Hintergrund der Erfindung
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Die Erfindung betrifft im allgemeinen Verfahren zur
Herstellung kovalent gebundener, hydrophiler Überzüge
auf hydrophoben Oberflächen.
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Chromatographischen Materialien auf der Basis von
Polystyroldivinylbenzol (PS-DVB) wie die von der Firma
PerSeptive Biosystems (Cambridge, MA) hergestellten
POROS(Warenzeichen)-Materialien erwiesen sich bei der
Trennung von Makromolekülen als geeignet. U. S.
-Patentschrift Nr. 5 019 270 (1991). Allerdings ist der
natürliche hydrophobe Charakter von
Kohlenwasserstoffbasierenden chromatographischen Trägermaterialien wie
PS-DVB für ihre Verwendung bei Protein-Trennungen ein
cfravierender Nachteil. Boardman und Patridge,
Biochem. J., 59: 543 (1955). Die hydrophoben
Wechselwirkuncfen zwischen Träger und Proteinen sind stark genug, so
daß die Proteine entweder bei der Adsorption oder
während der Elution denaturiert werden können. Zudem sind
PS-DVB-Chromatographieträger schwer zu derivatisieren,
da sie keine aktiven funktionellen Gruppen zur direkten
Derivatisierung besitzen. Frechet et al., "Future
Trends in Polymer Science and Technology", E.
Martuscelli, Ed., Technomic Publishing Co., Inc., Basel,
1.987.
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Die aromatischen Ringe der Monomeren wurden bereits vor
der Polymerisation unter Herstellung diverser
funktioneller für Protein-Trennungen nicht geeigneter PS-DVB-
Packmaterialien derivatisiert. Frechet et al.,
Pure&Appl. Chem., 60: 353 (1988). Die an die Ringe
angeknüpften funktionellen Ringe können die Oberfläche von
PS-DVB nicht maskieren, und die hydrophoben Reste der
Proteine können immer noch mit der hydrophoben
Oberfläche wechselwirken. PS-DVB-Perlen wurden durch Anknüpfen
hydrophiler funktioneller Gruppen sowohl an den
aromatischen Ring als auch an die Polymerskelette
modifiziert. Yang et al., Chromatographia, 20: 735 (1985),
Yang und Verzele, J. Chromatogr., 387: 197 (1987). Bei
Verwendung dieser modifizierten PS-DVB-Materialien
mußten der mobilen Phase während der Chromatographie
aufgrund der hydrophoben Wechselwirkungen allerdings
organische Lösungsmittel zugesetzt werden.
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Die Sulfonierung von PS-DVB und das anschließende
Überziehen mit Polyethylenimin nach Vernetzung und
Quaternisierung erzeugte ein starkes
Anionenaustauscher-Packmaterial. Rounds et al., J. Chromatogr., 397: 25 (1987).
Der Nachteil dieses Überzugs besteht darin, daß das
Polyamin-Polymere nur zur Herstellung von
Anionenaustauschern eingesetzt werden konnte. Die Herstellung eines
breiten Spektrums von PS-DVB-basierenden
Packmaterialien unter Verwendung dieser Überzug war unmöglich.
