DE69532088T2 - Verfahren zur steigerung der immunogenizität, erhaltenes produkt und arzneimittel - Google Patents
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- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
- C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Immunogenität eines Antigens und die Verwendung der erhältlichen Produkte.
- Der Human-Zytomegalovirus (CMV), ein Herpes-Virus, der bei immunokompetenten Individuen latent vorhanden ist, ist im Falle von Immunodepression (Foetus, Transplantation, Aids, Leukämie, Krebs) für sehr verschiedene und oft tödliche Pathologien verantwortlich (für eine Übersicht siehe (1)). Das CMV ist die Hauptursache angeborener Mißbildungen von infektiösem Ursprung. Aus allen diesen Gründen stellt das CMV ein großes Problem für das Gesundheitswesen dar. Die Bekämpfung dieses Virus ist begrenzt auf die Chemotherapie mittels unspezifischer antiviraler Mittel, wie Ganciclovir® und Foscarnet®, deren Nebenwirkungen und Nephrotoxizität beschrieben wurden. Als Vorbeugung verringert die passive Immunotherapie (Injektion von Gammaglobulinen) das Auftreten der Erstinfektion bei den seronegativen Knochenmarktransplataten. Bei den Transplantierten (Fremdtransplantate von Knochenmark, Niere, Herz, Leber) führt die CMV-Infektion zur Abstoßung des Transplantats. Die Empfänger, die unter dem Einfluß eines Immunosuppressors (Cyclosporin) stehen, werden während der Transplantation mit Ganciclovir® behandelt und erhalten Gammaglobuline während der drei auf die Operation folgenden Monate. Die intravenöse Injektion hoher Dosen von Immunoglobulinen bei diesen Patienten hat in bestimmten Fällen zu einer Verringerung der Häufigkeit von Pneumonien und Abstoßungen geführt. Damit stellt sich das nicht vernachlässigbare Problem der sehr hohen Kosten, die mit diesen Behandlungen verbunden sind. Die opportunistische Infektion durch CMV bei den HIV-positiven Individuen ist eine der höchst dramatischen und erfordert eine Chemotherapie mit antiviralen Mitteln.
- Erhebliche wirtschaftliche Einsparungen wurden erreicht durch Einführung einer Politik der Vorbeugung gegen Krankheiten, die mit der CMV-Infektion bei Risiko-Personen zusammenhängen. Abschätzungen der Kosten, die mit der Impfung einer Person und ihrer Behandlung (serologische Analysen, Impfstoff, Behandlung von kleineren Nebenwirkungen) zusammenhängen und in den Vereinigten Staaten durchgeführt wurden (2) zeigen, daß diese Kosten etwa um das 50-fache geringer wären als die der Behandlungen eines neugeborenen Opfers einer angeborenen Infektion. Die CMV-Infektion wird bei 2/3 der Nierentransplantierten und mit einer hohen Frequenz bei den anderen Transplantierten beobachtet. Da sie zu Komplikationen bei etwa 1/3 derselben führt, entstehen erhebliche jährliche Kosten zusätzlich zu denen der Transplantation. Trotz der Wirkung von Arzneimitteln wie Ganciclovir® oder der Injektion von Gammaglobulinen auf die Krankheit muß die Vorbeugung gegen die Primärinfektion und die Reaktivierung bei diesen Patienten Vorrang haben. Die Vorteile der Immunisierung sind offensichtlich sowohl auf der klinischen wie auf der wirtschaftlichen Ebene.
- Die Schaffung eines Anti-CMV-Impfstoffs würde die Auslöschung der Entwicklung von Pathologien ermöglichen, die mit den angeborenen Infektionen zusammenhängen, indem die jungen Frauen vor und während der Schwangerschaft geimpft werden, der Schutz von Kranken gewährleistet wird, welche Transplantationen erwarten, und ein Antizytomegalovirus-Response bei den asymptomatischen HIV-positiven Personen initiiert wird. Die Verwendung von abgetötetem Virus erscheint nicht geeignet, da die Virusextrakte im allgemeinen keinen zytotoxischen Response vom Typ TCD8+ induzieren. Das geschwächte Virus hat das Problem des onkogenen Charakters, der Latenz und der Reaktivierung von viralen Körpern. Die Entwicklung von rekombinanten Impfstoffen, welche die Vermeidung dieser Risiken ermöglichen würden, erfordert die Kenntnis der am stärksten immunogenen Antigene oder Antigenfragmente (Epitope) des infektiösen Agens. Das Ziel der Impfung ist die Induktion einer schützenden Immunität. Eine rationelle Entwicklung der Impfung muß drei Stufen umfassen: (i) die Identifizierung der für den Schutz verantwortlichen Wirkungsmechanismen, (ii) die Wahl eines Antigens, das einen Response bei allen Personen induzieren kann, und (iii) die Verwendung eines Verabreichungsweges des Impfstoffs, der den gewünschten Responsetyp induzieren kann (humoral: Antikörper, zellular: zytotoxisch und unterstützend).
- Der Organismus verteidigt sich gegen eine virale Infektion im wesentlichen durch die Entwicklung von einerseits einem humoralen Immun-Response (Herstellung von neutralisierenden Antikörpern), der die Adsorption des Virus an der Zelloberfläche verhindert, und andererseits einem zellularen Response (zytotoxische TCD8+-Zellen und TCD4+-Hilfszellen), welche die infizierten Zellen beseitigen und die virale Replikation behindern (Synthese von Zytokinen (TN-Fα, IFNγ ...)). Bei dem Human-Zytomegalovirus sind unter den 200 Proteinen, die von der DNA-Doppelhelix (230 kpb) kodiert werden, drei, die jeweils Haupttargets dieser verschiedenen Response-Typen sind: das Hüllen-Glycoprotein gB (3), das Tegument-Phosphoprotein pp65 (4) und das Regulations-Phosphoprotein IE1 (5).
- Wenn nun die Entwicklung eines Anti-CMV-Impfstoffs notwendig erscheint, bleibt das allgemeine Problem der Vektorisierung der rekombinanten Antigene. Die in synthetische Strukturen eingeführten Antigene müssen in der Lage sein, einen Immunresponse B und T (Hilfszellen CD4+ und zytotoxische Zellen CD8+) dauerhaft zu initiieren oder wiederherzustellen, indem so der Schutz der Personen gegen eine Primärinfektion, eine Reinfektion oder eine Reaktivierung des latenten Virus gewährleistet wird. Die Aktivierung der T-Zellen (naive oder Memory-Zellen) hängt zusammen mit der Fähigkeit der Antigen-präsentierenden Zellen, von denen die dendritischen Zellen, die B-Lymphozyten und die Makrophagen die wichtigsten sind, das Antigen zu präsentieren. In diesem Zusammenhang müssen die Partikelvektoren einen Zugang zu den endogenen Präsentationswegen (Klasse 1, TCD8+) und exogenen Präsentationswegen (Klasse II, TCD4+) ermöglichen.
- Die Firma Biovector Therapeutics hat einen als supramolekularen Biovektor (Biovecteur Supramoleculaire) bezeichneten Strukturtyp entwickelt, der aus einem Polysaccharidkern (NPS) besteht, der bedeckt ist durch einen Gürtel von Fettsäuren (CA) oder Phospholipiden (BVSM), deren Zusammensetzung man verändern kann. Das Polysaccharidnetz besitzt einen veränderbaren Vernetzungsgrad, kann funktionalisiert werden (anionischer oder kationischer Rest), ist sehr stabil und ermöglicht die Fixierung einer erheblichen Menge von Antigenen im Inneren des Kerns sowie an seiner Peripherie.
