DE69535023T2

DE69535023T2 - Ein diagnose-verfahren und ein testsatz für die bestimmung des kell blutgruppln-nenotyps

Info

Publication number: DE69535023T2
Application number: DE69535023T
Authority: DE
Inventors: Soohee Cliffside Park LEE; L. Colvin Franklin Square REDMAN
Original assignee: New York Blood Center Inc
Current assignee: New York Blood Center Inc
Priority date: 1994-11-10
Filing date: 1995-11-09
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2015-11-10
Also published as: JPH10509867A; EP1705255A2; EP0791076A4; ATE513061T1; EP1705255B1; AU4235396A; DE69535023D1; ATE328113T1; AU709728B2; CA2204636A1; WO1996015268A1; CA2204636C; EP1705255A3; EP0791076A1; EP0791076B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Kell-Blutgruppen-Genotyps. Insbesondere betrifft die Erfindung molekulargenetische Verfahren zur Bestimmung von K1/K2-Genotypen.
Das Kell-Blutgruppensystem ist eine bekannte, aber komplexe Gruppe von Blut-Antigenen, die über 20 verschiedene, verwandte Antigene umfasst. Darunter ist vom Antigen K1 (K, Kell) bekannt, dass es unter den 23 bekannten Phänotypen das stärkste Immunogen darstellt. Serologisch weist der K1-Sublocus eine allele Beziehung zum Antigen K2 (k, Cellano) von hoher Frequenz auf. Etwa 9% der Bevölkerung weisen den K1-Erythrozyten-Phänotyp auf und Antikörper gegen K1 werden bei etwa 5% von Personen, die eine einzige Einheit von unverträglichem Blut erhalten, entwickelt (Ref. 1).
Die hämolytische Krankheit von Neugeborenen (HDN) ist üblicherweise mit einer mütterlichen Alloimmunisierung gegen Rh (D) assoziiert, aber K1-Unverträglichkeiten können ebenfalls bei Neugeborenen eine schwere hämolytische Krankheit hervorrufen (Ref. 2-7). Eine K1-Sensibilisierung aufgrund einer früheren Schwangerschaft kann zu HDN und Komplikationen während anschließender Schwangerschaften kommen, wenn der Fötus ein K1-Träger ist. Ähnliche Arten von Problemen können im selteneren Fall von K2-Sensibilisierung entstehen. Die Identifizierung des fötalen K1/K2-Genotyps wäre von besonderer Bedeutung in Situationen, bei denen der Vater K1/K2-heterozygot ist. Da die Mutter zur Ermöglichung der früheren Sensibilisierung homozygot sein muss, besteht eine 50 %-ige Chance, dass der Fötus mit einem K:1,2-Vater HDN-gefährdet ist. Aufgrund dieses 50 %-igen Risikos wird die Identifizierung der homozygoten oder heterozygoten Beschaffenheit des K1/K2-Genotyps des Fötus bei diesen Schwangerschaften wichtig, um entsprechende Maßnahmen einzuleiten. Jedoch ist die Erkenntnis von Bedeutung, dass die Bestimmung des parentalen Genotyps bezüglich Kell-Antigenen, die sich von K1/K2 unterscheiden, ebenfalls von Bedeutung für die Überwachung von Schwangerschaften ist.
Die Kell-Vererbung ist autosomal und kodominant und das Gen für das Kell-Protein (KEL) wurde am Chromosom 7q33 kartiert (Ref. 8-11). Kell-Antigene werden offensichtlich in 5 Sätzen von antithetischen, gepaarten Allelen, die Antigene von hoher und niedriger Prävalenz exprimieren, kodiert. Somit stellen K1 (K) und K2 (k) Produkte von Allelen dar, ebenso K3 (Kp^a), K4 (Kp^b) und K21 (Kp^c); K6 (Js^a und K7 (Js^b); K17 und K11; und K24 und K14. Jedoch werden eine Anzahl von Antigenen mit hoher Prävalenz, wie K12, K13, K18 und K22, unabhängig voneinander exprimiert. Einige Kell-Phänotypen treten in rassischen oder ethnischen Gruppen gesondert auf. Beispielsweise ist K6, über das erstmals im Jahre 1958 berichtet wurde, bei Afroamerikanern häufiger. In einer in Seattle, Washington, durchgeführten Studie wurde festgestellt, dass es in dieser Bevölkerungsgruppe bis zu 19,5% auftritt (Ref. 12). Ferner ist K10 (U1^a) bei Finnen stärker vorherrschend (Ref. 13). Diese verschiedenen Beziehungen und ihre Positionen im Kell-System wurden im Laufe der Jahre durch serologische Analysen von informativen Familien festgestellt (Ref. 14-18).
In verschiedenen Studien, unter Einschluss von molekularer Klonierung, wurde festgestellt, dass Kell-Blutgruppen-Antigene von einem 93 kDa-TypII-Glycoprotein getragen werden (Ref. 19-25), das sich an der Oberfläche von Erythrozyten befindet (Ref. 26). Das Kell-Protein weist eine kurze, N-terminale Domäne mit 46 Aminosäuren im Zytoplasma und einen großen, C-terminalen Bereich mit 665 Aminosäuren auf der äußeren Oberfläche des Erythrozyten auf. Sämtliche Kohlenhydrate sind N-verknüpft (Ref. 27), vermutlich an 5 Stellen, nämlich an den Asparaginresten bei 93, 115, 191, 345 und 627. Frühe biochemische Untersuchungen ließen darauf schließen, dass Kell-Antigene auf einem Protein liegen, dessen Konformation weitgehend von Disulfid-Bindungen abhängt (Ref. 28). Das Kell-Protein weist 16 Cysteinreste auf, einen in der Transmembranregion und 15 im externen Bereich (Ref. 25). Eine Reduktion von Erythrozyten durch Sulfhydryl-Reagenzien führt zu einem Verlust an Kell-Antigenen und zur Freilegung von einigen Neoepitopen (Ref. 28).
Man hat ferner damit begonnen, die antigene Struktur des Kell-Proteins zu kartieren. Ein kürzlich entwickelter immunologischer Test, MAIEA, der sich monoklonaler Antikörper gegen verschiedene Kell-Antigene bedient, zeigt, dass bestimmte der identifizierten Kell-Antigene in räumlich getrennten Regionen des Glycoproteins auftreten (Ref. 26). Beispielsweise liegen die K1/K2- und K6/K7-Domänen offensichtlich nahe beieinander, während das K3/K4-Epitop sich an einer unterschiedlichen Position befindet und K18 sich in noch einer anderen Proteindomäne befindet (Ref. 29).
Die Bestimmung des Kell-Genotyps war bisher auf Rückschlüsse begrenzt, die aus dem Nachweis und der Identifizierung von Kell-Antigenen gezogen wurden. Derartige Verfahren verwenden Antikörper oder andere Verbindungen, die das Kell-Protein oder Teile davon identifizieren und mit ihnen in Wechselwirkung treten. Beispielsweise wurden verschiedene Antikörper, die spezifisch für bestimmte Kell-Antigene sind, identifiziert (Ref. 13, 22). Agglutinierungsverfahren zum Nachweis von Kell-Protein und anderer Blutgruppen-Antigene sind in folgenden US-Patenten beschrieben: 5 324 479, 5 302 512, 5 213 963, 4 560 647, 4 403 042, 4 358 436 und 4 148 607. Diese Verfahren liefern Informationen über exprimierte Proteinprofile, jedoch nicht über die molekulare Proteinstruktur oder den molekularen genetischen Aufbau des einzelnen Bestandteils. Zelinski et al. beschreiben ein Verfahren, mit dem indirekt aufgrund von Verknüpfungsstudien unter Verwendung von Marker-Genen auf den Kell-Genotyp geschlossen werden kann (Ref. 30). Derartige Verfahren liefern jedoch nur begrenzte und indirekte Informationen über den Kell-Genotyp. Im allgemeinen erfordern diese Verfahren auch die Gewinnung von Blutproben von den untersuchten Subjekten. Die Bestimmung des fötalen Kell-Phänotyps erfordert normalerweise die Gewinnung einer fötalen Blutprobe. Dies stellt ein potentiell gefährliches Verfahren dar, bei dem der Fötus eine Hämorraghie und möglicherweise den Tod erleiden kann. Keines der bisher beschriebenen Verfahren offenbart eine Methode, mit der der Kell-Genotyp leicht und direkt auf der Basis der KEL-Genstruktur bestimmt werden kann.
Infolgedessen besteht ein Bedürfnis nach einem Verfahren zum sicheren und bequemen Nachweis des Kell-Genotyps. Ferner wäre es wünschenswert, ein Verfahren zur Bestimmung des Kell-Genotyps in einem Fötus bereitzustellen, ohne dass die Gewinnung von Blutproben erforderlich ist. Ein Test auf der Basis von DNA-Proben, die amniotischen Zellen entnommen worden sind, würde es dem Arzt ermöglichen, das Risiko einer Schädigung des Fötus zu vermeiden und genauere Vorhersagen über eine mögliche anti-Kell-assoziierte HDN zu machen.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein diagnostisches Verfahren für die differentielle Bestimmung des Kell-Blutgruppen-Genotyps in einem Subjekt bereit. Das diagnostische Verfahren umfasst die Erzeugung eines charakteristischen Nucleinsäureprodukts aus einer Nucleinsäurequelle oder -probe, die einen Kell-Polymorphismus-Locus umfasst, und zwar in einer Menge, die ausreicht, die Charakterisierung des Kell-Genotyps zu ermöglichen. Das Verfahren kann zur Bestimmung des Kell-Genotyps in bezug auf einen oder mehrere Kell-Polymorphismen oder Kell-Phänotypen eingesetzt werden. Vorzugsweise ist das Verfahren auf den Nachweis der Kell-Polymorphismus-Loci, die den K1/K2-Genotyp festlegen, abgestellt.
Gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren folgendes: das selektive Spalten einer Nucleinsäureprobe, die einen Kell-Polymorphismus-Locus umfasst, vorzugsweise von genomischer DNA des Subjekts, um ein Nucleinsäureprodukt bereitzustellen, das ein oder mehr Nucleinsäurefragmente in einer zur Charakterisierung des Kell-Genotyps ausreichenden Menge umfasst. Vorzugsweise umfasst das Verfahren die selektive Spaltung von Nucleinsäure, die einen oder mehrere K1/K2-Polymorphismus-Loci umfasst.
Die selektive Spaltung von DNA wird durch Verdau der Probennucleisäure mit einem Restriktionsenzym erreicht, das die DNA differentiell auf der Grundlage des Kell-Polymorphismus-Locus spaltet. Es können beliebige geeignete Restriktionsenzyme je nach Wunsch verwendet werden. Im Fall des K1/K2-Polymorphismus-Locus ist BsmI ein bevorzugtes Restriktionsenzym.
Dieses diagnostische Verfahren umfasst vorzugsweise das Amplifizieren von Kell-DNA aus einer von einem Subjekt erhaltenen DNA-Probe. Typischerweise beinhaltet die Amplifikation die Verwendung eines Primers, der nur Nucleinsäure, die den Locus umfasst, der einen spezifischen Kell-Polymorphismus festlegt, amplifiziert. Primer können so ausgewählt werden, dass sie selektiv DNA unter Einschluss von bestimmten Kell-Polymorphismus-Loci, einschließlich des K1/K2-Polymorphismus-Locus, amplifizieren.
Vorzugsweise wird der Verdau von Kell-Nucleinsäure mit einem Restriktionsenzym im Anschluss an die Amplifikation der vom Subjekt erhaltenen Nucleinsäure durchgeführt, wobei der Verdau auch vor einer derartigen Amplifikation vorgenommen werden kann.
Bei einer zweiten bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße diagnostische Verfahren das differentielle Amplifizieren einer Nucleinsäureprobe, die einen Kell-Polymorphismus-Locus umfasst, um ein Nucleinsäureprodukt herzustellen, das zur Charakterisierung des Kell-Genotyps verwendet werden kann. Vorzugsweise arbeitet die Probennucleinsäure als Matrize, die eine Amplifikation mittels eines Primers ermöglicht, der differentiell Nucleinsäure amplifiziert, die für eine spezifische Allele eines Satzes von Allelen, die mit einem Kell-Polymorphismus assoziiert sind, kodiert.
Bei den erfindungsgemäßen diagnostischen Verfahren, die einen Primer oder ein Primerset erfordern, können der Primer oder das Primerset einen einzelnen Primer oder eine Mehrzahl von Primern, beispielsweise einschließlich einer Mehrzahl von Primerpaaren, umfassen. Zum Beispiel können in einer bevorzugten Ausführungsform beim erfindungsgemäßen Verfahren ein Primer, der spezifisch K1-DNA amplifiziert (K1-Allelenspezifischer Primer), ein Primer, der spezifisch K2-DNA amplifiziert (K2-Allelen-spezifischer Primer) und zwei Primer, die jeweils K1- und K2-DNA amplifizieren (Allelen-unspezifische Primer) verwendet werden. Bei dieser Ausführungsform werden PCR-Produkte von unterschiedlicher Größe erzeugt, die einer K1-DNA, K2-DNA und K1/K2-DNA entsprechen. Das Muster der PCR-Fragmente dient zur Unterscheidung zwischen K1/K1-, K2/K2- und K1/K2-Genotypen.
Ein besonders bevorzugter Oligonucleotid-Primer, der Allelenspezifisch für K1-enthaltende Nucleinsäure ist, umfasst eine Nucleotidsequenz, die aus der Gruppe der folgenden Nucleotidsequenzen ausgewählt ist: ATA CTG ACT CAT CAG AAG TTT CAG CA (SEQ ID NO:1), ATA CTG ACT CAT CAG AAG TCT CAG CA (SEQ ID NO:2) und ATA CTG ACT CAT CAG AAG TGT CAG CA (SEQ ID NO:61).
Ein besonders bevorzugter Oligonucleotid-Primer, der Allelenspezifisch für K2 enthaltende Nucleinsäure ist, weist die folgende Nucleotidsequenz auf: TGG ACT TCC TTA AAC TTT AAC TGA AC (SEQ ID NO:3).
Besonders bevorzugte Oligonucleotid-Primer, die spezifisch für K1 und K2 enthaltende Nucleinsäuren sind (jedoch Allelen-unspezifisch sind), weisen Nucleotidsequenzen auf, die aus der folgenden Gruppe von Nucleotidsequenzen ausgewählt sind: TTT AGT CCT CAC TCC CAT GCT TCC (SEQ ID NO:4), TAT CAC ACA GGT GTC CTC TCT TCC (SEQ ID NO:5), TTA GTC CTC ACT C-C CAT GCT TCC (SEQ ID NO:62) und TCA CAC AGG TGT CCT CTC TTC C (SEQ ID NO:63). Die Primer können für die Amplifikation in Paaren verwendet werden.
Das erfindungsgemäße diagnostische Verfahren umfasst ferner das Ableiten von Informationen aus erzeugten Nucleinsäure-Restriktionsfragmenten oder -Amplifikationsprodukten. Vorzugsweise umfasst das Ableiten von Informationen die Trennung der Nucleinsäureprodukte, um ein Muster von Fragmenten zu erzeugen, das spezifische Informationen zur Charakterisierung des Kell-Genotyps ergibt.
Insbesondere stellt die Trennung ein Muster von Nucleinsäureprodukten bereit, das spezifische Informationen zur Charakterisierung des K1/K2-Genotyps ergibt. Ferner ist es bevorzugt, einige oder sämtliche der Kell-Nucleinsäureprodukte nachzuweisen, z. B. durch Markieren oder Färben von einem oder mehreren Produkten. Produkte können mit einer nichtspezifischen Markersubstanz markiert werden. Derartige Substanzen können zur Färbung von einigen oder von sämtlichen Produkten verwendet werden, um ihre Unterscheidung auf der Grundlage ihres Trennungsmusters zu ermöglichen. Alternativ kann die Nachweisstufe das Markieren von einem oder mehreren der Kell-Nucleinsäureprodukte mit einer oder mehreren Hybridisierungssonden in einer selektiven oder spezifischen Art und Weise umfassen. Vorzugsweise werden eine oder mehrere Hybridisierungssonden verwendet, die spezifisch eines oder mehrere der Nucleinsäureprodukte markieren, die einen Kell-Polymorphismus-Locus von Interesse, z. B. den K1-Locus oder den K2-Locus umfassen.
