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Diese
Erfindung betrifft ein Immun-Testverfahren, wobei chemische modifizierte
Antikörper
verwendet werden, die Verwendung der chemisch modifizierten Antikörper, um
die Probeninterferenz in einem Immuntest zu minimieren und ein Kit
zur Testung von biologischen Proben, das die chemisch modifizierten
Antikörper
umfaßt.
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Die
Probeninterferenz in Immuntests schließt schädliche Interaktionen zwischen
spezifischen Komponenten von Immuntests und interferierenden Spezies
in Proben ein und ist ein gut dokumentiertes Phänomen. Referenzen für Probeninterferenz
schließen
ein (1) Levinson S., "Heterophilic antibodies
and their rote in immunoassay interference"; J. Clin. Immunoassay, 1992, 15, 108–115 und (2)
Maxey K. M., Krishna R. and Birkmeir J., "Interference in Enzyme Immunoassays"; J. Clin. Immunoassay,
1992 15, 116–120.
Vieles dieser Interferenz kann der Anwesenheit von Spezies innerhalb
von Proben zugeordnet werden, die spezifische Immuntestkomponenten
kreuzvernetzen. Routinemäßig wird
dies durch Antikörper
oder andere Probenkomponenten verursacht, die gegen entweder (a)
strukturelle Elemente der Immunglobuline des Immuntests oder (b)
strukturelle Elemente von nativen, rekombinanten oder synthetischen
Antigenen gerichtet sind.
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Immunglobuline
sind aus zwei schweren Ketten zusammengesetzt, die jede aus drei
konstanten Regionen (CH-1, CH-2 und CH-3) und einer variablen Region
(VH) bestehen. Diese sind mit zwei leichten Ketten assoziiert, die
jede aus einer konstanten Region (CL) und einer variablen Region
(VL) bestehen. Es gibt auch strukturelle Varianten von Immunglobulin
schweren und leichten Ketten, die Isotypen genannt werden – siehe
zum Beispiel Vlug A. and Van Remortal P., "The structure and function of human
IgG subclasses";
European Clinical Lab., 1989, 8, 26–33. Eine interferierende Probe
kann eine Reaktivität
gegen einen Isotyp zeigen, jedoch nicht gegen einen anderen. Andere
interferierende Proben können
Reaktivität über Isotypen
hinweg zeigen. Ein signifikanter Anteil, obwohl nicht alle, der
interferierenden anti-Antikörper-Komponenten
sind gegen die Fc-Region (CH2-CH3) der Test-spezifischen Immunglobuline
gerichtet. Die Interferenz kann auch auftreten, wenn markierte und
unmarkierte Test-spezifische Spezies, wobei eines oder mehrere dieser
ein Antigen ist, durch eine interfe rierende Spezies kreuzvernetzt
werden. Die Blockierung von Interferenz wurde in der Vergangenheit
durch die Hinzufügung von
Mengen von Immunglobulin-enthaltenden Seren und verschiedenen Spezies
oder gereinigten Immunglobulinen oder aggregierten Immunglobulinen
erreicht. Dies wurde in US-Patent Nr. 4,914,040 von Boehringer Mannheim,
erteilt 1990 und mit dem Titel "Reagent
und Verfahren zur Bestimmung einer polyvalenten Substanz unter der
Verwendung eines Immunaggregats" beschrieben.
Die Verringerung der Interferenz oder auch durch das Entfernen des Fc-Fragments
aus einem oder mehreren der Test-spezifischen
Immunglobulinen und auch durch Blockieren von Test-spezifischen
Antikörper
mit anti-Fc-Antikörper
erreicht, wie beschrieben in der Europäischen Patentanmeldung Nr.
566205A.