- In unerwarteter Weise hat die Anmelderin gefunden, daß die Vereinigung eines Proteins oder eine Peptids mit diesen Vektoren zu einer Potenzierung des immunogenen Responses im Bezug auf denjenigen ermöglicht, der auf die Verabreichung des Antigens allein folgt.
- Daher hat die vorliegende Erfindung als Zweck ein Verfahren zur Erhöhung der Immunogenität eines Antigens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Antigen durch ionische und/oder hydrophobe Bindungen an einen Partikelvektor angelagert ist, wobei der Vektor:
- – einen hydrophilen, nicht flüssigen Kern,
- – eine Außenschicht aus Lipidverbindungen, die aus der Gruppe Phospholipide und Fettsäuren ausgewählt sind, aufweist.
- Vorzugsweise besteht der Kern aus einer Matrix von natürlichen oder chemisch vernetzten Polysacchariden oder Oligosacchariden. Gemäß einem Aspekt der Erfindung sind die ionischen Liganden auf den Kern gepfropft, wobei dieser Ligand besonders eine Funktion tragen kann, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Phosphate, Sulfate, Carbonsäuren, quaternäres Ammonium, sekundäre Amine, primäre Amine umfaßt.
- Die Vektoren, welche die Durchführung des Verfahrens ermöglichen, können eine Größe zwischen 10 nm et 5 μm haben, und besonders vorteilhafte Ergebnisse werden mit Größen erhalten, die zwischen etwa 25 nm et 200 mm besonders in der Größenordnung von 80 mm liegen.
- Die Anlagerung eines Antigens an bestimmte acylierte oder phospholipidhaltige Vek toren verstärkt besonders den Proliferationsresponse in vitro von TCD4+-Zellen zu diesem Antigen in Gegenwart von Leukozyten des peripheren Bluts und isolierten Lymphozyten B/EBV. Die Ausbeuten der Anlagerung des Antigens an die Partikel sind hoch und die erhaltenen Komplexe sind sehr stabil im physiologischen Milieu. Der Nachweis einer Potenzierung des T-Proliferationsresponse unterstreicht die bemerkenswerten Eigenschaften dieser Biovektoren und das Interesse an ihrer möglichen Verwendung zur Impfung.
- Diese Ergebnisse werden nicht mit einer einfachen Mischung ohne vorherige Wechselwirkung des Antigens und des Partikelvektors erhalten.
- Das Antigen lagert sich an den Partikelvektor durch ionische und/oder hydrophobe Bindungen an.
- Die Außenschicht des Partikelvektors besteht aus natürlichen Fettsäuren, die an den Kern durch kovalente Bindungen gebunden sind. Gemäß einem anderen Aspekt besteht diese Außenschicht aus natürlichen oder synthetischen Phospholipiden.
- Die Erfindung hat auch als Zweck ein Produkt, das nach dem beschriebenen Verfahren erhalten werden kann und das eine Anlagerung umfaßt, welche die Immunogenität eines Antigens potenziert, das durch ionische und/oder hydrophobe Bindungen an einen Partikelvektor gebunden ist, wobei der Partikelvektor
- – einen nicht flüssigen hydrophilen Kern und
- – eine Außenschicht aufweist, die mit dem Kern durch hydrophobe Wechselwirkungen und/oder ionische Bindungen vereinigt ist und aus Verbindungen besteht, die ausgewählt sind aus der Gruppe, welche die Phospholipide und die Fettsäuren umfaßt. In diesem die Immunogenität potenzierende Produkt ist das Antigen ein Protein des CMV.
- Die bemerkenswerten Eigenschaften dieser Vektoren können tatsächlich zur Einkapselung von Antigenen des Human-CMV genutzt werden, um einen rekombinanten Impfstoff zu erhalten, der die Antigene IE1, pp65 und gB aus den oben erwähnten Gründen vereinigt. Ein solches Produkt wäre in der Lage, einen humoralen und zytotoxischen Response zu erzeugen.
- Das Antigen kann daher besonders das Protein IE1 des CMV oder ein Fragment dieses Proteins sein.
- Ein Fragment des viralen rekombinanten Proteins IE1 des Human-Zytomegalovirus (Stamm Towne) wurde hergestellt und gereinigt in Form eines Fusionsproteins (GST-e4) in E. Coli. Die Anlagerung des Proteins an verschiedene Typen von Partikeln (NPS, CA und BVSM) von 80 nm ist sehr stabil und die Ausbeuten sind sehr hoch. Wir haben somit einen Adjuvans-Effekt von Antigenkomplexen (Ag)/Partikeln für den in vitro Proliferationsresponse von spezifischen TCD4+-Klonen beschrieben Dieser Effekt wurde beobachtet, indem man als Antigen-Präsentationszellen Leukozyten des peripheren Bluts und durch EBV transformierte B-Lymphozyten (B/EBV) verwendete.
- Die Proliferation von Anti-IE1-T-Klonen in Gegenwart von löslichem oder an Partikel angelagertem rekombinanten GST-e4 läßt vermuten, daß die Kopplung des viralen Antigens an das bakterielle GST, die Abwesenheit der Phosphorylierung des Proteins in diesem System der Procaryoten-Expression und die Anlagerung an Biovektoren keinen Einfluß auf die Art der von den präsentierenden Zellen generierten Peptid-Epitope haben. Eine der Hypothesen, wodurch jedoch die Anmelderin in keiner Weise eine Begrenzung der Erfindung beabsichtigt, ist, daß der Adjuvans-Effekt, der beobachtet wird, wenn das Antigen an Partikel angelagert ist, mit einem stärkeren Einfangen des Proteins durch die präsentierende Zelle korreliert sein kann, als wenn das Antigen löslich ist, wie von der Anmelderin festgestellt. Die Konzentration des Antigens in den Endo-Lysosom-Kompartimenten könnte die Wechselwirkung von Molekülen der Klasse II mit den Viruspeptiden statt mit endogenen oder exogenen Peptiden begünstigen, die beispielsweise von den Serumproteinen herrühren. Das hätte als Konsequenz die Expression einer größeren Zahl von Komplexen DR-Peptid IE1 an der Zelloberfläche. Der mit den CA beobachtete Potenzierungseffekt könnte zusammenhängen mit einer besseren Zugänglichkeit des Antigens. Die von uns verwendeten Vektoren haben den Einbau einer erheblichen Masse von Antigen durch einfaches Mischen in wäßriger Lösung ermöglicht. Das bedeutet einen erheblichen Vorteil im Vergleich mit den Verfahrensschritten der Verkapselung in anderen Arten von Partikeln, wie den Liposomen (6). Es ist möglich, daß der beobachtete Adjuvans-Effekt auch vermittelt werden kann durch eine Opsonisierung der Partikel, welche die Wechselwirkung zwischen den Serum IgG oder Fragmenten des Komplements wie C3b und deren jeweiligen Rezeptoren an der Oberfläche des präsentierenden Zellen bewirkt.
- Die Anmelderin hat gezeigt, daß ein Fusionsprotein, das stabiler als nur e4 ist und durch die Fusion zwischen dem Fragment e4 des CMV und der Glutathion-S-Transferase (GST), durch Gentechnik hergestellt wurde, in den erfindungsgemäßen Vektoren verwendet werden kann, ohne eine Stufe der Spaltung zu erfordern, um den GST-Teil zu entfernen. Das bedeutet einen erheblichen Fortschritt, da ein solches Protein leicht gereinigt werden kann und der Wegfall der Spaltungsstufe eine Erhöhung der Ausbeute und die Planung seiner Herstellung im großen Maßstab ermöglicht.
