DE69615684T2

DE69615684T2 - Rekombinante temperaturempfindliche influenza-virus mutanten

Info

Publication number: DE69615684T2
Application number: DE69615684T
Authority: DE
Inventors: L. Coelingh; T. Parkin
Original assignee: AVIRON MOUNTAIN VIEW
Current assignee: AVIRON MOUNTAIN VIEW
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 2002-07-11
Anticipated expiration: 2016-06-04
Also published as: US5690937A; EP0835132A1; AU5970696A; AU701020B2; JP3545418B2; KR19990022335A; CA2423891A1; CA2223579A1; EP0835132A4; CA2223579C; EP0835132B1; DE69615684D1; WO1996039179A1; JPH11507510A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft immunogene Influenzavirus-Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung solcher Zusammensetzungen. Insbesondere betrifft die Erfindung immunogene Influenzavirus-Zusammensetzungen mit einzelnen, spezifisch herbeigeführten Mutationen in der PB2-Polymerase-RNA-Sequenz von Influenza.

Hintergrund der Erfindung

Influenza ist ein umhülltes einstrangiges RNA-Virus mit negativem Sense, das auf der ganzen Welt schwere Atemerkrankungen hervorruft. Es ist der einzige Vertreter der Orthomyxoviridae-Familie, der in drei Typen unterteilt ist (A, B und C).
Influenza-Virionen bestehen aus einem innenliegenden Ribonukleoprotein-Kern, der das einstrangige RNA-Genom enthält, und einer Lipoprotein-Außenhülle, die im Inneren mit einem Matrix-Protein (nachstehend als "M1" bezeichnet) ausgekleidet ist. Das segmentierte Genom von Influenza A besteht aus acht Molekülen linearer einstraniger RNA-Sequenzen negativer Polarität, die für zehn Polypeptide kodieren. Segment 1 besitzt eine Länge von 2.341 Nukleotiden und kodiert für PB2, ein 759-Aminosäuren-Polypeptid, das eines der drei Proteine ist, die den RNA-abhängigen RNA-Polymerase-Kompfex umfassen. Für die übrigen zwei Polymerase-Proteine - BP1, ein 757-Aminosäuren-Polypeptid, und PA, ein 716-Aminosäuren-Polypeptid - kodiert eine 2.341-Nukleotide-Sequenz bzw. eine 2.233-Nukleotide-Sequenz (Segmente 2 bzw. 3). Segment 4 des Genoms besteht aus einer 1.778-Nukleotide-Sequenz, die für ein 566-Aminosäuren-Hämagglutin- (HA-) Oberflächen-Glykoprotein kodiert, das aus der Lipoprotein-Hülle ragt und die Anlagerung an sowie den Eintritt in die Zellen mediiert. Segment 5 besteht aus 1.565 Nukleotiden, die für ein 498-Aminosäuren-Nukleoprotein- (NP-) Protein kodieren, welches das Nukleocapsid bildet. Segment 6 besteht aus einer 1.413-Nukleotide-Sequenz, die für ein 454-Aminosäuren-Neuraminidase- (NA-) Hüllen-Glykoprotein kodiert. Segment 7 besteht aus einer 1.027-Nukleotide-Sequenz, die für ein 252-Aminosäuren-M1-Protein und ein 96-Aminosäuren-M2-Protein kodiert und aus einer gespleißten Variante der mRNA translatiert wird. Segment 8 besteht aus einer 890-Nukleotide-Sequenz, die für zwei nicht-strukturelle Proteine (NS1 und NS2) kodiert, die aus 230 bzw. 121 Aminosäuren bestehen und deren Funktion nicht ausreichend definiert ist. NS2 wird aus einer gespleißten Variante der NS-RNA translatiert.
Das segmentierte Genom von Influenza B besteht aus acht Molekülen linearer, einstrangiger RNA-Sequenzen negativer Polarität, die für elf Polypeptide kodieren. Segment 2 besitzt eine Länge von 2.396 Nukleotiden und kodiert für BP2, ein 770-Aminosäuren- Polypeptid, das eines der drei RNA-abhängigen RNA-Polymerase-Proteine ist. Für die übrigen zwei Influenza B-Polymerase-Proteine - PB1, ein 752-Aminosäuren-Polypeptid, und PA, ein 725-Aminosäuren-Poylpeptid - kodiert eine 2.386-Nukleotide-Sequenz bzw. eine 2.304-Nukleotide-Sequenz (Segmente 1 bzw. 3). Segment 4 des Genoms besteht aus einer 1.882-Nukleotide-Sequenz, die für ein 584-Aminosäuren-HA-Oberflächen-Glykoprotein kodiert, das aus der Lipoprotein-Hülle ragt und die Anlagerung an Zellen und Membranfusion mediiert. Segment 5 besteht aus 1.839 bis 1.841 Nukleotiden, die für ein 560-Aminosäuren-NP-Protein kodieren, welches das Nukleocapsid bildet. Segment 6 besteht aus einer 1.454-Nukleotide-Sequenz, die für ein 466-Aminosäuren-NA-Hüllen-Glykoprotein und ein 100-Aminosäuren-NB-Protein, ein nicht-strukturelles Portein, dessen Funktion unbekannt ist, kodiert. Segment 7 besteht aus einer 1.191- Nukleotide-Sequenz, die für ein 248-Aminosäuren-M1-Protein und ein 195-Aminosäuren-BM2-Protein kodiert, das aus einem eigenen Leserahmen translatiert wird. Segment 8 besteht aus einer 1.096-Nukleotide-Sequenz, die für die nicht-strukturellen Proteine NS1 und NS2 kodiert, die aus 281 bzw. 122 Aminosäuren bestehen und deren Funktionen nicht ausreichend definiert sind. NS2 wird aus einer gespleißten Variante der NS- RNA translatiert.
Das segmentierte Genom von Influenza C besteht aus sieben Molekülen linearer, einstrangiger RNA-Sequenzen negativer Polarität, die für acht Polypeptide kodieren. Segment 1 weist eine Länge von 2.365 Nukleotiden auf und kodiert für PB2, ein 774-Aminosäuren-Polypeptid, das eines der drei RNA-abhängigen RNA-Polymerase-Proteine ist. Für die übrigen zwei Polymerase-Proteine - PB1, ein 754-Aminosäuren-Polypeptid, und PA, ein 709-Aminosäuren-Polypeptid - kodiert eine 2.363-Nukleotide-Sequenz bzw. eine 2.183-Nukleotide-Sequenz (Segmente 2 bzw. 3). Segment 4 des Genoms besteht aus einer 2.074-Nukleotide-Sequenz, die für ein 655-Aminosäuren-Hämagglutinin-Esterase-Oberflächen-Glykoprotein kodiert, das aus der Lipoprotein-Hülle ragt und die Anlagerung an Zellen und die Fusion mediiert sowie Rezeptor-zerstörende Aktivität aufweist. Segment 5 besteht aus einer 1.809-Nukleotide-Sequenz, die für ein 565-Aminosäuren- NP-Protein kodiert, welches das Nukleocapsid bildet. Segment 6 besteht aus einer 1.180-Nukleotide-Sequenz, die für ein 374-Aminosäuren-Matrix- (M-) Protein kodiert. Segment 7 besteht aus einer 934-Nukleotide-Sequenz, die für ein 286-Aminosäuren- NS1-Protein und ein 122-Aminosäuren-NS2-Protein kodiert und aus einer gespleißten Variante der NS-RNA translatiert wird.
Um eine Zelle zu infizieren, adsorbiert Influenza-HA-Protein an Sialyl-Oligosaccharid- Moleküle in Zellmembran-Glykoproteinen und -Glykolipiden. Nach Endozytose des Virions erfolgt eine Konformationsänderung im HA-Molekül innerhalb des zellulären Endosoms, das die Membranfusion erleichtert und das Abstreifen der Hülle auslöst. Das Nukleocapsid wandert zum Kern, wo virale mRNA als das wesentliche Anfangsereignis der Infektion transkribiert wird. Die Transkription und Replikation von Influenza-RNA finden im Kern infizierter Zellen statt, und die Assemblierung zu Virionen erfolgt durch Knospung aus oder durch die Plasmamembran. Die Viren können Gene im Fall von Mischinfektionen neu ordnen.
Die Replikation von Influenzavirus-RNAs hängt von vier viralen Genprodukten ab: PB1, PB2, PA und NP. Die drei Polymerase-Proteine PB1, PB2 und PA bilden einen trimolekularen Komplex in den Kernen infizierter Zellen. Jedes Protein besitzt sein eigenes Kern-Lokalisationssignal. Siehe Akkina, J. Virol. 61, 2217-24 (1987); Mukaigawa, J. Virol. 65, 245-253 (1991); und Nieto, J. Gen. Virol. 75, 29-36 (1994). Einige spezifische Funktionen wurden den einzelnen Polypeptiden zugeschrieben. PB1 scheint vor allem am enzymatischen Polymerisationsprozess, d.h. am Verlängerungsschritt, beteiligt zu sein. Es teilt sich Regionen mit Aminosäure-Homologie mit anderen RNA-abhängigen RNA-Polymerase-Proteinen. Die genaue Funktion von PA ist unbekannt. Das PB2-Protein bindet sich an die auf Wirtzellen-mRNAs vorhandene 5'-terminale Kappenstruktur; die mRNAs werden dann gespalten und produzieren ein verkapptes 9- bis 15-Mer-Oligoribonukleotid, das als Primer für die Transkription von Influenza-mRNAs dient. Die PB2-Aminosäuresequenz enthält eine Region beschränkter Homologie mit dem zellulären Kappen-bindenden Protein eIF-4E. Siehe de la Lung, Virus Res. 13, 143-56 (1989). PB2 ist zwar für die Replikation viraler RNA nicht absolut erforderlich, mRNAs, die aus viralem Templat in nur PB1, PA und NP exprimierenden Zellen transkribiert werden, sind jedoch nicht verkappt und können daher nicht translatiert werden. Siehe Nakagawa, J. Virol. 69, 728-33 (1995). Transkripte terminieren an Stellen, die 15-22 Basen von den Enden ihrer Template entfernt sind, wobei Oligo(U)-Sequenzen als Signale für die Templat-unabhängige Addition von Poly(A)-Abschnitten dienen. In einem späteren Infektionsstadium dienen die Polymerase-Proteine PB1, PB2 und PA dazu, neue virale RNA-Genome anstelle von mRNAS zu erzeugen. Der Polymerase-Komplex transkribiert zunächst cRNA, die dann als Templat für die Produktion von zusätzlicher vRNA dient. Die plus-strangigen cRNA-Kopien unterscheiden sich insofern von den plus-strangigen mRNA-Transkripten, als sie keine verkappten und methylierten 5'-Termini aufweisen. Ferner sind sie an den 3'-Termini nicht verkürzt oder polyadenyliert. Somit sind die cRNAs mit ihren negativ-strangigen Templaten co-terminal und enthalten die gesamte genetische Information in jedem genomischen Segment in komplementärer Form.
