterhin, im Gegensatz zu einer herkömmlichen, polyklonalen Antikörperherstellung, welche typischerweise verschiedene Antikörper gerichtet gegen verschiedene Strukturen (Epitope) umfassen, ist jeder monoklonale Antikörper nur gegen eine einzige Struktur an dem Antigen gerichtet. Zusätzlich zu Ihrer Spezifität erweisen sich monoklonale Antikörper vorteilhaft dadurch, dass sie in Hybridomkulturen, welche frei von anderen Immunglobulinen sind, synthetisiert werden können. Alle monoklonalen und polyklonalen Antikörper, eingeschlossen Hybridome, werden im VA Medical Center in Omaha, Nebraska aufbewahrt.
Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung umfassen auch Hybride und rekombinante Antikörper, welche durch Splicing einer variablen (eingeschlossen einer hypervariablen) Domäne des Anti-MAA Antikörpers mit einer konstanten Domäne (z. B. "humanisierte" Antikörper) oder einer leichten Kette mit einer schweren Kette oder einer Kette von einer Spezies mit einer Kette einer anderen Spezies oder Fusion mit heterologen Proteinen unabhängig von der Ausgangsspezies oder Immunglobulinklasse oder Unterklassenbestimmung sowie Antikörperfragmenten (z. B. Fab, F(ab')₂, and Fv) solang sie die erwünschte biologische Aktivität zeigen, hergestellt werden (Siehe z. B. Cabilly, et al., U.S. Pat. Nr. 4,816,567; Mage & Lamoyi, in "Monoclonal Antibody Production Technique and Applications", S. 79–97 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
Das Adjektiv "monoklonal" zeigt also den Charakter des Antikörpers als, einen aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörper erhaltenen an und ist nicht als notwendig für die Produktion des Antikörpers mit einer bestimmten Methode zu verstehen. Z. B. kann der monoklonale Antikörper, welcher in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, gemäß einer Hybridoma-Methode beschrieben von Köhler und Milstein, s. o., oder durch rekombinante DNA-Methoden (Cabilly, et al., s. o.) gemacht werden.
Diagnostische Verwendung von MAA und Anti-MAA Antikörpern
Anti-MAA Antikörper sind zum Einsatz in diagnostischen Tests für die MAA Expression in spezifischen Zellen oder Geweben geeignet, wobei die Antikörper, wie nachfolgend beschrieben, markiert sind und/oder an eine nichtlösliche Matrix fixiert sind. Anti-MAA Antikörper sind auch für den Einsatz bei der Affinitätsreinigung von MAA aus rekombinanter Zellkultur oder natürlichen Quellen geeignet. Anti-MAA Antikörper, die nicht nachweislich mit anderen Proteinen oder Materialien kreuzreagieren, können dazu verwendet werden, beliebige MAA-Protein-Addukte von anderen homologen Rezeptoren zu reinigen.
Geeignete diagnostische Tests für MAA sind an sich wohl bekannt. Als Beispiel kann eine biologische Probe auf MAA getestet werden durch das Auswählen der Probe aus einer gewünschten Quelle, das Vermischen der Probe mit Anti-MAA Antikörpern, um dem Antikörper zu ermöglichen mit allen in der Lösung vorliegenden MAA's einen Antikörper/MAA Komplex zu bilden und durch den Nachweis der Antikörper/MAA Komplexe in der Mischung. Die biologische Probe kann für den Test gemäß im Stand der Technik bekannter Methoden, die für die entsprechende Probe geeignet sind, vorbereitet werden. Die Methode zum Mischen der Probe mit den Antikörpern sowie die Methode zum Nachweis des Antikörper/MAA Komplexes kann entsprechend des verwendeten Testsystems ausgewählt werden. Solche Testsysteme umfassen kompetitive und Sandwichtests sowie sterische Inhibitionstests. Kompetitive oder Sandwichverfahren arbeiten mit einem Phasentrennungsschritt als dem essentiellen Schritt des Verfahrens, während sterische Inhibitionstests in einer einzigen Reaktionsmischung durchgeführt werden.
Analytische Verfahren für MAA verwenden alle ein oder mehrere der nachfolgenden Reagenzien: markierte MAA Analoga, immobilisierte MAA Analoga, markierte Anti-MAA Antikörper, immobilisierte Anti-MAA Antikörper und sterische Konjugate.
Da MAA selbst hoch fluoreszent ist und die Aktivität von Antikörpern nicht beeinträchtigt, kann MAA selber als Marker für seinen eigenen Nachweis verwendet werden, oder für den Nachweis von anderen Antikörpern durch Konjugieren des Antikörpers oder Proteins daran und unter Verwendung eines Fluoreszenznachweises eingesetzt werden. Die markierten Reagenzien sind auch als "Indikatoren" bekannt.
Der verwendete Marker ist eine beliebige, nachweisbare Funktionalität, die nicht mit der Bindung von MAA und Anti-MAA Antikörper interferiert. Zahlreiche Marker sind für die Verwendung von Immunoassays bekannt. Es gibt z. B. Reste, die direkt nachweisbar sind wie fluorochrome, chemilumineszente und radioaktive Marker sowie auch Enzymereste, die für einen Nachweis zunächst reagieren müssen oder derivatisiert werden müssen. Beispiele für solche Marker schließen die Radioisotope ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H und ¹³¹I, Fluorophore wie die seltenen Erdenchelate oder Fluorescein und dessen Derivate, Rhodamin und dessen Derivate, Dansyl, Umbelliferon, Luziferasen, z. B. Firefly Luziferase und bakterielle Luziferase (U.S. Pat. Nr. 4,737,456), Luziferin, 2,3 Dihydrothalazinedion, Horseradish Perodxidase (HRP), alkalische Phosphatase, α-Galactosidase, Glucoamylase, Lysozym, Saccharidoxidase, z. B. Glucoseoxidase, Galactoseoxidase und Glucose-6-Phosphatdehydrogenase, heterozylische Oxidasen wie Uricase und Xanthinoxidase, gebunden an ein Enzym, welches Wasserstoffperoxid zur Oxidation eines Farbstoffvorläufers wie HRP, Lactoproxidase oder Mikroperoxidase, Biotin/Avidin, Spin Label, Bakteriophagen Marker, stabile freie Radikale und ähnliches einbindet.
Es stehen Standard Methoden zur Verfügung, um diese Marker kovalent an Proteine oder Polypeptide zu binden. Beispielsweise können Kupplungsagenzien wie Dialdehyde, Carbondiamide, Dimaleimide, Bisimidate, bis-diazotiertes Benzidin und ähnliches verwendet werden, um die Antikörper mit den oben beschriebenen fluoreszierenden, chemilumineszenten und Enzymmarkern zu markieren. Siehe z. B. U.S. Pat. Nr. 3,940,475 (Fluorometrie) und 3,645,090 (Enzyme); Hunter et al., Nature, 144: 458 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014–1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Methods, 40: 219–230 (1981); und Nygren, J. Histochem. und Cytochem., 30: 407–412 (1982). Bevorzugte Marker der vorliegenden Erfindung sind Enzyme wie Horseradish Peroxidase und alkalische Phosphatase.
Die Konjugation solcher Marker einschließlich der Enzyme an einen Antikörper ist ein manipulatives Standardverfahren für den Fachmann auf dem Gebiet der Immunoassaytechniken. Siehe z. B. O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay", in Methods in Enzymology, et. J. J. Langone and H. Van Vunakis. Vol. 73 (Academic Press, New York, New York, 1981), S. 147–166.
Daher zieht eine alternative Ausführungsform einen neuen Marker, welcher in Immunoassays verwendet werden kann, in Betracht. Die Konjugation des MAA Markers an den Antikörper ist bedeutend vereinfacht. Wie vorangehend beschrieben, wird der Antikörper lediglich mit Acetaldehyd und Malondialdehyd zusammen inkubiert.
Für bestimmte Testmethoden ist die Immobilisierung von Reagenzien erforderlich. Die Immobilisierung bedingt das Abtrennen der Anti-MAA Antikörper (vom MAA gebundenen Proteinimmunogen) von jedem MAA das frei in Lösung bleibt. Herkömmlicher Weise wird dies erreicht entweder durch unlöslich machen der Anti-MAA Antikörper oder MAA-Analoga vor dem Testverfahren z. B. durch Absorbtion an eine wasserunlösliche Matrix oder Oberfläche (Bennich et al., U.S. Pat. Nr. 3,720,760) durch kovalente Bindung (z. B. unter Verwendung von Glutaraldehyd cross-linking) oder durch ein nachträgliches unlöslich Machen der Anti-MAA Antikörper oder MAA-Analoga z. B. durch Immunopräzipitation.