Das erfindungsgemäße molekulargenetische Verfahren beinhaltet allgemein die Gewinnung von Nucleinsäure, beispielsweise von genomischer DNA, aus einer biologischen Probe eines menschlichen Subjekts oder eines Patienten. Eine Blutprobe wird typischerweise bevorzugt, wobei aber auch andere Typen von Gewebeproben, die erythroides Gewebe enthalten, geeignet sind. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird erfindungsgemäß ein verfahren zur Bestimmung des K1/K2-Kell-Blutgruppen-Genotyps in einem Fötus bereitgestellt. Bei dieser Ausführungsform umfasst die bevorzugte Gewebeprobe eine Probe von amniotischer Flüssigkeit oder von chorionischem Villus.
Die Erfindung stellt ferner Nucleinsäure-Oligomere auf Kell-Basis bereit, die Nucleotidsequenzen umfassen, die zumindest im wesentlichen komplementär mit einer polymorphen Region einer Nucleinsäure auf Kell-Basis, z. B. Kell-Genom-DNA, -mRNA oder -cDNA, sind. Insbesondere stellt die Erfindung Nucleinsäure-Oligomere bereit, die eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die im wesentlichen komplementär mit K1-DNA ist, sowie Oligomere, die eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die im wesentlichen komplementär mit K2-DNA ist. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Oligomeren genau komplementär mit der Region von Interesse.
Außerdem stellt die Erfindung Nucleinsäure-Oligomere bereit, die eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die im wesentlichen homolog mit einer polymorphen Region einer Nucleinsäure auf Kell-Basis, wie Kell-Genom-DNA, -mRNA oder -cDNA, ist. Insbesondere werden erfindungsgemäße Nucleinsäure- Oligomere bereitgestellt, die eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die im wesentlichen homolog mit K1-DNA ist, sowie Oligomere, die eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die im wesentlichen homolog mit K2-DNA ist. Diese erfindungsgemäßen Oligomeren umfassen vorzugsweise eine Nucleinsäuresequenz, die zumindest teilweise genau homolog mit einem Zielbereich einer Nucleinsäure auf Kell-Basis ist.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Oligomeren können als Hybridisierungssonden zur Identifizierung der Gegenwart von Ziel-Nucleinsäuresequenzen über eine Bindung an derartige Zielsequenzen oder eine Hybridisierung mit diesen verwendet werden. Demzufolge können die Nucleinsäure-Oligomeren nachweisbar markiert werden, indem sie mit einem nachweisbaren Markerrest, z. B. einer fluoreszierenden Markierung, einer elektronendichten Substanz, einem Reporterrest, einem spezifischen oder unspezifischen Bindungsrest oder einem anderen nachweisbaren Rest, der aus dem Stand der Technik bekannt ist, verknüpft werden. Gegebenenfalls können die erfindungsgemäßen Oligomeren ferner einen reaktiven Rest umfassen, der eine Vernetzung mit einer Ziel-Nucleinsäuresequenz ermöglicht. Ferner können die erfindungsgemäßen Oligomeren mit einem Substratmaterial, z. B. einem Gel oder einem Harz, verknüpft werden, um die Oligomeren zu immobilisieren.
Die erfindungsgemäßen Oligomeren können auch als Amplifikationsprimer verwendet werden, die spezifisch an eine Region einer Kell-Nucleinsäure, die einen Kell-Polymorphismus-Locus umfasst, binden oder eine Verlängerung durch diese Region bewirken. Bevorzugte Primer binden an eine Kell-Nucleinsäure, die einen K1/K2-Locus enthält oder verursachen eine Verlängerung durch diese Kell-Nucleinsäure.
Außerdem ermöglicht es die Identifikation des Locus, der den K1/K2-Polymorphismus charakterisiert, Polypeptide auf Kell-Basis herzustellen, die Aminosäuresequenzen umfassen, die im wesentlichen homolog zur K1-Domäne oder K2-Domäne des Kell-Proteins sind. Die Polypeptide können sich von natürlichen Quellen ableiten und im wesentlichen gereinigt sein oder sie können in einer im wesentlichen reinen Form wunschgemäß synthetisiert werden. Derartige Polypeptide können gemäß bekannten Verfahren in nachweisbarer Weise markiert, mit reaktiven Resten verknüpft und an ein Substrat gebunden werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide eignen sich als Sonden beispielsweise zum Nachweis der Alloimmunisierung bei einem Subjekt oder Patienten. Bei einem derartigen Test kann das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfassen, die im wesentlichen homolog mit dem K1- Antigen ist und ein immunologisches Profil aufweist, das eine spezifische Reaktion mit anti-K1-Antikörpern erlaubt.
Somit wird erfindungsgemäß entsprechend einer weiteren Ausführungsform ein diagnostisches Verfahren zum Nachweis der Alloimmunisierung eines Patienten gegen ein Kell-Antigen, vorzugsweise K1-Antigen, bereitgestellt. Bei dieser Ausführungsform umfasst das Verfahren die Gewinnung einer Blutprobe eines Patienten oder Subjekts und die Messung eines Parameters der immunologischen Reaktivität der Probe mit einer Polypeptidsonde. Die Polypeptidsonde umfasst vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, die im wesentlichen homolog mit der K1/K2-Domäne des Kell-Proteins ist. Außerdem ist es erstrebenswert, dass die Polypeptidsonde spezifisch reaktiv mit anti-K1-Antikörpern, die in der Probe vorhanden sind, ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine diagnostische Testpackung zur Bestimmung des Kell-Blutgruppen-Genotyps in einer Gewebeprobe eines Patienten bereitgestellt. Bei dieser Ausführungsform wird erfindungsgemäß eine diagnostische Testpackung zur Bestimmung des Kell-Blutgruppen-Genotyps durch Nachweis von Ziel-Nucleinsäuresequenzen, z. B. von K1- und K2-spezifischen Sequenzen, bereitgestellt. Die Testpackung umfasst Amplifikationsprimer, d. h. Oligonucleotide, die an für K1 und K2 spezifische Sequenzen binden oder eine Verlängerung durch diese Sequenzen hervorrufen. Die in vitro-Testpackung umfasst ferner einen Behälter, z. B. eine Mikrotiterplatte mit einer Mehrzahl von Vertiefungen, an die Oligonucleotid-Abfangsonden gebunden sind, die Nucleinsäuresequenzen aufweisen, die im wesentlichen komplementär zu den K1- und K2-Zielsequenzen sind.
Alternativ wird erfindungsgemäß eine diagnostische Testpackung zur Bestimmung des Kell-Blutgruppen-Genotyps durch Nachweis von Ziel-Nucleinsäuresequenzen, die spezifisch für bestimmte Kell-Antigene, wie K1 und K2 sind, bereitgestellt. Bei dieser Ausführungsform umfasst die Testpackung folgendes:

(a) ein Primer-Set mit einem ersten und einem zweiten PCR-Primer, wobei es sich beim ersten PCR-Primer um ein Oligonucleotid handelt, das an eine für K1 spezifische Sequenz bindet oder eine Verlängerung durch diese bewirkt, und es sich beim zweiten PCR-Primer um ein Oligonucleotid handelt, das an eine für K2 spezifische Sequenz bindet oder eine Verlängerung durch diese bewirkt; und
(b) einen Behälter, wie eine Mikrotiterplatte mit einer Mehrzahl von Vertiefungen, an die Oligonucleotid-Abfangsonden gebunden sind, die eine Nucleinsäuresequenz aufweisen, die im wesentlichen komplementär zu Zielsequenzen ist.

Die Erfindung stellt ferner rekombinante Expressionsvektoren bereit, die Kell-Nucleinsäuresequenzen tragen. Die Erfindung stellt Expressionsvektoren bereit, die eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die für mindestens einen Teil des Kell-Proteins kodiert, einschließlich einen Teil des Proteins, der für eine Stelle des Kell-Polymorphismus kodiert. Insbesondere stellt die Erfindung Expressionsvektoren bereit, die K1-cDNA tragen, die eine Transformation von Zellen unter Bildung von tranformierten Zellen oder Transformanten ermöglicht, die K1-Protein auf ihren Zelloberflächen exprimieren. Erfindungsgemäß werden ferner stabile Zelllinien, die so modifiziert (d. h. transformiert) worden sind, dass sie ein Protein an ihrer Zelloberfläche exprimieren, sowie ein Verfahren zur Transformation einer Zelllinie zur Expression eines derartigen Proteins bereitgestellt. Bezüglich der K1-Expression umfasst ein derartiges Protein vorzugsweise mindestens die K1-Domäne und insbesondere handelt es sich bei dem Protein um das K1-Protein. Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines für ein Kell-Antigenspezifischen Antikörpers bereit, indem man die Erzeugung von mindestens einem Antikörper gegen ein Kell-Antigen induziert, das durch eine erfindungsgemäß erzeugte, transformierte Zelllinie exprimiert wird. Polyklonale Antikörper kommen in Betracht, jedoch handelt es sich beim Antikörper vorzugsweise um einen monospezifischen Antikörper, z. B. einen monoklonalen Antikörper oder eine Antigen-Bindungsregion davon.
Demzufolge wird erfindungsgemäß nunmehr ein sicheres und zweckmäßiges diagnostisches Verfahren zur differentiellen Bestimmung des Kell-Genotyps von Patienten bereitgestellt. Insbesondere wird nunmehr ein Verfahren zur Bestimmung des Kell-Genotyps in einem Fötus im Uterus bereitgestellt, ohne dass es erforderlich ist, eine Blutprobe zu entnehmen. Ein Test auf der Basis der Bestimmung des Kell-Genotyps, insbesondere des K1/K2-Genotyps, aus DNA, die aus amniotischer Flüssigkeit erhalten worden ist, ermöglicht es nunmehr dem Arzt, die Gefahr für den getesteten Fötus zu verringern. Außerdem ermöglicht das neue diagnostische Verfahren eine genaue Vorhersage über die Möglichkeit einer anti-K-assoziierten hämolytischen Erkrankung des Neugeborenen.
Diese und weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der ausführlichen Beschreibung und den Beispielen, die nachstehend vorgelegt werden. Die ausführliche Beschreibung und die Beispiele dienen dem besseren Verständnis der Erfindung, sollen aber den Schutzumfang der Erfindung nicht beschränken.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Zu Erläuterungs- und Beschreibungszwecken wurden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung ausgewählt, womit aber keine Absicht verbunden ist, den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken. Die bevorzugten Ausführungsformen bestimmter Aspekte der Erfindung sind in der beigefügten Zeichnung dargestellt.
1 zeigt eine Karte des Kell-Gens unter Angabe der Loci der Kell-Exons, der Beziehungen unter den Klonen, die zur Feststellung der Exon-Positionen herangezogen werden, sowie der Restriktionsstellen im Kell-Gen.
2A–2D zeigen die Nucleotidsequenzen der Exons des Kell-Gens.
3 zeigt die 5'-Flankierungsregion und das Exon 1 des Kell-Gens.
4 zeigt ein Autoradiogramm zur Erläuterung der Promotoraktivität der 5'-Flankierungsregion des Kell-Gens.
5 zeigt einen Vergleich der 3'-Enden des Kell-Gens, erhalten aus verschiedenen Klonen des Gens.
6 zeigt ein Ethidiumbromid/Agarose-Gel zur Erläuterung einer differentiellen Trennung einer amplifizierten DNA entsprechend spezifischen Fragmenten des Kell-Gens.
7 zeigt einen Vergleich entsprechender Bereiche von K1-DNA und K2-DNA.
8 zeigt ein Ethidiumbromid/Agarose-Gel zur Erläuterung einer differentiellen Trennung einer amplifizierten DNA entsprechend K1-DNA und K2-DNA gemäß den Verfahren der Erfindung.
9 zeigt eine elektrophoretische Ethidiumbromid/Agarose-Gelauftrennung von PCR-Produkten, die nach den erfindungsgemäßen Verfahren erhalten worden sind.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Das Kell-Blutgruppensystem ist durch seine antigene Komplexizität gekennzeichnet (Ref. 18). Dem Kell-System werden über 20 verschiedene Antigene zugeschrieben. Ein Großteil der Antigene sind in 5 antithetischen Sätzen von Antigenen mit hoher und geringer Frequenz organisiert, wobei andere Kell-Antigene unabhängig voneinander exprimiert werden. Die molekulare Basis für diese antigene Diversität wurde bisher nicht vestanden. Die vorliegende Erfindung, die die Beschreibung der Organisation des KEL-Gens und der Grenzbereiche ihrer 19 Exons beinhaltet, ermöglicht nunmehr die molekulare Charakterisierung der verschiedenen Kell-Phänotypen.
Die molekulare Basis der verschiedenen Kell-Phänotypen wurde bisher nicht bestimmt. Nachdem nunmehr die Struktur des KEL-Gens untersucht worden ist und erstmals die 19 Exons, die für das Kell-Protein kodieren, identifiziert worden sind, wurden molekulare Grundlagen der Polymorphismen im Kell-Genotyp nunmehr festgelegt.
Insbesondere wurde jetzt der K1/K2-Polymorphismus und dessen Locus durch Sequenzierung der Exons von K1/K1-DNA und durch einen Vergleich dieser Exons mit K2/K2-Sequenzen bestimmt. Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass eine Basensubstitution im Exon 6 des K1-Genotyps eine Vorhersage über einen Aminosäureaustausch gibt. Diese Basensubstitution schafft ferner eine Restriktionsenzymstelle, die zum Testen von über 40 verschiedenen Proben verwendet worden ist, um zu bestätigen, dass diese Basensubstitution den K1-Genotyp identifiziert.
Der am stärksten vorherrschende Kell-Phänotyp ist K: -1, 2, -3, 4, -6, 7, 9, 11, 12, 14, 18, 19, 22. Wir haben nunmehr die 19 Exons des KEL-Gens einer Person mit einem üblichen Kell-Phänotyp definiert. Zur Bestimmung der molekularen Basis des Kell-Polymorphismus konstruierten wir eine Reihe von Primern, die die 19 Exons von KELL amplifizieren. Wir verglichen dann die DNA-Sequenzen von Personen, die verschiedene Kombinationen von Antigenen mit hoher und niedriger Frequenz exprimieren, um Sequenzvariationen zu bestimmen, die möglicherweise mit den beobachteten Variationen der Antigen-Expression im Zusammenhang stehen.
Beispielsweise verglichen wir die DNA-Sequenzen von K1/K1- und K2/K2-DNA. Der einzige Basenaustausch, der für eine unterschiedliche Aminosäure kodiert, wurde im Exon 6 aufgefunden, der ein Threonin zu einem Methionin an einem Konsensus-N-Glycosylierungsmotiv austauscht (ASn.X.Thr→Met). Dieser Austausch verhindert eine N-verknüpfte Glycosylierung an dieser Stelle. Auf der Grundlage der Aminosäuresequenz des Kell-Proteins vom üblichen Phänotyp gibt es 6 mögliche N-Glycosylierungsstellen, d. h. die Asparaginreste 93, 115, 191, 345, 627 und 724. Jedoch ist das Asparagin in Position 724 vermutlich nicht glycosyliert, da es Bestandteil einer Asn.Pro.Ser-Sequenz ist und das Vorliegen von Prolin zwischen Asparagin und Serin/Threonin die N- Glycosylierung hemmt (Ref. 31). Jedenfalls würde ein Austausch von Threonin zu Methionin in Position 193 eine Glycosylierung am Asparagin 191 verhindern. Somit wäre das K1-Protein aus höchstens vier anstelle von 5 Kohlenhydratresten zusammengesetzt. Das Fehlen einer Kohlenhydrat-Seitenkette kann verschiedene Teile des Proteins exponieren, was zu einer immunogenen Beschaffenheit führt. Der Verlust der Glycosylierung in einem Erythrozyten-Oberflächenprotein kann zu einem Wechsel des Blutgruppen-Phänotyps führen. Bei der Webb-Glycophorin C-Variante fehlt ebenfalls ein N-Glycan (Ref. 32-33).