Die negativ-strangigen Genome (vRNAs) und Antigenome (cRNAs) sind immer mit viralen Nukleocapsid-Proteinen capsiert; die einzige nicht capsierte RNA-Spezies ist somit Virus-mRNA. Im Kern scheint eine Nukleocapsid-Assemblierung zu erfolgen. Das Virus reift heran, indem es aus der apikalen Oberfläche der Zelle mit dem M1-Protein an der Zytoplasma-Seite oder der Innenfläche der knospenden Hülle Knospen bildet. Die HA- und NA-Glykoproteine sind in die Lipidhülle eingebaut. In permissiven Zellen wird HA post-translational gespalten, doch die zwei resultierenden Ketten bleiben über Disulfidbindungen assoziiert.
Bemühungen, immunogene Influenza-Zusammensetzungen zu erzeugen, gehen in zwei Richtungen. Inaktive Vakzinen, die sich im Wirt nicht replizieren können, können entweder chemisch inaktiviertes Vollvirus oder Virenuntereinheit-Proteine sein. Sowohl inaktivierte Viren-Vakzinen als auch Vakzinen der Virusuntereinheit stehen für Influenza zur Verfügung. Diese Vakzinen enthalten die HA- und NA-Oberflächenproteine als Antigene, die nach Verabreichung an den Wirt zu einer Immunreaktion führen. Aus Gründen, die derzeit noch nicht zur Gänze erforscht sind, zeigen Vakzinen der Untereinheit eine Wirksamkeit von nur 60-80% gegen Grippeerkrankungen. Inaktivierte Vollvirus- Vakzinen werden intramuskulär verabreicht und stimulieren vor allem eine systemische Immunreaktion, während lebende abgeschwächte Vakzinen auch lokale mukosale Immunität stimulieren. Die letztere Form der Immunität ist wirksamer, da sie in den oberen Atemwegen wirkt, wo das Virus zuerst angetroffen wird. Inaktivierte Vakzinen besitzen ferner eine typischerweise verringerte Fähigkeit, zytotoxische T-Zellen-Reaktionen zu induzieren, und können manchmal verzögerte Hypersensibilitäts-Reaktionen hervorrufen. Das Guillain-Barre-Syndronn wurde mit der inaktivierten Influenza A-"Schweinegrippe"-Vakzine assoziiert. Siehe Schonberger, Ann. Neurol. 9(supp), 31-38 (1981).
Lebende abgeschwächte Viren können in immunogenen Zusammensetzungen verwendet werden und können typischerweise die erforderliche Schutzreaktion im Wirt induzieren. Lebende abgeschwächte Influenzaviren sind zu begrenzter Replikation im Wirt fähig und stimulieren demnach eine protektive Immunreaktion, jedoch ohne Krankheit zu bewirken. Bislang wurden solche Mutanten durch mehrere Durchgänge durch einen unnatürlichen Wirt, wie z.B. Hühnerembryoneneier, durch mehrmaligen Durchgang durch einen unnatürlichen Wirt kei immer niedrigeren Temperaturen oder durch Zufalls-Mutagenese mittels chemischer Methoden und Auswahl konditioneller Mutanten erzeugt. Diese Methoden können zum Verlust der Pathogenität führen, während die Immunogenität beibehalten wird. Die Identität der gemäß dem obigen Verfahren erzeugten genetischen Mutationen ist a priori unbekannt, wenn das "Masterdonor"-Mutantenvirus als Vakzinenkandidat ausgewählt wird. Wenn solche Mutationen auf eine oder zwei Nukleotid-Veränderungen begrenzt sind, könnte die Virus-Zusammensetzung letzten Endes "revertieren", d.h. im Wirt zurückmutieren und somit ihren ursprünglichen pathogenen Phenotyp wieder erlangen. Eines von diesen Verfahren - der mehrmalige Durchgang bei immer niedrigeren Temperaturen - führte jedoch zu einem Virus (dem "kaltadaptierten" Stamm von A/Ann Arbor/6/60) mit mehreren Mutationen, das genetisch stabil ist. Siehe Murphy, Inf. Dis. In Clin. Practice 2, 174-81 (1993). Bei der Herstellung solcher Vakzinen-Zusammensetzungen werden die HA- und NA-RNA-Sequenzen des abgeschwächte Masterdonor-Virus durch HA- und NA-RNA-Sequenzen aus zirkulierenden Influenzastämmen ersetzt. Solche Viren werden als "reassortante" Viren bezeichnet.
Temperaturempfindliche (ts-) Influenza-Mutanten, die durch chemische Mutagenese erzeugt oder durch Screenen auf spontane Mutanten identifiziert werden, wurden bereits beschrieben. Solche Mutanten können sich in den unteren Atemwegen infizierter Tiere nicht replizieren und replizieren sich oft in den oberen Atemwegen zu einem niedrigeren Niveau als Virus der Wildform. Eine dieser Mutanten, ts1A2, besitzt viele der gewünschten Eigenschaften einer lebenden abgeschwächten Influenza-Vakzine. Siehe Murphy und Chanock, "Genetic Variation Among Influenza Viruses", S. 60-615, D. Nayak (Hrsg.), Academic Press, NY, USA (1981); und Murhphy, Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 288, 401-15 (1980). Der ts1A2-Stamm enthält temperaturempfindliche Läsionen sowohl in PB1 als auch PB2 und weist den gewünschten Abschwächungsgrad auf, ist aber genetisch instabil und kehrt nach der Replikation in einer seronegativen jungen Vakzine wieder in einen virulenten Zustand zurück. Siehe Murphy, Ann. NY Acad. Sci. 354, 172-82 (1980); und Tolpin, Infection and Immunity 36, 645-5O (1982).
Es wurde bereits ein Panel temperaturempfindlicher Mutanten von A/Udorn/307/72 beschrieben, deren ts-Läsionen dem PB2-Gen zugeschrieben wurden. Die Sequenzanalyse führte zur Entdeckung von Mutationen an den Aminosäurepositionen 65, 100, 112, 171, 298, 310, 386, 391 und 556 von PB2. Ebenso stellte sich heraus, dass das PB2- Gen des ts1A2-Virus eine Mutation an Aninosäureposition 658 aufweist. Siehe Lawson, Virology 191, 506-10 (1992). Der kaltadaptierte Stamm von A/AA/6/60 ist auch temperaturempfindlich, und Sequenzanalyse legte nahe, dass eine der Mutationen, die teilweise für den ts-Phenotyp verantwortlich sein kann, eine Asparagin→Serin-Änderung an Aminosäureposition 265 von PB 2 ist. Siehe Cox, Virology 167, 554-67 (1988); Herlocher, Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 6032-36 (1993); und Snyder, J. Virol. 62, 488-95 (1988). Außerdem sind PB2-ts-Mutanten von WSN/33 und A/FPV/Rostock/34 bekannt. Die Mutation in der PB2-Gensequenz, die vermutlich für den ts-Phenotyp verantwortlich ist, wurde im Fall von A/WSN/33 an Aminosäure 417 und im Fall von A/FPV/Rostock/34 an Aminosäure 512 lokalisiert. Siehe McCauley, Virus Res. 18, 191-98 (1990); und Yamanaka, Arch. Virol. 114, 65-73 (1990). Insgesamt weisen diese Studien auf viele potenzielle Stellen im PB2-Protein hin, an denen Mutationen eingeführt wenden können, um ein ts-Virus zu erzeugen.
Ein alternatives Verfahren zur Erzeugung eines lebenden abgeschwächten Virus erfolgt mittels Anwendung der Techniken der "reversen Genetik". Siehe Enami, Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 3802-05 (1990); Enami und Palese, J. Virol. 65, 2711-13 (1991); und Luytjes, Cell 59, 1107-13 (1989). In diesem Prozess werden modifizierte vRNA-ähnliche Transkripte aus cDNA-Konstrukten in Gegenwart von gereinigten NP-, PB1-, PB2- und PA-Proteinen in vitro transkribiert. Das resultierende synthetische RNP wird dann in Zellen transfiziert, die zuvor mit dem Influenza-Virus infiziert wurden - üblicherweise einem Helfervirus, das einen konditionellen Wachstumsdefekt, wie z.B. eine Wirtsbereichs-Restriktion oder Temperaturempfindlichkeit aufweist -, was die anschließende Selektion von Transfektanten-Viren ermöglicht. Beispielsweise wurden Wirtsbereichs-Helferviren erfolgreich dazu verwendet, synthetische NA- und PB2-Gene zu gewinnen. Siehe Enami, s.o., und Subbarao, J. Virol. 67, 7223-28 (1993). Antikörper-Selektion kann auch dazu dienen, Transfektariten im Fall der HA- und NA-Gene zu selektieren. Unter Anwendung von Antikörper-Selektionstechniken wurde das Oberflächen-HA-Glykoprotein-Gen in Influenza A-Virus transfiziert und gewonnen. Siehe Horimoto und Kawaoka, J. Virol. 68, 3120-28 (1994); und Li, J. Virol. 66, 399-404 (1992). Das HA-Gen wurde auch in Influenza B-Virus transfiziert und gewonnen. Siehe Barclay und Palese, J. Virol. 69; 1275-79 (1995). Das M-Gen (siehe Yasuda, J. Virol. 68, 8141-46 (1994)) und das NP-Gen (sich Li, Virus Res., derzeit in Druck) wurde auch unter Anwendung der Techniken reverser Genetik gewonnen.
Angesichts der Möglichkeit der Anwendung reverser Genetik, um spezifische Mutationen in das Influenza-Genom einzuführen, sollte es auch möglich sein, einen ts-Stamm mit Mutationen zu erzeugen, die weniger wahrscheinlich revertieren und somit die gewünschte Eigenschaft genetischer Stabilität aufweisen. Dies kann erfolgen, indem neue Codons eingeführt werden, die mehr als ein Nukleotid innerhalb des Codons erfordern würden, um zur Kodierung für die Aminosäure der Wildform zu mutieren, indem Stellen mutiert werden, die weniger wahrscheinlich exiragenisch supprimiert werden, oder indem mehrere unabhängig wirkende. Mutationen in einem oder mehrere Genen eingeführt werden. Da nur vier der oben beschriebenen Aminosäure-Veränderungen so konstruiert werden können, dass mehr als eine Basenänderung notwendig ist, um zu einem Codon zu revertieren, das für die Aminosäure der Wildform kodiert, wäre die Identifikation zusätzlicher Stellen für die Einführung von ts-Mutanten sehr wünschenswert.