Andere Testmethoden, die als kompetitive oder Sandwichassays bekannt sind, sind gut etabliert und weit verbreitet in der kommerziellen diagnostischen Industrie. Kompetitive Tests beruhen auf der Fähigkeit eines Indikator-MAA Analoga mit dem MAA der Probe um eine begrenzte Anzahl von Anti-MAA Antikörper-Antigenbindungsstellen zu kompetitieren. Der Anti-MAA Antikörper ist im Allgemeinen vor oder nach Verdrängungsreaktion unlöslich und der Indikator und das an den Anti-MAA Antikörper gebundene MAA werden von dem ungebundenen Indikator und MAA abgetrennt. Diese Trennung wird durch Dekantieren erreicht (wobei der Bindungspartner vorangehend unlöslich gemacht wurde) oder durch Zentrifugieren (wobei der Bindungspartner nach der kompetitiven Reaktion präzipitiert wurde). Die Menge des MAA's in der zu testenden Probe ist invers proportional zu der Menge des gebundenen Indikators, welche durch die Menge der Markersubstanz gemessen wird. Die Dosis-Response Kurven mit bekannten Mengen von MAA werden erstellt und mit den Testergebnissen verglichen, um die Menge des MAA's in den Testproben quantitativ zu bestimmen. Solche Tests werden auch ELISA Systeme genannt, wenn Enzyme als detektierbare Marker eingesetzt werden. Eine andere Art von kompetitiven Tests, auch homogene Assays genannt, erfordert keine Phasentrennung. Hierzu wird ein Konjugat aus einem Enzym mit MAA erzeugt und derart eingesetzt, dass, wenn ein Anti-MAA Antikörper an MAA bindet, die Anwesenheit des Anti-MAA Antikörpers die Enzymaktivität verändert. In diesem Fall sind das MAA oder dessen immunologisch aktive Fragmente über eine bifunktionale organische Brücke an ein Enzym wie eine Peroxidase konjugiert. Die Konjugate werden für den Einsatz mit Anti-MAA Antikörpern so ausgewählt, dass die Bindung des Anti-MAA Antikörpers die Enzymaktivität des Markers inhibiert oder potenziert. Diese Methode ist an sich weit verbreitet unter dem Namen EMIT.
Sterische Konjugate werden in Verfahren zur sterischen Behinderung für homogene Assays eingesetzt. Diese Konjugate werden durch die kovalente Verbindung eines niedrig-molekulargewichtigen Haptens mit einem kleinen MAA Fragment synthetisiert, sodass Antikörper gegen das Hapten im Wesentlichen nicht in der Lage sind, das Konjugat zur gleichen Zeit wie ein Anti-MAA Antikörper zu binden. Unter diesen Versuchsbedingungen wird das MAA in der Testprobe den Anti-MAA Antikörper binden, wodurch dem Antihapten ermöglicht wird, dass Konjugat zu binden, was sich in einer Veränderung des Charakters des Hapten Konjugates, z. B. einer Fluoreszenzänderung äußert, wenn das Hapten ein Fluorophor ist.
Sandwichassays sind insbesondere für die Bestimmung von MAA oder Anti-MAA Antikörpern geeignet. In sequenziellen Sandwichassays wird ein immobilisierter Anti-MAA Antikörper verwendet, um das MAA der Probe zu absorbieren, die Probe wird dann durch Waschen entfernt, das gebundene MAA wird verwendet, um einen zweiten markierten Anti-MAA Antikörper zu absorbieren und das gebundene Material wird dann vom Restindikator abgetrennt. Die Menge des gebundenen Indikators ist direkt proportional zu dem MAA aus der Probe. In "simultanen" Sandwichassays wird die Probe nicht abgetrennt bevor der markierte Anti-MAA zugegeben wird. Zum Testen einer Probe für MAA ist ein sequenzielles Sandwichassay, welches einen Anti-MAA monoklonalen Antikörper als den einen Antikörper und einen polyklonalen Anti-MAA Antikörper als den anderen verwendet, geeignet.
Das vorangegangene sind exemplarische diagnostische Assays für MAA. Andere Methoden, die jetzt oder später entwickelt werden, und die Anti-MAA Antikörper für die Bestimmung von MAA verwenden, sind in den hiesigen Schutzumfang, der die oben beschriebenen Bioassays umfasst, eingeschlossen.
Das MAA-Addukt selbst ist hochfluoreszent mit einer Anregungsfrequenz von 398 nm und einem Absorptionsvermögen von 460. Es ist eines der am meisten fluoreszierenden Produkte, die jemals aufgefunden wurden und erlaubt die Detektion von Fluoreszenz im pikomolaren Bereich für den Nachweis von Antikörper-Antigen Komplexen oder von Antigen selber.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung umfasst die Verwendung eines Hybridproteinadduktes, welches im Verfahren mit markierten Antikörpern zur Visualisierung der Antigen-Antikörper Interaktion durch Markieren der Antigene oder Antikörper verwendet werden kann. MAA kann als Marker für Immunoassay wie vorher beschrieben, verwendet werden, kann jedoch auch zur Visualisierung von Protein-Proteininteraktionen und der Überwachung der Aufreinigung von biologischen Reaktionen in Gelen wie dem Westernblot oder ELISA, im FAXSCan oder bei anderen Techniken verwendet werden.
Weiterhin berücksichtigt die vorliegende Erfindung, dass die Strukturen der MAA-Addukte auf verschiedene Art und Weise modifiziert werden können, um sie noch fluoreszierender zu machen. Z. B. sobald das MAA-Addukt synthetisiert ist, kann eine Benzylgruppe gegen eine Methylgruppe ausgetauscht werden, um dessen Nachweisbarkeit und Immunogenität zu verstärken.
Wegen ihrer Nachweisbarkeit im pikomolarem Bereich können MAA-Addukte verwendet werden, um den Nachweis von Proteinen zu erhöhen und könnten potenziell die ¹²⁵I Markierung in der Autoradiographie ersetzen. Weiterhin können MAA-Addukte in Verbindung mit DNA Proben verwendet werden, um die radioaktive Hybridisierung der Proben zu ersetzen. MAA-Addukte können ferner verwendet werden zur Isolierung und/oder Aufreinigung von Proteinen. Die MAA-Addukte können zuerst verwendet werden, um eine Mischung von Proteinen zu markieren und dann könnte die Abtrennung der Proteine (unter Verwendung von Standardtechniken) überwacht werden, wobei die einzigartigen fluoreszierenden Eigenschaften dieser Erfindung verwendet werden. Die Addukte würden außerdem eine Möglichkeit zur Verfügung stellen die Immunogenität der Proteine zu erhöhen.
Die nachfolgenden Beispiele sind zur Illustration nicht als Limitierung beigefügt.
Beispiel 1
Herstellung von polyklonalen MAA Antikörpern
Materialien
[1,2¹⁴C] Acetaldehyd (5 mCi/mmole) wurde von New England Nuclear (Boston, MA) gekauft. Radioaktiv markiertes Acetaldehyd wurde vom Hersteller als gefrorene wässrige Lösung (1 mCi/ml) abgegeben, aufgetaut und mit destilliertem Wasser zu 250 μCi/ml verdünnt, schockgefroren und bei –70°C aufbewahrt. Die spezifische Aktivität des Acetaldehyds wurde, wie es bei Miwa et al., "The Direct Oxidation of Ethanol by a Catalase- and Alcohol Dehydrogenase-Free Reconstituted System Containing Cytochrome P-450", Arch Biochem Biophyx, 1978; 30: 464–475 beschrieben ist, überprüft. Bovines Serumalbumin (BSA) (kristallisiert, gefriergetrocknet und frei von Fettsäuren) wurde bei Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) gekauft. Nichtradioaktives Acetaldehyd wurde von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI) gekauft. MDA wurde durch die Behandlung von Tetramethoxypropan (Aldrich) mit NaOH entsprechend der Methode von Kikugawa und Ido "Studies on Peroxidized Lipids. V. Formation and Characterization of 1,4-Dihydrophyridine-3,5-Dicarbaldehydes as Model of Fluorescent Components in Lipofusion", Lipids, 1984; 19: 600–608" erhalten. Alle anderen Chemikalien hatten Analysequalität.