Ferner wurde nunmehr beobachtet, dass die Punktmutation von C zu T im Exon 6 auch eine neue Restriktionsenzymstelle, 5'-GAATGCT-3', schafft, die durch BsmI, eine bekannte Restriktionsendonuclease, geschnitten werden kann. Die Anwendung des Restriktionsenzym-Verdaus ermöglicht die Differenzierung von K1/K1- und K2/K2-Homozygoten und K1/K2-Heterozygoten, was die Entwicklung eines diagnostischen Genotyp-Verfahrens erlaubt.
Ohne Festlegung auf eine Theorie weiß man, dass in seltenen Fällen Erythrozyten beobachtet werden, die keinerlei Kell-Antigene exprimieren. Bei diesen Phänotyp, bekannt als K_o (null), weisen die Erythrozyten auf ihrer Zellmembran offensichtlich keinerlei Kell-Protein auf. Doch zeigen vorläufige Experimente in unserem Laboratorium, dass zwei K_o-Personen Kell-mRNA im peripheren Blut enthalten und dass die Sequenz der mRNA vom ATG-Initiationskodon zum Poly-A-Schwanz identisch mit der von mRNA ist, die von Personen mit dem üblichen Kell-Phänotyp erhalten worden sind. Dies zeigt, dass die Basensequenzen in den 19 Exons von K2 und von einigen K_o-Personen identisch sind. Daher könnte eine PCR-Amplifikation des Exons 6 und eine Genotypisierung durch Behandlung mit BsmI ein Anzeichen für einen K2-Genotyp in K_o-Personen sein. Eine serologische Analyse stellt leicht den K_o-Homozygoten fest, doch würden die K_o-Heterozygoten serologisch als K2 oder K1 identifiziert und eine BsmI-Analyse würde keine weitere Unterscheidung liefern. Vermutlich wäre die gleiche Situation bei den Kmod-Phänotypen gegeben, bei denen die Expression sämtlicher Kell-bezogener Antigene geschwächt ist. Trotzdem sind aus praktischen Gründen derartige zweifelhafte Phänotypen von geringerer klinischer Bedeutung, da K_o- und Kmod-Phänotypen sehr selten sind. K_o-Heterozygoten wären phänotypisch und daher klinisch gleichwertig mit K1- oder K2-Homozygoten. Was bei K1-sensibilisierten Schwangerschaften allgemein von Bedeutung ist, ist die Feststellung, ob der Fötus ein K1-Träger ist oder nicht. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht nunmehr die Identifizierung des Kell-Genotyps einschließlich einer Identifizierung des K1-Gens.
Um eine klarere und genauere Beschreibung der Erfindung zu ermöglichen, werden in der folgenden Erörterung bestimmte terminologische Konventionen eingehalten. Diese Konventionen dienen dazu, eine praxisgerechte Handhabe zur vertieften Beschreibung der Erfindung zu gewährleisten, sind aber nicht als Beschränkung anzusehen. Der Fachmann erkennt, dass auch andere zusätzliche Interpretationen eingeschlossen sein können.
Der hier verwendete Ausdruck "Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus" oder "RFLP" bezieht sich auf Unterschiede in DNA-Nucleotidsequenzen, die willkürlich über das gesamte Genom verteilt sind und die bei Verdau von genomischer DNA verschiedene Restriktionsendonuclease-Muster für verschiedene Individuen ergeben. Gleichermaßen bezieht sich der Ausdruck "Restriktionsstelle" auf eine Stelle in einer Nucleinsäure, an der ein Restriktionsenzym die Nucleinsäure spaltet. Die Spaltung einer Nucleinsäure durch ein Restriktionsenzym erzeugt Nucleinsäurestücke, die als "Restriktionsfragmente" bezeichnet werden. Wenn eine Restriktionsstelle als Folge einer Mutation oder eines Allelismus gewonnen wird oder verloren geht, kann sich das Restriktionsfragmentmuster verändern, wodurch man Informationen über die Position der Stelle erhält.
Die Ausdrücke "polymorph" oder "DNA-Polymorphismus" beziehen sich auf den Zustand, bei dem zwei oder mehr Variationen einer spezifischen DNA-Sequenz gemeinsam in der gleichen Kreuzungspopulation vorliegen. Polymorphe Unterschiede werden durch Unterschiede in der Aminosäuresequenz verursacht, die womöglich auf Punktmutationen, Genumordnungen oder alternative Spleißvorgänge zurückzuführen sind. Bei "Allelen" handelt es sich um Gene, die untereinander polymorphe Varianten sind und alternativ an einem gegebenen Locus im Genom auftreten.
Ein für ein Kell-Protein kodierendes Gen wird als "Kell-Gen" bezeichnet. Die Region eines Kell-Gens, die für eine spezifische Domäne eines Kell-Proteins kodiert, wird als "Kell-Locus" bezeichnet. Beispielsweise wurde als Ergebnis der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass das K1-Antigen und das K2-Antigen durch Allelen des Kell-Gens kodiert werden. Speziell handelt es sich beim K1-Antigen und beim K2-Antigen um wechselweise Versionen der gleichen Domäne des Kell-Proteins, wobei festgestellt worden ist, dass eine einzige Aminosäuresubstitution zum Unterschied zwischen dem Kell-Protein, das das K1-Antigen einschließt, und dem Kell-Protein, das das K2-Antigen einschließt, führt. Es wurde nunmehr festgestellt, dass diese einzige Aminosäuresubstitution aufgrund einer einzigen Nucleotidsubstitution im Kell-Gen entsteht. Somit wird der Bereich des Kell-Gens, der diese Stelle der Nucleotid-Variation einschließt, als "K1/K2-Locus" bezeichnet. Wenn der K1/K2-Locus für das K1-Antigen kodiert, wird diese Region des Kell-Gens als "K1-Locus" bezeichnet. Wenn der K1/K2-Locus für das K2-Antigen kodiert, wird diese Region des Kell-Gens als der "K2-Locus" bezeichnet. Der K1/K2-Locus wird auch als die Stelle oder Locus bezeichnet, der den "K2/K2-Polymorphismus" festlegt oder charakterisiert, d. h. den beobachteten phänotypischen Unterschied zwischen den K1- und K2-Antigenen.
Für die Zwecke der Erfindung kann Kell-Protein, das eine spezielle Domäne von Interesse umfasst, entsprechend dieser Domäne ohne Berücksichtigung der übrigen Domänen des Proteins bezeichnet werden. Wenn somit ein Kell-Protein die für das K1-Antigen verantwortliche Domäne umfasst, kann das Protein als "K1-Protein" bezeichnet werden, während Kell-Protein, das das K2-Antigen oder die K2-Domäne umfasst, als "K2-Protein" bezeichnet wird. Unter Anwendung einer ähnlichen Analyse kann DNA, die für K1-Protein kodiert, als "K1-DNA" bezeichnet werden, während DNA, die für K2-Protein kodiert, als "K2-DNA" bezeichnet werden kann, ohne Berücksichtigung der Tatsache, ob die DNA für andere Kell-Domänen kodiert oder nicht. Ferner ist darauf hinzuweisen, dass andere, mit Kell verwandte oder auf Kell basierende, chromosomale DNAs (einschließlich Exons und Introns und Teile davon), Nucleinsäure-Matrizen, Nucleinsäure-Transkripte, sowie cDNAs gleichermaßen als K1/K2, K1 oder K2 bezeichnet werden können, und zwar je nach Zusammenhang oder Anwendung.
Als Ergebnis der vorliegenden Erfindung ist es nunmehr möglich, Sonden und/oder Primer zu konstruieren, die Nucleinsäure-Oligomere oder Oligonucleotide umfassen, die zum Nachweis von Polymorphismen im Kell-Gen verwendet werden können. Die Sonden oder Primer, die sich für diesen Zweck eignen, hybridisieren bevorzugt mit einer Region des Kell-Antigens oder sind für diese Region spezifisch, die eine Stelle oder eine Region umfasst, in der eine Punktänderung in der Nucleotidsequenz eine Veränderung des Kell-Genprodukts verursacht, die einen Polymorphismus charakterisiert. Demzufolge umfassen die Sonden oder Primer solche, die mit Allelen von höherer Frequenz hybridisieren, sowie solche, die mit Allelen von geringer Frequenz hybrisieren. Bei bestimmten Anwendungen ist es erstrebenswert, das Vorliegen einer heterozygoten Beschaffenheit zu definieren. In derartigen Fällen haben sich Sonden- oder Primerkombinationen, die einen differenziellen Nachweis von zwei oder mehr Allelen und/oder Loci ermöglichen, als wertvoll erwiesen.
Beispielsweise kann bei einer erfindungsgemäßen Sonde davon gesprochen werden, das sie an Kell-DNA bindet oder mit dieser hybridisiert, wenn sie spezifisch eine definierte Region von Kell-DNA. erkennt. Eine größere Präzision ist beabsichtigt, wenn bei einer Sonde davon gesprochen wird, dass sie mit einer spezifischen Allele, wie einer "K1-Sonde" hybridisiert, von der man sagt, dass sie mit K1-DNA hybridisiert.
Bei einem erfindungsgemäßen Primer kann davon gesprochen werden, dass er spezifisch Kell-DNA amplifiziert, wenn er an eine definierte Region von Kell-DNA bindet oder eine Verlängerung durch diese DNA bewirkt. Somit amplifiziert ein Primer spezifisch K1/K2-DNA, wenn er bevorzugt eine Region die den K1/K2-Locus einschließt, amplifiziert. Demgemäß amplifiziert ein K1/K2-Primer DNA unter Einschluß des K1/K2-Locus, amplifiziert aber weder K1-DNA noch K2-DNA in selektiver Weise. Andererseits ist ein Primer für eine bestimmte Allele spezifisch, wie K1 (K1-Primer), wenn er spezifisch nur DNA, die mit dieser Allele assoziiert ist, amplifiziert, wie K1-DNA, während ein für K2 spezifischer Primer (K2-Primer) spezifisch nur K2-DNA amplifiziert. Ähnliche Erwägungen gelten für andere Polymorphismen im Kell-System.
Es ist besonders bevorzugt, dass die Sonden zur Unterscheidung von zwei Allelen befähigt sind, die sich durch nicht mehr als eine einzige Nucleotidmodifikation unterscheiden. Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, dass es möglich ist, die Spezifität der Hybridisierung zu steuern, indem man selektiv Sonden und Primer konstruiert und die Hybrisierungsbedingungen und die übrigen experimentellen Bedingungen einstellt. Es kann jedoch Situationen geben, bei denen es erstrebenswert wäre, Sonden zu verwenden, die etwas weniger selektiv hybridisieren. Demgemäß ist es in einem bestimmten Zusammenhang möglich, dass eine erfindungsgemäße Sonde oder Primer als "im wesentlichen komplementär" mit einer spezifischen Kell-Sequenz bezeichnet wird. Dies bedeutet, dass dann, wenn die Situation eine hohe Präzision erfordert, eine Sonde oder ein Primer im wesentlichen komplementär mit einer Zielsequenz ist, wenn es nur eine sehr geringe Wahrscheinlichkeit gibt, dass das Oligomere mit einer von der spezifischen Zielsequenz abweichenden Sequenz eine Bindung eingeht. In anderen Situationen kann eine Sonde oder ein Primer als im wesentlichen komplementär mit einer Zielsequenz angesehen werden, wenn die Wahrscheinlichkeit einer einzigen Hybridisierung erheblich weniger als 1,0 beträgt. Somit ist eine erfindungsgemäße Sonde oder Primer "im wesentlichen komplementär" mit einer Zielregion, wenn sie im wesentlichen genau komplementär oder auch nur partiell komplementär mit der Zielregion ist, je nach der geforderten Stringenz der Verfahrensparameter.
Somit werden erfindungsgemäß Sonden und Primer bereitgestellt, die mit Teilen oder der Gesamtheit des Kell-Locus hybridisieren. Derartige Sonden sind dann geeignet, wenn es angestrebt wird, das Kell-Gen oder Transkripte davon zu charakterisieren. Außerdem werden erfindungsgemäß Sonden und Primer bereitgestellt, die einen Teil oder die Gesamtheit von einem oder mehreren Introns im Kell-Locus in der chromosomalen DNA umfassen. Derartige Sonden sind geeignet, wenn das Kell-Gen selbst charakterisiert werden soll, um zusätzliche Informationen über die Struktur des Gens in einem bestimmten Individuum zu erhalten.
Die erfindungsgemäßen Sonden und Primer können ferner als Teil ihrer Nucleotidsequenzen Regionen umfassen, die nicht im wesentlichen komplementär mit einer Region, die sich neben oder in der Nähe einer Zielsequenz befindet, sind. Somit ist in einer beliebigen erfindungsgemäßen Sonde oder Primer mindestens ein Teil der Sonde oder des Primers im wesentlichen komplementär mit einem Zielsegment.
Der Ausdruck "Amplifikation" bezieht sich auf eine beliebige molekularbiologische Technik zum Nachweis von Spurenkonzentrationen einer spezifischen Nucleinsäuresequenz durch exponentielles Amplifizieren einer Matrizen-Nucleinsäuresequenz. Techniken für die Amplifikation von DNA sowie von RNA sind bekannt, sowie für die Erzeugung von amplifizierter RNA aus DNA und umgekehrt. Insbesondere umfassen Amplifikationstechniken die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und die Ligase-Kettenreaktion (LCR). Von PCR ist bekannt, dass es sich um eine hochempfindliche Technik handelt, die in breitem Umfang eingesetzt wird. LCR ist als hochgradig spezifisch bekannt und ist zum Nachweis von Punktmutationen befähigt. Unter bestimmten Umständen ist es erstrebenswert, die beiden Techniken zu koppeln, um die Nachweispräzision zu verbessern. PCR ist eine bekannte Technik und wird beispielsweise von Innis et al. (Ref. 34) beschrieben. LCR wurde erst in jüngerer Zeit entwickelt und wird von Landegren et al. (Ref. 35) und Barany et al. (Ref. 36) beschrieben. Eine LCR-Testpackung ist von der Firma Stratagene erhältlich. Von weiteren Amplifikationstechniken lässt sich erwarten, dass sie in erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können.
Der Ausdruck "Primer" bezieht sich auf ein Oligonucleotid (natürlich, kloniert oder synthetisch), das zur Einleitung der Nucleinsäuresynthese zur exponentiellen Amplifikation einer Ziel- oder Matrizen-Nucleinsäuresequenz durch eine Amplifikationstechnik befähigt ist. Bei PCR wirkt der Primer als Initiationspunkt der DNA-Synthese unter Bedingungen, bei denen eine Synthese eines Primer-Erweiterungsprodukts, das komplementär zu einem Nucleinsäurestrang ist, induziert wird, d. h. in Gegenwart von vier verschiedenen Nucleosidtriphosphaten und einem Polymerisationsagens (d. h. DNA-Polymerase oder reverse Transkriptase) in einem geeigneten Puffer und bei einer geeigneten Temperatur. Für LCR ist der Primer zum Annealing mit einer Ziel-Nucleinsäure oder zur Verknüpfung mit einem benachbarten Primer befähigt, um als Matrize für die Amplifikation zu dienen. Für die Zwecke der LCR umfasst der Primer ferner im allgemeinen paarweise Sätze von benachbarten, komplementären Oligonucleotiden, die einzelsträngige Zielmoleküle einem Annealing zuführen können und sie miteinander verknüpfen können. Für die LCR-Amplifikation von DNA umfassen die Primer zwei Sätze von benachbarten, komplementären Oligonucleotiden.
Bei einem Primer handelt es sich vorzugsweise um ein Oligodesoxyribonucleotid, das im Hinblick auf einen maximalen Amplifikationswirkungsgrad einzelsträngig ist, das aber auch doppelsträngig sein kann. Bei doppelsträngiger Beschaffenheit wird der Primer im allgemeinen zunächst zur Trennung seiner Stränge behandelt, bevor er zur Herstellung von Extensionsprodukten verwendet wird. Typischerweise sind LCR-Primer doppelsträngig. Die genaue Länge eines Primers hängt von zahlreichen Faktoren ab, liegt aber typischerweise im Bereich von 15 bis 25 Nucleotiden. Kurze Primermoleküle erfordern im allgemeinen kühlere Temperaturen zur Bildung von in ausreichendem Maße stabilen Hybridkomplexen mit der Matrize. Ein Primer muss nicht die genaue Sequenz der Matrize Wiederspiegeln, muss aber in ausreichendem Maße komplementär sein, um mit einer Matrize zu hybridisieren. Ein Beispiel für eine nicht-komplementäre Sequenz, die in den Primer eingebaut werden kann, ist eine Sequenz, die für eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle kodiert (vergl. US-Patent 4 800 159).