- Das Ziel der Impfung ist es, die Reifung der Zellen zu induzieren, die in der spezifischen Beseitigung eines pathogenen Agens eine Rolle spielen, und Klone von Zellen mit spezifischem Memory für die Targetantigene im Kreislauf und in den sekundären lymphoiden Organen zu halten. Der erhebliche Beitrag von B-Zellen als Zellen, welche das Antigen für die Aktivierung der T-Zellen präsentieren, wurde berichtet (7). Es wurde gezeigt, daß die B-Zelle die löslichen Antigene bei geringer Konzentration nur mittels ihres Oberflächen-Immunoglobulins wirksam endozytiert. Die Arbeiten, welche darauf abzielen, Liposome auf B-Lymphozyten als Target zu bringen, benutzten zur Fixierung an ihrer Oberfläche monoklonale Antikörper (8), die dazu bestimmt sind, mit den Oberflächen-Immunoglobulinen dieser Zellen zu interagieren. Da die Frequenz der spezifischen B-Lymphozyten sehr gering ist, sollte der hier beobachtete Effekt bei Verwendung der Partikel ermöglichen, den spezifischen T-Response auf das komplexe Antigen zu verstärken, ohne über eine Erkennung durch die spezifischen B-Lymphozyten zu gehen. Die Präsentation eines Ag an den aktivierten TCD4+-Zellen induziert außer deren Proliferation die Sekretion von Zytokinen und die Expression von Oberflächenmolekülen, die wesentlich sind für die Proliferation und die Differenzierung der B-Zellen zu Plasmozyten, welche Antikörper ausscheiden.
- Gemäß einem anderen Aspekt bezweckt die Erfindung eine Verwendung eines Partikelvektors zur Herstellung eines Arzneimittels, das nützlich ist zur Verstärkung der Immunogenität eines Antigens. Diese Verwendung umfaßt ein Antigen, das angelagert ist an einen Partikelvektor gemäß den oben angegebenen Maßnahmen.
- Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern ohne ihren Schutzbereich in irgendeiner Weise zu beschränken. In diesen Beispielen wird Bezug genommen auf die folgenden Figuren:
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1 : schematische Darstellung des genomischen Virus-DNA-Fragments, welches die DNAc von IE1 enthält. -
2 : schematische Darstellung des Fusionsproteins GST-e4. -
3 : Analyse der Expression von GST-e4 durch E. Coli durch Elektrophorese an Polyacrylamid-SDS-Gel (SDS-PAGE): Die Lysate von nicht rekombinanten Bakterien (1 ) und rekombinanten GST-e4 (2 ) wurden einer Elektrophorese SDS-PAGE unterworfen und mit Coomassie-Blau gefärbt. Nach Durchlaufen der Glutathion-Affinitätsäule wurden die Eluate unter den gleichen Bedingungen analysiert (2 ,4 ). Das scheinbare Molekulargewicht der Marker (M) ist angegeben. -
4 : Analyse durch "western blot" (A) und Autoradiographie (B) der Expression von GST-e4 durch E. Coli. Die Bakterienlysate wurden einer Elektrophorese SDS-PAGE unterworfen und dann auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Eine Inkubation der Membran in Gegenwart des Antipeptids 85.75 zeigte die Gegenwart von GST-e4 im Gesamtlysat (5 ), dem Bodensatz und dem Überstand der Ultraschallbehandlung (4 ,3 ) und in der an der Affinitätsäule zurückgehaltenen Fraktion (2 ). Die Spur 1 enthält ein Lysat von nicht rekombinanten Bakterien.4.B entspricht der Autoradiographie der Membrane. -
5 : Sättigungskurve der BVSM durch gereinigtes GST-e4: Steigende Mengen von kaltem GST-e4 (50 bis 400 μg) wurden mit BVSM (100 μg) vorinkubiert. Die so gebildeten Komplexe wurden in Gegenwart von radiomarkiertem GST-e4 (GST-e4*) inkubiert und das Anlagerungsverhältnis (cpm) des heißen Proteins wurde durch Zählen nach Ultrafiltration über Microsep 300 bestimmt. -
6 : Stabilität der Anlagerung GST-e4/Partikel: Komplexe von GST-e4*/Partikel wurden im Medium RPMI/SVF bei 37°C 0 bis 6 Tage lang inkubiert. Der Prozentgehalt von im Verlauf jeder Inkubationsperiode angelagertem GST-e4* wurde durch Zählen nach Ultrafiltration bestimmt. -
7 : Einfangen von löslichem oder an Partikel angelagertem GST-e4* durch B-Lymphozyten /EBV.11 Das radioaktive Antigen GST-e4*, frei oder angelagert an Partikel (NPS, CA, BVSM) wurde in Gegenwart von 5 × 105 B-Lymphozyten /EBV in RPMI/SVF, bei 37°C während 15 Stunden inkubiert. Der Prozentanteil von Eingefangenem (A), die Menge des an Zellen angelagerten Antigens (B) und die Menge des im Me dium wiedergefundenen Antigens (C) sind in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration in den Vertiefungen angegeben. -
8 : Einfangen von löslichem oder an Partikel angelagertem GST-e4* durch die Makrophagen-Linie "Mono Mac 6": Das freie oder an Partikel (NPS, CA, BVSM) angelagerte radioaktive Antigen GST-e4* wurde in Gegenwart von 5 × 105 Zellen Mono Mac 6 in RPMI/SVF bei 37°C während 15 Stunden inkubiert. Der Prozentanteil von Eingefangenem (A), der an die Zellen angelagerten Menge Antigen (B) und der im Medium wiedergefundenen Menge Antigen (C) sind in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration in den Vertiefungen dargestellt. -
9 : Proliferationstest des Klons (A3) an Gegenwart von B-Lymphozyten /EBV und dem Gemisch leere CA/GST-e4: Die Zellen des Klons A3 wurden in Gegenwart von bestrahlten B-Lymphozyten BBV und löslichem Antigen allein (GST, GST-e4) oder mit leerem CA (CA + GST-e4) und mit dem an CA angelagertem Antigen (CA/GST-e4) inkubiert. Die Proliferation wurde durch Einbau von [3H]-Thymidin gemessen in cpm bestimmt. -
10 : Das GST-e4 ist vor Proteolyse durch seine Fixierung an Biovektoren geschützt. Freies oder an NPS angelagertes GST-e4 wurde mit Trypsin inkubiert (Massenverhältnis 1/600), und wurde schließlich der Reaktion wie angegeben unterworfen. Die Proben wurden einer Elektrophorese SDS-PAGE unterworfen und das GST-e4 mit 82 kDa wurde durch densitometrische Auswertung des Gels bestimmt. Die Ergebnisse sind in Prozent des Ausgangs-GST-e4 angegeben. -
11 : Der Response von T-Lymphozyten CD4+ auf GST-e4 wird in vitro verbessert nach Fixierung an Biovektoren mit PBL, wie CPA. Die Zellen stammen vom Klon "BeA3" und wurden in Gegenwart von bestrahltem PBL und verschiedenen Konzentrationen von GST-e4 (A) und GST (B) in freier oder Partikelform kultiviert. -
12 : In vitro wurde der Response von T-Lymphozyten CD4+ gegenüberGST-e4 nach Fixierung an Biovektoren mit durch den Virus EBV transformierten B-Lymphozyten verbessert hinsichtlich des CPA. Die vom "BeA3" stammenden Zellen wurden in Gegenwart von durch EBV transformierten bestrahlten B-Zellen kultiviert und von verschiedenen Konzentrationen von GST-e4 (A) und GST (B) in freier oder Partikelform kultiviert. - Beispiele
- 1) Stoffe und Verfahren
- Synthese der kanonisierten Vektoren mit der Größe 80 nm:
- Die in dieser Untersuchung verwendeten Vektoren wurden alle gewonnen ausgehend von der gleiche Charge des gleichen synthetischen Polysaccharidkerns (NPS). Diese NPS wurden entweder mit Palmitinsäure acyliert (CA) oder mit verschiedenen Arten von Phospholipiden phospholipidiert (BVSM).