Bestimmung einer stabilen Bindung von Acetaldehyd an Proteine in der Anwesenheit von MDA
[¹⁴C] Acetaldehyd in verschiedenen Konzentrationen (0,1 mM oder 1,0 mM) wurde mit verschiedenen Proteinlösungen in Abwesenheit und Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen des MDA's inkubiert. Die Inkubationen wurden in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7.4) bei 37°C in Polypropylengefäßen durchgeführt, die verschlossen wurden, um den Verlust an flüchtiger Radioaktivität zu minimieren. Die Reaktionen wurden in einer Stickstoffatmosphäre im Dunkeln durchgeführt. Während der 72-stündigen Inkubationszeit wurden Aliquots genommen, um eine stabile Acetaldehydbindung zu bestimmen und Fluoreszenzmessungen, wie vorangegangen bei Hoffmann, "Reaction of Acetaldehyde with Proteins: Formation of Stable Fluorescent Adducts", Alcohol Clin Exp Res, 1993; 17: 69–74 beschrieben, durchzuführen. Hierzu in Kürze, im Anschluss an die Inkubation wurden freie und instabil gebundenen Acetaldehyde mittels vollständiger Dialyse gegen Phosphatpuffer für 24 Stunden bei 4°C abgetrennt. Dann wurde die Radioaktivität im Rückstand gemessen, welche die stabilen Actetaldehydbindungen repräsentiert. Die Ergebnisse wurden in nmol Acetaldehyd gebunden pro mg Protein ausgedrückt. Nach der Dialyse wurden von den Proben Fluoreszenzmessungen unter Verwendung eines Perkin Elmer LS-5B Spektrophotofluorometer angeschlossen an einem Perkin Elmer GP-100 Grafikdrucker durchgeführt.
Erzeugung, Aufreinigung und Biotinylierung des polyklonalen Rabbit-Antikörpers gegen MDA/Acetaldehyd-modifizierte Proteine
Das Immunogen wurde durch die Behandlung von Hasenplasmaproteinen (hergestellt durch Ammoniumsulfatfällung) (Klassen, "Detection of Reduced Acetaldehyde Protein Adducts Using a Unique Monoclonal Antibody", Alcohol Clin Exp Res, 1994; 18: 164–171) in einer Konzentration von 1 mg/ml mit 1 mM Acetaldehyd und 1 mM MDA für 3 Tage bei 37°C hergestellt. Im Anschluss an eine über Nacht Dialyse gegen 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4 und 4°C) wurde die Lösung mit dem entsprechenden Volumen von Freund's komplett Adjuvans vermischt und emulgiert. Weiße New Zealand Hasen wurden subkutan an vier Stellen entlang ihres Rückens injiziert (400 μg des modifizierten Proteins). Nach zwei bis vier Wochen wurden die Hasen nach demselben Verfahren geboostet, wobei Freund's inkomplettes Adjuvans verwendet wurde. Zwei Wochen nach der letzten Injektion wurde das Serum gewonnen und auf Antikörperaktivität getestet.
Die erhaltenen Antisera wurden mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Lysin-derivatisierte Sepharose 4B Kügelchen (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurden durch den Zusatz von Acetaldehyd (1 mM) und MDA (1 mM) in 0,1 Phosphatpuffer, pH 7,4 verändert und für 3 Tage bei 37°C und konstantem Schütteln inkubiert. Die Kügelchen wurden mit vierfachem Volumen des Puffers gewaschen und in eine 0,7 cm × 15 cm große Niedrigdruck-Econo-Säule (BioRad Laboratories, Hercules, CA) geschüttet. Zehn ml des Hasenserums der immunisierten Tiere wurde auf die Säule geladen. Die Säule wurde mit 5-fachem Volumen an Puffer und nachfolgend 1 mM NaCl gewaschen und dann mit 0,5 M Essigsäure (pH 2,5) in Trispuffer (pH 8,2) zum Neutralisieren der Säure ausgespült. Das eluierte Material wurde dann mittels Protein G-Sepharose B (Pharmacia, Piscataway, N.J.) Säulenchromatographie weiter aufgereinigt, wodurch ein Reinheitsgrad der IgG Fraktion von mehr als 95% erzielt wurde.
Der affinitätsgereinigte Antikörper wurde mittels der Methode von Bayer und Wilchek biotinyliert. Bayer, "The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology", Methods Biochem Anal, 1980; 26: 1–46. Hierzu in Kürze, 1 mg/ml Antikörper wird gegen 0,1 M Natriumboratpuffer (pH 8,8) für 4 Stunden bei Raumtemperatur dialysiert. N-Hydroxysuccinimid Biotin (100 μg) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde dieser Lösung zugesetzt und für weitere 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dieser Zeit wurde die Lösung mit 15 μl 1 M Ammoniumchlorid Lösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur behandelt und über Nacht bei 4°C gegen Phosphat gepufferte Saline (PBS) (pH 7,4) dialysiert. Der biotinylierte Antikörper wurde bei 4°C bis zur Verwendung aufbewahrt.
Beispiel 2
Direkte und kompetitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA)
Ein direkter ELISA wurde zum Screenen des polyklonalen Hasenantiserums sowie zur Überprüfung der Spezifität der affinitätsgereinigten Antikörper verwendet. Testproteine wurden zu 20 μg/ml in Bikarbonatpuffer (pH 9,6) verdünnt und 100 μl der Proben in eine 96-Loch ELISA Platte gegeben (Immulon IV, Nunc, Fisher Scientific, St. Louis, MO). Nach einer einstündigen Inkubation bei 37°C gefolgt von einer über Nacht Inkubation bei 4°C wurden die beschichteten Löcher mit PBS, welches 0,05% Tween-20 (PBST) enthielt, gewaschen, um ungebundenes Protein zu entfernen. Der biotinylierte Antikörper wurde dann zu den mit Antigen beschichteten Löchern zugegeben und für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBST wurden 100 μl alkalische Phosphatase gebunden an Streptavidin (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) zugegeben und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann 3-mal mit PBST gewaschen und es wurden 100 μl des Substrates, p-Nitrophenylphosphat (Sigma) zugegeben. Die optische Dichte wurde bei 405 nm mit einem Dynatech Micro ELISA Reader MR7000 (Dynateck, Chantilly, VA) gemessen.
Es wurde ein kompetitiver ELISA entwickelt, um die Anwesenheit und die Quantität des MDA/Acetaldehyds-modifizierten Proteins zu bestimmen. Gemäß der Standardmethodik, welche von Robert, et al., "A Sensitive Immunochemical Assay for Acetaminophen Adducts", J Pharmacol Exp Ther, 1987; 241: 527–533; Pumford, et al., "Immunochemical Quantitation of 3-(cystein-S-yl)Acetaminophen Adducts in Serum and Liver Proteins of Acetaminophen-Treated Mice", J Pharmacol Exp Ther, 1989; 248: 190–196 entwickelt wurde, wurden diese Assays derart durchgeführt, dass eine begrenzte Menge des Antikörpers mit dem Inhibitor, entweder einem Standard oder unbekannten, in Anwesenheit von im Übermaß vorliegenden an eine feste Phase gebundenen Antigens (MDA/Acetaldehyd-modifizierte Proteine) zur Reaktion gebracht wird. Nach vorläufigen Experimenten wurden die nachfolgenden spezifischen und optimalen Bedingungen zur Durchführung der kompetitiven ELISA Test etabliert: ELISA Platten wurden mit 100 μl BSA, welches mit 1 mM Acetaldehyd und 1 mM MDA für 24 Stunden (annähernd 2 μg/Loch) behandelt wurde, beschichtet. Biotinylierte Antikörper (1/500 Endverdünnung) wurden mit verschiedenen Konzentrationen der Testproben (Standards oder unbekannt) über Nacht bei 4°C inkubiert und dann wurde ein 100 μl Aliquot jeder Probe in ein zweites Loch der beschichteten Platten gegeben und für 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschen wurden 100 μl des alkalischen Phosphatase-Streptavidin Konjugates zugegeben und das Verfahren wie oben für den direkten ELISA beschrieben, zum Erhalt der optischen Dichtungsmessungen durchgeführt. Die Ergebnisse der verschiedenen Inhibitorenkonzentration wurden in % Inhibierung, welche entsprechend der nachfolgenden, von Roberts et al. entwickelten (siehe oben) Formel berechnet wurde, ausgedrückt.
wobei OD_max die OD in Abwesenheit eines Inhibitors ist, BKG die OD der unspezifischen Absorption der Testreagenzien ist und OD_Probe die OD für ein vorgegebene Konzentration des Standards oder einer unbekannten Probe ist.