"Clustered charged-to-alanine"-Mutagenese ist ein Verfahren, bei dem geladene Aminosäuren zur ungeladenen Aminosäure Alanin mutiert werden, um die Gesamtstruktur oder Stabilität des Proteins beizubehalten und gleichzeitig seine biologische Verfügbarkeit zu modifizieren. Es wurde dazu eingesetzt, Mutanten des Human-Wachstumshormon-Rezeptorproteins (siehe Bass, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 4498-4502 (1991)), des Saccharomyces cervisiae-Actinproteins (siehe Wertman, Genetics 132, 337-50 (1995)), des Poliovirus-3D-Polymerase-Proteins (siehe Diamond umd Kirkegaard, J. Virol. 68, 863-76 (1994)), des Vaccinia-Virus-G2R-Proteins (siehe Hassett und Condit, Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 4554-59 (1994)) und des Human-Immunschwächevirus-Typ 1-Integrase- Proteins (siehe Wiskerchen, J. Virol. 69, 597-601 (1995)) zu produzieren. In jedem der obigen Fälle war ein "geladener Cluster" als Sequenz von fünf benachbarten Aminosäuren definiert, von denen zumindest zwei geladen sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Anmelder haben festgestellt, dass die Modifikation geclusterter geladener Aminosäurereste im nativen PB2-Influenza-Protein zur konsistenten, vorhersagbaren Eigenschaft der Temperaturempfindlichkeit im Influenza-Virus führt. "Geclusterte geladene Aminosäurereste" sind - wie hierin in Bezug auf Influenza-Virus definiert - eine Sequenz von zumindest fünf im nativen PB2-Protein eines Influenza-Virus aufeinander folgend angeordneten Aminosäuren, bestehend aus vier oder fünf positiv oder negativ geladenen Aminosäuren. Geladene Aminosäuren (positiv oder negativ) sind z.B. Arginin, Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure und Histidin.
Demzufolge bietet die Erfindung in einem Aspekt ein rekombinantes temperaturempfindliches Influenza-Virus, in dem zumindest eine RNA-Sequenz, die für das Influenza- PB2-Protein kodiert, durch das Ersetzen von für eine oder mehrere der geladenen Aminosäuren kodierenden Nukleotiden durch für eine oder mehrere neutrale Aminosäuren kodierende Nukleotide in zumindest einem geladenen Cluster von Aminosäuren modifiziert wurde, sowie PB2-Varianten von Polypeptidsequenzen und RNA-Sequenzen, die für PB2-Polypeptid-Varianten kodieren, die bei Einführung in virale Influenza-Masterdonor-Viren bewirken, dass solche Viren einen temperaturempfindlichen Phenotyp aufweisen.
Die PB2-Varianten von RNA-Sequenzen können in Influenza-Genome hinein gewonnen werden, um Influenza-Masterdonor-Virusstämme zu schaffen, welche die spezifischen, Temperaturempfindlichkeit induzierenden Mutationen enthalten, die unter Anwendung der Techniken reverser Genetik gewünscht werden. Somit umfasst die Erfindung in einem weiteren Aspekt rekombinante Influenza-Viren, die solche neuartigen PB2-Varianten-RNA und -Polypeptidsequenzen enthalten. Diese rekombinanten Influenza-Viren bewirken abgeschwächtes Wachstum in kultivierten Zellen und/oder lebenden Wirten und eignen sich als Masterdonor-Viren zur Herstellung von reassortantem Influenzavirus und immunogenen Zusammensetzungen zur prophylaktischen Behandlung von Menschen betreffend Influenza-Infektion. Um solche rekombinanten Influenza-Viren herzustellen, werden permissive Wirtzellen mit einem Helfervirus infiziert und mit einem synthetischen RNP-Komplex transfiziert. Der synthetische RNP-Komplex wird in vitro aus DNA transkribiert, die für die mutierte RNA-Sequenz kodiert, und vor der Transfektion in Ribonukleoprotein (RNP) gepackt. Die virale Nachkommenschaft, die aus der Transfektion resultiert, umfasst Viren, welche die mutierte transfizierte RNA-Sequenz in virale Partikel eingebaut enthält. Transfektante Viren, die aus den Zellen gewonnen werden, welche die mutierte transfizierte Sequenz eingebaut enthalten, werden dann aus dem Gemisch aus Transfektant und Helfervirus selektiert, wobei hier der unterschiedliche Phenotyp zwischen den beiden Viren ausgenutzt wird. Diese so selektierten transfektanten Viren umfassen die rekombinanten Influenza-Viren der Erfindung. Die mutierte Sequenz ist eine Influenza-PB2-Sequenz, und in solchen Ausführungsformen enthält die PB2-Sequenz temperaturempfindliche Mutationen, die zu abschwächenden Phenotypen führen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung von Modifikationen in einem Influenza-Genom, umfassend das Einführen eines rekombinanten negativ-strangigen RNA-Templats, das für ein PBS2-Varianten-Protein mit geladenen Cluster-Mutationen kodiert, in Zellen, die mit einem Helfervirus infiziert sind, das Influenzavirus-RNA-Segmente produzieren kann. Ein geeignetes Helfervirus ist zum Wachstum in Vögel-, jedoch nicht in Säugetierzellen fähig. Genauer gesagt können z.B. Madin-Darby- Rindernieren- (MDBK-) Zellen mit einer Wirtsbereich-Mutante von Influenza infiziert werden, die das PB2-Gen des Vogelvirus enthält. Siehe Clements, J. Clin. Microbiol. 30, 655-62 (1992). Synthetisches PB2-RNP wird dann durch Trankription eines für die mutierte vRNA-sense-PB2-RNA kodierenden cDNA-Templats in Gegenwart gereinigter RNP-Proteine hergestellt. Die cDNA muss für ein PB2-Protein kodieren, das es ihr beim Rescue in das Helfervirus ermöglicht, Plaques in Säugetierzellen zu bilden. Das resultierende RNP wird in die infizierten MDBK-Zellen eingesetzt, die Zellen werden inkubiert, und das Medium wird geerntet und zum Infizieren von MDCK-Zellen verwendet.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein reassortantes Virus, umfassend RNA- Sequenzen, die für HA- und NA-Glykoproteine kodieren, die aus einem epidemischen lnfluenzavirus-Stamm der Wildform gewonnen werden, und die übrigen RNA-Sequenzen, die aus dem transfektanten Virus stammen. Das epidemische Virus der Wildform ist ein zirkulierender Stamm von Influenza-Virus, gegen das Immunität angestrebt wird. Das transfektante Virus ist der abgeschwächte Masterdonor, d.h. das rekombinante Influenza-Virus der Erfindung, das abgeschwächte Mutationen in einem oder mehreren RNA-Segmenten enthält, die für die internen Proteine kodieren, einschließlich einer oder mehrerer geladener Cluster-Modifikationen in den PB2-Sequenzen der hierin geoffenbarten Erfindung, die gemäß den hierin beschriebenen Methoden erzeugt und auf Abschwächung untersucht werden können. Die reproduzierbarste Möglichkeit der Erzeugung eines geeigneterweise abgeschwächten Vakzinenvirus ist die Bewahrung aller sechs internen Protein-RNA-Segmente (PB1, PB2, PA, NP, M und NS) des Masterdonors; es ist aber auch möglich, weniger Masterdonor-Segmente im Vakzinenvirus vorzusehen, aber trotzdem ein geeinetes Abschwächungsniveau sowie genetische Stabilität aufrechtzuerhalten.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung immunogene pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine immunogen induzierende wirksame Menge einer Influenza- Virusvariante im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder einer pharmazeutisch annehmbaren Lösung enthalten.
In einem zusätzlichen Aspekt umfasst die Erfindung die obigen Viren zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren, insbesondere ihre Verwendung zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung (z.B. prophylaktischen Behandlung) von Influenza.
Unter "immunogen induzierend"' ist hierin eine Menge gemeint, die ausreicht, um in einem Säugetier die Produktion schützender Influenza-Antikörper zu stimulieren. Eine derartige Menge kann die Antikörper-Produktion lokal und/oder systemisch stimulieren, wodurch Infektion oder die durch eine derartige Infektion hervorgerufene Krankheit verhindert wird. Vorzugsweise ist der Patient ein Mensch.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Es wird hierin auf die üblichen Aminosäuren unter Verwendung der herkömmlichen Einbuchstaben-Symbole Bezug genommen.
Die Modifikation geclusterter geladener Aminosäurereste bei Influenza resultiert in der konsistenten und vorhersagbaren Eigenschaft der Temperaturempfindlichkeit im Virus. Unter "geladenen Clustern", "Cluster-geladen" oder "geclusterten geladenen Aminosäuren" ist hierin eine Sequenz von zumindest fünf aufeinander folgend angeordneten Aminosäuren zu verstehen, die aus vier oder fünf positiv oder negativ geladenen Aminosäuren in den nativen Influenza-Proteinen bestehen. Geladene Aminosäuren sind z.B. Arginin, Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure und Histidin.
Acht geladene Cluster von Aminosäureresten wurden im Influenza A-Virus-A/LA/2/87- PB2-Protein identifiziert. Diese geladenen Cluster umfassten die Aminosäuren 2 bis 6 (im Experimentellen Teil als "AL. A1" bezeichnet), 120 bis 124 ("ALA2"), 140 bis 144 ("ALA3"), 187 bis 192 ("ALA4"), 339 bis 343 ("ALA5"), 677 bis 681 ("ALA6"), 699 bis 673 ("ALA7") und 736 bis 740 ("ALA8"); dabei kam die herkömmliche Nummernzählung ab dem N-terminalen MET-Rest als Nr. 1 zur Anwendung. Die Identität dieser nativen Aminosäuren ist aus der später angeführten Tabelle 2 ersichtlich.