- Synthese der NPS
- 100 g Maltodextrin (Glucidex 6, Roquettes), entsprechend der Monographie Maltodextrin der Pharmacopoe US NF XVII, wurden in 17 ml Wasser unter kräftigem mechanischen Rühren gelöst und dann in einen Glasreaktor überführt, in den man anschließend 2,4 g NaBH4 gab. Eine halbe Stunde später wurden 44 ml 10 N Natriumhydroxid und dann 9,72 ml (0,124 mol) Epichlorhydrin (Fluka) als ein Vernetzungsmittel zugegeben. Nach 90 Minuten Reaktion bei Raumtemperatur wurden 31,18 g eines kationisierenden Mittels, nämlich Hydroxycholin (Glycidyltrimethylammoniumchlorid, Fluka), die zuvor in 20 ml Wasser gelöst worden waren, zugegeben. Es wurde weiter während 20 Stunden unter mechanischem Rühren inkubiert. Das erhaltene Gel wurde mit 1,5 l Wasser verdünnt und dann mit Essigsäure neutralisiert. Das Gel wurde anschließend in einem Homogenisator durch Extrusion unter Hochdruck zerkleinert und dann durch ein Filtermodul von 40 kDa ultrafiltriert. Die Ultrafiltration wurde abgebrochen sobald das Ultrafiltrat nicht mehr mit Silbernitrat reagierte. Die Bestim mung der Größe der Nanopartikel (NPS) wurde mit einem Nanosizer Coulter N4SD durchgeführt.
- Synthese von acylierten Kernen (CA)
- Zu 10 g frisch lyophilisierten NPS die zuvor in 100 ml von Dichlormethan (frisch destilliert), dispergiert worden waren, wurden 9,34 ml Palmitinsäurechlorid zugegeben. Man ließ die Reaktion 4 Stunden bei Raumtemperatur ablaufen. Nachdem man dem Reaktionsmilieu 200 ml Diethylether zugesetzt hatte, wurden die acylierten CA über Buchner filtriert, mit Ethanol gewaschen, in 500 ml Wasser aufgenommen und homogenisiert.
- Synthese der BYSM
- Die NPS wurden mit verschiedenen Anteilen Phospholipiden phospholipidiert (20% Gewicht/Gewicht des lyophilisierten NPS).
- Toxizitätstest in vivo
- Die untersuchten Vektoren (NPS, CA, BVSM) wurden in einer Konzentration von 1 mg/ml wieder in Wasser dispergiert. Die Pyrogenität der Proben wurden in vivo beim Kaninchen mit der Dosis 100 μg des Vektors pro Dosis gemäß der europäischen Pharmacopoe bestimmt.
- Herstellung des Fusions-Proteins GST-e4 in Escherichia coli
- Klonierung in Escherichia coli:
- Die dem Exon 4 (e4,
1 ) entsprechende cDNA wurde durch Amplifizierung (PCR) mit der Taq-Polymerase (Promega, Coger, France) ausgehend vom Plasmid pRL 103 (Gabe von R. LaFemina, (9)) hergestellt, welches die Region IE des CMV (Stamm Towne) enthält. Die Primer A 1 (A1 = 5'CCCGGGeAATTCTCATGGTCAAACAGATTAAGGTTCGAG3') und A2 (A2 = 5'CCCGGGAω AGCTTTTACTGGTCAGCCTTGCTTCTA3'), die jeweils dem Ende 5' und 3' von e4 entsprechen, wurden verwendet. Die EcoRI (l)- und HindIII (ω )-Stellen wurden in diese Primer eingeführt, um die Einführung des Fragments von PCR in das Plasmid pGEX-KG zu ermöglichen (10). Das eingeführte Fragment ist im Leserahmen mit dem Gen der Glutathion-S-transferase (GST) deren Promotor mit Isopropyl-thiogalactosid (IPTG, Sigma, Frankreich) induzierbar ist. Zwischen dem Ende 3' des Gens von GST und der multiplen Klonierungsstelle liegt ein Bereich, der für eine Stelle der spezifischen Peptidspaltung des Thrombins kodiert. Die Transformation der Bakterien Escherichia coli DH5a (Gibco, Cergy, Frankreich) und das Auswählen der Rekombinanten wurden nach den klassischen Methoden (11) vorgenommen. Die Einführung des dem Exon 4 entsprechenden PCR-Produkts in pGEX-KG wurde durch Analyse an mehreren Klonen von Fragmenten der Restriktion der plasmidischen DNA verifiziert, die nach Elektrophorese an Agarosegel mit 1% Ethidiumbromid (BET) sichtbar gemacht wurden. Die Einführung in pGEX-KG wurde bestätigt, indem die Expression des rekombinanden Produkts GST-e4 nach Induktion durch IPTG geprüft wurde. Die positiven Klone wurden nach der Methode von Sanger (12) mit einem Reagenzkit „Hot tub sequenase " (Pharmacia, Saint Quentin Yvelines, Frankreich) nach den Angaben des Lieferanten sequenziert. - Expression und Reinigung von GST-e4
- Die bei –80°C aufbewahrten rekombinanten Bakterien wurden im Medium "Luriabroth" (Difco, Osi, Frankreich) kultiviert, das 50 μg/ml Ampicillin (LB/Ap) (Sigma) enthielt. Diese Vorkultur, die mit LB/Ap auf 1/10 verdünnt wurde, wurde unter den gleichen Bedingungen bis zu einer DO/600 nm = 1.0 kultiviert. Die Induktion der Expression des rekombinanten Produkts GST-e4 wurde realisiert, indem man 100 μM IPTG der Kultur zusetzte. Die Inkubation wurde während 2 Stunden bei 25°C fortgesetzt, um die Bildung von Inklusions-Bodies zu vermeiden (13). Die durch Zentrifugieren gesammelten Bakterien wurden in PBS ("phosphatgepufferte Salzlösung", pH 7,3, 4,3 mM NaHP2O4, 1,4 mM KHP2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl) gewaschen. Der Bodensatz von Zellen, der eine Nacht bei –80°C aufbewahrt und dann aufgetaut wurde, wurde in 50 ml Lyse-Puffer (PBS, 1 mg/ml Lysozym, 1 mM Phenyl-methyl-sulfonid-fluorid (PMSF)) aufgenommen. Die Suspension wurde 30 Minuten in Eis inkubiert und dann mit Ultraschall behandelt. Das Lysat wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur in Gegenwart von TRITON X 100 (Endkonzentration: 1%) gerührt und dann durch Zentrifugieren (30000 g/l Std) geklärt. Der Überstand wurde auf eine Affinitätssäule gegeben, deren Substrat mit der GST gepfropft war (Glutathione/Sepharose 4B, Pharmacia), und die zuvor in PBS ins Gleichgewicht gesetzt war (14). Nach Waschen der Säule mit PBS wurde das Fusionsprotein GST-e4 mit 10 mM reduziertem Glutathion im Elutionspuffer 50 mM Tris HCl, pH 8,0 eluiert.