Gewinnung von Leberzytosol der mit Ethanol gefütterten und Kontrollratten
Männliche Wistar Ratten (150–160 g) wurden paarweise mit einer Ethanol enthaltenden Lieber-DeCarli bzw. einer flüssigen Kontrollnahrung gefüttert, Lieber et al., "The Feeding of Ethanol in Liquid Diets", 1986 Update, Alcohol Clin Esp Res, 1986; 10: 550–553, und zwar bis zu 5 Wochen entsprechend der Methode von Casey, et al., "Chronic Ethanol Administration Impairs the Binding and Endozytosis of Asialoorosomucoid in Isolated Hepatocytes", J Biol Chem, 1987; 262: 2704–2710. Isolierte Hepatozyten wurden mittels Kollagenaseperfusion wie vorangehend berichtet, gewonnen und eine Fraktion enthaltend das Zytosol der Hepatozyten wurde mittels Ultrazentrifugation hergestellt. Volentine, et al., Subcellular Location of Secretory Proteins Retained in the Liver During the Ethanol-Induced Inhibition of Hepatic Protein Secretion in the Rat", Gastroenterology, 1986; 90: 158–165. Der Proteingehalt der Zytosolfraktion wurde mittels der Methode nach Lowry et al., "Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent", J Biol Chem, 1951; 193: 265–275 bestimmt. Am Tag der Herstellung wurden Aliquots der zytosolischen Hepatozytenproteine mittels kompetitivem ELISA auf Addukte untersucht.
Die in 1 dargestellten Ergebnisse zeigen einen dramatischen Effekt von MDA auf die stabile Bindung des Acetaldehyd an BSA. Wenn Acetaldehyd (1 mM) mit bovinem Serumalbumin (BSA) in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von MDA über einen Zeitraum von 72 Stunden inkubiert wurde, stimulierte MDA die Bindung des Acetaldehyds an BSA merklich in einer konzentrationsabhängigen Art und Weise. Beispielsweise wurden nach einer 24-stündigen Inkubation eine 13-fache Anregung bei einem 4-fach molaren Überschuss an MDA beobachtet. Es ergab sich, dass eine maximale Anregung der Acetaldehydbindungen bei einem 4-molaren Überschuss des MDA's auftrat. Die MDA induzierte Zunahme von Acetaldehydbindungen an BSA wurde auch bei geringeren Konzentrationen der Aldehyde beobachtet. Wenn 0,1 mM Acetaldehyd mit MDA (0,1 bis 0,4 mM) inkubiert wurde, war immer noch eine MDA Anregung der Acetaldehydbindungen an BSA erkennbar, obwohl der Effekt bei diesen niedrigen Konzentrationen ein wenig abgeschwächt war (2). Zusätzlich zu BSA zeigten auch andere Proteine, die getestet wurden, deutlich erhöhte Acetlaldehydbindungen in der Anwesenheit von MDA. Die getesteten Proteine umfassten Mausplasmaproteine, Hasenplasmaproteine, Hämoglobin, epidermale Wachstumsfaktoren, Polylysin und zytosolische Rattenleberproteine.
Die MDA induzierte Anregung der Acetaldehydbindungen an BSA zeigte als Begleiteffekt die Bildung von hochfluoreszierenden Produkten (3A). Obwohl vorangegangene Studien gezeigt haben, dass Reaktionsgemische aus BSA und hohen Konzentrationen von Acetaldehyd (< 3 mM) auch alleine schon fluoreszierende Eigenschaften aufwiesen, war die Fluoreszenz, welche in Anwesenheit von MDA beobachtet wurde hiervon deutlich verschieden. Wie es 3B gezeigt wird, resultiert die Acetaldehydbindung in Anwesenheit von MDA in der Bildung von extrem hochfluoreszierenden Produkten verglichen mit der Fluoreszenz, welche bei gleichwertigen Bindungen von Acetaldehyd alleine beobachtbar ist. Zusätzlich war das Anregungs- und Emissionsmaximum für die zwei Zustände unterschiedlich (3). Wenn BSA mit MDA alleine behandelt wurde zeigte sich auch eine Fluoreszenz, diese war aber über den getesteten MDA Konzentrationsbereich (0 bis 8 mM), um etwa 20 bis 60-fach geringer als diejenigen, welche beobachtet wurde, wenn sowohl Acetaldehyd als auch MDA anwesend waren. Daraus folgt, dass die Anregung der Acetaldehydbindungen an Proteine durch MDA auf der Bildung von bestimmten Produkte, MDA-Acetaldehyd-Addukte (MAA), beruht, welche von den Produkte, die gebildet werden wenn Proteine mit entweder Acetaldehyd oder MDA alleine behandelt werden, verschieden sind.
In nachfolgenden Experimenten wurde ein Immunoassay entwickelt um die Anwesenheit von MAA-Addukten in Leberproben nachzuweisen. Es wurde ein Hasenantikörper gegen das MAA-Addukt erzeugt, indem Tiere mit Hasenplasmaprotein-MAA-Addukten immunisiert wurden und das Antiserum aufgereinigt wurde, um eine affinitätsgereinigte IgG Fraktion, die MAA erkennen kann, zu erhalten. Die Spezifität dieser Antikörper wurde im direkten ELISA gegen modifiziertes und unmodifiziertes BSA getestet. Der Antikörper erkannte nur mit MAA modifiziertes BSA. Der Antikörper zeigte eine Affinität für mit entweder 1 mM oder 0,1 mM der beiden Aldehyde modifiziertes BSA (4). Der Antikörper erkannte kein natürliches (unverändertes) BSA oder BSA, welches mit entweder Acetaldehyd oder MDA alleine modifiziert wurde (4). Die Spezifität für MAA-Addukte wurde weiterhin mit anderen Proteinen getestet (z. B. Hasenplasmaproteine, Mausplasmaproteine, Hämoglobin) und ELISAs zeigen erneut, wie es auch mit BSA der Fall war, dass der affinitätsgereinigte Antikörper speziell MAA Epitope an Proteinen, erkennt.
Dieser affinitätsgereinigte Antikörper wurde dann für die Entwicklung eines kompetitiven ELISAs verwendet, um MAA-Addukte in Leberproben nachzuweisen und zu quantifizieren. Die Eignung dieser Methode wurde mittels BSA, welches zu verschiedenen Ausmaßen durch MAA derivatisiert wurde, getestet. Das Ausmaß der Austausche wurde für jedes modifizierte BSA durch [¹⁴C] Radiomarkierung bestimmt und die Werte der MAA Austausche wurden als nmol gebundenes Acetaldehyd pro mg BSA ausgedrückt. Wenn diese BSA-MAA-Addukte in kompetitiven ELISA getestet wurden, zeigten die Ergebnisse eine geordnete Gruppe von Inhibierungskurven, wobei bei einem Auftrag der prozentualen Inhibierung als Funktion der BSA Konzentration die am höchsten modifizierten BSAs die effizientesten Inhibitoren waren und die am wenigsten substituierten BSAs die am wenigsten effizienten Inhibitoren waren (5A). Auf der anderen Seite schien die Gruppe der Kurven sich zu überlagern, wenn dieselben Inhibierungsdaten als Funktion der MAA Modifizierung (d. h. gebundenes Acetaldehyd) aufgetragen wurden (5B). Diese Ergebnisse deuten an, dass der kompetitive ELISA geeignet ist, das Ausmaß der MAA Modifizierung von Proteinen abzuschätzen, und dass die Zahl der MAA Epitope als der wichtigste Bestimmungsfaktor, welcher eine Hemmung der Antikörperbindung verursacht, erscheint. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, dass unter diesen Bedingungen die Inhibierung durch MAA Epitope bei höher substituierten BSAs effizienter erschien (5B). Als die obrigen Experimente mit zytosolischem Leberprotein, welches mit MAA modifiziert wurde, wiederholt wurden, wurden ähnliche Inhibierungskurven, wie sie mit BSA-MAA erhalten wurden, beobachtet (6). Zusätzlich zeigt natives (unbehandeltes) zytosolisches Leberprotein und zytosolisches Leberprotein, welches mit MDA oder Acetaldehyd alleine behandelt wurde minimale oder keine Inhibierung der Antikörperbindung in dem kompetitiven ELISA. Diese Ergebnisse weisen auf die Eignung des kompetitiven ELISA's zum Nachweis und der Quantifizierung von MAA-Addukten in zytosolischen Leberproteinen hin. Ähnliche Verfahren können verwendet werden, um andere Antikörper zu testen.