Eine Analyse von Aminosäuresequenzen der PB2-Proteine aus zahlreichen anderen Influenza A-Stämmen identifizierte die entsprechenden acht geladenen Cluster in diesen Stämmen. Zu solchen Influenza A-Stämmen zählen A/Memphis/8/88, A/Chile/l/83, A/Kiev/59/79, A/Udorn/307/72, A/NT/60/68, A/Korea/426/68, A/Great Lakes/0389/65, A/Ann Arbor/6/60, A/Leningrad/13/57, A/Singapore/l/57, A/PR/8/34 und A/WSN/33. Ihre Sequenzen sind bei GenBank erhältlich, und virale Stammlösungen können von der American Type Culture Collectiorr, Rockville, Maryland, USA, oder von anderen öffentlichen Stellen bezogen werden. Die die geladenen ALA1-, ALA3-, ALA4-, ALA5- und ALA6-Cluster umfassenden Nukleotide sind in jedem dieser Influenza-Stämme vollständig konserviert.
Im geladenen ALA2-Cluster ist der Aminosäurerest an Position 120 entweder ein D-Rest oder ein anderer geladener Rest (E), im Fall der oben erwähnten Stämme Chile, NT, Korea, Great Lakes, Ann Arbor, Leningrad, Singapore, PR und WSN. Im geladenen ALA7-Cluster ist die Aminosäure an Position 700 ein G-Rest im Kiev-Stamm; in allen anderen Stämmen ein E-Rest. Im geladenen ALA8-Cluster ist der Aminosä urerest an Position 740 ein N-Rest in den Stämmen Ann Arbor und WSN, während die anderen Stämme vollständige Identität mit A/LA/2/87 in diesem geladenen Cluster aufweisen. Obwohl demnach der A/LA/2/87-Starnm in den Beispielen verwendet wurde, hätten ebenso gut beliebige der obigen Stämme verwendet werden können. Außerdem könnten Analysen betreffend geladene Cluster von Aminosäuren in Influenza B und/oder Influenza C problemlos gemäß den Lehren der Erfindung durchgeführt werden, um PB2-Proteinvarianten und lebende rekombinante Influenza B- und Influenza C-Viren in analoger Weise wie für Influenza A zu erzeugen. Beispielsweise wurden geladene Cluster, die den geladenen Clustern ALA4 und ALA8 in Influenza A entsprechen, in zwei Influenza B- Stämmen festgestellt, nämlich B/AA/1/66 und B/NY/1/93. Unter Anwendung der hierin geoffenbarten Lehren wären Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung in der Lage, solche andere geladene Clusterreste in den anderen Typen und Stämmen von Influenza zu identifizieren.
Außerdem können geladene Cluster in anderen Proteinen von Influenza-Viren mittels dieser Techniken identifiziert und modifiziert werden. Es ist insbesondere möglich, die M1-Proteine von Influenza A, B oder C zu modifizieren, um Varianten von M1-Proteinen zu erzeugen, die zu immunogen signifikanten Abschwächungen führen würden, wodurch die Produktion lebender, abgeschwächter, immunogener Zusammensetzungen mittels reverser genetischer Techniken für die prophylaktische Verabreichung an Menschen ermöglicht wird. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der M-Proteine aus verschiedenen Influenza-Typen und -Stämmen sind bekannt. Siehe z.B. Bayfor, Virol. 163, 618-21 (1988); Markusin, Virus Res. 10, 263 (1988); Cox, Virology 167, 554-67 (1988); und Buckler-White, J. Virol. 57, 670-700 (1986). Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können sich der hierin geoffenbarten Techniken bedienen, um geladene Cluster in den Influenza M-Proteinern zu identifizieren und modifizieren und rekombinante Influenza-Viren zu erzeugen, die solche modifizierte M-Proteine enthalten. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der NP-Proteine aus mehreren Stämmen von Influenza A sind bekannt. Siehe z.B. Shu, J. Virol 67, 223-29 (1993). Fachleute auf dem Gebiet können sich der hierin geoffenbarten Verfahren bedienen, um geladene Cluster im Influenza NP-Protein zu identifizieren und zu modifizieren und rekombinante Influenza-Viren zu erzeugen, die solche modifizierte NP-Proteine enthalten.
Geladene Cluster können gemäß den hierin geoffenbarten Lehren modifiziert werden, um temperaturempfindliche rekombinante Influenza-Viren zu erzeugen. Zu solchen temperaturempfindlichen rekombinanten Influenza-Viren zählen jene, die PB2-Aminosäuresequenz-Varianten und die kodierenden RNA-Sequenzen enthalten, die für die an den Tag gelegte Temperaturempfindlichkeit verantwortlich sind.
Demzufolge offenbart und beschreibt die Erfindung neuartige RNA- und entsprechende cDNA-Sequenzen, die für PB2-Protein-Varianten kodieren. Die Proteine der Erfindung umfassen Varianten von oder modifizierte PB2-Sequenzen, worin zumindest ein und bis zu acht der geladenen Cluster von Wildform-Influenza-PB2-Sequenzen durch Substitution neutraler Aminosäuren modifiziert sind. Die Ausdrücke "Variante", "modifiziert" und "Mutante" oder "mutiert" werden hierin austauschbar verwendet. Eine neutrale Aminosäure ist als ungeladen bei neutralem pH-Wert definiert und beeinträchtigt nicht die Sekundär- oder Tertiär-Gesamtstruktur. Beispiele für neutrale Aminosäuren sind Alanin, Valin und Serin. Alanin ist eine bevorzugte neutrale Aminosäure.
Wenn solche Proteine in Influenza-Viren eingebaut werden, um Masterdonor-Stämme von Influenza zu erzeugen, bewirken sie die Erzeugung temperaturempfindlicher Mutanten, die sich zur Herstellung immunogener Zusammensetzungen und zur prophylaktischen Behandlung von Influenza eignen.
Die PB2-Protein-Varianten (d.h. die modifizierten PB2-Proteine) der Erfindung können durch bekanntes genetisches Umordnen oder Methoden reverser Genetik in Influenza- Viren eingearbeitet werden. Bei den Methoden reverser Genetik wird die native PB2- Sequenz durch ein synthetisches Gen ersetzt, das in vitro aus cDNA synthetisiert wurde, die für eine oder mehrere der geladenen Cluster-Modifikationen im PB2-Protein kodiert. Mit Helfervirus infizierte Zellen werden mit der synthetischen PB2-Sequenz transfiziert, die notwendigerweise für die geladenen Cluster-Modifikationen kodiert. Das lebende Virus, das die synthetische Sequenz enthält, kann als Masterdonor-Virus dienen, das bei Kombination mit dem HA- und/oder NA-Gen der Wildform epidemischer (d.h. gegenwärtig virulenter zirkulierender) Influenza-Stämme zur Produktion reassortanter Influenza-VGren ("6 : 2-Reassortanten") führt, die als immunogene Zusammensetzungen für die Influenza-Prophylaxe beim Menschen herangezogen werden können. Analog dazu können die M-Sequenz-Varianten und/oder NP-Sequenz-Varianten in Influenza-Viren eingebaut sein. Die 6 : 2-reassortanten Viren bestehen somit aus sechs Genen aus dem Masterdonor-Stamm, umfassend die synthetische(n) Sequenz(en), sowie aus HA- und NA-Genen aus einem derzeit zirkulierenden virulenten Influenza-Stamm. Das Verfahren zur Herstellung eines 6 : 2-reassortanten Influenza-Virus umfasst das Infizieren einer Zelle mit dem abgeschwächten Masterdonor-Stamm und mit einem derzeit zirkulierenden virulenten Influenza A-Virus, sowie das Selektieren des Reassortant-Virus durch In-Kontakt- Bringen der Nachkommenschaft mit einem Antikörper, der mit einem Epitop auf dem HA- oder NA-Gen des epidemischen Stamms reaktiv ist. Alternativ dazu kann man mithilfe reverser gentechnischer Verfahren Zellen mit den HA- und NA-Genen aus einem epidemischen Stamm transfizieren. Die Zellen werden dann mit dem Masterdonor- Stamm und 6 : 2-Reassortanten infiziert, die durch Antikörper-mediierte Selektion selektiert wurden (siehe oben).
Beispielsweise werden Primär-Küken-Nieren- (PCK-) oder MDBK-Zellen-Monoschichten mit Helfervirus bei einer Infektionsmultiplizität (moi) von 1-10 eine Stunde lang infiziert. Erfindungsgemäße RNA, die für eine oder mehrere der PB2-Varianten oder M1- oder NP-Proteine kodiert, wird mithilfe von Techniken iri die infizierten Zellen transfiziert, die von Luytjes, s.o., Enami und Palese, s.o., und Enami, s.o., gegebenenfalls gemäß der Modifikation von nachstehendem Beispiel 4, beschrieben wurden. Die Transkriptionsreaktion umfasst linearisiertes Plasmid, jedes der Desoxyribonukleotide, T3- RNA-Polymerase und Ribonukleoprotein aus Virus, das in den Allantois-Hohlräumen befruchteter Eier gemäß den Verfahren von Parvin und Enami, s.o., gezüchtet wird. Das Gemisch wird 45 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, was die Produktion von RNA-Transkripten bewirkt, die gleichzeitig in RNP-Komplexe gepackt werden. Zugabe von DNase eliminiert dann das Plasmid, und das Gemisch wird in die mit dem Helfervirus infizierten und mit DEAE-Dextran behandelten PCK- oder MDBK-Zellen eingeführt. Alternativ dazu wird das Gemisch durch Elektroporation in die infizierten Zellen eingebracht. Kulturen werden bei der geeigneten Temperatur (z.B. 34ºC) gehalten und dann 16-22 Stunden später geerntet. Zellbruchstücke werden pelletiert und der das Virus enthaltende Überstand auf geeigneten Säugetierzellen, z.B. MDCK-Zellen, geplaquet. Die Nachkommenschaft des geplaqueten Virus kann anschließend noch ofter geplaquet werden und wird dann in den Allantois-Hohlräumen befruchteter Eier amplifiziert.