- Metabolische Markierungen von GST-e4 wurden hergestellt, indem man dem Kulturmedium zum Zeitpunkt der Induktion durch das IPTG die Reste L-[35S]-Methionin und -Cystein (35S Express, NEN, Les Ulis, Frankreich) in einer Menge von 10 μ Ci/ml zusetzte. Die Reinigung des radioaktiven Produkts (GST-e4*) wurde unter den gleichen Bedingungen wie bei dem nicht radiomarkierten Produkt vorgenommen. Die Konzentration der gereinigten Produkte wurde nach der Methode von Bradford bestinmt (Reagenzkit "Bio-Rad Protein assay"; Biorad, Yvry sur Seine, Frankreich). Die Herstellung des Fusionsproteins GST-e4 wurde kontrolliert durch Elektrophorese an 10% Polyacrylamidgel in Gegenwart von SDS (SDS PAGE) (15). Vorgefärbte Indikatoren des Molekulargewichts (Gibco) wurden verwendet. Der Nachweis erfolgte entweder wurde Färbung des Gels mit Coomassie-Blau oder mit "western blot" nach Transfer auf eine Nitrozellulosemembrane (Hybond C super, Amersham, Les Ulis, Frankreich) (16) wie folgt. Nach Sättigung in "Motto" (PBS, 0,2% NP40, 2,5% Magermilch), wurde die Membran 1 Stunde lang mit dem Immunserum eines für CMV seropositiven Individuums (CMV+) oder mit dem Kaninchen-Antipeptid 85,75 inkubiert, welches ein im C-Endteil des Exon 4 gelegenes Epitop erkennt (Gabe von J. A Nelson, (17)). Das Immunserum und das Antipeptid wurden jeweils in "blotto" auf 1/100 und auf 1/500 verdünnt. Die Membran wurde 3 × 5 Minuten in PBS gewaschen und 1 Stunde lang mit Anti-Human-Ziegen-IgG oder Anti-Kaninchen-IG-Ziegen-IgG, die mit Peroxydase markiert waren (GAH/PO, GAR/PO, Nordic, Tebu, Le Perrey en Yvelines, Frankreich), und die in "blotto" auf 1/500 verdünnt waren, inkubiert. Nach dreimaligem Waschen von je 5 Minuten in PBS wurde die Membran in der Entwicklungslösung (PBS, 0,5 mg/ml Diaminobenzidin (DAB), 0,1% H2O2) inkubiert. Da die analysierten Produkte radiomarkiert waren, wurde eine Autoradiographie des Gels oder der Membran nach dem "western blotting" auf dem Film Kodak X-OMAT (Polylabo, Frankreich) durchgeführt.
- Anlagerung von GST-e4* an Partikel:
- Das Fusionsprotein GST-e4*, gelöst in Elutionspuffer 50 mM Tris-Cl, pH 8,0, wurde mit den drei Hauptarten von Partikeln (NPS, CA, BVSM) in Suspension in Wassesr mit einer Konzentration von 1 mg/ml inkubiert. Die Inkubation wurde bei 4°C unter Rühren während einer Stunde durchgeführt. Der Prozentsatz der Anlagerung wurde bestimmt durch Messen der an die Partikel angelagerten Radioaktivität. Das freie Antigen wurde durch Ultrafiltration bei 5000 g über eine Membran mit einer Cut-Off-Schwelle von 300 kDa (microsep 300, Filtron, Coignieres, Frankreich) entfernt. Die Messung der freien Radioaktivität im Eluat, in den Waschflässigkeiten und an den Partikeln angelagert wurde dreimal mit einem Beta-Zähler (BETAmatic, Kontron) durchgeführt. Der Prozentsatz der Anlagerung wurde berechnet indem man das Verhältnis der gebundenen Radioaktivität zur Summe der freien Radioaktivität und der an die Partikel gebundenen Radioaktivität ermittelte. Untersuchungen der Anlagerung von GST an die Partikel wurden unter den gleichen Bedingungen wie mit GST-e4* durchgeführt. Die Anlagerung von GST an die Partikel nach dem Waschen wurde durch SDS PAGE bestätigt.
- Stabilität von an Partikel angelagertem GST-e4*:
- Die Anlagerung von GST-e4* an die drei Typen von Partikeln wurde wie zuvor mit einem Verhältnis von GST-e4*/Partikel von 0,1 (R = 0,1) vorgenommen. Die Waschungen erfolgten mit RPMI/10% Kalbsfötusserum (RPMI/SVF) (Gibco), ergänzt mit 1 mM Natriumsalz der Brenztraubensäure, 2 mM L-Glutamin, 200 U/ml Penicillin und 80 ng/ml Streptomycin. Die Komplxe GST-e4*/Partikel wurden im gleichen Medium wieder aufgenommen und bei 37°C inkubiert. Aliquots wurden zu verschiedenen Zeiten abgenommen und der Prozentsatz von an die Partikel angelagertem GST-e4* wurde wie zuvor bestimmt.
- "in vitro"-Einfangen von GST-e4* durch Linien von B-Lymphozyten und Makrophagen:
- Die Analyse des Einfangens von löslichem oder an Partikel angelagertem GST-e4* erfolgte an Linien von Makrophagen ("MonoMac 6", DSM ACC 124) und B-Lymphozyten, die durch den Virus Epstein Barr (B/EBV) immortalisiert waren. Die Zellen (5 × 105/ml) wurden in Platten mit 24 Vertiefungen mit ebenem Boden (Falcon, Becton Dickinson, New Jersey) in RPMI/SVF in feuchter Atmosphäre mit 5% CO2 inkubiert mit verschiedenen Konzentrationen von löslichem oder an Partikeln komplex gebundenem (R = 0,1) GST-e4*. Nach 15 Stunden Inkubation wurden die Zellen gesammelt und zweimal in PBS gewaschen. Die freie Radioaktivität wurde im Überstand, in der Waschflüssigkeit und in den in PBS wieder suspendierten Zellen gezählt. Die Ergebnisse der Zählung entsprechen dem Mittelwert von drei Messungen. Der Prozentsatz des Einfangens für eine gegebene Antigenkonzentration wurde ausgedrückt durch das Verhältnis der an die Zellen gebundenen Radioaktivität zur Gesamtradioaktivität.
- Trypsinverdau eines an Nanopartikeln angelagerten Antigens
- Bei Raumtemperatur wurden lösliches [35S]-GST-e4 und Mischungen von Antigen mit verschiedenen Nanopartikeln mit Trypsin aus Rinderpankreas (Sigma) inkubiert, wobei das Verhältnis der Masse Enzym zum Substrat 1 : 600 betrug. Am Ende der verschiedenen Zeitintervalle wurde in Aliquots von 20 μl die Reaktion durch sofortiges Einfrieren in flüssigem Stickstoff beendet. Vor SDS-PAGE wurden die verschiedenen Proben aufgetaut und in einem Laemmli-Probepuffer fünf Minuten zum Kochen gebracht. Um zu verifizieren, daß die Partikel die proteolytische Aktivität des Trypsins nicht inhibierten, wurden Gemische, die 5 μg des Enzyms enthielten, in Gegenwart oder Abwesenheit von 3 mg der Partikel pro ml mit dem Enzymsubstrat Chromozym-Try (Boehringer Mannheim, Frankreich) gemäß den Anweisungen des Herstellers inkubiert. Die Trypsin-Aktivität wurde bestimmt durch Erhöhung der Adsorption bei 1 = 405 nm. Die Menge des Proteins GST-e4 mit 82 kDa wurde bestimmt durch densitometrische Bestimmung des mit Coomassie gefärbten Gels.