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Pharmacia (Uppsala, Schweden) stell funktionelle PS-
DVB-basierende Packmaterialien zur Protein-Trennung
unter dem Warennamen MONOBEADS durch gesetzlich
geschütz
te Verfahrensweisen her. Bei einigen Anwendungen wurde
ein Pfropfcopolymer von Polyoxyethylen und vernetzten
Polymeren wurde als Träger zur Bindung von Proteinen
konstruiert, allerdings wurde bisher über sehr wenige
chromatographischen Eigenschaften berichtet. E. Bayer,
deutsche Patentschrift Nr. DE 35 00 180 (1986) und
U.S. -Patentschrift Nr. 4 908 405 (1990)
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Auf einem hydrophoben polymeren Träger wie PS-DVB
wurden Moleküle eines gelösten Stoffes, der hydrophile und
hydrophobe Bereich aufweist, adsorbiert und unter
Herstellung eines hydrophilen Überzuges auf dem Träger
vernetzt. U. S. -Patentschrift Nr. 5 030 352 (1991). Die
Vernetzung und Polyrnerisation von Epichlorhydrin und
Glycidol wurde beschrieben. Auch über die Bildung eines
vernetzten Überzugs von Glycidylmethacrylat, das auf
PS-DVB adsorbiert ist, und die anschließende
Derivatisierung des Überzugs mit Methacrylsäure in Gegenwart
von Ammoniumpersulfat und Tetramethylenethylendiamin
wurde beschrieben. Die Literatur offenbart, daß die
Moleküle des Überzugs untereinander unter Bildung einer
kontinuierlichen Schicht chemisch vernetzt werden und
daß die vernetzte Schicht durch hydrophobe-hydrophobe
Wechselwirkung an der PS-DVB-Oberfläche adsorbiert ist.
Die Literatur versäumte es darauf hinzuweisen, daß sich
zwischen Überzug und PS-DVB kovalente Bildungen
ausbildeten.
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Eine Aufgabe der Erfindung besteht in der
Bereitstellung von Verfahren zur Bildung kovalenter Bindungen
zwischen den hydrophilen Überzügen und der Oberfläche
hydrophober Materialien wie PS-DVB. Eine weitere
Aufga
be der Erfindung besteht in der Bereitstellung
kovalenter hydrophiler Überzügen auf hydrophoben Oberflächen
wie PS-DVB-Polymeren, die zur Maskierung der
hydrophoben Oberflächen hydrophil genug sind und durch die sich
das Polymere bei der Protein-Trennung einsetzen läßt,
ohne daß es zu einer Protein-Denaturierung kommt. Eine
weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der
Bereitstellung kovalenter Überzüge, die leicht unter
Herstellung diverser unterschiedlicher funktioneller Gruppen
zur Verwendung bei verschiedenen chromatographischen
Anwendungen derivatisiert werden können.
Zusammenfassung der Erfindung
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Die Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung
hydrophiler kovalent an hydrophobe Oberflächen gebundener
Überzüge sowie durch das Verfahren hergestellte
Materialien bereit. Nach den erfindungsgemäßen Verfahren
können kovalente hydrophile Überzugen an die hydrophobe
Oberfläche von Polymeren wie PS-DVB gebunden werden,
damit die Polymere bei diversen chromatographischen
Anwendungen verwendet werden können.
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Bei einer Ausführungsform wird ein oberflächenreiches
Polymeres mit hydrophober Oberfläche, das ungesättigte
Gruppen besutzt, bereitgestellt. Auch eine erste
Polyglycidylmethacrylat- oder Methacrylsäure-freie
Verbindung, die einen hydrophoben Bereich enthält, der
kovalent und flexibel an einen hydrophilen. Bereich gebunden
ist, wobei der hydrophobe Bereich eine ungesättigte
Gruppe aufweist, wird bereitgestellt. Alternativ wird
die erste Verbindung Methacrylsäure-frei
bereitgestellt. Die hydrophobe Oberfläche wird mit einer
flüssigen, bezüglich der Oberfläche hydrophilen Phase, die
solvatisierte Moleküle der ersten Verbindung enthält,
zusammengebracht. Die Moleküle der Verbindung lagern
sich auf der hydrophoben Oberfläche ab, wobei die
hydrophoben Bereiche proximal zur Oberfläche ausgerichtet
und an ihr adsorbiert sind und die hydrophilen Bereiche
von der Oberfläche nach außen in die flüssige Phase
hineinragen. Sodann werden die ungesättigten Gruppen
des hydrophoben Bereichs der Moleküle der ersten
Verbindung mit den ungesättigten Gruppen auf der
hydrophoben Oberfläche unter Herstellung eines hydrophilen
kovalent an die Oberfläche des Polymeren gebundenen
hydrophilen Überzugs vorzugsweise über eine
Radikalreaktion vernetzt.