Genauer gesagt wurde eine Wirtsbereich-Mutante des Influenza-Virus A/LA/2/87 beschrieben. Dieses Helfervirus enthält das vom Vogelvirus abgeleitete P82-Gen (A/Mallard/New York/6750/78) und kann sich produktiv in Vogelzellen, wie z.B. PCK-Zellen, vermehren; allerdings kann es in Säugetierzellen, wie z.B. MDCK, keine Plaques bilden. Siehe Clements, J. Clin. Microbiol. 30, 655-62 (1992). Die Ersetzung des Mallard PB2- Gens in A/LA/2/87 durch eine transfizierte Säugetier-PB2-Sequenz ermöglicht es dem Virus, in MDCK-Zellen Plaques zu bilden. Siehe Subbarao, J. Virol. 67, 7223-28 (1993). Auf diese Weise können spezifische Änderungen in der Nukleotidsequenz des PB2- Gens eingeführt werden, indem synthetische RNAs, die in die cDNA der Säugetier-PB2- Sequenz eingeführte stellengerichtete Mutationen tragen, transfiziert und für die in vitro- Transkription verwendet werden. Die so produzierte rekombinante Influenzavirus-Variante weist Temperaturempfindlichkeit auf, wodurch sie als Masterdonor-Stamm zur Schaffung lebender, abgeschwächter, immunogener Zusammensetzungen für die prophylaktische Verabreichung an Menschen verwendet werden können.
Standardverfahren können zum Vermehren der rekombinanten Influenza-Viren der Erfindung zum Einsatz kommen. Virale Stammlösungen können in primären oder etablierten Zellkulturen plaquegereinigt werden, z.B. in Primär-Rinder- oder -Küken-Nierenzellen oder MDCK-Zellen. Plaquegereinigtes Virus kann in solchen Zellinien weiter vermehrt werden. Die Zellen werden typischerweise auf Kunststoff-Gewebekulturplatten kultiviert und Virus typischerweise mit einer moi von 0,001 bis 0,1 eingeimpft und 2-3 Tage lang inkubiert. Virus-Stammlösung kann alternativ dazu in den Allantois-Hohlraum von 10-12 Tage alten befruchteten Hühnereiern eingeimpft und bei 33-37ºC 2-3 Tage lang inkubiert werden.
Das Testen auf Abschwächung der erfindungsgemäßen rekombinanten Influenza-Viren kann gemäß bekannter in vitro- und in vivo-Tests erfolgen. Beim in vitro-Test wird das rekombinante Virus auf Vorliegen des temperaturempfindlichen Phenotyps untersucht wie in Beispiel 6 hierin beschrieben. Die in vivo-Reaktogenizität der rekombinanten Influenza-Viren kann gemäß dem hierin angeführten Beispiel 7 bestimmt werden.
Solche rekombinanten modifizierten Influenzaviren-Varianten können auch in der genetischen Komplementierungsanalyse zur Kartierung von ts-Läsionen anderer Viren, in der funktionellen Analyse der Rolle von PB2 im Virus-Lebenszyklus und beim Lokalisieren von Domänen des PB2-Proteins eingesetzt werden, das an Wechselwirkungen mit viraler RNA oder anderen viralen Proteinen, wie z.B. PB1 oder PA, beteiligt ist.
Die modifizierten PB2-Proteine der Erfindung können - wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt - rekombinant in unterschiedlichen Zelltypen unter Einsatz der geeigneten Expressions-Kontrollsysteme exprimiert werden, um die Proteinfunktionalität zu testen. Die Konstruktion geeigneter Vektoren, welche die Nukleinsäure-Sequenzen der Erfindung enthalten, ist ebenso auf dem Gebiet bekannt wie Hybridisierungstests, in denen solche Sequenzen eingesetzt werden können. Siehe. z.B. die US-Patente 4.356.270 (Itakura), 4.431.739 (Riggs) und 4.440.859 (Rutter). Andere Beispiele für Wirtszellen, Promotoren, selektierbare Marker und Techniken sind auch in den US-Patenten 5.122.469 (Mather), 4.399.216 und 4.634.665 (Axel), 4.713.339 (Levinson), 4.656.134 (Ringold), 4.822.736 (Kellems) und 4.874.71J2 (Fiers) geoffenbart.
Die Konstruktion geeigneter Vektoren, welche die Nukleinsäure-Sequenzen der Erfindung enthalten, erfolgt gemäß konventioneller Ligations- und Restriktionstechniken, die heute auf dem Gebiet allgemein bekannt sind. Stellenspezifische Spaltung erfogt durch Behandlung mit geeigneten Restriktionsenzym(en) unter Standardbedingungen, wobei Details typischerweise vom Restriktionsenzym-Hersteller angegeben sind. Polyacrylamidgel- oder Agarosegel-Elektrophorese kann durchgeführt werden, um die gespaltenen Fragmente mittels Standardtechniken größenmäßig zu trennen. Synthetische Oligonukleotide können z.B. unter Anwendung des auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Diethyphosphoamidit-Verfahrens hergestellt werden. Ligationen können unter Verwendung von T4-DNA-Ligase unter Standardbedingungen bei Standardtemperaturen durchgeführt und korrekte Ligationen durch Transformieren von E. coli mit dem Ligationsgemisch bestätigt werden. Erfolgreiche Transformanten werden anhand von Ampicillin-, Tetracyclin- oder andere Antibiotika-Resistenz oder unter Einsatz anderer, auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Marker selektiert.
Solche Rekombinationstechniken werden eingehend in der Literatur beschrieben. Siehe z.B. Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausgabe (1989); DNA Cloning, Bd. I und II, D.N. Glover (Hrsg.), 1985; "Oligonucleotide Synthesis", M.J. Gait (Hrsg.), 1984; "Nucleic Acid Hybridization", B.D. Hames (Hrsg.), 1984; "Transcription and Translation", B.D. Hames (Hrsg.),· 1984; "Animal Cell Culture", R.I. Freshney (Hrsg.), 1986; B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells", J.H. Miller (Hrsg.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Scopes, "Protein Purification: Principles and Practice", 2. Ausgabe, Springer-Verlag, New York, 1986; und "Handbook of Experimental Immunology", Bd. I-IV, D.M. Weired (Hrsg.), 1986.
Die lebenden rekombinanten Influenzavirus-Varianten der Erfindung können in immunogenen Zusammensetzungen eingesetzt werden, um Infektion durch ein Influenza-Virus oder den durch eine solche Infektion hervorgerufenen Krankheitszustand zu verhindern. Zur Herstellung solcher immunogener Zusammensetzungen werden kultivierte Zellen mit der lebenden rekombinanten Influenza-Variante (d.h. dem Masterdonor) und einem epidemischen Stamm der Wildform co-infiziert. Reassortant-Viren werden geerntet und auf Vorliegen von Temperaturempfindlichkeit induzierenden Mutationen untersucht. Reassortanten, die HA- und/oder NA-Proteine der Wildform enthalten, können durch Exposition gegenüber Antiseren gegen die Oberflächen-Epitope, für welche die HA- und/oder NA-Proteine aus dem Donorvirus kodieren, selektiert werden. Die resultierende virale Nachkommenschaft, welche die mutierten Sequenzen der Erfindung sowie die HA- und/oder NA-Sequenzen aus den epidemischen Influenza-Stämmen der Wildform enthält, wird zur Herstellung immunogener Zusammensetzungen eingesetzt. Solche immunogenen Zusammensetzungen umfassen eine immunogen induzierende wirksame Menge einer rekombinanten Influenzavirus-Variante der Erfindung im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder einer pharmazeutisch annehmbaren Lösung. Ein Beispiel für einen pharmazeutisch annehmbaren Träger ist Kochsalzlösung. Die Zusammensetzung kann systemisch verabreicht werden - vorzugsweise subkutan oder intramuskulär, in Form einer annehmbaren subkutanen oder intramuskulären Lösung. Noch bevorzugter kann die Zusammensetzung intranasal entweder durch Tropfen, Aerosol mit großen Partikeln (mehr als 10 um) oder Spray in die oberen Atemwege verabreicht werden. Die Herstellung solcher Lösungen, bei der auf pH-Wert, Isotonie, Stabilität und dergleichen Rücksicht genommen wird, liegt im Kompetenzbereich von Fachleuten auf dem Gebiet. Das Dosierungsschema wird vom behandelnden Arzt unter Berücksichtigung verschiedener Faktoren bestimmt, welche die Wirkungsweise von Arzneimitteln modifizieren, z.B. Alter, körperlicher Zustand, Körpergewicht, Geschlecht, Ernährungsgewohnheiten, Zeitpunkt der Verabreichung und andere klinische Faktoren. Beispiele für Dosierungen reichen von etwa 1 bis etwa 1000 HID&sub5;&sub0; ("human infectious dose"; infektiöse Dosis beim Menschen) des Virus.
Bei der Durchführung des prophylaktischen Behandlungsverfahrens der Erfindung wird eine immunologisch induzierende wirksame Menge einer immunogenen Zusammensetzung der Erfindung an einen menschlichen Patienten verabreicht, der prophylaktische Behandlung benötigt. Eine immunologisch induzierende wirksame Menge einer Zusammensetzung der Erfindung leigt im Bereich von etwa 1-1000 HID&sub5;&sub0;, d.h. von etwa 10&sup5; bis 10&sup8; pfu (Plaque-bildenden Einheiten) pro verabreichter Dosis. Die Anzahl der verabreichten Dosen kann in Abhängigkeit von den oben erwähnten Faktoren variieren. Die bevorzugte Verabreichungsweise ist die nasale Verabreichung in die oberen Atemwege des Patienten.
Es folgt eine Beschreibung der Erfindung anhand der nachstehenden Beispiele, die lediglich veranschaulichend sind und die Erfindung nicht einschränken.