- Analysen mittels Immunofluoreszenz und konfokaler Mikroskopie
- Man verwendete B-Lymphozyten, die durch EBV transformiert waren, vom Spender "Be" und die B-Lymphozytenlinie Raji des Lymphoms von Burkitt. Die Zellen wurden in einem serumfreien Medium RPMI ergänzt durch einen Puffer HEPES 20 mM pH 7,2 und 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) bei 37°C oder 4°C mit Rhodamin-Transferrin 600 nM und/oder 45 mg/ml FITC-CA während verschieden langer Inkubationszeiten inkubiert. Dann wurden die Zellen gewaschen mit zwei Wiederaufnahmen in kaltem PBS, das 1 mg/ml BSA enthielt (BSA-PBS), einmal in nur kaltem PBS, und sie wurden während 30 Minuten bei Raumtemperatur in PBS mit einem Gehalt von 3,7% Paraformaldehyd und 30 mM Saccharose fixiert. Nach 10 Minuten Inkubation in NH4Cl-PBS 50 mM, drei Waschungen in BSA-PBS und einer Waschung in PBS wurden die Zellen in 25 mg/ml Dabco (1,4-Diacylbicyclo(2.2.2)-oktan, Sigma St. Louis, MO), 100 mg/ml Mowiol (Calbiochem, La Jolla, CA), 25% (v/v) Glycerin, Tris-HCl 100 mM pH 8,5 auf Objektträger gebracht. Die Proben wurden mit einem Konfokal-Mikroskop (Leica) untersucht, das an einem Diaplan-Mikroskop (Leitz) befestigt war, das mit einem Doppellaser Argon-Krypton ausgerüstet war. Eine Reihe optischer Schnitte wurde in Abständen von 0,5 mm mit Hilfe eines Objektivs 63 × aufgezeichnet. Die Photographien wurden mit einem Film Ilford XP2 400 ASA aufgenommen.
- Prüfungen der Proliferation von Klonen TCD4+ anti IEI:
- Die Gewinnung von Klonen von Lymphozyten TCD4+ anti IE1 und die Analyse ihrer Proliferation in Gegenwart von autologen Antigen präsentierenden Zellen (CPA) von CMV+-Spendern (Centre de Transfusion Sanguine de Toulouse) wurde bereits beschrieben (18). 2 × 104 Zellen eines T-Klons CD4+ wurden kurz in Platten mit 96 Vertiefungen mit rundem Boden (Falcon) mit den bestrahlten CPA entsprechend 1 × 105 Leukozyten des peripheren Bluts (PBL) oder 5 × 104 Lymphozyten B/EBV, autolog oder mit CMH-Molekülen der Klasse II des gleichen Allotyps DR inkubiert. Die Zellen wurden in einem Endvolumen von 100 μl in RPMI mit einem Gehalt von 10% eines Pools von humanen Seren (RPMI/SH) (Laboratoires FANDRE, Ludres, Frankreich) und verschiedenen Verdünnungen von freiem Antigen oder an Partikel angelagertem Antigen inkubiert. Als Alternative wurden das lösliche Ag und die leeren Partikel den Zellen zur gleichen Zeit zugefügt. Die Komplexe Ag/Partikel wurden durch Bestrahlung sterilisiert. Drei Tage später wurde die Kultur während 15 Stunden mit 1 μCi pro Vertiefung mit [3H]-Thymidin (49 Ci/mmol, Amersham) markiert.
- Die Proliferation der T-Klone wird bestimmt durch Messung des Einbaus von [3H]-Thymidin in die Zellen. Die Ergebnisse sind ausgedrückt in cpm entsprechend dem Mittelwert von drei gleichzeitigen Untersuchungen.
- Extrakte von humanen Astrozytomen (U373MG), die durch die IE-Genom-DNA transfiziert waren (A2) oder nicht transfiziert waren (AO), die zur Generierung der Klone verwendet worden waren (18), wurden als positive bzw. negative Kontrollen verwendet. Die Bestimmung von DR-Allotypen verschiedener Spender wurde mittels PCR mit spezifischen Oligonukleotid-Primern durchgeführt (Pr Abbal, Lab. Centr. Immunol, CHU Rangueil, Toulouse). Es wurden die Klone D11 und A3 verwendet, die jeweils von den Individuen (DR3/DR4) und (UR8/DR7) stammten.
- 2) Ergebnisse
- Charakterisierung der synthetisierten Partikel
- Die Größe der Partikel war 80 nm mit einer Standardabweichung von 20 nm. Der Beladungsgrad wurde titriert mit 0,8 mmol Hydroxycholin pro Gramm lyophilisierte Nanopartikel. Die untersuchten Proben waren apyrogen.
- Herstellung von GST-e4
- Expression von GST-e4 in E. Coli
- Die Expression des Fusionsprodukts GST-e4 in den Bakterienlysaten wurde durch SDS-PAGE geprüft. Die
3 und4 entsprechen der Analyse der Lysate von in Gegenwart von IPTG kultivierten Bakterien.3 zeigt nach Färbung mit Coomassie-Blau die Gegenwart einer Bande entsprechend einer relativen Masse von 82000, deren Intensität stärker im Lysat von rekombinanten Bakterien (Spur 3) als in der Probe der nicht rekombinanten Bakterien (Spur 1) ist. Dagegen zeigt die Spur 1 eine erhebliche Produktion von GST (Mr 27000). Die Analyse mit "western blotting" der gleichen Proben mit Antipeptid 85.75 (4A ) und einem Anti-CMV-Human-Immunserum zeigte eine spezifische Reaktivität im Zusammenhang mit einem Protein von einer relativen Masse 82000 in Übereinstimmung mit der für das Fusionsprotein GST-e4 (2 ) erwarteten Masse. Die Autoradiographie der Membran (4B ) zeigt einen guten Einbau von radiomarkierten Resten in das Protein mit 82 kDa, die durch das Antipeptid aufgezeigt wird, unter den oben beschriebenen Kulturbedingungen. - Reinigung von GST-e4 durch Affinitäts-Chromatographie
- Die Bakterienlysate wurden einer Chromatographie an Sepharose-Glutathion unterworfen und durch SDS-PAGE analysiert. Die
3 und4 zeigen, daß die Proteine GST (Spur 2, Mr 27000) und GST-e4 (Spur 4, Mr 82000) vom Träger spezifisch zurückgehalten wurden. Banden von geringerer, mit GST-e4 gemeinsam wandernder Masse wurden nach western blotting (4A ) sichtbar gemacht. Diese zusammen mit GST-e4 gereinigten Produkte rühren wahrscheinlich vom Abbau des Fusionsproteins her und enthalten die vom Anti serum 85.75 erkannte Peptidsequenz. In der dem GST entsprechenden Spur (Spur 1) wurde keinerlei Signal beobachtet. Wir haben in reproduzierbarer Weise und nach einem einzigen Durchlauf über diese Säule 1 mg GST-e4* mit einer spezifischen Aktivität von 400 mCi/mmol erhalten. - Anlagerung von GST-e4* an Partikel
- Ausbeute der Anlagerung in Abhängigkeit vom Partikeltyp
- Die Partikel (NPS, CA, BVSM) wurden in Gegenwart von radiomarkiertem GST-e4 (GSTe4*) im Verhältnis von 1 mg Protein auf 10 mg Vektor (R = 0.1) inkubiert. Die mittleren Anlagerungsgrade (20 Tests) liegen in der Größenordnung von 90% und sind identisch, unabhängig von den Partikeln.