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Es
wurde berichtet, daß rheumatoider
Faktor und andere interferierende Spezies hauptsächlich mit den CH-2- und CH-3-Regionen
von Immunglobulin schweren Ketten reaktiv sind – siehe zum Beispiel Williams
R. C., Malone C. and Solomon A., "Conformational dependency of human IgG
heavy chain-associated Gm allotypes"; Mol. Immunol., 1993, 30, (4), 341–351. Die
Existenz von Spezies, die mit der CH-1-Region von Immunglobulin
schwerer Kette reaktiv sind, ist auch bekannt – siehe zum Beispiel Aguado
M. T., Balderas R. S., Rubin R. L., Duchosal R. K., Kofler R., Birshtein
B. K., Secher D. S., Dixon F. J. and Theofilopoulos A. N., "Specificity and molecular characteristics
of monoclonal IgM rheumatoid factors from arthritic and non-arthritic
mice"; J. Immunol., 1987,
139, 1080–1087.
Die Anwesenheit dieser Faktoren in Probenseren können inkorrekte Antigen-Konzentrationsbestimmungen
in Immuntests verursachen. Das Entfernen des Fc aus Test-spezifischen
Immunglobulinen wird daher Faktoren, die mit der CH-1-Region reaktiv
sind, nicht an ihrer Bindung hindern.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung stellen wir ein Verfahren für den Immuntest in einer biologischen
Probe, wie definiert im Anspruch 1, zur Verfügung.
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Weiter
gemäß der vorliegenden
Erfindung stellen wir zur Verwendung in einem Verfahren für den Immuntest
in einer biologischen Probe die Verwendung eines modifizierten Antikörpers und/oder Fragments
eines Antikörpers,
wie definiert in Anspruch 2, zur Verfügung.
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Weiter
gemäß der vorliegenden
Erfindung stellen wir einen Kit zur Verfügung, das in einem Immuntest
brauchbar ist, der einen Antikörper
und/oder Fragment eines Antikörpers,
wie definiert in Anspruch 3, umfaßt.
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Die
chemische Modifikation von spezifischen Aminosäureresten in Immunglobulin
ermöglicht
es, eine Blockade oder Verringerung der oben genannten Interaktionen
zu erreichen. Geeigneter Weise wird der Antikörper und/oder das Fragment
(hier im folgenden als der Reagenzpartikel bezeichnet) chemisch
behandelt, um die Ladung und/oder strukturellen Eigenschaften von
einer oder mehrerer der Gruppe der betroffenen Aminosäuren, d.
h. Arginin, Histidin, Lysin, Threonin und Tyrosin zu modifizieren,
so daß die
Erkennung durch den Reagenzpartikel eines interferierenden Antikörpers nicht
länger
möglich
ist. Geeigneter Weise sind die aktiven Stellen auf dem Reagenzpartikel,
die für
eine Modifikation von Aminosäuren
ausgewählt
werden, diejenigen, an die eine interferierende Aminosäure in einem
signifikanten Ausmaß binden
könnte.
Die Zielregionen des Reagenzpartikels schließen die "konstanten" Regionen von Antikörpern ein. Während des
Modifikationsverfahrens werden Arginin-, Histidin-, Lysin-, Threonin- und
Tyrosin-Gruppen, die anderswo auf einem Reagenzpartikel als an aktiven
Stellen lokalisiert sind, auf eine geeignete Weise geschützt, um
ein Auftreten irgendeiner signifikanten Modifikation dieser zu verhindern.
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Jede
geeignete chemische Modifikation der betroffenen Aminosäuregruppen
auf dem Reagenzpartikel kann im Modifikationsverfahren der Erfindung verwendet
werden. Die bevorzugte Modifikationstechnik wird in jedem Fall von
der zu modifizierenden Aminosäure
abhängen.