Beispiel 3
Des Weiteren wurden Experimente durchgeführt, um den Einsatz des kompetitiven ELISAs bei der Quantifizierung von geringfügig mit MAA modifizierten Proteinen zu verifzieren. Die Daten, welche in 5 und 6 gezeigt werden, deuten die Anzahl der MAA Epitope (d. h. der Acetaldehydbindungen) an, welche in der Assaymischung vorliegen müssen, um in dem kompetitiven ELISA eine ausreichende Hemmung der Antikörperbindung zu bewirken. Begründet durch die Interpretation dieser Daten war die Untersuchung von großen Probengrößen (mg-Bereich) im kompetitiven ELISA für minimal modifizierte Proteine zwingend vorgegeben. Bei diesen Untersuchungen wurden unter Auftrag der prozentualen Hemmung als Funktion der Proteinkonzentration eine Gruppe von Inhibierungskurven erzeugt, die eine zunehmende Inhibierungseffizienz bei zunehmendem Ausmaß der MAA Modifizierung für sowohl BSA-MAA (7A) als auch zytosolische Leberproteine-MAA (8A) zeigten. Wenn jedoch die Inhibierungsdaten als Funktion der Anzahl der MAA Epitope (d. h. Acetaldehydbindungen) aufgetragen wurden, überlagerten sich die Kurven sowohl für BSA-MAA (7B) als auch für zytosolische Leberproteine-MAA (8B). Diese Ergebnisse bekräftigen die Eignung des kompetitiven ELISA's für den Nachweis und die Quantifizierung von MAA Epitopen in zytosolischen Leberproteinen.
Die Ergebnisse des kompetitiven ELISA's für Leberzytosol von zwei Ratten, die über 5 Wochen mit Ethanol gefüttert wurden und das entsprechend gefütterte Kontrollpaar sind in 9 gezeigt. MAA-Addukte wurden in den mit Ethanol gefütterten Ratten leicht nachgewiesen wie es sich aus den Inhibierungskurven für das Leberzytosol, welches von diesen zwei mit Ethanol gefütterten Ratten gewonnen wurde, zeigt. Das Zytosol der Kontrollleber schien nur leichte unspezifische Hemmung zu zeigen (9A). Wenn diese Werte der Hemmung von den entsprechenden Werten der mit Ethanol gefütterten Ratten abgezogen wurden, konnten Inhibierungskurven erzeugt werden, welche eine Abschätzung der Menge der MAA Modifikationen der zytosolischen Leberproteine der Ethanol gefütterten Tiere darstellt (9B). Kompetitiver ELISA Assays wurden dann mit zytosolischen Leberproteinen von sieben mit Ethanol gefütterten Ratten und den entsprechend gefütterten Kontrollen durchgeführt. Wenn Inhibierungskurven, die mit Leberzytosol, welches in vitro mit bekannten Werten der MAA Substituierung (8B) modifiziert wurden, als Standardkurven eingesetzt wurden, konnten die zytosolischen Leberproteine der mit Ethanol gefütterten Ratten auf einen MAA-Adduktgehalt im Bereich von 75 ± 14 pmol des gebundenen Acetaldehyds pro mg Protein eingeschätzt werden.
Beispiel 4
Anders als Standardadjuvantien ist MAA ein spezifischer Immunverstärkungsfaktor. Um diese Eigenschaft des MAA's darzustellen, führten die Anmelder eine Reihe von Studien bezüglich der Immunogenität im autologen und heterologen Systemen durch.
Antikörperantworten in autologen und heterologen Systemen
100 μg der normalen Plasmaproteine, welche mit MAA modifiziert wurden, wurde wöchentlich über einen Zeitraum von 3 Wochen in autologe Tiere injiziert. Als Ergebnis wurden hohe Antikörpertiter ausschließlich gegen MAA (Hapten), nicht jedoch gegen das normale Protein erzeugt. Daher verursachte MAA keine Autoimmunkrankheit in den Tieren im Gegensatz zu den Wirkungen von vielen Haptenkonjugaten. Dieses Experiment wurde unter der Verwendung von Hasen-, Ratten- und Mäuseplasmaproteinen durchgeführt.
Auf ähnliche Art und Weise wurde auch mit MAA modifiziertes, bovines Serumalbumin (BSA) ohne Adjuvans zu 100 μg/Maus in Mäuse injiziert. Es ergaben sich hohe Antikörpertiter sowohl gegen BSA als auch MAA. Weiterhin wurde auch BSA zu 100 μg/Maus (kein Adjuvans) in Mäuse injiziert und es zeigte sich keine Antikörperantwort gegen BSA oder MAA. Die Ergebnisse ergaben sich aus Antikörperlitern, welche im ELISA oder Westernblot zusätzlich analysiert wurden.
T-Helferzellantworten in autologen und heterologen Systemen
Zunächst wurde über einen Zeitraum von 3 Wochen, wöchentlich 100 μg normales Plasmaprotein in autologe Tiere injiziert, wodurch sich keine T-Zellantwort ergab. Anschließend wurde über einen Zeitraum von 3 Wochen, wöchentlich 100 μg normales Plasmaprotein, welches mit MAA modifiziert wurde, in autologe Tiere injiziert, wodurch sich ebenfalls keine T-Zellantwort gegen MAA (das Hapten) ergab. Es zeigte sich jedoch eine T-Helferzellantwort gegen das normale Plasmaprotein (den Träger).
In derselben Art und Weise wie oben dargestellt, wurde im heterologen System BSA ohne Adjuvans in Tiere injiziert. Es ergab sich keine T-Helferzellantwort gegen BSA. Wenn BSA, welches mit MAA modifiziert war, in Mäuse injiziert wurde, zeigte sich eine T-Helferzellantwort gegen BSA (den Träger) jedoch nicht gegen MAA (Hapten). Diese Daten wurden in einem T-Helferzell Proliferationstest generiert und durch die Verwendung einer Vielzahl von Trägerproteinen überprüft. Die Experimente wurden unter der Verwendung von menschlichem Hämoglobin und Transferrin wiederholt, welche ähnliche Daten generierten.
Immunologische Untersuchungen

Bis zu diesem Zeitpunkt wurden alle Immunisierungen durch wöchentliche Injektionen über ein 3-wöchiges Intervall ausgeführt. Den Tieren wurde dann Blut entnommen und vor jeder Immunisierung getestet. Der Grund dieser Experimente war es herauszufinden, welche Dosis und wieviele Immunisierungen nötig sind, um Antikörper oder T-Helferzellantworten zu erhalten. Die ersten Studien welche Transferrin einsetzten, ergaben die folgenden Ergebnisse:

MAA Adduktbildung	Antikörper Titer
100 μg eines humanen Transferrin-MAA-Adduktes	62,500
50 μg eines humanen Transferrin-MAA-Adduktes	62,500
10 μg eines humanen Transferrin-MAA-Adduktes	2,500
Keine MAA Adduktbildung
100 μg eines humanen Transferrin	2,500
10 μg eines humanen Transferrin	< 100

Weitere Immunisierungsstudien
Die nachfolgenden Immunisierungsstudien zeigen weiterhin, dass MAA kein generelles Adjuvans oder Mitogen ist, sondern spezifisch das konjugierte Protein immunogen macht.