- Sättigung der Partikel mit GST-e4*
- BVSM (jeweils 100 μg) wurde mit wachsenden Mengen kaltem GST-e4 in einem Massenverhältnis Ag/BVSM von 0,1 bis 4 (R = 0,1 à R = 4) vorinkubiert. Für jedes dieser Verhältnisse wurde zu den Komplexen GST-e4* zugefügt und der Anlagerungsgrad des heißen Proteins an die Vektoren wurde durch Zählung nach Ultrafiltration bestimmt.
5 zeigt, daß die BVSM mit Antigen gesättigt sind, wenn das Massenverhältnis Ag/BVSM gleich 2 ist. - Stabilität der Anlagerung GST-e4*/Partikel als Funktion der Zeit
- Komplexe GST-e4/Partikel (R = 0,1) wurden in RPMI/SVF bei 37°C inkubiert. Die Analyse des Prozentsatzes GST-e4, das nach mehreren Stunden Inkubation an die Partikel angelagert bleibt (
6 ), zeigte, daß die Kinetik der Freisetzung für die drei Partikeltypen identisch sind mit einer stärkeren Steigung in den ersten 24 Stunden. Nach 6 Tagen Inkubation beträgt das Verhältnis von angelagertem GST-e4* bei BVSM, CA, und NPS jeweils 85%, 80%, und 70%. Eine Analyse durch SDS-PAGE der gleichen Proben gefolgt von einer Autoradiographie ermöglichte die Sichtbarmachung des an die Partikel angelagerten Proteins. - Das Antigen wurde in stabiler Weise an Vektoren angelagert und vor einer Proteolyse geschützt
- Die Anlagerungsausbeute des [35S]-GST-e41ag zwischen 80 und 90% und hing nicht von der Art der kationisierten Partikel (NPS, CA, BVSM) ab, und wenn das Antigen mit anionischen Vektoren (CA-Phosphat) inkubiert wurde, trat kein Einfangen irgendeiner Substanz ein, wie man es nach dem sauren isoelektrischen Punkt des GST-e4 erwarten könnte. Dieses Ergebnis führt zu der Einschätzung, daß die An der Wechselwirkungen zwischen dem Antigen und den Partikeln i-m wesentlichen ionisch ist. Um die Stabilität der Anlagerung des GST-e4 an Vektoren zu untersuchen, wurde die Freisetzung des Antigens von den Partikeln unter den Kulturbedingungen in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt. In 6 Tagen Inkubation in einem Komplettmedium (10% SVF) war die Kinetik der Antigenfreisetzung identisch für NPS, für CA und für BVSM, und die Freisetzung überstieg niemals 30% für NPS, 20% für CA und 15% für BVSM. Wir haben untersucht, ob das Antigen durch seine Anlagerung an die Vektoren vor einer Proteolyse geschützt war. Zu diesem Zweck wurde ein lösliches und komplexes Antigen [35S]-GST-e4 einem Verdau durch Trypsin unterworfen und durch SDS-PAGE analysiert. Das Gel wurde anschließend untersucht, um die Anwesenheit des Produkts mit 82 kDa festzustellen. Eine densitometrische Untersuchung zeigte, daß nach zwei Stunden Inkubation mit dem Enzym 30% des komplexen Antigens für die Proteolyse zugänglich waren, während 85% des Antigens in löslicher Form abgebaut waren (
10 ). Die Schutzwirkung war nicht auf eine direkte Inaktivierung des Enzyms durch das Partikel zurückzuführen, da die Kinetik der enzymatischen Aktivität durch Verwendung des Substrats "Chromozyme Try" durch die Gegenwart von Vektoren nicht beeinflußt wurde. - Einfangen von GST-e4* durch Linien von B-Lymphozyten und Makrophagen
- Komplexe von GST-e4*/Partikel (R = 0,1) und dem löslichen Protein GST-e4* wurden in steigender Menge mit Linien von Makrophagen und B-Lymphozyten EBV inkubiert. Eine Kinetik der Anlagerung von Antigenpräparaten (0.6 μg/ml, R = 0,1) an die Zellen zeigte einen äquivalenten Einbau für einen gegebenen Typ von Probe und für Inkubationszeiten von 10 Minuten bis 15 Stunden (nicht gezeigtes Ergebnis). Die
7 und8 zeigen den Prozentsatz von an die Zellen angelagertem Antigen nach 15 Stunden Inkubation in Abhängigkeit von der Menge des zugesetzten komplexen oder löslichen Proteins. Diese Figuren zeigen, daß für die B-Lymphozyten EBV (7 ) und die Makrophagen (8 ) die an die Zellen angela gerte Menge von löslichem Antigen sehr gering ist, selbst bei hohen Konzentrationen. Was das Einfangen des Antigens in Abhängigkeit von den verschiedenen Typen von Partikeln betrifft, liefern die BVSM die höchste Einbauausbeute (30%) mit den zwei Zelltypen. Ausbeute von der Größenordnung von 5% bis 10% wurden mit den NPS und den CA erhalten, während sie mit dem löslichen Antigen in der Nähe von 1% lagen. - Synthetische Vektoren werden internalisiert von Antigen präsentierenden Zellen (CPA)
- Um in weiteren Einzelheiten den Mechanismus zu untersuchen, durch welchen die Partikel für die Vermittlung der Erhöhung des Einfangens des Antigens durch die Zellen sorgen, wurde unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops ihre Fähigkeit zur Internalisierung untersucht. Inkubiert wurden durch EBV-transformierte und vom Spender "Be" stammende B-Lymphozyten mit Partikeln von mit Fluoreszein markiertem CA und Rhodamin-Transferrin während verschiedener Zeitdauer bei einer Temperatur von 4°C oder 37°C. Die Zellen wurden dann fixiert, aufgebracht und beobachtet unter einem konfokalen Mikroskop, wie oben unter Stoffe und Methoden beschrieben. Man führte eine Reihe Z von optischen Schnitten mit Inkrementen von 0,5 μm durch und erhielt in Sequenzart die Meßergebnisse von Emission des Fluoreszeins und des Rhodamins von der gleichen Zelle. Jedes Bild zeigt einen medialen optischen Schnitt einer repräsentativen Zelle: Fluoreszein oder Rhodamin. Strich: 10 nm.
- Zu diesem Zweck wurden während 19 Stunden bei 37°C mit CA-Partikeln, die mit Fluoreszein markiert waren, B-Lymphozyten inkubiert, die durch EBV transformiert waren und vom Spender "Be" stammten. In den intrazellularen Vesikeln wurden CA-Partikeln gefunden, was zeigt, daß sie sich tatsächlich im Inneren der Zellen befinden. Um weiter im Einzelnen den Mechanismus zu untersuchen, der für die Internalisierung synthetischer Vektoren verantwortlich ist, wurde die Kinetik des Eintritts untersucht, und sie wurde verglichen mit der von Transferrin, das als Indikator für die von einem Rezeptor vermittelte Endozytose verwendet wird. Die Zellen wurden durch das Transferrin rasch internalisiert, was man leicht in den intrazellularen Vesikeln sieht. Dagegen wurden die fluoreszierenden Vektoren CA, BVSM oder NPS selten im Inneren der Zellen bei Inkubationszeiten unter drei Stunden beobachtet. Im Gegensatz zum Transferrin werden die fluoreszierenden Partikeln in Form von Flecken oder Hauben großer Abmessungen an der Oberfläche der Zellen angesammelt. Nach Verlauf von 5, 7 und 19 Stunden bei 37°C zeigten die meisten Zellen CA-Partikel in den in trazellularen Abteilungen, obgleich die zellularen Organellen sich verschieden zeigten von denen, welche das internalisierte Transferrin enthielten. Man erhielt analoge Ergebnisse bei der Untersuchung von Zellen, die von der B-Zelllinie Raji des Burkitt-Lymphoms stammten.