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Chemische
Verbindungen, die verwendet werden können, um Reagenzpartikel zu
modifizieren, schließen
Verbindungen ein, die die Struktur: R-O-CO-X aufweisen,
worin R jedes eines weiten Bereichs von Gruppen, einschließlich Alkyl,
Aryl und Pyridyl, sein kann und
X eine abspaltbare Gruppe ist,
wie zum Beispiel Pyrocarbonat -O-CO-OR, eine Halogengruppe,
insbesondere ein Chlorid oder ein Bromid oder ein gemischtes Säureanhydrid,
wie zum Beispiel -O-CO-R', worin R' jede eines weiten
Bereichs von Alternativen sein kann (Verbindungen dieser Struktur
sind besonders brauchbar für
die Modifikation von Histidin- oder Lysin-Gruppen);
Alkylhaliden;
und
Verbindungen, die die Strukturen: Y-CR-CO-R; R-CO-Y; und R-NCO-Z aufweisen,
worin R wie oben ist, wobei es einen weiten Bereich von Möglichkeiten
aufweist;
Y ist geeigneter Weise eine saure Gruppe, eine aktivierende
Estergruppe oder eine Halogengruppe, insbesondere Chlorid oder Bromid;
und
Z ist eine Halogengruppe.
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Die
im Modifikationsverfahren verwendete chemische Verbindung kann auch
ein Vorläufer
der Verwendeten sein um die Modifikation zu bewirken, d. h. eine
Quelle von geeigneten Resten. Ein Beispiel von solch einem Vorläufer ist
Diazomethan.
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Spezifische
Verbindung, die verwendet werden können, schließen N-Benzyloxycarbonyloxysuccinimid,
N-(2-Brombenzyloxcycarbonyloxy)succinimid, Diphenylcarbamylchlorid
und Adamantylfluorformat ein.
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Besonders
für das
Modifikationsverfahren der Erfindung brauchbare Verbindungen in
einem weiten Bereich von Fällen
sind Pyrocarbonate, die die Struktur: R-O-CO-O-OC-O-R, aufweisen,
worin R stark variieren kann, mögliche Gruppen
schließen
Aryl, Alkyl und Pyridyl ein.
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Besonders
brauchbare Pyrocarbonate schließen
Dimethylpyrocarbonat, Diethylpyrocarbonat und Dipropylpyrocarbonat
ein.
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Geeignete
Bedingungen für
das Modifikationsverfahren der Erfindung hängen vom Reagenzpartikel, dem
verwendeten chemischen Modifikator, der zu modifizierenden Aminosäuregruppe
und seiner Anordnung in dem Reagenzpartikel, d. h. der Zielregion,
ab. Geeigneter Weise wird der pH so ausgewählt, daß die Zielstelle und das verwendete
chemische Reagenz berücksichtigt
wird, das die Modifikation bewirkt. Die Temperatur beeinflußt die Spezifität der erreichten
Modifikation und wird geeignet kontrolliert, um eine geeignete Spezifität zu erhalten. Größere Spezifitäten werden
bei niedrigeren Temperaturen erreicht.
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Die
Erfindung ist allgemein auf Immuntests anwendbar, einschließlich Tests
für TSH,
Toxo IgG, Toxo IgM, Rubella und freie Hormontests. Der modifizierte
Antikörper
in dem Kit der Erfindung wird als Konjugat zusammen mit einem Enzymmarker,
zum Beispiel Meerrettichperoxidase (HRP), zur Verfügung gestellt.
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Die
Erfindung ergibt den Vorteil von verringerter Probeninterferenz
bei der Durchführung
von Immuntests.
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Die
Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und durch die beigefügten Zeichnungen
verdeutlicht, worin:
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1 ein
Blockdiagramm ist, das die Ergebnisse von Beispiel 2 verdeutlicht;
und
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2 ein
Graph ist, der die Ergebnisse von Beispiel 3 verdeutlicht.