Beispiel 1: cDNA-Klonierung des A/LA/2/87-Gens

Madin-Darby-Hundenieren- (MDCK-) und Madin-Darby-Rindernieren- (MDBK-) Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) erhalten und wurden in "Eagle's Modified Essential Medium" (EMEM; JRH Biosciences, Lenexa, KS, USA), ergänzt mit 10% Rinderfötenserum (JRH), 2 ml L-Glutamin (JRH), 100 Einheiten/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin (Sigma, St. Louis, MO, USA), bei 37ºC in 5% CO&sub2; gezüchtet. Influenza-Virus A/LA/2/87 (H3N2) stammte von Dr. L. Potash (DynCorp/PRI, Rockville, MD, USA), wurde einmal in MDCK-Zellen bei 37ºC passagiert und dann in den Allantois-Hohlraum von 10-12 Tage alten, spezifischen Pathogen-freien (SPF), befruchteten Hühnereiern in Standardqualität (SPAFAS, Norwich, CT, USA) gemäß dem Verfahren von Barrett, Growth, "Purification and Titration of Influenza Viruses", S. 119-150, B.W.J. Mathy (Hrsg.), IRL Press, Oxford, England (1985), amplifiziert.
Allantois-Flüssigkeit aus mit A/LA/2/87-Virus infizierten Eiern wurde entfernt, durch Zentrifugation bei 15.000 U/min in einem SW28-Rotor 90 Minuten lang bei 4ºC konzentriert und anschließend durch Zentrifugation auf einem Saccharose-Stufengradienten (1260% Saccharose in Phosphat-gepufferter Salzlösung in vier 12%-Schritten) bei 27.000 U/min in einem SW28-Rotor 75 Minuten lang bei 4ºC gereinigt. Virionen-Banden wurden mit 1% NP-40 zerstört. Virale RNA (vRNA) wurde dann extrahiert, zunächst durch Behandlung mit 0,5 mg/ml Proteinase K (PK; Amresco, Solon, OH, USA) in Gegenwart von 1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethylhydrochlorid (Tris), pH 7,5, 100 mM NaCl und 1 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA) bei 37ºC 1 Stunde lang und dann durch drei aufeinanderfolgende Behandlungen mit dem gleichen Volumen an Phenol/Chloroform, sowie mit 2,5 Volumina Ethanol gefät.
Nach einstündigem Kühlen auf -20ºC wurde der RNA-hältige Niederschlag durch Zentrifugation in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge bei 14.000 U/min über 20 Minuten pelletiert, mit 80% Ethanol gewaschen, getrocknet und in mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser in einer Endkonzentration von 0,5 mg/nil resuspendiert. Etwa 1 pg vRNA wurde mit Oligonukleotid PB2003, einem Oligonukleotid, das zu den 24 3'-terminalen Nukleotiden des PB2-Gens komplementär ist, auf der Basis der Sequenz des A/Memphis/8/88 PB2-Gens (siehe Gorman, J. Virol. 64, 4893-4902 (1990)) hybridisiert, das auch BamHl- und Bsml-Restriktionsstellen enthielt. Die Sequenz von PB2003 ist in Tabelle 1 angegeben.
Erststrang-cDNA wurde mittels reverser Transkriptase Superscript II (Gibco/BRL, Bethesda, MD, USA) im vom Hersteller bereitgestellten Reaktionspuffer, jeweils 0,5 M der Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs; Promega, Madison, WI, USA) und 2 Einheiten/ul RNAsin (Promega) 2 Stunden lang bei 42ºC synthetisiert. Die cDNA wurde durch Phenol/Chloroform-Extraktion gereinigt und auf einer S-300 HR-Mikrosäule (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) chromatographiert. Die cDNA wurde dann mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in zwei Segmenten amplifiziert, die beide die singuläre Ncol-Stelle an Position 1.229 umfassten. Der C-terminale Klon wurde unter Einsatz der Oligonukleotid-Primer PB2003 und PB2005 hergestellt (vRNA-Sense, Positionen 1.257-1.276; siehe Tabelle 1 für die Sequenz von P132005). Der N-terminale Klon wurde unter Einsatz der Primer PB2002 (vRNA-Sense, umfassend eine Xbal-Restriktionsstelle, die T3-Promotorsequenz und 28 nts vom 5'-Ende von PB2-vRNA) und PB2004 (mRNA-Sense, Positionen 1.126-1.146) erzeugt. Die Sequenzen von PB2003 und PB2005 sind in Tabelle 1 angegeben.
PCR erfolgte in einem Thermozyklierer von Perkin Eimer (Norwalk, CT, USA) in 1 · PCR Puffer II (Perkin Eimer), umfassend 2 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM dNTPs, 0,2,uM Primer und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase, unter Durchführung von 50 Denaturierungszyklen bei 94ºC über 1 Minute, Annelierung bei 40ºC über 2 Minuten und Verlängerung bei 72ºC über 3 Minuten, gefolgt von 30-minütiger Inkubation bei 72ºC. Die durch PCR erzeugten Fragmente wurden mil: Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in einem 1% Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt (RMC, Rockland, ME, USA) 100 Voltstunden lang in 1 · TAE-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA, pH 8,0) Elektrophorese unterzogen. Die DNA-Fragmente mit den erwarteten Größen (1,29 kb für das N-terminale Fragment und 1,24 kb für das C-terminale Fragment) wurden aus dem Gel geschnitten, der Gelschnitt wurde geschmolzen und die DNA mithilfe des "QN&spplus;"-Verfahrens von Langridge, Anal. Biochem. 103, 264-71 (1980), extrahiert. Eine Aliquote jeder gereinigten DNA diente zur Ligation an den pCRII-TA-Klonierungsvektor (InVitrogen, San Diego, CA, USA) unter Einsatz von T4-DNA-Ligase (New England Biolabs, Beverly, MA, USA). Eine Aliquote des Ligationsgemisches diente zum Transformieren kompetenter E. coli DH5α-Zellen (Gibco/BRL, Bethesda, MD, USA). Einzelne Kolonien wurden durch Standardtechniken auf das Vorliegen von Inseris gescreent.
Das Sequenzieren der PB2-Gen-Inserts erfolgte unter Einsatz von Primern, deren Sequenz auf jener des A/Memphis/8/88-PB2-Gens basierte, durch Didesoxy-Ketten-Terminationssequenzierung doppelstrangiger Plasmid-DNA mit Sequenase (USB, Cleveland, OH, USA). Die Sequenz zweier unabhängiger Klone für jedes Fragment wurde bestimmt und stellte sich bis auf eine Nukleotid-Deletion in einem der N-terminalen Klone, die verworfen wurde, da man davon ausgehen kann, dass sie eine Rahmenverschiebungs-Mutation im für PB2 kodierenden offenen Leserahmen bewirkt, als identisch heraus. Wie erwartet war die Sequenz hochgradig zu jener des A/Memphis/8/88-PB2-Gens homolog, wobei nur elf Nukleotid- und drei Aminosäure-Unterschiede beobachtet wurden. Die A/Memphis/8/88-PB2-Sequenz wurde von Gorman, J. Virol. 64, 4893-4902 (1990), geoffenbart. Sequenzunterschiede zwischen A/Memphis/8/88- (siehe GenBank) und A/LA/2/87-PB2-Genen fanden sich an folgenden Nukleotidpositionen (gezählt ab dem ersten Nukleotid des cRNA(+)-Sense-Strangs): 80 (G in Memphis/8/88 und A in A/LA/2/87), 81 (A in Memphis/8/88 und G in A/LA/2/87), 306 (T in Memphis/8/88 und C in A/LA/2/87), 338 (A in Memphis/8/88 und C in A/LA/2/87), 504 (C an Memphis/8/88 und A in A/LA//87), 505 (A in Memphis/8/88 und C in A/LA/2/87), 543 (T in Memphis/8/88) und G in A/LA/2/87), 886 (C in Memphis/8/88 und A in A/LA/2/87), 887 (A in Memphis/8/88 und C in A/LA/2/87), 990 (G in Memphis/8/88 und A in A/LA/2/87), 1.164 (A in Memphis/8/88 und G in A/LA/2/87), 1.179 (T in Memphis/8/88 und C in A/LA/2/87) und 1.929 (T in Memphis/8/88 und C in A/LA/2/87). Das Resequenzieren eines kleinen Abschnitts der Memphis/8/88-cDNA brachte an Positionen 80 und 81 zwei Fehler in der GenBank-Sequenz zutage; die Sequenz ist an diesen Positionen die gleiche wie jene von A/LA/2/87. Drei der Nukleotid-Differenzen führten zu Aminosäure- Unterschiede in A/LA/2/87, und zwar an den Aminosäure-Positionen 104, 160 und 287.
Die PB2-cDNA voller Länge wurde dann durch Spaltung des C-terminalen Klons mit BamHI und Ncol sowie des N-terminalen Klons mit Xbal und Ncol rekonstruiert. Die durch Spaltung freigesetzten DNA-Fragmente wurden mittels des QN&spplus;-Verfahrens gelgereinigt und in einen BamHI/Xbal-gespaltenen pUC19-Standard-Klonierungsvektor ligiert. Tabelle 1: In den Beispielen 1, 2 und 5 eingesetzte Oligonukleotid-Sequenzen (die Sequenzen sind 5' → 3' aufgelistet)

Beispiel 2: Mutagenese der PB2-cDNA

Die Anmelder definierten einen geladenen Cluster als vier oder fünf positiv oder negativ geladene Aminosäuren in einer Sequenz von fünf aufeinander folgend angeordneten Aminosäuren und identifizierten acht geladene Cluster in der Aminosäuresequenz des Influenza-A/LA/2/87-PB2-Proteins. Unter Verwendung der in Beispiel 1 klonierten cDNA wurden acht PB2-cDNA-Varianten, die spezifische stellengerichtete Modifikationen enthielten, wie folgt konstruiert.
Eine Zusammenfassung der Positionen der Cluster und Aminosäure-Modifikationen und Restriktionsenzym-Stellen in den klonierten PB2-cDNAs aus Beispiel 1 findet sich in Tabelle 2. In allen Fällen bis auf einen wurden nur die positiv geladenen Aminosäuren (R oder K) im Cluster durch Substitution von Nukleotiden, die für einen neutralen Aminosäurerest - Alanin - kodieren, modifiziert. Dies geschah deshalb, um die Möglichkeit einer spontanen Umkehr zu minimieren, da jedes Codon für das neutral geladene Alanin (GCA, GCC, GCG oder GCU) mittels einer einzigen Nukleotid-Änderung zurück in negativ gealdene Aspartat- (GAC oder GAU) oder Glutamat- (GAA oder GAG) Aminosäurereste mutiert werden kann. Inn Fall von ALA6, worin der Cluster nur aus negativ geladenen Aminosäuren besteht, wurden die zwei D-Reste und der zweite E-Rest durch Substitution von für Alanin kodierenden Nukleotiden modifiziert. Die eingeführte ALA8- Mutation fällt mit einem Teil des vorgeschlagenen Kern-Lokalisierungssignals zusammen, und es wurde gezeigt, dass die Mutation zu Glutamin an der gleichen Position im PB2-Protein des A/WSN/33-Influenza A-Stamms zur Produktion von PB2-Protein führt, das gleichermaßen zwischen dem Kern und dem Zytoplasma von BHK-Zellen, die das rekombinante Protein exprimieren, verteilt ist. Siehe Mukaigawa und Nayak, J. Virol. 65, 245-253 (1991). In allen Fällen wurden andere translational stille Mutationen gebildet, um Restriktionsenzym- (RE-) Anderungen zwecks Aufspüren verschiedener Allele einzuführen.
PB2-cDNAs, welche die ALA1- und ALA5-Modifikationen enthielten, wurden durch Kassetten-Mutagenese unter Verwendung der durch PCR amplifizierten Fragmente erzeugt. Ein Primer (ALA1 oder ALA5, siehe Tabelle 1, wo ihre Sequenzen angeführt sind), der die Sequenz einer nahe liegenden singulären Restriktionsstelle sowie die Sequenz der gewünschten Substitution enthielt, wurde in Verbindung mit einem Primer des entgegengesetzten Senses distal zu einer anderen singulären Restriktionsstelle eingesetzt. PB2-cDNAs, die ALA2, ALA3, ALA4, ALA6, ALA7 und ALA8 enthielten, wurden unter Einsatz des "Chameleon Site Directed Mutagenesis"-Sets (Stratagene, La Jolla, CA, USA) erzeugt. Tabelle 2: Aminosäure-Änderungen in LA-PB2-Alanin-Ntutanten
¹ Die Position des geladenen Clusters ist anhand der Nummer der ersten dargestellten Aminosäure angegenen tiefgestellter Index.
² Zu Alanin mutierte Aminosäuren sind fett angegeben.