- Unsere Ergebnisse haben gezeigt, daß die CA-Vektoren durch die CPA internalisiert wurden, indem sie sich langsam in den intrazellularen Kompartimenten ansammeln. Außerdem führt sowohl die Eintrittskinetik wie ihre intrazellulare Lokalisierung zu dem Gedanken, daß diese Partikel einem anderen Weg der Endozytose folgen als der Weg des Transferrins.
- Ein spezifischer Response von T-Zellen auf CD4+ wird in vitro verstärkt nach Anlagerung von GST-e4 an Nanopartikel
- Wir haben untersucht, ob das rekombinierte Fusionsprotein GST-e4, frei oder angelagert an Partikel, durch die CPA wirksam Klonen von T-Lymphozyten von CD4+ anti IE 1, mit Restriktion an DR3 und DR8 präsentiert werden kann. Die Ergebnisse eines Proliferationsresponses, der repräsentativ für den Klon BeA3 ist, in Gegenwart von PBL angelagert an HLA (
11 ) oder B-Lymphozyten (12 ) sind dargestellt. Man erhielt entsprechende Ergebnisse mit dem Klon FzD11. Keinerlei Proliferation von T-Zellen wurde beobachtet, wenn man leere Partikel oder an GST angelagerte Partikel in Gegenwart oder Abwesenheit von PBL (11B ) und von B-Lymphozyten (12B ) inkubierte. Dagegen wurde die besondere Fähigkeit von GST-e4, die Proliferation von Klonen stimulieren, mit allen Typen von Vektoren verstärkt. Wenn man als CPA die PBL verwendete, erreichte dieser Adjuvans-Effekt das 5- bis 25-fache. Bemerkenswerterweise benötigt man eine bis zu 25-fach geringere Menge von Proteinen in komplexer Form (CA), um einen Proliferationsresponse von einer Stärke entsprechend derjenigen zu erhalten, die man mit dem freien Antigen erhält (11A ). Bei Verwendung der B-Lymphozyten zur Präsentation des besonderen Antigens (12A ) war die Wirkung von gleicher Größenordnung wie die mit den PBL beobachtete. Um festzustellen, ob die Bindung des Antigens an das Partikel eine notwendige Vorbedingung für diese Wirkung ist, wurden gleichzeitig leere CA und lösliches Antigen den Zellen zugesetzt. Unter diesen Bedingungen wurde die Potenzierung auch noch beobachtet, jedoch viel geringer (2-fach), was möglicherweise auf eine rasche Anlagerung des Antigens an die Vektoren zum Zeitpunkt ihrer Einführung in die Vertiefungen der Kultur zurückzuführen ist, da die Gesamtfixierung des GST-e4 an den Partikeln in einer Stunde bei 4°C realisiert wurde (Stoffe und Methoden). - Bibliographie
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Claims (27)
- Verfahren zur Erhöhung der Immunogenität eines Antigens, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen durch ionische und/oder hydrophobe Bindungen an einen Partikelvektor angelagert ist, wobei der besagte Vektor entweder (i) aus einem hydrophilen, nicht flüssigen Kern oder (ii) einem hydrophilen, nicht flüssigen Kern mit einer äußeren Phospholipidschicht oder (iii) einem hydrophilen, nicht flüssigen Kern mit einer äußeren Fettsäureschicht besteht.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor aus einem hydrophilen, nicht flüssigen Kern besteht.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor aus einem hydrophilen, nicht flüssigen Kern mit einer äußeren Schicht natürlicher oder synthetischer Phospholipide besteht.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor aus einem hydrophilen, nicht flüssigen Kern mit einer äußeren Fettsäureschicht besteht.
- Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die äußere Schicht des Vektors aus natürlichen Fettsäuren besteht, die am Kern durch kovalente Verbindungen fixiert sind.
- Verfahren nach einem beliebigen der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Kern aus einer natürlich oder chemisch vernetzten Polysaccharid- bzw. Oligosaccharidmatrix besteht.
- Verfahren nach einem beliebigen der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ionische Liganden auf den Kern gepfropft sind.
- Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der ionische Ligand sich mindestens auf eine innerhalb der Gruppe gewählte Funktion stützt, die ausgewählt ist aus der Gruppe: Phosphate, Sulfate, Carbonsäuren, quarternäres Ammonium, sekundäre Amine, primäre Amine.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen an den Partikelvektor durch ionische Bindungen angelagert ist.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen an den Partikelvektor durch hydrophobe Bindungen angelagert ist.
- Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen an den Kern des Partikelvektors angelagert ist.
- Verfahren nach einem der beliebigen der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen an die äußere Schicht des Partikelvektors angelagert ist.
- Produkt, das durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 hergestellt werden kann, das eine Anlagerung eines Antigens aufweist, das durch ionische und/oder hydrophobe Bindungen mit einem Partikelvektor verbunden ist, der entweder (i) aus einem hydrophilen, nicht flüssigen Kern oder (ii) einem hydrophilen, nicht flüssigen Kern mit einer äußeren Phospholipidschicht oder (iii) einem hydrophilen, nicht flüssigen Kern mit einer äußeren Fettsäureschicht besteht, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Protein des CMV ist.
- Produkt nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen das Fragment e4 des Proteins IEI des CMV ist.
- Produkt nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment e4 an die Glutathion-S-transferase angelagert ist.
- Produkt nach einem beliebigen der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen durch ionische Bindungen mit dem Partikelvektor verbunden ist.
- Produkt nach einem beliebigen der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen durch hydrophobe Bindungen mit dem Partikelvektor verbunden ist.
- Produkt nach einem beliebigen der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Partikelvektor aus einem hydrophilen, nicht flüssigen Kern besteht.
- Produkt nach einem beliebigen der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Partikelvektor aus einem hydrophilen, nicht flüssigen Kern mit einer äußeren Phospholipidschicht besteht.
- Produkt nach einem beliebigen der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Partikelvektor aus einem hydrophilen, nicht flüssigen Kern mit einer äußeren Fettsäureschicht besteht.
- Einsatz eines Partikelvektors zur Herstellung eines Medikaments, das zur Erhöhung der Immunogenität eines Antigens dient, wobei der besagte Partikelvektor entweder (i) aus einem hydrophilen, nicht flüssigen Kern oder (ii) einem hydrophilen, nicht flüssigen Kern mit einer äußeren Phospholipidschicht oder (iii) einem hydrophilen, nicht flüssigen Kern mit einer äußeren Fettsäureschicht besteht, und das Antigen an den besagten Partikelvektor durch ionischen und/oder hydrophobe Bindungen angelagert ist.
- Einsatz nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen durch ionische Bindungen mit dem Partikelvektor verbunden ist.
- Einsatz nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen durch hydrophobe Bindungen mit dem Partikelvektor verbunden ist.
- Einsatz nach einem beliebigen der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Partikelvektor aus einem hydrophilen, nicht flüssigen Kern besteht.
- Einsatz nach einem beliebigen der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Partikelvektor aus einem hydrophilen, nicht flüssigen Kern mit einer äußeren Phospholipidschicht besteht.
- Einsatz nach einem beliebigen der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Partikelvektor aus einem hydrophilen, nicht flüssigen Kern mit einer äußeren Fettsäureschicht besteht.
- Einsatz nach einem beliebigen der Ansprüche 21 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß das besagte Medikament ein Impfstoff ist.
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