Der Anmelder verwendete zuerst 100 μg einer Mischung aus vier Proteinen (je 25 μg von menschlichem Albumin, Hasenalbumin, Rattenalbumin und bovinem Albumin) und immunisierte damit Mäuse einmal die Woche über einen Zeitraum von drei Wochen. Am Ende der vierten Woche wurde den Mäusen Blut entnommen und das Serum auf Antikörper gegen diese Proteine getestet, sowie gegen zwei Proteine, die nicht im Immunisierungsprotokoll eingeschlossen waren. Es wurden zwei getrennte Experimente durchgeführt: a) das bovine Albumin war mit MAA modifiziert, b) keines der Proteine war mit MAA modifiziert.

a) In den Untersuchungen bei denen die Tiere mit einer Mischung aus Albuminen, von denen BSA mit MAA modifiziert war, immunisiert wurden:
b) Die Tiere wurden mit einer Mischung aus Albuminen, wobei BSA nicht modifiziert war, immunisiert:

Die Daten zeigen, dass MAA bewirkt, dass BSA von antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen wird und es zur Produktion einer spezifischen Antikörperantwort kommt. Wenn MAA ein polyklonaler Aktivator wäre, dann würden sich eine große Anzahl von Antikörpern gegen Ratte, Hase und menschliche Proteine nachweisen lassen, dies wurde jedoch nicht beobachtet. Es wurden einige Kreuzreaktionen zu Hasenalbumin gezeigt, welche von einem gemeinsamen Epitop kommen könnten. Es laufen gerade Untersuchungen, um zu belegen, ob dies zutrifft.
Die Daten über die Art der Antikörperantwort sind sehr schlüssig, dass vorrangig eine IgG1 Antwort gegen das MAA-Addukt hervorgerufen wurde. Diese Daten sind auch konsistent mit der Beobachtung, dass es zu einer starken T-Helferzellantwort kam, wenn MAA-Protein-Addukte verwendet wurden. Es ist gut bekannt, dass IgM und IgG3 in Mäusen die vorrangigen Antworten darstellen, wenn bei der Bildung von IgG1 und IgG2a keine T-Zellhilfe durch T-Helferzellen beobachtet wird. In dem oben dargestellten Experiment a) sind die Antikörper gegen BSA vom Typ IgG1, IgG2a und IgG2b. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Transferrin und Hämoglobin erhalten.
Das Ziel der mit MAA modifizierten Proteine scheinen die peritonealen Makrophagen zu sein. Dies wurde vorgeschlagen, da die Daten zeigen, dass der f-Alb Scavenger Rezeptor auf Leberendothelzellen eifrig Proteine, die mit MAA modifiziert sind, bindet. Der einzige andere Platz an dem diesen Rezeptor nachgewiesen ist, sind peritoneale Makrophagen und alle Immunisierungen mit Mäusen wurden durch Verabreichung von intraperitonealen Injektionen durchgeführt.
Modifizierungen von Proteinen mit MAA scheinen die Zeitspanne für die Produktion von Antikörpern zu verkürzen. Tiere wurden eine Woche nach einer Immunisierung mit 100 μg BSA-MAA Blut abgenommen und das Serum auf unmodifizierte und modifizierte Proteine getestet. Innerhalb einer Woche produzierten die Mäuse Antikörper gegen BSA, wobei es sich um IgG1 Isotypen handelte und es nachfolgend zu keinem Anstieg der IgM Antikörperproduktion kam.
Aus den obigen Experimenten folgt, dass die Erzeugung von B-Zellen für monoklonale Antikörperproduktion erheblich beschleunigt werden könnte. Normalerweise brauchen Tiere 3 Immunisierungen in Freund's oder RIBI Adjuvans über einen Zeitraum von 6 Wochen, um eine ausreichende IgG Antikörperantwort zu erzeugen. Die vorliegenden Studien zeigen, dass dieser Zeitrahmen verkürzt werden kann und gleichzeitig eine hohe Spezifität und Abnahme der polyklonalen Aktivierung erreicht werden kann.
Eine Anwendung der vorliegenden Erfindung ist ein billigeres und effizienteres Vakzin, welche die Notwendigkeit von wiederholten Boostern hinfällig macht.
Bezugnehmend auf die Techniken mit markierten Antikörpern, kann MAA verwendet werden, um in Verfahren mit markierten Antikörpern die Antigen-Antikörper Interaktion durch Markieren der Antigene oder Antikörper zu visualisieren. Das MAA-Addukt am Antigen oder Antikörper verändert dessen Aktivität weder direkt noch indirekt. Die 3a und b stellen die Fluoreszenzintensität von Reaktionsgemischen aus BSA mit Acetaldehyd und MDA dar.
3a bildet die relative Fluoreszenz über einen Zeitraum von 8 Stunden mit Acetaldehyd (1 mM) und BSA (1 mg/ml) sowie verschiedenen Konzentrationen von MDA (0 bis 8.0 mM) bei 37°C ab. Die Ergebnisse stellen den Durchschnitt + Standardfehler aus fünf Experimenten dar.
3b ist ein Diagramm, welches das Verhältnis der Acetaldehydbindung und Fluoreszenz in Abwesenheit (Viereck) und Anwesenheit (Kreis) von MDA darstellt. Reaktionsgemische mit MDA zeigen ein Absorptionsmaximum von 460 nm und ein Anregungs- und Emissionsmaximum von 357 nm bzw. 440 nm in Abwesenheit von MDA.
Bezogen auf Antikörper für einen FACScan kann MAA als universeller Marker verwendet werden, um die Visualisierung von Protein-Protein Interaktionen zu verstärken und die Aufreinigung von biologischen Materialien zu überwachen.
Wegen ihrer fluoreszierenden Eigenschaften können MAA und Anti-MAA spezifische monoklonale Antikörper als fluoreszierende Antikörper im FACScan, immunhistochemischen Methoden usw. verwendet werden. Weiterhin können sie für die Evaluierung von komplexen Mischungen bei ,high performance' Trennungsverfahren eingesetzt werden. Ein Vorteil gegenüber früheren Antikörpern ist eine geringe Kreuzreaktivität von MAA.
Beispiel 5
Kürzlich wurde gezeigt, dass die gleichzeitige Inkubation von Protein mit MDA und AA die Menge der Addukte synergistisch erhöht und in der Produktion eines neuen Epitopes (MAA) resultiert. Es wurde gezeigt, dass dieses Epitop ohne die Verwendung von Adjuvantien immunogen ist und unter Bedingungen hergestellt werden kann, die nahe an die physiologische Schwellen (1 mM) von AA und MDA heranreichen. Der Zweck dieser Untersuchungen war es heraus zu finden, wie Modifizierungen mit MAA-Addukten am löslichen Trägerprotein die humorale Immunantwort verändern. Balb/c Mäuse wurden wöchentlich mit 100 μg unmodifiziertem (BSA) oder mit MAA modifiziertem bovinem Serumalbumin (BSA-MAA) als i. p. Injektion immunisiert. Antiserumtitrationen wurden durch ELISA in entweder mit BSA, BSA-MAA, Mausserumalbumin (MSA) und MSA-MAA beschichteten Löchern durchgeführt. In weiteren Experimenten zur Bestimmung der nötigen Proteinmenge, um eine derartige Immunantwort zu induzieren, wurden 12 Gruppen von Mäusen (5/Gruppe) mit einer der nachfolgenden 6 Dosen BSA oder BSA-MAA immunisiert: 100 μg, 50 μg, 25 μg, 10 μg, 5 μg und 1 μg. Die Ergebnisse zeigten, dass in Mäusen, welche mit 100 μg BSA-MAA immunisiert wurden, die Serumantikörpertiter gegen BSA sowie BSA-MAA nach 3 Wochen ihre Maxima erreichten (> 1 : 3200). Weitere Tests bezüglich MSA und MSA-AA zeigten signifikante Antikörpertiter gegen das MAA-Addukt, jedoch keine Antwort auf das autologe Protein. In Mäusen, die mit niedrigeren Konzentrationen des BSA-MAA immunisiert wurden, nahmen die Antikörpertiter in einer dosisabhängigen Art und Weise sowohl für BSA wie auch für BSA-MAA ab (> 1 : 3200 bei 100 μg bis 1 : 2000 bei 25 μg). Überraschenderweise erkannte das Antiserum von Mäusen, welche mit 25 μg BSA-MAA immunisiert wurden, Epitope der BSA Polypeptidkette und nicht des MAA-Addukts selbst. Das BSA ohne MAA-Addukt löste eine schwache Antikörperreaktion nur gegen BSA und auch nur bei hohen Dosen (> 50 μg) aus. Diese Daten deuten daher an, dass das Addukt eines Proteins mit MAA dessen Immunogenität verstärkt und deuten weiterhin an, dass MAA-Addukte das Targeting, Prozessieren und/oder Präsentieren eines Trägerproteins an das humorale Immunsystem stimulieren.