Der hier verwendete Ausdruck "Primer" kann sich auf mehr als einen Primer beziehen, insbesondere in Fällen, bei denen eine gewisse Zweideutigkeit der Informationen bezüglich eines oder beider Enden der zu amplifizierenden Zielregion gegeben ist. Wenn beispielsweise eine Nucleinsäuresequenz aus einer Proteinsäuresequenz abgeleitet wird, kann ein funktioneller "Primer" tatsächlich eine Ansammlung von Primer-Oligonucleotiden umfassen, die Sequenzen enthalten, die einen Teil oder die Gesamtheit der möglichen Kodon-Variationen auf der Grundlage der Degeneration des genetischen Codes repräsentieren. Eines der Primer-Oligonucleotide in dieser Sammlung ist homolog mit dem Ende der Zielsequenz. Gleichermaßen können dann, wenn eine "konservierte" Region einen signifikanten Grad des Polymorphismus in einer Population zeigt, Gemische von Primern hergestellt werden, die benachbarte Sequenzen amplifzieren.
Gegebenenfalls kann ein erfindungsgemäßer Primer oder Sonde markiert werden, indem man eine Markierung einbaut, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunochemische oder chemische Maßnahmen nachweisbar ist. Zu geeigneten Markierungen gehören beispielsweise ³²P, fluoreszierende Farbstoffe, elektronendichte Reagenzien, Reportermoleküle, wie Enzyme (die üblicherweise in ELISAs verwendet werden), Biotin oder Haptene oder Proteine, für die Antiseren oder monoklonale Antikörper verfügbar sind. Eine Markierung kann auch zum "Abfangen" des Primers verwendet werden, um die Immobilisierung des Primers oder der amplifizierten DNA an einem festen Träger zu erleichtern.
Der Ausdruck "Oligonucleotid" oder "Nucleinsäure-Oligomeres" bezieht sich auf nachzuweisende Primer, Sonden und Nucleinsäurefragmente, Nucleinsäurekontrollen und unmarkierende, blockierende Oligomere und ist als ein Molekül definiert, das aus zwei oder mehr Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden besteht. Bei den erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Oligomeren kann es sich um einzelsträngige Oligomere von Desoxyribonucleinsäure (DNA) oder Ribonucleinsäure (RNA) handeln. Die genaue Größe eines Oligonucleotids hängt von zahlreichen Faktoren und der letztendlichen Funktion oder der Verwendung des Oligonucleotids ab. Die Oligodesoxyribonucleotide und Oligoribonucleotide können nach bekannten Verfahren aus natürlichen Quellen erhalten oder abgeleitet werden. Alternativ können die Oligonucleotide synthetisch gemäß bekannter Verfahren erzeugt werden. Derartige Verfahren umfassen beispielsweise die Klonierung und Restriktion von entsprechenden Sequenzen und die direkte chemische Synthese durch ein Verfahren, wie das Phosphotriester-Verfahren gemäß Narang et al. (Ref. 37); das Phosphodiester-Verfahren von Brown et al. (Ref. 38); das Diethylphosphoramidit-Verfahren gemäß Beaucage et al. (Ref. 39); und das Verfahren mit einem festen Träger gemäß US-Patent 4 458 066. Es ist bevorzugt, dass die Oligomeren mindestens im wesentlichen Umfang gereinigt werden, um die Einführung von Artefakten in das Genotyp-Bestimmungsverfahren zu vermeiden.
Erfindungsgemäß werden ferner Oligonucleotide bereitgestellt, die strukturell homolog mit einem Teil oder der Gesamtheit des genetischen Materials, das mit dem Kell-Gen verwandt oder davon abgeleitet ist, sind. Ein Oligomeres wird als "im wesentlichen homolog" mit einem anderen Oligomeren bezeichnet, wenn das Oligomere ungeachtet von Variationen in der Nucleotidsequenz für eine Aminosäuresequenz kodiert, die phänotypisch mit der Sequenz, mit der sie verglichen wird, identisch ist. Somit sind Sequenzen nicht in wesentlichem Umfang homolog, wenn die Sequenzen bei der Expression zu einer Verschiebung des Kell-Phänotyps führen. Andererseits sind zwei Sequenzen, die für den gleichen Locus oder Sublocus kodieren, im wesentlichen homolog, wenn sie nicht identisch sind, aber dennoch für Sequenzen kodieren, die Teilen oder der Gesamtheit von phänotypisch nicht-differenzierbaren Varianten des Kell-Proteins entsprechen. Demgemäß sind Sequenzen, die für die K1-Domäne kodieren, und Sequenzen, die für die K2-Domäne kodieren, nicht im wesentlichen Umfang homolog, obgleich sie, wie nunmehr festgestellt wurde, sich nur durch eine einzige Nucleotidsubstitution unterscheiden. Im Gegensatz dazu können Variationen in der Nucleotidsequenz, die nicht zu einer Aminosäure-Verschiebung im kodierten Genprodukt führen, im wesentlichen homolog sein.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um ein molekulargenetisches Verfahren, das die Bestimmung von einem oder mehreren Aspekten des Kell-Genotyps eines Subjekts ermöglicht. Das Verfahren beinhaltet im allgemeinen die Gewinnung von DNA oder einer anderen Nucleinsäure aus einer biologischen Probe eines humanen Subjekts oder Patienten. Typischerweise benötigt das Verfahren eine Blutprobe, wobei aber auch andere Typen von Gewebeproben, die erythroides Gewebe enthalten, geeignet sind. Das Verfahren kann zum Testen von beliebigen Individuen auf den Kell-Genotyp herangezogen werden. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung jedoch ein Verfahren zur Bestimmung des Kell-Blutgruppen-Genotyps in einem Fötus bereit. Bei dieser Ausführungsform umfasst die bevorzugte Gewebeprobe eine Probe von amniotischer Flüssigkeit. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass derartige Proben aus Probenbanken oder Gewebearchiven, wie Blutbanken oder aus forensischem Beweismaterial und dergl. stammen können. Demgemäß kann das Verfahren an einer einzigen oder unersetzbaren Probe eingesetzt werden oder es kann zum Screening einer großen Probenanzahl verwendet werden.
Im allgemeinen umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Erzeugung mindestens eines charakteristischen Nucleinsäureprodukts aus einer Nucleinsäureprobe. Die Probennucleinsäure wird von einem Subjekt, dessen Kell-Genotyp bestimmt werden soll, erhalten oder leitet sich von diesem ab und umfasst vorzugsweise eine Nucleotidsequenz, die einen Kell-Polymorphismus-Locus enthält, obgleich die genaue Sequenz oder Struktur nicht vorher gut definiert sein muss. Gemäß bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Nucleinsäureprobe genomische DNA des Subjekts.
Das erfindungsgemäße Verfahren erzeugt ein Nucleinsäureprodukt, das für einen spezifischen Kell-Genotyp charakteristisch ist, in einer ausreichenden Menge, um eine Charakterisierung von mindestens einem Aspekt des Kell-Genotyps zu ermöglichen. Vorzugsweise erzeugt das erfindungsgemäße Verfahren ein charakteristisches Nucleinsäureprodukt, das die Differenzierung von Allelen eines Kell-Polymorphismus, wie K1 und K2, erlaubt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße diagnostische Verfahren die Einwirkung eines Restriktionsenzyms, das differenziell Nucleinsäure mit einem Gehalt an einem Kell-Polymorphismus-Locus spaltet oder verdaut, auf Kell-DNA. Typischerweise erzeugt das Restriktionsenzym ein Nucleinsäureprodukt, das mindestens ein Restriktionsfragment umfasst, das in Bezug auf die Größe unterscheidend ist und in übereinstimmender Weise mit einer spezifischen Kell-Allele assoziiert werden kann. Beispielsweise kann das Restriktionsenzym eine Allele eines Polymorphismus-Satzes verdauen, während es die übrigen Allelen des Satzes nicht verdauen kann. Alternativ spaltet das Restriktionsenzym Allelen in dem Satz, mit Ausnahme einer Allele, die intakt bleibt und diesbezüglich erkennbar ist. Aus dem Stand der Technik sind zahlreiche Restriktionsenzyme bekannt. Gemäß dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können beliebige Restriktionsenzyme verwendet werden, die auf diese Weise mindestens ein unterscheidendes oder charakteristisches Fragment erzeugen.
Für die K1/K2-Differenzierung handelt es sich bei einem bevorzugten Restriktionsenzym um BsmI, das an einer Restriktionsstelle schneidet, von der nunmehr überraschenderweise festgestellt worden ist, dass sie in K1-DNA, jedoch nicht in K2-DNA auftritt. Somit spaltet BsmI K1-DNA, während es K2-DNA intakt lässt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beinhaltet das erfindungsgemäße diagnostische Verfahren die differenzielle Amplifikation von DNA, die einen Kell-Polymorphismus-Locus einschließt. Vorzugsweise wird die Kell-DNA mittels eines Primers amplifiziert, der differenziell eine spezifische Allele in einem Satz von Allelen, die mit einem Kell-Polymorphismus assoziiert sind, amplifiziert. Beispielsweise kann durch sorgfältige Auswahl eines geeigneten Amplifikationsprimers DNA, die einen K1-Locus enthält, amplifiziert werden, um ein unterscheidendes amplifiziertes Produkt zu bilden, während DNA, die einen K2-Locus enthält, nicht in erheblichem Umfang amplifiziert wird. Alternativ kann ein Satz von Primern verwendet werden, der einen unterscheidenden Satz von amplifizierten Produkten erzeugt, die zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Allelen analysiert werden können. Beispielsweise kann ein K1-spezifischer Primer ein Produkt, das für einen K1-Genotyp charakteristisch ist, erzeugen und ein K2-Primer kann ein Produkt, das für den K2-Genotyp charakteristisch ist, erzeugen. Weitere Allelen von anderen Kell-Polymorphismen können ebenfalls differenziell amplifiziert werden, indem man geeignete Primer auswählt.
Gemäß dieser Ausführungsform können beliebige Kombinationen von Primern verwendet werden, vorausgesetzt, dass das oder die Amplifikationsprodukte eine Charakterisierung eines erwünschten Aspekts des Kell-Genotyps ermöglichen. Zu bevorzugten Primersätzen gehören: Primer, die differenziell K1 und K2 amplifizieren oder Kombinationen davon.
Es gehört zu den Vorteilen dieser Möglichkeit, dass durch Verwendung geeigneter Primerkombinationen spezifische Fragmente von DNA amplifiziert werden, um Produkte in einer ausreichenden Menge bereitzustellen, um den Kell-Genotyp zu charakterisieren, ohne dass es erforderlich ist, die DNA mit Restriktionsenzymen zu verdauen. Dennoch fällt es unter die Erfindung, Primer zu verwenden, die differenzierende Sätze von DNA-Fragmenten ergeben, und die Differenzierung der Produkte und die anschließende Charakterisierung des Kell-Genotyps mittels einer selektiven Spaltung der Fragmente mit Restriktionsenzymen zu ergänzen. Dies kann besonders hilfreich in solchen Situationen sein, bei denen einige Fragmente aufgrund von technischen Beschränkungen nicht vollständig trennbar oder differenzierbar sind, während eine selektive Spaltung der Fragmente Unsicherheiten behebt.
Die erfindungsgemäßen diagnostischen Verfahren führen typischerweise zu einem Nucleinsäureprodukt, wie verdauten DNA- oder RNA-Fragmenten oder amplifizierten DNA- oder RNA-Produkten, in für eine Charakterisierung des Kell-Genotyps ausreichenden Menge. Die Nucleinsäurestücke ermöglichen eine derartige Charakterisierung, da sie in ihren Sequenzen und/oder Größen Informationen tragen, die für mindestens einen Teil der Fragmente die Differenzierung von den übrigen Fragmenten ermöglichen. Die Differenzierungscharakteristiken der Fragmente können nach beliebigen bekannten Verfahren ausgewertet werden.
Beispielsweise können Fragmente voneinander auf der Grundlage ihrer physikalischen Eigenschaften getrennt werden. Ein hochgradig bevorzugtes Differenzierungsmerkmal ist das Molekulargewicht. Spezifische und charakteristische Molekulargewichte der Fragmente werden direkt durch stellenspezifische Spaltung durch Restriktionsenzyme bestimmt. Spezielle Primer können Amplifikationsprodukte mit spezifischen Molekulargewichten erzeugen. Die Fragmente können voneinander durch Verfahren, wie die Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt werden, die sich auf das Molekulargewicht sowie auf die molekulare Nettoladung zur Trennung stützt. Derartige Techniken erzeugen Informationsmuster über Fragmente, die eine Bestimmung des Kell-Genotyps ermöglichen.
Kell-Nucleinsäureprodukte können auch auf der Grundlage ihrer Sequenzidentität voneinander unterschieden werden. Spezielle Sonden können gemäß bekannten Verfahren verwendet werden, um eine spezifische oder einzigartige Hybridisierung mit bestimmten Fragmenten herbeizuführen. Durch differenzielle Markierung von mehreren Sonden kann die Anwesenheit oder Abwesenheit von speziellen Kell-Polymorphismusspezifischen Fragmenten festgestellt werden. Alternativ kann im Anschluss an eine Trennung der Fragmente deren Nachweis ermöglicht werden, indem man einige oder sämtliche Fragmente nach bekannten Verfahren spezifisch oder unspezifisch markiert oder färbt. Es sind verschiedene Sequenzunspezifische Markersubstanzen bekannt, wie Ethidiumbromid.
Hybridisierungssonden können verwendet werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von spezifischen Kell-Nucleinsäuren in einem Testsystem festzustellen. Diagnostische Tests auf der Basis von Hybridisierungstechniken können äußerst spezifisch und hochgradig empfindlich sein, wobei sie Informationen zur Charakterisierung des Kell-Genotyps bereitstellen. Derartige Techniken werden beispielsweise von B. R. Glick und J. J. Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D. C., (1994), S. 192-201 (Ref. 40) beschrieben.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das diagnostische Verfahren folgendes:

(a) das Gewinnen von DNA aus einer Gewebeprobe eines Patienten;
(b) das Amplifizieren der DNA durch die Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung eines Primers oder Primersatzes, der spezifisch DNA, die einen spezifischen Kell-Polymorphismus charakterisiert oder festlegt, amplifiziert;
(c) das selektive Spalten der amplifizierten DNA durch ein Restriktionsenzym, das differenziell Kell-DNA unter Erzeugung eines Musters von DNA-Fragmenten spaltet; und
(d) das Trennen der DNA-Fragmente entsprechend ihrem Molekulargewicht zur Bildung eines Musters von DNA-Fragmenten, wobei das Muster von DNA-Fragmenten spezifische Informationen zur Charakterisierung des Kell-Genotyps des Patienten in bezug auf den spezifischen Kell-Polymorphismus liefert.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das diagnostische Verfahren folgendes:

(a) das Gewinnen von DNA aus einer Gewebeprobe eines Patienten;
(b) das Amplifizieren der DNA durch die Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung eines Primers oder Primersatzes, der mindestens einen Primer umfasst, der nur DNA einer Allele in einem Kell-Allelensatz amplifiziert; und
(c) das Abtrennen der amplifizierten DNA entsprechend dem Molekulargewicht zur Bildung eines Musters von DNA-Fragmenten, wobei das Muster von DNA-Fragmenten spezifische Informationen, die den Genotyp des Patienten in bezug auf den spezifischen Kell-Polymorphismus charakterisieren, liefert.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das diagnostische Verfahren folgendes:

(a) das Gewinnen von DNA aus einer Gewebeprobe eines Patienten;
(b) das Amplifizieren der DNA durch die Ligase-Kettenreaktion unter Verwendung eines Primersatzes, der nur DNA eines Kell-Allelensatzes amplifiziert unter Bildung eines Musters von DNA-Fragmenten; und
(c) das Abtrennen der DNA-Fragmente entsprechend ihrem Molekulargewicht unter Bildung eines Musters von DNA-Fragmenten, wobei das Muster von DNA-Fragmenten spezifische Informationen, die den Genotyp des Patienten in bezug auf den Kell-Polymorphismus charakterisiert, liefert.