Beispiel 3: Herstellung von viralem RNP

Virales Ribonukleoprotein (RNP) wurde aus dem in SPF-Eiern gezüchteten A/PR/8/34-Virus nach der Arbeitsvorschrift von Parvin, J. Virol. 63, 5142-52 (1989), mit einigen unten geoffenbarten Modifikationen gereinigt.
In 600-700 SPF-Eier wurden etwa 104 pfu des Influenza-A/PR/8/34-Virus injiziert und zwei Tage lang bei 35ºC inkubiert. Nach dem Abkühlen auf 4ºC über Nacht, wurde Allantois-Flüssigkeit geerntet und unter Verwendung einer Amicon-Hohlfaser-Patrone (Typ H1P100-20) und einer Amicon-LP-1-Pumpe etwa zehnfach aufkonzentriert. Virus wurde durch Zentrifugation in einem SW28-Rotor für 90 Minuten bei 25.000 U/min und 4ºC pelletiert, in 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA (NTE-Puffer) resuspendiert und zweimal durch ein 30% Saccharose-Kissen (25.000 U/min in einem SW28-Rotor für 2,5 Stunden, dann 36.000 U/min in einem SW50.1-Rotor für 90 Minuten) erneut pelletiert.
Das Viren-Pellet wurde in 0,1 M Tris, pH 8,1, 0,1 M KCl, 5 mM MGCl&sub2;, 5% Glycerin, 1,5% Triton-N101, 10 mg/ml Lysolecithin (frisch zugegeben) und 1,5 mM Dithiothreitol (DTT) bis zu einer endgültigen Protein-Konzentration von 3 mg/ml resuspendiert und 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Zerstörtes Virus wurde auf einem Amicon-Centriprep-10-Konzentrator 1-3 Stunden lang bei 3.000 U/min in einer Beckman J-6B-Zentrifuge aufkonzentriert. Virenkerne wurden auf einem Dreischichten-Glycerin-Stufengradienten (33%, 50% und 70% Glyoerin) gereingt und in einem SW50.1-Rotor 4 Stunden lang bei 45.000 U/min und 4ºC zentrifugiert. Fraktionen von 0,3 ml wurden aus dem Gradienten geerntet und durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) analysiert.
An NP-Protein angereicherte Fraktionen wurden vereinigt und durch einen. CsCl/Glycerin-Stufengradienten (drei Schichten: 1,5 M CsCl/30% Glycerin, 2,0 M CsCl/35% Glycerin und 2,5 M CsCl, 40% Glycerin) in einem SW50.1-Rotor bei 45.000 U/min und 4 C 24 Stunden lang zentrifugiert. Wiederum wurden an NP-Protein angereicherte Fraktionen vereinigt und zu einer endgültigen Puffer-Zusammensetzung von 50% Glycerin, 50 m M Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2; und 1 mM DTT unter Verwendung von Dialyseschläuchen mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 50.000 Dalton dialysiert. Die Proteinkonzentration verschiedener RNP-Präparate reichte von 1-2 mg/ml. Die RNPs wurden bei -80ºC gelagert. Die Aktivität des RNP wurde durch NA-Rescue mittels des WSN-HK-Helfervirus nach dem Verfahren von Enami, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3802-05 (1990), und der nachstehend beschriebenen Arbeitsvorschrift bestimmt, außer dass 0,1 ug/ul RNP eingesetzt und das erhaltene Virus auf MDBK-Zellen in Abwesenheit von Trypsin geplaquet wurde. Die Transfektionsausbeute betrug üblicherweise 5-10 · 10&sup4; pfu.

Beispiel 4: Transfektion der PB2-cDNA-Varianten und Gewinnung von rekombinantem PB2-Virus

Influenza-A/LA-PB2-cDNA der Wildform und die in Beispiel 2 konstruierten acht Influenza-A/LA-PB2-cDNA-Varianten wurden mittels einer modifizierten Version der revers-genetischen Arbeitsvorschrift von Palese et al. (siehe z.B. Enami und Palese, J. Virol. 65, 2711-13 (1991)) und unter Einsatz einer Wirtsbereich-PB2-Helfervirus-Mutante (siehe Murphy et al. in Clements,). Clin. Microbiol 30, 655-62 (1992); und Subbarao, J. Virol. 67, 7223-8 (1993)) in Influenza-Virus hineingewonnen. Das PB2-Wirtsbereich- Helfervirus ist ein singuläres Gen-reassortantes Virus, welches das PB2-Gen von A/Mallard/NY/6750/78 und die übrigen sieben Gene von A/LA/2/87 enthält. Es stammte von Dr. L. Potash (DynCorp/PRf, Rockville, MD, SA) und wurde in SPF-Eiern gezüchtet.
Dieses PB2-Helfervirus war bereits zur Gewinnung durch Transfektion von Primär-Küken-Nieren- (PCK-) Zellen eingesetzt worden (siehe Sublarao, J. Virol. 67, 7223-8 (1993)), da das Virus eine Wirtsbereich-Mutante ist, die produktiv in PCK-Zellen gezüchtet werden kann, aber keine Plaques in Säugetierzellen bildet. Siehe Clements, J. Clin. Microbiol. 30, 655-62 (1992). Überraschenderweise stellten die Anmelder fest, dass die Säugetier-Zelllinie MDBK mit dem Virus infiziert werden und die Expression eines transfizierten Reportergens (Chloramphenicol-Acetyl-Transferase, CAT) unterstützen kann, die von der Influenza-Polymerase-Funktion für die Expression (IVACAT) abhängt. Siehe Luytjes, Cell 59, 1 107-13 (1989). Statt der PCK-Zellen verwendeten die Anmelder daher MDBK-Zellen für PB2-Rescueversuche.
Außerdem wurde ein verbessertes Transfektionsverfahren angewandt, das die Elektroporation von MDBK-Zellen vorsieht und eine gleich hohe oder höhere Anzahl an Transfektantenviren mit einer zehnfachen Reduktion der Replikation von Helfervirus im Vergleich zum bereits veröffentlichten DEAE-Dextran-Transfektionsverfahren erzielt (siehe Li, Virus Res., in Druck; und US-08/316.049, eingereicht am 30. September 1994, hierin durch Verweis aufgenommen). Die Elektroporationstechnik schien auch eine weitere Hintergrundquelle auszuschalten, d.h. die Gewinnung der für PB2 kodierenden RNA aus A/PR/8/34, das in geringen Mengen im RNP-Präparat vorhanden ist.
MDBK-Zellen stammten von der ATCC, Rockville, MD, USA. Subkonfluente Monoschichten von MDBK-Zellen (eine 60 mm-Schale pro Transfektion) wurden mit dem in phosphatgepufferter Salzlösung (FBS; JRH BioSciences, Lenexa, KS, USA) verdünnten Helfervirus 1 Stunde lang bei Raumtemperatur infiziert, um eine moi von 5 zu ergeben. Die infizierten Zellen wurden durch zweiminütiges Applizieren von 0,4 ml vorgewärmtem (37ºC) 0,5% Trypsin (JRH) bei Raumtemperatur aus der Schale entfernt. Das Trypsin wurde durch Zugabe von 2 mg Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (Sigma) in PBS, umfassend Mg&spplus;² und Ca&spplus;² (JRH), inaktiviert. Die infizierten Zellen wurden bei 2.000 U/min in einer klinischen Beckman-Laborzentrifuge 5 Minuten lang bei Raumtemperatur pelletiert und in 0,3 ml PBS resuspendiert. Die Zellen wurden in eine Elektroporationsküvette (0,4 cm Weite, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) übertragen. vRNA-Sense-RNP wurde durch in vitro-Transkription der mit Bsml linearisierten PB2-cDNA (2 ug pro Transkription) mit T3-Polymerase (2 Einheiten/ul Stratagene, La Jolla, CA, USA) in Gegenwart von 0,5 mM aller Nukleotidtriphosphate (Prornega, Madison, WI, USA), 1 Einheit/pl RNAsin (Promega) und 0,2 bis U,4 ug/pl gereinigtem RNP-Protein hergestellt. Transkriptionen wurden 45 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, gefolgt von fünfminütiger Behandlung mit RQ1DNase (Promega) bei 37ºC. Das RNP-Gemisch wurde den infizierten Zellen in der Küvette zugegeben und sofort mit einem Puls bei 250 mV, 500 pF unter Verwendung eines Bio-Rad (Hercules, CÄ, USA) Gene Pulsers elektroporiert. Die elektroporierten Zellen wurden dann in 2 rnl MEM (JRH) erneut ausplattiert, umfassend 1% Rinderserum-Albumin (BSA; Gibco/BRL, Grand (sland, NY, USA) und 1,25 ug/ml mit L-(Tosylamido-2-phenyl)ethylchlormethylketon (TPCK) behandeltes Trypsin (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ, USA), und über Nacht bei 34ºC inkubiert.
Der Überstand wurde geerntet und unverdünnt eingesetzt, um konfluente Monoschichten von MDCK-Zellen in 10-cm-Schalen (zwei pro Transfektion) zu infizieren, die dann mit 0,8% Agarose in L-15-Medium (JRH), das 2,5 ug/ml TPCK-Trypsin enthielt, überschichtet und bei 34ºC 3 Tage lang inkubiert wurden. Plaques wurden in 0,5 ml MEM/l % BSA übertragen, mit einer Pipette dispergiert und 0,1 ml der Plaque-Dispersion dazu eingesetzt, MDCK-Zellen in 24-Napf-Schalen zu infizieren. Die infizierten MDCK-Zellen wurde 2-3 Tage, lang bei 34ºC inkubiert und gemäß nachstehendem Beispiel 5 auf rekombinantes Virus gescreent.