Beispiel 6
Proteine (zu 2 mg/ml) wurden mit 1 mM AA und/oder 1 mM MDA für 3 Tage bei 37°C inkubiert. Hasen wurden subkutan mit einem MAA modifizierten Hasenplasmaprotein (RbPP) in Freund's Adjuvans immunisiert. Mäuse wurden intraperitoneal mit einem MAA modifizieren Mausplasmaprotein (MsPP) in Freund's Adjuvans immunisiert. Polyklonales Hasenserum wurde an MAA-Addukten unter Verwendung von Lysinsepharose 4B Kügelchen, welche mit 1 mM MDA und 1 mM AA für 16 Stunden bei 37°C modifiziert wurden, affinitätsgereinigt. Die Antikörper wurden unter Verwendung von Standard Affinitäts-Chromatographiemethoden gereinigt. Milzzellen von Mäusen, die mit MsPP-MAA immunisiert wurden, wurden mit Myelomas entsprechend etablierter Methoden fusioniert, um Hybidome zu produzieren, die MAA spezifische monoklonale Antikörper sezernieren und wurden unter Verwendung von Protein G gereinigt. Um die Spezifität zu bestimmen, wurde das Antiserum und die gereinigten Antikörper gegen RbPP, MsPP und BSA, welches unmodifiziert, AA, MDA oder MAA modifiziert war, titriert. Die Antiseren von Hasen und Mäusen hatten Antikörpertiter von 1 : 12800 und entsprechend 1 : 6400 gegen das MAA-Addukt, jedoch keine Titer gegen das genetisch identische Trägerprotein. Beide Antisera zeigten geringe Reaktivität zu AA- und MDA-modifizierten Proteinen (1 : 200 oder weniger). Die Affinitätsreinigung der Hasenantikörper und die Produktion von monoklonalen Mausantikörpern führte zu hochtitrigen Antikörpern, die spezifisch nur das MAA-Addukt erkannten und in der Lage waren MAA an einer Vielzahl von verschiedenen Proteinen nachzuweisen. Kürzlich konnten die Anmelder unter Verwendung eines kompetitiven Inhibierungs-ELISA zeigen, dass MAA-Protein-Addukte in der Leber von regelmäßig mit Ethanol gefütterten Ratten anwesend ist. Aus diesem Grund könnte sich die Verwendung dieser Antikörper als hilfreich für die Bestimmung der physiologischen Relevanz von MAA assoziierten Proteinen bei der Entwicklung und/oder den Fortschritt von ALD erweisen.
Beispiel 7
Es wurde ein immunologisches Testsystem unter Verwendung eines affinitätsgereinigten polyklonalen, für MAA-Addukte spezifischen Antikörpers eingesetzt, um die Anwesenheit solcher Addukte in der Leber von mit Ethanol gefütterten Ratten nachzuweisen. Da die MAA-Addukte wahrscheinlich aus mehr als einem bestimmten Produkt bestehen, haben die Anmelder vorgeschlagen, dass das 4-Methyl-1,3-Dihydropyridin-3,5-Dicarbaldehyd (MDDC), welches an der α-Aminogruppe des Lysins derivatisiert ist, die Struktur eines der vorrangigen MAA-Protein-Addukte repräsentiert. Es war der Zweck dieser Untersuchung die antigenbindenden Eigenschaften der MAA spezifischen Antikörper zu charakterisieren und zu bestimmen, ob MDDC Epitope die Hauptdeterminante der Antikörpererkennung sind. Ein kompetitiver ELISA, welcher bovines Serumalbumin-MAA als Festphasenantigen verwendet, wurde zur Bestimmung der Bindungsspezifität der Antikörper eingesetzt. 1-Hexyl-MDDC war in diesem Test der effizienteste Inhibitor der Antikörperbindung, mit einer 50 prozentigen Hemmkonzentration von 4 pmol/Loch, wobei 1-Hexyl-MDDC eine MDDC Gruppe Anlagerung an einen Lysylrest des Proteins stimuliert. Analoga von 1-Methyl und 1-Hydrogen MDDC erhöhten die 50 prozentige Hemmkonzentration auf 14 bzw. 240 pmol/Loch. Noch größeren Effekt zeigte die Substituierung an der vierten Position des MDDC. Der Austausch des 4-Methyl durch eine 4-Hexyl oder 4-Zyklohexylgruppe führte zu einer 3800 bzw. 20000 fachen Erhöhung der 50 prozentigen Hemmkonzentration. Endogene Lebersubstanzen mit 1-Hexyl- MDDC ähnlichen Strukturen, wie NADH und Pyridoxal, wiesen eine vernachlässigbare Hemmung der Antikörperbindung auf. Als 8 verschiedene MAA-Protein-Addukte in einem kompetitive ELISA getestet wurden und die aufgefundene Hemmung als Funktion der Zahl der Lysyl-MDDC Reste pro Protein ausgedrückt wurde, reichte die 50 prozentige Hemmkonzentration dieser verschiedenen MAA-Protein-Addukte von 1 bis 31 pmol des Lysyl-MDDC Äquivalentes/Loch. Der Verdau dieser Proteine mit Pronase verkleinerte den Bereich der beobachteten 50 prozentigen Hemmkonzentration (6 bis 15 pmol/Loch) deutlich, was bedeutete, dass Proteinhydrolyse die Zugänglichkeit des Antikörpers, um die Epitope der verschiedenen Proteine zu binden, ausgleicht. Diese Ergebnisse deuten an, dass die MAA-Addukt-spezifischen Antikörper vorrangig den 1-Lysyl-MDDC Rest an Proteinen erkennen, und dass sie effizient eingesetzt werden können, um MAA-Protein-Addukte nachzuweisen und zu quantifizieren.
Beispiel 8 Antikörper titriert gegen
Die obigen Ergebnisse zeigen, dass Freund's Adjuvans während es die Antikörperaktivität auf die verschiedenen Proteine erhöht auch hohe Hintergrundantworten gegen BSA und MSA verursacht. Die MAA-Adduktbildung erhöhte nur die Antwort gegen modifiziert Proteine, was einen niedrigen Hintergrund gegen andere Proteine und gleichzeitig erhöhten Antikörperlitern gegen das Trägerprotein (Spezifität) bedeutete.
Dem entsprechend führte die Immunisierung mit löslichem BSA und MSA zu niedrigen Antikörperantworten, während die Immunisierung mit löslichem BSA-MAA eine starke Antikörperantwort gegen BSA und MSA-MAA, sowie einen leichten Anstieg gegen MSA verursachte. Weiterhin entwickelte sich durch die Immunisierung mit löslichem MsPP-MAA eine starke Antikörperantwort nur gegen das mit MAA modifizierte Protein.
Die nachfolgende Untersuchung verglich die Titer von entweder unmarkierten oder mit MAA markierten Hasen-anti-Transfeninantikörpern durch Westernblotanalysen. Markierte und unmarkierte Antikörper wurden wie folgt verdünnt: 1 : 500, 1K, 2K, 4K, 6K, 8K und 16K. Jede Verdünnung wurde auf einem Steifen, der aus einem Blot des präparativen SDS-PAGE Geles des gereinigten Transferrins ausgeschnitten wurde, inkubiert. Die Transferrin-Antigenbande enthielt ungefähr 2 μg Protein. Die Anti-Transferrinaktivität wurde mittels einer indirekten Methode unter Verwendung von alkalischer Phosphatase, gekoppelt an Ziegen-Anti-Hasen IgG's, nachgewiesen.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Hasen-Anti-Transferrinantikörper ausreichend mit MAA markiert waren, wie durch eine Fluoreszenz-Antikörperfärbung auf dem Blotstreifen bewiesen wurde. Es wurde außerdem kein Unterschied in den Antikörperlitern zwischen den MAA markierten und unmarkierten Antikörpern durch den Ziegen-Anti-Transferrinantikörper nachgewiesen. Folglich wurde hieraus geschlossen, dass die Antikörpermarkierung mit MAA-Addukten nicht mit der Fähigkeit an die Antigene zu binden, interferiert.