(a) das Gewinnen von DNA aus einer Gewebeprobe eines Patienten;
(b) das selektive Spalten der DNA durch ein Restriktionsenzym, das differenziell DNA mindestens einer Allele in einem Kell-Allelensatz unter Bildung eines Musters von DNA-Fragmenten spaltet;
(c) das Amplifizieren des Musters von DNA-Fragmenten durch die Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung eines Primers oder Primersatzes, der nur DNA des Allelensatzes amplifiziert; und
(d) das Abtrennen der amplifizierten DNA entsprechend dem Molekulargewicht unter Bildung eines Musters von DNA-Fragmenten, wobei das Muster von DNA-Fragmenten spezifische Informationen, die den Genotyp des Patienten in bezug auf den spezifischen Kell-Polymorphismus charakterisiert, liefert.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird erfindungsgemäß ein diagnostisches Verfahren bereitgestellt, das folgendes umfasst:

(a) das Gewinnen von DNA aus einer Gewebeprobe eines Patienten;
(b) das Einwirken eines Restriktionsenzyms, das differenziell K1-DNA und K2-DNA unter Bildung eines Musters von DNA-Fragmenten spaltet, auf die DNA;
(c) das Trennen der DNA-Fragmente entsprechend ihrem Molekulargewicht unter Bildung eines Musters von DNA-Fragementen; und
(d) das Bestimmen der Anwesenheit von K1-DNA und/oder K2-DNA unter Verwendung von nachweisbar markierten Kell-cDNA-Sonden; wobei das Muster von DNA-Fragmenten spezifische Informationen, die den K1/K2-Genotyp des Patienten charakterisieren, liefert. Derartige Verfahren umfassen beispielsweise Southern-Blot-Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind.

Gemäß einer alternativen Ausführungsform wird erfindungsgemäß ein diagnostisches Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Nucleinsäure, die spezifisch für K1 oder K2 ist, bereitgestellt. Bei dieser Ausführungsform umfasst das Verfahren folgendes:

(a) das Gewinnen einer Nucleinsäurefraktion aus einer Gewebeprobe eines Patienten;
(b) das Feststellen der Anwesenheit einer Ziel-Nucleinsäure, die für mindestens einen Teil des Kell-Proteins kodiert und die Stelle, die den K1/K2-Polymorphismus charakterisiert, enthält, in der Nucleinsäurefraktion. Bei diesem Verfahren wird die Anwesenheit der Ziel-Nucleinsäure mittels einer Sonden-Nucleinsäure festgestellt, die eine Nucleinsäuresequenz umfasst, von der bekannt ist, dass sie spezifisch an K1-DNA oder K2-DNA oder Transkripten davon findet oder mit diesen hybridisiert. Bei den Sonden-Nucleinsäuren, die für dieses Verfahren geeignet sind, kann es sich um beliebige der hier beschriebenen Oligomeren auf Kell-Basis handeln, einschließlich solche, die nachweisbar markiert oder an ein Substrat gebunden sind. Dieses Verfahren kann zum Nachweis von Ziel-Nucleinsäuren herangezogen werden, bei denen es sich um chromosomale oder genomische DNA, mRNA und cDNA handelt, sowie von anderen verwandten Formen von Nucleinsäuren, die für die K1/K2-Domäne des Kell-Proteins kodieren. Derartige Verfahren umfassen beispielsweise Dot-Blot-Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Kell-Blutgruppen-Genotyps bereit. Bei dieser Ausführungsform umfasst das Verfahren die folgenden Stufen:

(a) das Auswählen einer Sonden-Nucleinsäuresequenz, die im wesentlichen mindestens einem Teil eines bekannten Kell-Exons oder einem Transkript davon entspricht, wobei das bekannte Kell-Exon einen Kell-Polymorphismus-Locus umfasst und für eine spezifische Kell-Allele kodiert;
(b) das Kontaktieren der Proben-Nucleinsäuresequenz, die von einem Subjekt erhalten oder von diesem abgeleitet worden ist, wobei das Subjekt einen unbekannten Phänotyp in bezug auf den Kell-Polymorphismus-Locus aufweist, mit der Sonden-Nucleinsäuresequenz unter Bedingungen, die eine Hybridisierung ermöglichen, wenn die Nucleinsäuresequenzen in signifikantem Umfang komplementär sind; und
(c) das Messen einer Hybridisierungsmenge zwischen der Sonden-Nucleinsäuresequenz und der Proben-Nucleinsäuresequenz.

Bei dieser Ausführungsform gibt der Nachweis einer Hybridisierungsmenge entsprechend einer Menge, die sich aus im wesentlichem Umfang komplementären Sequenzen ergibt, einen Hinweis darauf, dass das Subjekt die spezifische, zur Untersuchung anstehende Kell-Allele aufweist. Andererseits gibt der Nachweis einer unnormal geringen Hybridisierungsmenge den Hinweis, dass bei dem Subjekt die spezifische, zur Untersuchung anstehende Kell-Allele fehlt.
Die Erfindung stellt ferner rekombinante Expressionsvektoren, die Kell-Nucleinsäuresequenzen tragen, bereit. Derartige Vektoren ermöglichen eine Transformation von Zellen, insbesondere von eukaryontischen Zellen, wie Hefe und humanen Zellen, um zu bewirken, dass derartige Zellen ein heterologes Proteinprodukt exprimieren. Die Erfindung stellt Expressionsvektoren bereit, die eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die für mindestens einen Teil des Kell-Proteins kodiert, einschließlich eines Teils des Proteins, der für eine Stelle des Kell-Polymorphismus kodiert. Insbesondere stellt die Erfindung Expressionsvektoren bereit, die K1-cDNA tragen, die eine Transformation von Zellen unter Erzeugung von transformierten Zellen oder Transformanten, die K1-Protein an ihren Zelloberflächen exprimieren, ermöglichen. Die Erfindung stellt ferner stabile Zelllinien bereit, die so modifiziert (d. h. transformiert) worden sind, dass sie an ihrer Zelloberfläche Protein exprimieren, sowie ein Verfahren zur Transformation einer Zelllinie zur Expression eines derartigen Proteins. In bezug auf die K1-Expression umfasst ein derartiges Protein vorzugsweise mindestens die K1-Domäne und insbesondere handelt es sich beim Protein um das K1-Protein. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Expressionsvektoren und zur Transformation von Zelllinien unter Verwendung von derartigen Vektoren sind aus dem Stand der Technik bekannt und werden allgemein von B. R. Glick und J. J. Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D. C. (1994), Kapitel 5 (Ref. 40) beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung des Kell-Genotyps eignet sich besonders bei der Bestimmung des fötalen Kell-Genotyps. Das hier beschriebene molekulargenetische Verfahren lässt sich leicht auf DNA-Proben anwenden, die aus amniotischen fötalen Zellen erhalten worden sind, und es eignet sich zur Bestimmung des Kell-Genotyps des Fötus. Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich auch in einer Reihe von anderen Situationen, bei denen molekulargenetische Informationen über eine Person erstrebenswert sind. Beispielsweise eignen sich die erfindungsgemäßen Verfahren in Situationen, bei denen angestrebt wird, bestimmte Informationen bezüglich der Identität eines Individuums aus forensischen Proben zu erhalten. Alternativ eignen sich die erfindungsgemäßen Verfahren zur Gewinnung von genetischen Informationen, die eine Vaterschaftsbestimmung in Fällen, bei denen die Vaterschaft zweifelhaft oder umstritten ist, ermöglichen. Ferner eignen sich die erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Kell-Genotyps eines Empfängers einer Bluttransfusion sowie zum Screening von gelagertem Blut auf den Kell-Genotyp, um eine Transfusionsunverträglichkeit zu vermeiden. Die erfindungsgemäßen Verfahren auf Peptidbasis eignen sich insbesondere zur Bestimmung der Alloimmunisierung einer Person gegenüber einem Kell-Antigen, wie K1. Es ist zu erwarten, dass Informationen über eine derartige Alloimmunisierung bei der Beratung von Frauen über die Gefahren zukünftiger Schwangerschaften wertvoll sind. Weitere Anwendungsmöglichkeiten für die erfindungsgemäßen Verfahren sind für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich.
Ferner kann das erfindungsgemäße Genotyp-Charakterisierungsverfahren selektiv so durchgeführt werden, dass die Beschreibung von einigen oder sämtlichen Mitgliedern der Kell-Familie von Allelen ermöglicht wird. Das Verfahren kann auch in Verbindung mit der Phänotyp-Bestimmung von einigen oder sämtlichen Mitgliedern der Kell-Familie von Antigenen durchgeführt werden. Somit ist es möglich, den Kell-Genotyp zu bestätigen, indem man sich eines serologischen Tests in Verbindung mit einer Genomanalyse unter Verwendung eines Restriktionsenzyms bedient. Derartige serologische Teststufen können entweder vor, parallel mit oder nach dem vorgeschriebenen Genomtest vorgenommen werden. Außerdem kann die Planung der Testverfahren auf der Basis von vorläufigen Teilergebnissen erfolgen, die die Möglichkeit beispielsweise von bestimmten seltenen Genotypen auschließen oder implizieren. Es kann auch erstrebenswert sein, einen Genotyp-Test auf andere Marker oder Blutgruppen zusammen mit dem erfindungsgemäßen Rh-Genotypisierungsverfahren durchzuführen. Beispielsweise kann das in der US-Patentanmeldung SN 08/553,888, Anmeldetag 06. November 1995, bezüglich der Bestimmung eines Rh-Genotyps in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden, um eine Beratung bezüglich eines breiteren Spektrums von möglichen Schwangerschaftskomplikationen vorzunehmen. Im allgemeinen ist zu erwarten, dass das diagnostische Verfahren, die Zusammensetzungen und die Testpackungen der Erfindung in Verbindung mit einer breiten Vielzahl von bekannten medizinischen Tests eingesetzt werden können, um die für den Arzt verfügbaren Informationen über den Patienten auszuweiten und zu ergänzen; vergl. z. B. R. H. Walker et al. Herausg., Technical Manual, 10. Auflage, American Association of Blood Banks, Arlington, Virginia (1990) (Ref. 41).
Die folgenden Beispiele dienen einem tieferen Verständnis der Erfindung. Die speziellen Materialien und Bedingungen, die eingesetzt werden, dienen zur tieferen Erläuterung der Erfindung und begrenzen nicht deren vernünftigen Schutzumfang.
In jedem der hier beschriebenen Beispiele wurden die eingesetzten molekularbiologischen Techniken allgemein nach auf dem einschlägigen Gebiet anerkannten Verfahren durchgeführt; vergl. beispielsweise Sambrook et al. (Ref. 42) und Innis et al. (Ref. 34).
Beispiel 1
Die Organisation des KEL-Gens wurde unter Anwendung des folgenden Verfahrens bestimmt.
Screening einer Genoatbank
Eine humane, plazentale Genom-DNA-Bank, die in EMBL3-Sp6/T7 konstruiert worden war, wurde von der Firma Clontech, Inc. (Palo Alto, CA), erhalten. Die Genom-DNA-Bank wurde durch partiellen Verdau von humaner Plazenta-Genom-DNA it Sau3A1 und Verknüpfung der Fragmente in die BamHI-Stelle des Vektors konstruiert. Für das Screening wurde die λ-Phagenbank entweder im Stamm NM528 oder im Stamm LE392 von E. coli gezüchtet und ausgestrichen. Die DNA wurde auf Hybond^R-N+-Membranen (Amersham Co., Arlington Heights, IL) abgehoben und mit Kell-cDNA-Sonden gemäß üblichen Verfahren hybridisiert (Ref. 43). Die cDNA-Sonden wurden mit ³²P durch willkürliche Primererweiterung unter Verwendung einer handelsüblichen Testpackung (Boehringer Mannheim Inc., Indianapolis, IN) markiert. Die spezifische Aktivität der Sonden betrug etwa 1×10⁸ cpm/μg. Vierzehn positive Klone wurden isoliert.
Charakterisierung von Exons und Introns
Von den 14 identifizierten positiven Klonen wurden 5 (λ2, λ8, λB, λF und λE) für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Zwei der Klone (λ2 und λE) überspannen den Großteil des Kell-Gens und decken etwa 21,5 Kb ab (vergl. 1). Der Klon λ8 wurde untersucht, da er sich mehr zur 5'-Flankierungsregion erstreckte und auch zur Bestätigung der aus dem Klon λ2 bestimmten Sequenz diente. Die Klone λB und λF wurden verwendet, da sie mit λE überlappten und ferner ein kleines Segment von λF mit dem 3'-Ende von λ2 überlappte (vergl. 1).
Diese fünf Klone wurden zunächst durch Verdau mit XhoI plus PstI sowie mit Xhol plus EcoRI unter anschließender Southern-Blot-Hybridisierung unter Verwendung von verschiedenen Oligonucleotiden, die für verschiedene Positionen in der Kell-cDNA-Sequenz spezifisch waren, kartiert. Die Genomklone wurden sodann mit den folgenden Enzymen verdaut: PstI, EcoRI, BamHI, BglII und XhoI, entweder einzeln oder in Kombination. Die einzelnen Genfragmente wurden in pUC18 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) oder pGEM-3Zf(+) (Promega Co.) subkloniert und an einem 373A-DNA-Sequenzierautomat (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) sequenziert. Die Exons, bestimmt in bezug auf die Kell-cDNA-Sequenz, und ihre Flankierungsregionen wurden vollständig sequenziert, ebenso einige kurze Introns. Mit einer Ausnahme wurden die langen Introns einer Größenbestimmung durch PCR unter Verwendung von Primern von den Flankierungsregionen der Introns unterzogen. Das längste Intron zwischen den Exons 10 und 11 wurde partiell einer Größenbestimmung unter Verwendung von Primern aus bekannten Intronsequenzen, die aus λ2, λE erhalten worden waren, unter Verwendung eines YAC-Klons als Matrize unterzogen. (Sieben künstliche Hefechromosom (YAC)-Klone wurden getrennt durch PCR, spezifisch für KEL-Exon 6 aus einer YAC-Quelle, die in bezug auf Chromosom-7-DNA angereichert war, isoliert.) Dieser Bereich des Introns wurde durch PCR unter Verwendung von humaner Genom-DNA als Matrize bestätigt.
Restriktionsenzymkartierung und Southern-Blot-Analyse der Genomklone
Subklone wurden mit BamHI, EcoRI und PstI kartiert. Die verschiedenen Größen von verdauter DNA wurden durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die DNA-Fragmente wurden in einigen Fällen weiter durch Southern-Blots unter Verwendung von ³²P-markierten Oligonucleotiden analysiert, die von verschiedenen Positionen von Kell-cDNA abgeleitet und ferner mit verfügbaren Sequenzen der subklonierten Genfragmente identifiziert worden waren. Die Kombination dieser Verfahren ermöglichte die Erstellung einer Restriktionskarte von BamHI, EcoRI und PstI. Eine Sequenzanalyse der subklonierten Kell-Genfragmente aus diesen 5 Genomklonen ergab, dass das humane KEL-Gen 19 Exons im Größenbereich von 63 by (qExon 7) bis 288 by (Exon 19), das eine 3'-untranslatierte Region umfasst, enthält.