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Beispiel 1
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Ein
Meerrettichperoxidase-konjugierter anti-TSH-Antikörper (anti-TSH-HRP)
wurde mit 34 mMolar Diethylpyrocarbonat in 0,1 Molar Phosphatpuffer
bei pH 6,0 für
30 Minuten bei Raumtemperatur vorbehandelt. Der so vorbehandelte
und modifizierte anti-TSH-HRP wurde dann auf 0,42 μg/ml in einem Phosphatpuffer
verdünnt,
der 1% w/v Rinderserumalbumin enthielt. Dies wurde dann in Immuntest-Wells, die
mit einem zweiten anti-TSH-Antikörper
beschichtet waren mit einem Euthyroidserum inkubiert, von dem bekannt
war, daß es
eine interferierende Spezies enthielt. Unmodifizierter anti-TSH-HRP
wurde als eine Kontrolle in dem Experiment eingeschlossen. Die Inkubation
wurde für
30 Minuten bei 37°C
auf einem "Amerlite"-(TM)-Schüttelinkubator,
vertrieben durch Kodak Clinical Diagnostics Limited (KCDL), Mandeville
House, 62 The Broadway, Amersham, Buckinghamshire, HP7 0HJ, UK,
durchgeführt.
Danach wurden die Wells gewaschen und "Amerlite"-Signal-Erzeugungsreagenz (auch durch KCDL vertrieben)
wurde hinzugefügt.
Der Signalspiegel und die Datenintegration für jede Probe wurde auf einem "Amerlite"-Analyser (auch durch
KCDL vertrieben) bestimmt. Das Experiment wurde im allgemeinen auf die
Weise durchgeführt,
die in der Packungsanweisung des Standardtests für anti-TSH-Antikörper beschrieben
wurde, der durch KCDL vertrieben wurde.
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Die
Ergebnisse waren wie folgt:
TSH gemessen unter der Verwendung
von nicht-modifizierten Antikörper
9,37 mIU/ml = Hypothyroid
TSH gemessen unter der Verwendung
von modifizierten Antikörper
0,23 mIU/ml = Euthyroid
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Beispiel 2
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Dieses
Beispiel wurde unter der Verwendung von experimentellen Bedingungen
durchgeführt,
die mit denjenigen von Beispiel 1 mit der Ausnahme der hier im folgenden
beschriebenen Modifikationen, identisch waren. Beispiel 1 wurde
so modifiziert, daß 29
bekannte rheumatoid-positive Proben, die alle als Euthyroid bekannt
waren, 1 in 10 verdünnt
wurden und unter der Verwendung von entweder modifizierem oder nicht-modifiziertem
anti-TSH-HRP-Antikörper gestestet
wurden. Die Ergebnisse sind in 1 angegeben,
die ein Blockdia gramm ist, das die Intensitäten der Lichtsignale in Lichteinheiten
für modifizierte
und nicht-modifizierte
Proben vergleicht. 1 zeigt, daß die Intensitäten der
interferierenden Signale für
die unmodifizierten Proben signifikant größer waren, als diejenigen der
modifizierten Proben.
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Beispiel 3
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Die
Beibehaltung der Antigen-bindenden Fähigkeit eines modifizierten
anti-TSH-HRP-Antikörpers wurde
durch Inkubieren eines Bereichs von Konzentrationen von TSH in anti-TSH-Antikörper-beschichteten
Wells in der Anwesenheit von entweder einem modifizierten oder einem
nicht-modifizierten anti-TSH-HRP-Antikörper gezeigt. Die von jedem System
gemessene Menge von TSH wurde dann nach Hinzufügung von "Amerlite"-(TM)-Signalerzeugungsreagenz aus Signalausgaben
bestimmt.
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2,
die ein Graph der Signalintensität
gegen TSH-Konzentration in mIU/ml ist, vergleicht die Antigen-Bindungsfähigkeiten
der modifizierten und nicht-modifizierten Wells. Es kann aus 2 ersehen werden,
daß es
keinen signifikanten Unterschied zwischen den Antigen-bindenden
Fähigkeiten
der modifizierten und nicht-modifizierten Antikörper gibt.