Auch die Untersuchungen von Ohya unterstützten die Schlussfolgerung, dass MAA-Protein-Addukte eine einzigartige und chemisch unterschiedliche Struktur repräsentieren. Ohya T. "Formation of an new 1,1,1 adduct in the reation of malondialdehyde, n-hydroxylamine and alkanal under neutral conditions." Biol Pharm Bull 1993; 16: 137–141. In seinen Untersuchungen, in welchen er die Reaktion von MDA und Alkanalen mit primären Aminen unter neutralen Bedingungen untersuchte, beobachtete er die Bildung von zwei Hauptprodukten. Diese Produkte wurden als ein 1 : 1 : 1 Addukt und entsprechend ein 2 : 1 : 1 Addukt von MDA, Alkanal und primärem Amin identifiziert. Wenn man diese Ergebnisse extrapoliert, um die Reaktion von MDA und Acetaldehyd mit der α-Aminogruppe des Lysins (oder vielleicht auch eines α-Aminoendes) in Proteinen einzuschließen. Es war gezeigt worden, dass das zyklische 2 : 1 Addukt (10B) hoch fluoreszent ist und die Bildung dieses Addukts zu der Fluoreszenz der MAA-Addukte, welche in den Studien des Anmelders beobachtet wurden, beiträgt. Im Gegensatz zu der Komplexität und Heterogenität, die mit den strukturellen Verknüpfungen der Acetaldehyd-Protein-Addukte und der MDA-Protein-Addukte einhergeht, können für MAA-Addukte definierte chemische Strukturen vorgeschlagen werden.
Ein weiteres Merkmal der Bildung von MAA-Addukten mit Proteinen ist die Herstellung von immundominanten Antigendeterminanten. So konnte ein hochtitriger polyklonaler Antikörper in Hasen gezogen werden, welchen mit Hasenplasmaproteinen, die mit nur 1 mM Acetaldehyd und MDA behandelt wurden, geimpft worden waren. Nach einer Affinitätsaufreinigung an MAA Lysinkügelchen zeigte der Antikörper eine hohe Spezifität für MAA Epitope an Proteinen und reagierte nicht mit Acetaldehyd-behandelten, MDA-behandelten oder Trägerproteinen. Der Antikörper erkannte MAA Epitope auf einer Vielzahl von Trägerproteinen, die entweder mit hohen oder niedrigen Konzentrationen von Aldehyden modifiziert wurden. Dieser spezifische Antikörper wurde dann verwendet, um ein immunochemisches Testsystem für den Nachweis und die Quantifizierung von MAA-Addukten in biologischen Proben zu entwickeln.
Ein sensitiver ELISA wurde entwickelt, um das Ausmaß der MAA Modifikation von Leberproteinen während der andauernden Verabreichung von Alkohol an Ratten zu bestimmen. Das Testsystem hatte eine hohe Spezifität für MAA Derivate von Proteinen und das Ausmaß der MAA Modifikation war der wichtigste Faktor beim Bestimmen der Effizienz der Hemmung der Antikörperbindung in diesem System. Diese Faktoren deuten die Eignung dieses Testsystems nicht nur für den Nachweis von MAA-Addukten, sondern auch deren Quantifizierung an. Wenn zytosolische Leberproteine, welche zuvor in vitro mit niedrigen Spiegeln von MAA Konjugaten modifiziert und getestet wurden, zeigte es sich, dass das Testsystem effizient die Quantifizierung des Ausmaßes der MAA Modifikationen im pmolaren Bereich ermöglichte (8). Die Quantifizierung der MAA wurde auf pmol des gebundenen [¹⁴C] Acetaldehyds bezogen, da es den Anschein hatte, basierend auf der vorgeschlagenen Struktur der MAA-Addukte (10), dass pro 1 Mol Acetaldehyd ein Mol MAA-Derivat kommt.
Die MAA modifizierten Proteine aus dem Leberzytosol von Ratten, die mit Ethanol gefüttert waren, wurden mit dem kompetitiven ELISA leicht nachweisbar; wohingegen geringe oder keine Immunoreaktivität auf MAA-Addukte bei zytosolischen Proteinen von Kontrolltieren beobachtet wurde (9). Die Quantifizierung der Hemmkurven des kompetitiven ELISA deutete an, dass der geschätzte Wert der MAA Modifikationen bei etwa 75 pmol MAA pro mg zytosolischem Leberprotein der mit Ethanol gefütterten Tiere liegt. Demgemäß tritt eine signifikante Bildung von MAA-Addukten an zytosolische Leberproteine während einer chronischen Verabreichung von Ethanol an Ratten auf.
Zahlreiche Untersuchungen in der Literatur haben immunochemische Techniken angewandt, um das Vorliegen einer Vielzahl von Protein-Addukten in der Leber von mit Ethanol behandelten Tieren nachzuweisen. Diese würden auch Acetaldehydaddukte, MDA-Addukte und erst kürzlich Hydroxyethyl-radikalderivatisierte Addukte mit einschließen. Es fehlen jedoch strukturelle Informationen und Epitopcharakterisierungen dieser Addukte und auch quantitative Daten wurden nicht berichtet. Im Gegensatz hierzu stellt der Anmelder eine quantitative Abschätzung der MAA-Adduktbildung bereit und schlägt Strukturen für die MAA-Addukte vor. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, dass MDA und Acetaldehyd in synergistischer Art und Weise miteinander reagieren, wodurch die MAA-Adduktbildung gegenüber den aus Acetaldehyd des MDA's alleine gebildeten Addukten bevorzugt werden und MAA-Addukte die Hauptgruppe der Addukte, welche in der Leber während des Alkoholstoffwechsels gebildet werden, darstellen. Da sowohl die kovalente Bindung von Acetaldehyden an Proteinen als auch ein Anstieg der Lipidperoxidation als mögliche Mediatoren von alkoholbedingten Leberschäden vorgeschlagen wurden, stellt die Bildung von MAA-Protein-Addukten ein von beiden Mechanismen abhängiges Ereignis dar und kann daher als allgemeiner oder verbindender Vorgang (d. h. die MAA-Adduktbildung) verstanden werden, durch den die beiden Mechanismen zur alkohlabhängigen Hepatotoxizität beitragen.
Die vorangegangene Beschreibung legt dar, dass MAA-Addukte als Immunverstärkungsfaktoren geeignet sind. Die Beschreibung stellt weiterhin Methoden zur Verwendung der neuen Addukte als allgemeine Fluoreszenzmarker in immunologischen Techniken, sowie Methoden zur Verwendung der Addukte als allgemeine Marker zur Visualisierung von Proteininteraktionen und zur Überwachung der Aufreinigung von biologischen Materialien bereit.

Claims

Verfahren zum Herstellen eines Immunverbesserungsfaktors mit den Schritten: – in Kontakt bringen eines Antigens mit einem Malondialdehyd und Acetaldehyd – unter neutralen Bedingungen – so daß ein Antigen-Malondialdehyd-Acetaldehyd-Addukt (Antigen-MAA), gekennzeichnet durch den Nachstehenden, ausgebildet wird:
wobei X das Antigen ist, und eine Aminogruppe enthält; R aus der aus der unteren C1 bis C6 Alkylgruppe, Benzyl, Aryl und Wasserstoff bestehenden Gruppe ausgewählt wird; und wobei das Antigen aus der aus einem Kohlehydrat, einem DNA-Molekül, einem Protein, einem Peptid und einem Lipid bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei R Methyl ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Antigen tierischen Ursprungs ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Antigen ein Allergen ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Antigen menschlichen Ursprungs ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Antigen aus der aus bovinem Serumalbumin, menschlichem Interferon, Hämoglobin und humanem Serumalbumin bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
Verwendung des durch das Verfahren von Anspruch 1 bis 6 erzielbaren Antigen-MAA für die Herstellung eines Vakzins zum Erzeugen einer Immunantwort in einem Lebewesen, einschließlich des Menschen.
Vakzin mit einem gemäß dem Verfahren 1 bis 6 erzielbaren Antigen-MAA.
Vakzin nach Anspruch 8, welches für die Erzeugung einer Immunantwort, insbesondere die Induktion von Antikörpern und T-Zellenantworten nützlich ist.