1 zeigt die neu bestimmte Struktur des humanen Kell-Gens (KEL) mit Restriktionsenzymstellen. Die Positionen der Exons sind als schwarze Kästchen und die Introns als Verbindungslinie zwischen den Exons dargestellt. Die senkrechten Linien von unterschiedlicher Höhe markieren die Restriktionsenzymstellen im Kell-Gen. Die λ-Phasen-Genomklone sind im Diagramm unten angegeben (λ2, λ8, λE, λB und λF). Zwei der Genomklone aus der handelsüblichen Genombank, die Klone λB und λF, ergaben beim Vergleich mit anderen Klonen (λ2 und λ8) inkonsistente Sequenzen. Die 5'-Segmente der Klone λB und λF sollten mit den 3'-Segmenten von λ2 und λ8 identisch sein, jedoch ergab die Sequenzanalyse, dass sie unterschiedlich waren. Der Grund hierfür ist nicht bekannt, könnte aber auf die Ligation von DNA-Material während der Herstellung der Genombank zurückzuführen sein. Diese unterschiedlichen Bereiche sind in 1 durch gestrichelte Linien dargestellt. Die mit Restriktionsenzymen verdauten Produkte, die subkloniert und analysiert wurden, sind über den Genomklonen dargestellt. Bei jedem Subklon sind die verwendeten Restriktionsenzyme und die Genomklone, aus denen sie abgeleitet sind, angegeben. Vier PCR-abgeleitete Subklone (PCR 25, PCR 6, PCR 1 und PCR 20) sind ebenfalls dargestellt. In Klammern ist für jedes PCR-Produkt der Genomklon, aus dem die Amplifikation vorgenommen worden ist, angegeben. Ein kleines Segment des großen Introns, das nicht durch die Klone λ2, λ8 und λE abgedeckt ist, wurde durch Sequenzierung von PCR-Produkten (PCR 6) aus einem YAC-Klon (yWSS679) und aus der Genom-DNA bestimmt. Diese Strategie wurde angewandt, obgleich der λF-Klon das 3'-Ende des λ2-Klons abdeckt. Dies ermöglichte es uns, das gesamte Kell-Gen abzudecken und das Intron zwischen den Exons 10 und 11 zweifelsfrei einer Größenbestimmung zu unterziehen.
Bei sämtlichen Exon/Intron-Spleißverbindungen wurde festgestellt, dass sie die 5'-Donator-gt- und die 3'-Akzeptor-ag-Sequenzen enthielten. Die Introns lagen im Größenbereich von 93 by bis etwa 6 kb. Es gab 6 Introns, die größer als 1 kb waren (1 und 2). Die langen Introns wurden nicht vollständig sequenziert, jedoch einer Größenbestimmung durch PCR unterzogen. Es ergab sich eine Unsicherheit bei der Analyse des Introns zwischen den Exons 10 und 11, da die 5'-Region der Klone λB und λF, von denen eine Überlappung mit der 3'-Region der Klone λ2 und λ8 erwartet wurde, sich nicht überlappte. Diese unsicheren Bereiche der Klone λB und λF sind in 1 als gestrichelte Linien dargestellt. Aufgrund dieser Unsicherheit wurde die kleine Lücke des Gens, die nicht durch die Klone λ2 und λE abgedeckt war, durch PCR-Amplifikation des YAC-Klons yWSS679 mit einem Gehalt an dem Kell-Gen überbrückt (1). Die Größe dieser PCR-amplifizierten Region wurde ferner durch PCR von Genom-DNA, die von einer Person mit dem üblichen Kell-Phänotyp erhalten worden war, unter Verwendung der gleichen Primer, wie sie für den YAC-Klon verwendet wurden, bestätigt.
Sämtliche Exons wurden sequenziert und mit der Sequenz einer KellcDNA von voller Länge, die aus einer humanen Knochenmarkbank der Firma Clontech Laboratories, Inc., isoliert worden war, verglichen. Der Kell-Phänotyp dieser Bank war unbekannt. Unterschiede wurden in vier Basen im Exon 3 im Vergleich zur veröffentlichten Sequenz für Kell-cDNA festgestellt (Ref. 14). Diese Unterschiede waren auf Sequenzierfehler in der ursprünglichen Studie zurückzuführen. Die korrigierten Sequenzen wurden der EMBL/GenBank Updates (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD) unter der Zugangsnummer M64934 mitgeteilt. Ein bemerkenswerter Unterschied ist eine Basensubstitution in der membranüberspannenden Region, die für einen Leucinrest anstelle eines Prolinrestes kodiert. Die korrigierten Basensequenzen sind in 2 in Fettdruck dargestellt.
Die 2A–2D erläutern die Sequenz der einzelnen Exons, die für humanes Kell-Protein kodieren, zusammen mit den unmittelbar Intronflankierenden Spleißverbindungssequenzen. Die Basensequenzen der einzelnen Exons sind in Großbuchstaben dargestellt und die flankierenden Intronsequenzen in Kleinbuchstaben. Die Aminosäuresequenzen, die durch die Exons kodiert werden, sind oberhalb der Basensequenzen dargestellt. Die Nummern auf der linken Seite unter den angegebenen Exons beziehen sich auf die Basennummern der cDNA. Die übrigen Nummern an den linken und rechten Seiten geben die Aminosäurereste und die Basen an, wie sie früher für die cDNA beschrieben wurden (Ref. 25). Die Introngrößen sind am Ende der Exons angegeben. Die 5'- und 3'-Spleißstellen sind ebenfalls dargestellt.
Da der Kell-Phänotyp der Person, aus dem die Genom-DNA-Bank konstruiert worden ist, unbekannt ist, isolierten wir RNA aus peripherem Blut einer Person mit bekanntem üblichem Phänotyp (K: -1, 2, -3, 4, -6, 7). cDNA wurde durch RNA-PCR hergestellt und gemäß bekannten Verfahren sequenziert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz war mit der in 2 dargestellten Sequenz, die von der Clontech-Genombank erhalten worden war, identisch. Bei der Person von bekanntem Phänotyp traten Basenunterschiede von C nach T an zwei Positionen (nt 1656 und 1664) auf, jedoch veränderten diese Substitutionen nicht die vorhergesagten Aminosäuren.
Von Interesse ist, dass das Exon 1 die 5'-untranslatierte Region umfasst und nur für das Initiations-Methionin kodiert. Die einzige membranüberspannende Region befindet sich im Exon 3 und die pentamere Sequenz (HELLH), die mit einer Consensus-Sequenz (HEXXH) übereinstimmt, die in den aktiven Zentren von neutralen Zink-Endopeptidasen auftritt (Ref. 43), befindet sich im Exon 16 (2).
Die Kodierungsregion des nativen Proteins ist in 18 der 19 Exons vorhanden; das erste Exon enthält die 5'-untranslatierte Region und das Initiations-Methionin. Weitere Beispiele, die nur das Initiationskodon im ersten Exon enthalten, sind bekannt (Ref. 44). Die einzige Transmembranregion wird im Exon 3 kodiert, wobei die Exons 4 bis 19 für den Großteil des extrazellulären Bereiches kodieren. Das HEXXH-Motiv, das für Zink-Metallopeptidasen einzigartig ist (Ref. 29), wird in einem 68 bp-Exon (Exon 16) kodiert. Zusätzlich zu der pentameren Konsensus-Sequenz weist Kell eine Sequenz- und Strukturhomologie mit einer Familie von membranassoziierten neutralen Zink-Endopeptidasen (EC24.11) auf (Ref. 25), für die Enkephalinasen und CALLA Beispiele darstellen (Ref. 45-46). Das CALLA-Gen ist größer als das Kell-Gen, etwa 80 kb, und ist aus 24 Exons zusammengesetzt (Ref. 47). In CALLA wird das mutmaßliche aktive Enzymzentrum im Exon 19 kodiert und ein Vergleich der Basensequenzen der Exons 18 und 19 von CALLA mit den Exons 15 und 16 von Kell zeigt eine 54,5 %-ige Basenidentität.
Beispiel 2
Transkriptionsinitiationsstelle
Die Transkriptionsinitiationsstelle des KEL-Gens wurde durch die rasche Amplifikation der cDNA-Enden (5'-RACE) unter Verwendung einer humanen Fötusbank (5'-RACE Ready^R-cDNA-Bank, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) bestimmt. Bei der Quelle für poly(A)⁺-RNA handelte es sich um normale Leber, gepoolt aus zwei weiblichen kaukasischen Phöten in der 22. und 26. Schwangerschaftswoche. Die einzelsträngige cDNA-Bank wurde durch reverse Transkription unter Verwendung von willkürlichen Hexameren als Primer hergestellt. Ein Oligonucleotidanker 3'-NH₃-GGA GAC TTC CAA GGT CTT AGC TAT CAC TTA AGC AC-p-5' (SEQ ID NO:6) wurde mit der cDNA verknüpft. Für das 5'-RACE wurden zwei Sätze von geschachtelten PCR-Reaktionen durchgeführt, wobei Primer von zwei verschiedenen Positionen an Kell-cDNA (nt 132 und nt 178) verwendet wurden. Bei der ersten PCR wurde 5'-RACE Ready^®-cDNA als Matrize verwendet. Die für einen Satz (PCR1) verwendeten Primer umfassten den Ankerprimer der Firma Clontech (5'-CTG GTT CGG CCC ACC TCT GAA GGT TCC AGA ATC GAT AG-3') (SEQ ID NO:7) und den Kell-antisense-Primer (5'-CTC GGC TCT TCC TCA CTT TGG TCC-3', nt 132) (SEQ ID NO:8). Für den anderen Satz (PCR2) umfassten die Primer den Clontech-Ankerprimer (SEQ ID NO:7) und den Kell-antisense-Primer (5'-CTC TTG GCT CCA GAG AGT TCC CAT-3', nt 178) (SEQ ID NO:9). Für die zweite geschachtelte PCR wurden die Produkte der ersten PCR-Reaktionen als Matrizen verwendet und der Clontech-Ankerprimer (SEQ ID NO:7) wurde erneut als sense-Primer für beide parallelen Reaktionen verwendet. Bei der PCR1 wurde ein Kell-antisense-Primer (5'-CCC ACC TTC CAT CTG TCT ATC TTC-3', nt 109) (SEQ ID NO:10) verwendet. Für die PCR2 wurde der Kell-antisense-Primer nt 132 (SEQ ID NO:8) verwendet.
Die PCR wurde in einem automatisierten Thermocycler-Gerät (Minicycler, MJ Research Inc., Watertown, MA) unter Anwendung eines anfänglichen Zyklus bei 94 °C für 3 Minuten, 62 °C für 1 Minute und 72 °C für 30 Sekunden durchgeführt. Bei den Zyklen 2 bis 30 wurden folgende Bedingungen eingehalten: 94 °C für 30 Sekunden, 62 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 30 Sekunden. Beim letzten Zyklus wurde die Polymerisationsstufe bei 72 °C auf 10 Minuten verlängert. Die Endkonzentrationen der Reagenzien betrugen 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 9,0), 3 mM MgCl₂, 400 nM von jedem Primer, 200 μM von jedem dNTP, 0,1% Triton-X100 und 2,5 Einheiten taq-Polymerase in einem Endvolumen von 50 μl. Es wurde das "Heißstart"-Verfahren unter Verwendung von Ampliwax^R der Firma Perkin Elmer (Branchburg, NJ) eingesetzt. Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese in 0,8% niedrigschmelzenden Agarosegelen getrennt, eluiert und direkt mit pT7-Blue(R)-Plasmidvektor der Firma Novagen (Madison, WI) verknüpft und in den DH5αF'-Stamm von E. coli transformiert.
Jeder Primer ergab drei Produkte von verschiedener Größe. Diese Produkte wurden subkloniert und sequenziert. Das größte Produkt aus jeder PCR-Reaktion wies ein 5'-Ende 120 by strangaufwärts vom Initiationskodon auf. Die zwei kürzeren PCR-Produkte endeten bei 81 und 30 by strangaufwärts vom Initiationskodon.
3 erläutert die Nucleotidsequenz der KEL-5'-Flankierungsregion, die das Exon 1 und mögliche cis-regulatorische Elemente zeigt. Eine 185 bp-Region strangaufwärts von der mutmaßlichen "cap"-Stelle ist dargestellt. Die drei möglichen Transkriptions-Initiationsstellen sind mit ∇ markiert. Consensus-Sequenzen für GATA-1, Sp1 und eine CACCC-Region sind eingerahmt. Die Region -176 bis -1, die durch die PCR kopiert und in einen CAT-Expressionsvektor platziert wurde, ist dargestellt. Das Initiations-Methionin ist in Fettschrift gedruckt.
Drei mögliche Transkriptions-Initiationsstellen wurden unter Anwendung des 5'-RAGE-Verfahrens und von Poly(A)⁺-RNA aus fötaler Leber gefunden. Die erste dieser "cap"-Stellen, die sich 120 by strangaufwärts vom Initiations-ATG befand, ist auch das 5'-Ende einer cDNA, die aus einer humanen Knochen-cDNA-Bank kloniert wurde (Ref. 25). Die anderen beiden Stellen befinden sich 81 und 30 by strangaufwärts vom Initiationskodon. Sämtliche 3 Stellen wurden unter Verwendung von zwei verschiedenen Kell-cDNA-antisense-Primern erhalten. Obgleich sämtliche drei Positionen Purinbasen darstellen und als Transkriptionsinitiationsstellen wirken könnten, ist es auch möglich, dass die Stellen bei 81 und 30 by strangaufwärts von ATG aufgrund einer unvollständigen reversen Transkription Artefakte darstellen. Dies ist unwahrscheinlich, da willkürliche "Hexamere" zur Herstellung der cDNA-Bank verwendet wurden. Jedoch können auch sekundäre RNA-Strukturen eine vorzeitige Beendigung der reversen Transkription verursachen.
Beispiel 3
Analyse der 5'-Flankierungsregion
Die Konstitution der 5'-Flankierungsregion wurde durch DNA-Sequenzierung des Subklons λ8 unter anschließendem Verdau mit PstI erhalten (vergl. 1). Es wurde festgestellt, dass die 5'-Flankierungsregion die Nucleotide -176 bis -1 überspannt.
5 zeigt eine 185 bp-Sequenz strangaufwärts von der ersten möglichen Initiations-Transkriptionsstelle. Eine Analyse dieser Region und des Exons 1 zeigt, dass keine TATA-Sequenzen vorlagen, es wurden aber mehrere andere mögliche Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen festgestellt. Mindestens zwei GATA-1-Stellen sind nahe an einer CACCC-Box vorhanden. Sp1- und GATA-1-Sequenzen sind im Exon 1 vorhanden. Die 5'-Flankierungsregion enthält purinreiche Regionen. Diese Bereiche von Interesse sind in 3 dargestellt.
Die Transkriptionsaktivität der 5'-Flankierungsregion von -176 bis -1 (3) wurde durch CAT-Bestimmung in transfizierten K562-Zellen bei Vergleich mit dem promotorlosen pCAT-Vektor bestimmt. Bei diesem Verfahren wurde ein PCR-Produkt, das die Nucleotide -176 bis -1 relativ zur ersten "cap"-Stelle überspannt, in einem von der Firma Promega Co. erhaltenen Grund-pCAT-Vektor subkloniert. Zellen der erythroleukämischen Zelllinie K562 wurden sodann unter Anwendung des Lipofectin-Verfahrens transfiziert. Die Konstruktion des CAT-Vektors, die Transfektion und die Chloramphenicol-acetyltransferase (CAT)-Aktivität wurden gemäß dem von der Firma Promega angegebenen Verfahren getestet. Die enzymatische CAT-Aktivität wurde unter Verwendung von [¹⁴C]-Chloramphenicol (50-60 mCi/mMol, Amersham Co., Arlington Heights, IL) gemessen. Die Reaktionsprodukte wurden durch Flüssigszintillationsspektrometrie und Analyse der Reaktionsprodukte durch Dünnschichtchromatographie gemessen. Als negative Kontrolle wurde der pCAT-Grundvektor ohne Promotor verwendet. Sämtliche Zellextrakte wurden durch Proteinanalyse normiert, um die Werte zu vergleichen.
Nach Einführung vor einem CAT-Reportergen wies die 5'-Flankierungsregion Promotoraktivität in der erythroleukämischen Zelllinie K562 auf. Es wurde festgestellt, dass der pCAT-Vektor mit der 5'-Flankierungsregion etwa 0,8 Einheiten CAT-Aktivität pro Milligramm Zellextraktprotein exprimiert. Eine Einheit der CAT-Enzymaktivität ist als die Enzymmenge definiert, die zur Übertragung von 1 nmol Acetat von Chloramphenicol in 1 Minute bei 37 °C erforderlich ist. 4 zeigt die CAT-Aktivität der 5'-Flankierungsregion. Ein Autoradiogramm nach einer Expositionszeit von 48 Stunden ist dargestellt. Bahn 1 zeigt den pCAT-Vektor mit der 5'-Flankierungsregion und Bahn 2 den pCAT-Grundvektor ohne Promotor. Das radioaktiv butyrylierte Chloramphenicol ist als "bCm" angegeben und das nicht-umgesetzte Chloramphenicol ist mit "Cm" bezeichnet.