Beispiel 5: PT/PCR-Screening auf rekombinantes Virus

Überstände aus Näpfen, die zytopathische Wirkung (CPE), d.h. Zellverlängerung und -abrundung, gefolgt von Zellablösung und Zelltod, zeigten, wurden geerntet und mit RQ1-DNase 10 Minuten lang bei 37ºC behandelt, um den Übertrag von Spurenmengen der zugesetzten cDNA zu verhindern. vRNA wurde durch PK-Behandlung des Mediums und anschließende Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung (siehe Beispiel 1) hergestellt. 1/3 der RNA wurde für das RT/PCR-Screening unter Einsatz der Primer n2pb2.4 und PB2006 (siehe Tabelle 1, in der die Sequenzen dieser Primer angeführt sind) eingesetzt. Diese Primer sind in der Lage, eine kurze Region des PB2-Gens aus den drei in diesen Versuchen eingesetzten Stämmen (A/LA/2/87, A/R/8/34 oder A/Mallard/NY/6750/18) zu amplifizieren. Erststrang-cDNA wurde mittels reverser Transkriptase Superscript II (Gibco/BRL, Bethesda, MD, USA) im vom Hersteller bereitgestellten Reaktionspuffer, 0,1 mM aller Desoynukleotidtriphosphate (dNTPs; Promega Madison, WI, USA),1 uM n²pb2.4-Primer und 2 Einheiten/ml RNAsin (Promega) 30 Minuten lang bei 42ºC synthetisiert. Das Reaktionsgemisch wurde auf 1 · PCR Puffer II (Perkin Eimer), 2 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM dNTPs, jeweils 0,2 uM Primer und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase eingestellt. PCR erfolgte in einem Thermozyklierer von Perkin Eimer (Norwalk, CT, USA). 35 einminütige Denaturierungszyklen bei 94ºC, einminütiges Annelieren bei 50ºC und zweiminütiges Verlängern bei 12 tC erfolgten, bevor 30-minütige Inkubation hei 72ºC erfolgte.
Die unter Verwendung dieser Primer erzeugten PCR-Fragmente wurden durch Spaltung mit Hinfl (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) charakterisiert, was zu unterschiedlich dimensionierten Spaltprodukten führt, die für die PB2-Gene der drei Stämme diagnostisch sind (siehe nachstehende Tabelle 3). Tabelle 3: PB2 RT/PCR-Hinfl-Spaltungsfragment-Größen (bp)
PB2-Virusvarianten aus Plaques, deren Identifizierung ergab, dass sie PB2-RNA-Sequenz-Varianten aufwiesen, wurden in MDCK-Zellen plaquegereinigt, einmal in MDCK- Zellen bei 34ºC (in MEM + Trypsin, 2-3 Tage lang) passagiert, durch RT/PCR und Hinfl-Restriktionsanalyse wie oben erneut gescreent Lind dann In SPF-Eiern (SPAFAS) bei 35ºC gezüchtet (außer Virus mit der ALA4-Mutation, das in SPF-Eiern (SPAFAS) bei 33 ºC gezüchtet wurde). RT/PCR zeigte, dass sechs der acht PB2-Influenzavirus-Varianten mittels der obigen Techniken erfolgreich transfiziert und gewonnen wurden (ALA1, ALA4, ALA5, ALA6, ALA7 und ALA8). ALA2 und ALA3 wurden nach mehreren Versuchen nicht gewonnen und kodieren wahrscheinlich für PB2-Proteine, die in MDCK-Zellen biologisch inaktiv sind.

Beispiel 6: Bestimmung der Temperaturempfindlichkeit

Stammlösungen der PB2-Virusvarianten aus Beispiel 5 wurden durch Plaque-Tests in MDCK-Zellen bei 34ºC (der permissiven Temperatur) in einem CO&sub2;-Inkubator oder bei 37ºC, 38ºC, 39ºC oder 40ºC in Nalgene-Biocontainern (Nalge, Rochester, NY, USA), die in Wasserbäder eingetaucht waren, deren Temperaturen durch Lauda-Konstanttemperatur-Immersionszirkulatoren (Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA) präzise kontrolliert wurden, titriert. Die Wasserbäder hielten die gewünschten Temperaturen innerhalb eines Bereichs von 0,1ºC. Die wasserdichten Behälter wurden vor dem Verschließen mit 5% CO&sub2;, 21% O&sub2;, und 74% N&sub2; (Bioblend; Altair, San Ramon, CA, USA) gespült. Die Shut-off-Temperatur war als die niedrigste Temperatur definiert, bei der eine zumindest 100fache Senkung der Plaquing-Effizienz (EOP) gegenüber der bei 34 ºC beobachteten Effizienz beobachtet wurde.
Ein Virus wurde als temperaturempfindlich definiert, wenn die Plaque-Größe bei erhöhten Temperaturen reproduzierbar verringert wurde und/oder wenn die EOP bei 39ºC zumindest zehnfach verringert war. EOP und Plaque-Morphologie wurden bei Temperaturen analysiert, die von 37ºC bis 40ºC reichten. Die EOP des A/LA/2/87-Stammvirus oder des Transfektanten der Wildform (Isolat LA 36-8.1) variierte in diesem Bereich weniger als zweifach. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle 4 angeführt. Tabelle 4: Phenotypen von PB2-ALA-Virusmutanten in MDCK-Zellen :
¹ Plaque-Durchmesser (nach dreitägiger Inkubation): groß = 2-3 mm; klein = 1-2 mm; winzig = ≤1 mm

Beispiel 7: Reaktionsfähigkeit von PB2-Virusvarianten in Frettchen

Frettchen sind ein sehr gut geeignetes Tiermodell zum Testen der Reaktionsfähigkeit von Kandidaten für lnfluenzavakzinen-Stämme, da sie mehrere Anzeichen der Influenza-Infektion zeigen, die sie mit Menschen teilen, z.B. Fieber, Coryza, Niesen und Lethargie.
Zehn bis zwölf Wochen alte männliche kastrierte Frettchen, die auf Influenza-Antikörper vorgescreent und sieben Tage lang mit Penicillin behandelt worden waren (30.000 Einheiten pro Tag) stammten von den Triple F Farms (Sayre, PA, USA). Die Frettchen wurden mit Diethylether anästhesiert und intranasal mit etwa 10&sup8; EID&sub5;&sub0;-Virus in einem Inoculum von 1 ml (0,5 ml in jedes Nasenloch) infiziert. Die Körpertemperatur der infizierten Frettchen wurde rektal zweimal täglich drei Tage lang ermittelt. Die normale Körpertemperatur nicht-infizierter Frettchen beträgt 39ºC (102,2ºF). Fieber ist als eine Temperatur von 39,73ºC (103,5ºF) oder darüber definiert. Nach drei Tagen wurden die Frettchen mittels Herzpunktion mit Natriumpentobarbital (130 mg/Frettchen) euthanasiert und die Lungen und die Nasenmuscheln entfernt. Gewebesuspensionen (10% (w/v)) wurden durch Homogenisieren in Hank's Balanced Saline Solution (HBSS, Gibco/BRL, Bethesda, MD, USA), umfassend 2 · Basal Eagle Media (BME) Aminosäuren, 2 x BME Vitamine, 4 mM L-Glutamin und 0,05 mg/ml Gentamycinsulfat (alle Ergänzungsstoffe von Gibco/BRL), hergestellt. Die Virenliter wurden mittels des EID&sub5;&sub0;-Tests bestimmt (siehe Barrett, "Growth, Purification and Titration of Influenza Viruses", S. 119- 150, B.W.J. Mahy (Hrsg.), IRL Press, Oxford, England (1985)).
Die zwei am stärksten abgeschwächten PB2-Mutanten, ALA1 (Isolat 49-14.1) und ALA4 (Isolat 65-31.1.), dienten zum Infizieren von Gruppen von jeweils drei Frettchen. Als Vergleiche wurden drei Frettchen auch mit einem transfektanten Virus infiziert, welches das LA PB2-Gen der Wildform enthielt (Isolat LA 36-8.1 dient als Vergleich für ALA1 und LA 36-9.1 als Vergleich für ALA4). Die Ergebnisse sind in nachstehenden Tabellen 6a und 6b angegeben. ALA1 war nicht signifikant abgeschwächt, da es in den Nasenmuscheln auf identische Werte replizierte, und induzierte einen identischen Temperaturanstieg wie der Transfektant der Wildform. ALA4 bewirkte jedoch bei den drei infizierten Frettchen kein Fieber und replizierte in den Nasenmuscheln auf niedrigere Titer. Diese Ergebnisse belegen, dass ein ts-Virus, das durch "Clustered-charged-to-alanine"-Mutagenese des PB2-Gens (ALA4) erzeugt wird, einen Phenotyp besitzt, der sich dazu eignet, Kandidaten für Vakzinen in abgeschwächter Form herzustellen. Tabelle 6a: Reaktionsfähigkeit von ALA1 in Frettchen Tabelle 6b: Reaktionsfähigkeit von ALA4 in Frettchen

SEQUENZAUFLISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: AVIRON
(B) STRASSE: 297 North Bernardo Avenue
(C) STADT: Mauntain View
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: CA 94043
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Neuartige, rekombinante, temperaturempfindliche Influenza-Mutanten
(iii) ANZAHL AN SEQUENZEN: 30
(iv) COMPUTERLESBARE FORM:
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(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
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(v) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
ANMELDENUMMER: EP 96917006.7
(vi) PRIORITÄTSANMELDUNGSDATEN:
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Claims

1. Rekombinantes, temperaturempfindliches Influenza-Virus, in dem zumindest eine RNA-Sequenz, die für das Influenzavirus-PB2-Protein kodiert, duch Ersetzen von Nukleotiden, die für eine oder mehrere der geladenen Basen paare kodieren, durch Nukleotide, die für eine oder mehrere neutrale Basenpaare kodieren, in zumindest einem geladenen Cluster von Basen paare modifiziert wurde.

2. Virus nach Anspruch 1, worin die für PB2-Protein kodierende RNA-Sequenz eine Sequenz umfasst, welche die aus der aus ALA1, ALA4, ALA6, ALA7 und ALA8 bestehenden Gruppe ausgewählten Modifikationen enthält.

3. Virus nach Anspruch 1, worin das Virus ein "reassortantes" Virus ist.

4. Für PB2-Protein kodierende, modifizierte RNA-Sequenz, die für ein Influenza- PB2-Protein kodiert, das eine aus der aus ALA1, ALA4, ALA6, ALA7 und ALA8 bestehenden Gruppe ausgewählte Mutation enthält.

5. Influenza-PB2-Protein, das eine aus der aus ALA1, ALA4, ALA6, ALA7 und ALA8 bestehenden Gruppe ausgewählte Mutation enthält.

6. cDNA-Sequenz, die einer RNA-Sequenz nach Anspruch 4 entspricht.

7. Immunogene Zusammensetzung, umfassend eine wirksame immunogen induzierende Menge an Virus nach nach einem der Ansprüche 1 bis 3 im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

8. Rekombinantes, temperaturempfindliches Influenza-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren.

9. Verwendung eines rekombinanten, temperaturempfindlichen Influenza-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines Medikaments zur Influenza-Behandlung.

10. Verwendung nach Anspruch 9, worin die Behandlung der Prophylaxe dient.