Die mutmaßliche Promotorregion enthält nicht die typische TATA-Box, die sich üblicherweise bei -25 bis 30 nt relativ zur cap-Stelle befindet (Ref. 48). Jedoch wurden wie bei mehreren erythroidspezifischen Genen Consensus-Sequenzen für den GATA-1-Faktor in der Promotorregion gefunden. Ferner sind mögliche Sp1- und GATA-1-Bindungsstellen im Exon 1 angegeben. Es ist nicht bekannt, ob GATA-1 und Sp1 die KEL-Genexpression regulieren, jedoch ist GATA-1 in Erythroidgenen üblich (Ref. 49-55) und es ist bekannt, dass es in niedrigen Konzentrationen in hämatopoetischen Progenitorzellen exprimiert wird und während der Erythroidreifung hochreguliert wird (Ref. 56-58). Wenn diese Transkriptionsfaktoren die Erythroid-Gewebespezifität definieren, steht dies in Übereinstimmung mit unseren Northern-Blot-Studien, die Kell-Transkripte in Knochenmark und fötaler Leber jedoch nicht in mehreren nicht-erythroiden Geweben nachwiesen (Ref. 8).
Beispiel 4
Analyse des 3'-Endes
Das Exon 19 ist das größte Kell-Exon. Es kodiert für die C-terminalen 53 Aminosäuren und enthält die 3'-untranslatierte Region mit einem Polyadenylierungssignal 100 by strangabwärts vom Terminationskodon. Eine frühere Northern-Blot-Analyse zeigte, dass das hauptsächliche Kell-Transkript in Knochenmark und fötaler Leber 2,5 kb aufweist, obgleich auch geringere Mengen an größeren mRNAs, immerhin 6,6 kb, ebenfalls beobachtet wurden (Ref. 8). Bei der ursprünglichen Klonierung der Kell-cDNA aus einer humanen Knochenmarkbank isolierten wir eine cDNA mit einer großen (3 kb) 3'-untranslatierten Region (Ref. 25).
Zur Bestimmung der 3'-Endstruktur des Kell-Gens wurde RNA aus peripherem Blut gemäß den Angaben von Goosens et al. isoliert (Ref. 59) und cDNA wurde durch reverse Transkription und PCR-Amplifikation unter Verwendung einer Perkin Elmer RNA-PCR-Testpackung (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ) hergestellt. Die erste Strangsynthese wurde unter Verwendung eines verankerten oligo-d(T)₁₆-Primers eingeleitet und eine PCR-Amplifikation des 3'-Endes von Kell-cDNA wurde unter Verwendung des Ankerprimers und eines Oligonucleotid-Primers aus der Kodierungssequenz von Kell-cDNA durchgeführt. Beim verwendeten Ankerantisense-Primer handelte es sich um oligo-5'-GACTCGAGTCGACAACGTT(T)₁₆-3' (SEQ 2D NO:11) und beim sense-Primer von der 3'-Ende-Kodierungssequenz von Kell-cDNA handelte es sich um 5'-ATGGGGAGACTGTCCTG-3' (SEQ ID NO:12).
Ein PCR-Produkt von etwa 400 by wurde erhalten, subkloniert und sequenziert. 3'-Endsequenzen von verschiedenen Subklonen sind in 5 dargestellt. Die Basensequenzen vor der poly-A-Region von cDNA-Klonen aus einer humanen Knochenmarkbank (oben) und aus peripherem Blut einer Person mit üblichem Kell-Phänotyp (unten) sind dargestellt. (A) zeigt die poly-A-Region.
Die 3'-Endsequenzen von vier verschiedenen Subklonen, die aus peripherem Blut erhalten wurden, sind im unteren Bereich von 5 dargestellt. Sämtliche vier Subklone wiesen identische Sequenzen vom Terminationskodon bis zum Polyadenylierungssignal (AATAAA) auf. Am 3'-Ende unterscheiden sich die Basensequenzen geringfügig in ihrer Länge vor dem Start der poly-A-Sequenz. Der Abstand zwischen dem Polyadenylierungssignal und der Spaltungsstelle ist bekanntlich variabel (Ref. 60). Ähnliche Variationen in 3'-Endsequenzen wurden in drei verschiedenen Kell-cDNAs beobachtet, die von einer humanen Knochenmark-cDNA-Bank erhalten worden waren (Klone 185, 182 und 190).
Nur einer der cDNA-Klone, die aus der Knochenmarkbank erhaltene ursprüngliche cDNA von voller Länge (Klon 191), enthielt eine große 3'-untranslatierte Region. Das untranslatierte 3 kb-Fragment von diesem cDNA-Klon hybridisiert nicht mit humaner genomischer DNA, was zeigt, dass es sich um fremde DNA handelt. Diesem fremden Fragment geht eine EcoRI-Stelle und ein möglicher Linker voraus. Es wurde möglicherweise während der Herstellung der Bank künstlich inseriert.
Sequenzen der 3'-Segmente von Transkripten in peripherem Blut wiesen durch RNA-PCR nur kurze 3'-untranslatierte Regionen nach, die vor dem poly-A-Schwanz geringfügig in ihrer Länge variierten. Ähnliche Sequenzen wurden erhalten, wenn andere cDNAs aus der humanen Knochenmarkbank analysiert wurden. Die größeren Kell-Transkripte konnten unter Anwendung des RNA-PCR-Verfahrens aufgrund ihrer Länge nicht amplifiziert werden, jedoch zeigt die Northern-Analyse ihre Anwesenheit. Das Auftreten von mehrfachen Transkripten mit einer größeren 3'-untranslatierten Region ist nicht unüblich und, obgleich ihre Funktion nicht richtig aufgeklärt ist, wird angenommen, dass die 3'-untranslatierten Regionen eine Rolle bei der Regulation der Expression spielen (Ref. 61-62).
Beispiele 5 bis 7
DNA-Präparation
In den Beispielen 5-7 wurde DNA aus peripherem Blut von Personen, deren Kell-Phänotypen serologisch bestimmt worden waren, präpariert. DNA wurde entweder aus 1 bis 5 ml Vollblut, das unter Zusatz von Antikoagulantien gewonnen worden war, oder bei Entfernung von Erythrozyten durch 10-minütige Zentrifugation mit 1000 × g aus der erhaltenen Leukozytenmanschette (buffy coat) präpariert. In beiden Fällen wurde das von John et al. (Ref. 63) beschriebene Verfahren zur Präparation von DNA herangezogen. Einige der DNA-Proben wurden von kanadischen Hutterern gewonnen und serologische Studien dieser Familien zeigten, dass sie für K1 oder K2 homozygot waren. In diesen Proben wurde DNA gemäß den Angaben von Zelinski et al. isoliert (Ref. 30).
Polymerase-Kettenreaktion
Für die Beispiele 5-7 wurde die Polymerase-Kettenreaktion folgendermaßen durchgeführt: Denaturierungs-, Annealing- und Polymerisationsstufen wurden in einem automatisierten Thermocycler-Gerät (Minicycler, MJ Research Inc., Watertown, MA) durchgeführt. Ein anfänglicher Zyklus umfasste 3 Minuten bei 94 °C, 1 Minute bei 62 °C und 30 Sekunden bei 72 °C. In den Zyklen 2 bis 30 wurden folgende Bedingungen eingehalten: 30 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 62 °C und 30 Sekunden bei 72 °C. Im letzten Zyklus wurde die Polymerisationsstufe bei 72 °C auf 10 Minuten verlängert. Die Endkonzentrationen der Reagenzien waren 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 9,0), 3 mM MgCl₂, 350 nM von jedem Primer, 200 uM von jedem dNTP, 0,1% Triton-X100, 100-200 ng genomische DNA und 2,5 Einheiten taq-Polymerase in einem Endvolumen von 100 μl. Es wurde das "Heißstart"-Verfahren unter Verwendung von Ampliwax^® der Firma Perkin Elmer (Branchburg, NJ) angewandt. Die amplifizierten PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese an 0,8% Agarose-Gelen aufgetrennt und durch Ethidiumbromid-Färbung nachgewiesen.
Restriktionsenzymverdau
BsmI wurde direkt zum endgültigen PCR-Reaktionsgemisch gegeben. Das PCR-Gemisch (10 μl) wurde durch BsmI-Verdau unter Zugabe von 2 μl 35 mM MgCl₂, 1 μl von 10 mM Mercaptoethanol oder 10 mM DTT, 1 μl von 10X BsmI-Puffer, 4 μl Wasser und 2 ul von 5 Einheiten/ml BsmI optimiert. Das Gemisch wurde 90 Minuten bei 65 °C inkubiert. Die DNA im Reaktionsgemisch wurde durch Elektrophorese in 0,8% Agarose analysiert.
Weitere Reagenzien
Taq-DNA-Polymerase und dNTPS wurden von der Firma Promega Co. (Madison, WI) bezogen. X-Gal wurde von der Firma Appligen Inc. (Pleasanton, CA) bezogen. Die DNA-1 kb-Ladder-Standards, DH5aF'-Stamm-E. coli-kompentente Zellen und niedrigschmelzende Agarose wurden von der Firma Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg, MD) bezogen. T4-DNA- Ligase und BsmI wurden von der Firma New England Biolabs (Beverly, MA) bezogen. pT7-Blue (R)-Plasmidvektor wurde von der Firma Novagen (Madison, WI) bezogen. Die Quick Spin^®-Säule (G-50 Sephadex) für die DNA-Reinigung wurde von der Firma Boehringer Mannheim, Inc. (Indianapolis, IN) bezogen.
Beispiel 5
Vergleich von K1- und R2-DNA-Sequenzen
Neun Paare von Vorwärts- und Rückwärtsprimern wurden zur Amplifikation der 19 KEL-Exons verwendet. Diese Primerpaare wurden so ausgewählt, dass sie die offenen Leseraster der Exons abdeckten. Die Sequenzen der Primer und die Ziel-Exons (Überspannungsregionen) sind in Tabelle 1 aufgeführt. Genomische DNA von einer homozygoten K1-Person wurde als Matrizen-DNA verwendet. Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese an 0,8% Agarosegelen getrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt. In sämtlichen Fällen wurden einzelne Produkte im Größenbereich von 0,48 bis 1,5 kb erhalten. 6 erläutert die PCR-Amplifikation der KFL-Exons. Bei den Bahnen 1 und 11 in 6 handelt es sich um 1 kb-DNA-Ladder-Standards. Die Bahnen 2 bis 10 enthalten PCR-Produkte der Primerpaare PCR 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 und 9 in der angegebenen Reihenfolge.
Beispiel 6
Die in Beispiel 1 erhaltenen PCR-Produkte wurden unter Anwendung des folgenden Verfahrens sequenziert. Die durch Elektrophorese an niedrigschmelzender 2,8 %-iger Agarose abgetrennten PCR-Produkte wurden eluiert, mit pT7-Blue (R)-Plasmidvektor verknüpft und in den DH5αF'-Stamm von E. coli transformiert. Plasmid-DNA wurde in einem kleinen Maßstab durch das Alkali-Lysisverfahren präpariert und mit einer Quick Spin^® (Sephadex G50)-Säule gereinigt. Übliche molekularbiologische Verfahren wurden herangezogen, wie sie bei Sambrook et al. (Ref. 42) ausführlich beschrieben sind. Die DNA-Sequenzierung wurde mit einem automatisierten System (Applied Biosystems, Modell 373A, Version 1.2.0) durchgeführt.
Die sequenzierten Produkte wurden mit der früher beschriebenen Sequenz von K2-cDNA (Ref. 25) verglichen. Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass die Sequenz von K1-DNA für eine Aminosäuresequenz kodiert, die identisch mit der von K2-DNA ist, ausgenommen ein einziger Basenaustausch. Dieser Unterschied zwischen K1 und K2 erfolgt als eine Verschiebung von C zu T beim Nucleotid 701 in Exon 6.
Das PCR-Produkt PCR3 (Tabelle 1), das die Exons 5 und 6 überspannt, wies bei Vergleich mit K2-DNA einen Unterschied in einer einzelnen Base auf. Die Basensequenzen eines Teils des Exons 6 und die Aminosäuren, für die diese kodieren, sind in 7 dargestellt. Die Sequenz von K2-DNA ist oben und die von K1-DNA ist unten angegeben. Im PCR3-Produkt, das eine Länge von 740 by aufwies, lag eine einzelne Substitution von Cytosin (C) zu Thymin (T) vor, entsprechend der Position 701 von Kell-cDNA. Die C- zu T-Substitution ist in Fettbuchstaben dargestellt und durch einen Pfeil markiert. Dieser Austausch lässt eine Vorhersage eines Austausches von Threonin zu Methionin an einer Consensus-N-Glycosylierungsstelle zu (Asn.X.Thr). Ein N-verknüpftes Glycosylierungsmotiv in K2 und das unterbrochene Motiv in K1 sind unterstrichen. Da dieser einzelne Basenaustausch den einzigen Unterschied zwischen K1 und K2 darstellt, der für einen Austausch einer Aminosäure kodiert, ließ diese Beobachtung darauf schließen, dass der Austausch von Threonin zu Methionin (Thr→Met) in Position 193 die N-Glycosylierung am Asparaginrest 191 in K1-exprimierenden Proteinen behindert, wodurch der K1/K2-Polymorphismus identifiziert wird.
Beispiel 7
Bestätigung des K1/R2-Polymorphismus durch BsmI-Analyse
Die Substitution von C zu T an der Nucleotidposition 701 (nt 701) im Exon 6 erzeugt eine neue Sequenz unter Einschluss der Sequenz 5'-GAATGCT-3', von der bekannt ist, dass sie eine für BsmI spezifische Restriktionsenzymstelle definiert. Infolgedessen wurde angenommen, dass eine Behandlung des 740 bp-PCR-Produkts, das die Exons 5 und 6 (PCR 3) überspannt, mit BsmI eine Maßnahme darstellt, mit der die K1/K2-Genotypen zu differenzieren sind. Bei einem PCR-Verfahren unter Anwendung eines Verdaus mit BsmI sollte der K1/K1-Genotyp zwei Fragmente ergeben, und zwar mit 540 und 200 bp; der K2/K2-Genotyp sollte das ungeschnittene 740 bp-PCR-Produkt ergeben; und K1/K2-Heterozygoten sollten drei Fragmente mit 740, 540 und 200 by ergeben. Um zu bestätigen, dass dieser Basenaustausch tatsächlich den K1-Genotyp identifiziert, wurde diese Region bei 42 verschiedenen Personen von bekanntem K1/K2-Phänotyp analysiert.
Das PCR3-Primerpaar (Tabelle 1) wurde zur Erzeugung von PCR-Produkten (740 bp) durch PCR-Amplifikation von DNA, die von verschiedenen Kell-Phänotypen erhalten worden war, verwendet. Nach der Amplifikation wurden die Proben mit BsmI behandelt und durch Elektrophorese an 0,8% Agarosegelen getrennt.
8 erläutert die beim vorstehenden Experiment erhaltenen Ergebnisse. Die Gelbahnen sind folgendermaßen definiert:
Die Bahnen 1 und 20 enthalten 1 kb-Ladder-DNA-Standards. Bei der Bahn 2 handelt es sich um unbehandeltes PCR3 von K1-Homozygoten. Die Bahnen 3 bis 19 sind mit BsmI behandelt. Sämtliche K2-Homozygotenproben (K:-1,2) ergaben ungeschnittene 740 bp-Produkte. Die K1-Homozygoten (K:1,-2) ergaben nur 540- und 200 bp-Fragmente. K1/K2-Heterozygoten (K:1,2) wiesen 3 Banden auf, nämlich das ungeschnittene 740 bp-Produkt und die kleineren 540 bp- und 200 bp-Produkte.
Von den 42 getesteten DNA-Proben waren 12 entweder K1- oder K2-homozygot, 6 waren K1/K2-heterozygot und 24 waren K:-1,2-Phänotypen, enthielten aber wenig vorherrschende oder seltene Kell-Phänotypen. Diese umfassten K3-, K6-, K10-, K_o-, K14/K24-Heterozygoten und einen McLeod-Phänotyp. In 40 der 42 Fälle stimmte die BsmI-Genotypisierung mit den Kell-Phänotypen, die durch serologische Analyse von Erythrozyten bestimmt worden waren, überein. In zwei Fällen identifizierte die Genotypisi.erung eine der Proben als K:-1,2-homozygot und die andere als K:1,2-heterozygot. Diese beiden Proben wurden jedoch serologisch als "schwache" K1-Phänotypen identifiziert.
Keiner der übrigen, vorstehend aufgeführten wenig verbreiteten oder seltenen Kell-Phänotypen wiesen im Exon 6 die Basensubstitution von C zu T auf, was zeigt, dass dieser Austausch spezifisch für den K1/K2-Polymorphismus ist.
Beispiel 8
Bei einem Verfahren zur differentiellen Bestimmung des K1/K2-Genotyps bediente man sich der Polymerase-Kettenreaktion, um Proben von genomischer DNA unter Verwendung eines einzigen Primergemisches zu testen. Das Primergemisch umfasste die folgenden Primer:
MK1R ATA CTG ACT CAT CAG AAG TTT CAG CA (SEQ ID NO:1)
MK2F TGG ACT TCC TTA AAC TTT AAC TGA AC (SEQ ID NO:3)
EI5F TTT AGT CCT CAC TCC CAT GCT TCC (SEQ ID NO:4)
EI6R TAT CAC ACA GGT GTC CTC TCT TCC (SEQ ID NO:5)
Der MK1R-Primer ist spezifisch für K1-DNA und erzeugt ein PCR-Produkt mit einer Länge von 540 bp. Der MK2F-Primer ist spezifisch für K2-DNA und erzeugt ein PCR-Produkt mit einer Länge von 240 bp. Die übrigen Primer EI5F und EI6R sind K1/K2-spezifisch und erzeugen PCR-Produkte mit einer Länge von 740 bp. Sie werden als interne Kontrolle verwendet.
Das Primergemisch enthielt die Primer in den folgenden Konzentrationen: 20 ng/μl MK1R; 20 ng/μl MK2F; 30 ng/μl EI5F; und 30 ng/μL EI6R. EI5F- und EI6R-Primer werden bei der PCR für zwei Reaktionen verwendet, während die MK1R- und MK2F-Primer jeweils nur für eine Reaktion verwendet werden. Die Konzentrationen der Primer werden angepasst, um ausreichende Mengen der EI5F- und EI6R-Primer während der Dauer der Reaktion zu gewährleist.
Blutproben wurden von freiwilligen Versuchspersonen erhalten. DNA wurde von Leukozyten, die in der Leukozytenmanschette von Blutproben vorhanden waren, unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens isoliert.
Reaktionsröhrchen mit einem Gehalt an 1 Ampliwax^R und 25 μl eines ersten Reagenzcocktails mit folgenden Bestandteilen wurden vorbereitet: 2,5 μl 10X Puffer (Promega Co., Madison, WI); 4 μl dNTP; 3 μl 25 mM MgCl₂; 7 μl Primergemisch; und 8,5 μl H₂O. Man erhielt ein vorläufiges Reaktionsgemischvolumen von 25 μl. Diese vorläufigen Gemische wurden vor der Weiterverarbeitung 5 Minuten bei 80 °C inkubiert und 5 Minuten auf Raumtemperatur gekühlt. Jedes der Röhrchen wurde mit 23 μl eines zweiten Reagenzcocktails mit einem Gehalt an folgenden Bestandteilen versetzt: 2,5 μl 10X Puffer; 3 μl 25 mM MgCl₂; 17 μl H₂O; und 0,5 μl taq-DNA-Polymerase (Promega Co., 5 Einheiten/μl) und 100 ng isolierte genomische DNA in 2 μl H₂O.
Die PCR-Reaktion wurde unter Anwendung des folgenden Zyclisierungsprogramms durchgeführt. Der anfängliche Zyklus bestand aus 3 Minuten bei 94 °C, 1 Minute bei 62 °C und 30 Sekunden bei 72 °C. Die Zyklen 2-30 umfassten jeweils 30 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 62 °C und 30 Sekunden bei 72 °C. Im letzten Zyklus wurde die Polymerisationsstufe bei 72 °C auf 10 Minuten verlängert.
Im Anschluss an die Beendigung der PCR wurden die amplifizierten Produkte unter Verwendung von Ethidiumbromid/Agarose-Gelelektrophorese gemäß Literaturverfahren aufgetrennt.
Die Ergebnisse dieses Verfahrens sind in 9 dargestellt. Die Bahnen 1 und 11 stellen identische Kontrollproben mit einem Gehalt an gemischten DNA-Fragmenten von bekannter Größe dar. Die Bahnen 2-4 stellen interne Kontrollproben von Personen, deren K1/K2-Genotyp bereits bekannt war, dar. Die Kontrollbahn 2 zeigt die Anwesenheit von 540 bp- und 740 bp-Fragmenten, was darauf hinweist, dass das Subjekt K1-homozygot ist (K:1,-2). Die Kontrollbahn 3 zeigt die Anwesenheit von 200 bp- und 740 bp-Fragmenten, was darauf hinweist, dass das Subjekt K2-homozygot ist (K:-1,2). Die Kontrollbahn 4 zeigt die Anwesenheit der einzelnen K1/K2-Fragmente, d. h. 200 bp, 540 by und 740 bp, was darauf hinweist, dass das Subjekt heterzygot ist (K:1,2).
Die Bahnen 5-7 in 9 stellen Proben einer Familie von Testpersonen dar: Die Bahnen 5 und 6 stammen von den Eltern und die Bahn 7 von einem Fötus. Ein Vergleich der Testbanden mit den Kontrollbanden ergibt, dass der in Bahn 5 wiedergegebene Elternteil heterozygot ist (K:1,2) und dass der in Bahn 6 wiedergegebene Elternteil K2-homozygot ist (K:-1,2). Der Fötus ist klar K2-homozygot (K:-1,2).
Die Bahnen 8-10 in 9 geben Proben einer weiteren Familie von Testpersonen wieder. Der erste Elternteil, der in Bahn 8 wiedergegeben ist, ist heterozygot (K:1,2), während der in Bahn 9 wiedergegebene zweite Elternteil K2-homozygot ist (K:-1,2). Der in Bahn 10 wiedergegebene Fötus ist als K2-homozygot identifizierbar (K:-1,2).
Die in den Beispielen 7 und 8 vorgelegten experimentellen Daten beweisen klar die diagnostische Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Beispiele zeigen, dass Individuen von jedem der drei K1/K2-Genotypen in positiver Weise aufgrund der Unterschiede zwischen K1-DNA und K2-DNA unterscheidbar sind. Insbesondere kann der neu identifizierbare Locus des K1/K2-Polymorphismus mittels Amplifikation von Kell-DNA unter Verwendung von K1- und K2-spezifischen Nucleinsäuresonden sowie mittels differenziellem Verdau von K1- und K2-DNA mit einem Restriktionsenzym ausgenützt werden.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Diagnostisches Verfahren zur Bestimmung des K1- und/oder K2-Genotyps eines Subjekts, umfassend: das Erzeugen eines Nucleinsäureprodukts, das charakteristisch für den K1- und/oder K2-Genotyp ist, aus einer Nucleinsäureprobe, die einen K1/K2-Polymorphismuslocus umfasst, wobei der Locus sich im Exon 6 des Gens, das für das Kell-Protein kodiert, befindet, wobei der K1-Genotyp des Kell-Proteins durch die Exons 1 bis 19 gemäß der Definition in SEQ ID NO 37 bis SEQ ID NO 55 kodiert wird, mit der Ausnahme, dass es sich beim Nucleotid 78 in SEQ ID NO 42 um Thymin handelt, wobei der K2-Genotyp des Kell-Proteins durch die Exons 1 bis 19 gemäß der Definition in SEQ ID NO 37 bis SEQ ID NO 55 kodiert wird, wobei diese Erzeugungsstufe das Verdauen der Nucleinsäureprobe mit einem Restriktionsenzym, das in charakteristischer Weise die K1-Nucleinsäure und/oder K2-Nucleinsäure spaltet, umfasst, wobei das Restriktionsenzym BsmI umfasst, wobei das Produkt in einer Menge erzeugt wird, die zur Charakterisierung des K1- und/oder K2-Genotyps ausreicht.
Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Erzeugungsstufe ferner das Amplifizieren von Nucleinsäure umfasst.
Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Amplifizierungsstufe das Amplifizieren der Nucleinsäureprobe vor der selektiven Spaltungsstufe umfasst.
Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Amplifizierungsstufe das Amplifizieren des Nucleinsäureprodukts im Anschluss an die selektive Spaltungsstufe umfasst.
Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Amplifizierungsstufe das Amplifizieren von Nucleinsäure durch die Polymerase-Kettenreaktion, Ligase-Kettenreaktion oder eine Kombination davon umfasst.
Diagnostisches Verfahren zur Bestimmung des K1 und/oder K2-Genotyps eines Subjekts, umfassend: das Erzeugen eines Nucleinsäureprodukts, das charakteristisch für den K1- und/oder K2-Genotyp ist, aus einer Nucleinsäureprobe, die einen K1/K2-Polymorphismuslocus umfasst, wobei der Locus sich im Exon 6 des Gens, das für das Kell-Protein kodiert, befindet, wobei der K1-Genotyp des Kell-Proteins durch die Exons 1 bis 19 gemäß der Definition in SEQ ID NO 37 bis SEQ ID NO 55 kodiert wird, mit der Ausnahme, dass es sich beim Nucleotid 78 in SEQ ID NO 42 um Thymin handelt, wobei der K2-Genotyp des Kell-Proteins durch die Exons 1 bis 19 gemäß der Definition in SEQ ID NO 37 bis SEQ ID NO 55 kodiert wird, wobei diese Erzeugungsstufe folgendes umfasst: das charakteristische Amplifizieren der Nucleinsäureprobe unter Verwendung eines Allelen-spezifischen Primers, der in charakteristischer Weise Allelen eines K1/K2-Polymorphismus amplifiziert, wobei der Allelen-spezifische Primer einen Primer einschließt, der die Nucleotidsequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: ATA CTG ACT CAT CAG AAG TTT CAG CA (SEQ ID NO:1); ATA CTG ACT CAT CAG AAG TCT CAG CA (SEQ ID NO:2); ATA CTG ACT CAT CAG AAG TGT CAG CA (SEQ ID NO:61); TGG ACT TCC TTA AAC TTT AAC TGA AC (SEQ ID N0:3); TTT AGT CCT CAC TCC CAT GCT TCC (SEQ ID NO:4); TAT CAC ACA GGT GTC CTC TCT TCC (SEQ ID NO:5); TTA GTC CTC ACT CNC CAT GCT TCC (SEQ ID NO:62); und TCA CAC AGG TGT CCT CTC TTC C (SEQ ID NO:63) zur Bereitsstellung des charakteristischen Nucleinsäureprodukts, wobei das Produkt in einer Menge erzeugt wird, die ausreicht, den K1- und/oder K2-Genotyp zu charakterisieren.
Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 6, wobei die charakteristische Amplifizierungsstufe das charakteristische Amplifizieren der Nucleinsäureprobe durch die Polymerase-Kettenreaktion, die Ligase-Kettenreaktion oder eine Kombination davon, umfasst.
Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 1 oder 6, ferner umfassend das Ableiten einer Information, die den K1/K2-Genotyp charakterisiert, aus dem Nucleinsäureprodukt, wobei das Nucleinsäureprodukt ein oder mehr Nucleinsäurefragmente umfasst und wobei die Informationsableitungsstufe folgendes umfasst: Abtrennen des einen oder der mehreren Nucleinsäurefragmente zur Bereitstellung eines Fragmentmusters, wobei das Fragmentmuster eine spezifische Information liefert, die den K1/K2-Genotyp des Subjekts charakterisiert.
Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Informationsableitungsstufe ferner das Nachweisen von einem oder mehreren Nucleinsäurefragmenten im Fragmentmuster umfasst.
Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Nachweisstufe das Markieren des einen oder der mehreren Nucleinsäurefragmente mit einer nicht-spezifischen Markersubstanz umfasst.
Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Nachweisstufe das spezifische Markieren des einen oder der mehreren Nucleinsäurefragmente mit einer oder mehreren Hybridisierungssonden umfasst und wobei jede der Hybridisierungssonden Spezifität für ein einzelnes Nucleinsäurefragment zeigt.
Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 11, wobei jede der Hybridisierungssonden nachweisbar markiert ist.
Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 1 oder 6, ferner umfassend das Bestimmen eines Nicht-Kell-Genotyps des Subjekts.
Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 1 oder 6, ferner umfassend das Bestimmen eines Kell-Phänotyps des Subjekts.
Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Bestimmungsstufe das Bestimmen eines Kell-Phänotyps des Subjekts durch serologisches Testen umfasst.
Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 1, umfassend eine von einem Subjekt abgeleitete DNA-Probe.
Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 16, wobei die DNA-Probe genomische DNA umfasst.
Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 16, wobei die DNA-Probe sich von einer biologischen Probe ableitet, die erythroides Gewebe des Subjekts enthält.
Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 18, wobei die biologische Probe amniotische Flüssigkeit oder Chorionzotten umfasst und wobei es sich beim Subjekt um einen Fötus in utero handelt.
Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 18, wobei die biologische Probe eine Blutprobe umfasst.
Nucleinsäure-Oligomeres, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, die spezifisch an den K1-Polymorphismuslocus gemäß der Definition in Anspruch 1 bindet.
Nucleinsäure-Oligomeres nach Anspruch 21, wobei das Oligomere nachweisbar markiert ist.
Nucleinsäure-Oligomeres nach Anspruch 21, wobei das Oligomere an einem Substrat angebracht ist.
Nucleinsäure-Oligomeres nach Anspruch 21, wobei die Nucleinsäuresequenz genau komplementär zum Locus der K1-Nucleinsäure ist.
Nucleinsäure-Oligomeres, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, die für eine polymorphe Region von K1 kodiert, wobei die Aminosäuresequenz der polymorphen Region in SEQ ID NO:58 dargestellt ist.
Nucleinsäure-Oligomeres nach Anspruch 25, wobei das Oligomere nachweisbar markiert ist.
Nucleinsäure-Oligomeres nach Anspruch 25, wobei das Oligomere an einem Substrat angebracht ist.
Polypeptid auf Kell-Basis, umfassend eine Aminosäuresequenz, die die in SEQ ID NO:58 dargestellte K1-Domäne umfasst.
Polypeptid auf Kell-Basis nach Anspruch 28, wobei das Polypeptid nachweisbar markiert ist.
Polypeptid auf Kell-Basis nach Anspruch 28, wobei das Polypeptid an einem Substrat angebracht ist.
Rekombinanter Expressionsvektor, der zum Transformieren einer Zelle unter Verursachung einer Expression des K1-Proteins befähigt ist, umfassend einen Expressionsvektor, der SEQ ID NO:37 bis SEQ ID NO:55 umfasst, wobei es sich beim Nucleotid 78 in SEQ ID NO:42 um Thymin handelt.
Verfahren zur Herstellung einer Zelllinie, die so transformiert ist, dass sie das K1-Protein exprimiert, umfassend das Transformieren einer Zelle mittels des rekombinanten Expressionsvektors nach Anspruch 31 zur Erzeugung einer transformierten Zelle und das Schaffen einer stabilen transformierten Zelllinie, die sich von der transformierten Zelle ableitet.
Transformierte Zelllinie, hergestellt nach dem Verfahren von Anspruch 32.
Verfahren zur Herstellung eines für K1 spezifischen Antikörpers, umfassend: das Induzieren der Erzeugung von mindestens einem Antikörper gegen das K1-Antigen, das durch eine transformierte Zelllinie, die gemäß Anspruch 32 hergestellt worden ist, exprimiert worden ist.