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Das hydrophile überzogene Polymere kann z. B. eine
chromatographische Matrix definieren. Bei einer
Ausführungsform kann die hydrophobe Oberfläche ein
Divinylbenzol-vernetztes Folystyrol(PS-DVB)-Polymeres
enthalten. Hochvernetzte PS-DVB-Packmaterialien weisen auf
ihrer Oberfläche nicht umgesetzt verbleibende
Doppelbindungen auf. Malinsky et al., J. Macromol. Sci. Chem.,
A5: 1071 (1971). PS-DVB-Polymere, die bei den
erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, enthalten
vorzugsweise ungesättigte Gruppen auf der Oberfläche des
Polymeren in einem Gehalt von wenigstens etwa
0,23 mmol/g. Bei der Bildung des kovalenten Überzugs
auf dem PS-DVB-Polymeren werden aktive Vinylgruppen auf
dem PS-DVB-Polymeren, die bei einigen
chromatographischen Anwendungen unerwünschte Additionsreaktionen
eingehen könnten, entfernt.
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Der hydrophile, kovalent an die hydrophobe Oberfläche
gebundene Überzug wird zur Maskierung der hydrophoben
Bereiche und der hydrophoben Oberfläche mit genügend
hydrophilen Gruppen konstruiert. Es können kovalente
hydrophile Überzüge aufgebaut werden, die in einem
breiten pH-Bereich, z. B. pH 2-12, stabil sind und die
die hydrophobe Oberfläche zur Verwendung für Protein-
Trennungen hydrophil genug gestalten. Die kovalenten
hydrophilen Überzüge besitzen eine Fransenstruktur mit
kovalenten hydrophilen Polymerketten, die die
hydrophobe Oberfläche des Polymeren vor einem Kontakt mit
Proteinen abschirmen und die Ladekapazität durch
Vergrößerung der verfügbaren spezifischen Oberfläche erhöhen.
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Die erste Verbindung enthält sowohl einen hydrophilen
als auch einen hydrophoben Bereich. Der hydrophobe
Bereich, der eine ungesättigte Gruppe enthält, wird an
die hydrophobe Oberfläche adsorbiert, was die
Vernetzung der ungesättigten Gruppe an der ersten Verbindung
mit der ungesättigten Gruppe auf der hydrophoben
Oberfläche erleichtert. Die erste Verbindung kann mehrere
hydrophile und mehrere hydrophobe Bereiche aufweisen.
Die hydrophilen Bereiche schirmen die hydrophobe
Oberfläche und die hydrophoben Bereiche ab, und die
hydrophoben Bereiche stellen funktionelle Gruppen bereit,
die unter Herstellung stationärer Phasen für
verschiedene chromatographische Anwendungen derivatisiert
werden können.
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Gegebenenfalls kann die erste Verbindung unter
Herstellung einer hydrophilen Gruppierung wie Hydroxyl,
Alde
hyd, Carbonsäure, Sulfonsäure oder quaternäres Amin zur
Erhöhung der Hydrophilie des Überzugs derivatisiert
werden. Zur Erleichterung der Derivatisierung des
Überzugs kann die erste Verbindung eine reaktive Gruppe wie
ein Hydroxyl aufweisen, die mit einer zweiten
Verbindung, die eine hydrophile Gruppierung aufweist,
kovalent umgesetzt werden. Bei einer Ausführungsform kann
die erste Verbindung modifizierten, durch Tosylierung
eines Teils der Alkoholgruppen des PVA und
anschließende Eliminierung unter Bildung von Doppelbindungen
gebildeten Polyvinylalkohol (PVA) enthalten. Der
modifizierte (PVA) ist geeignet, da er keine instabilen
Bindungen aufweist, sehr hydrophil und biologisch
verträglich ist, ungesättigte Gruppen enthält und leicht zu
derivatisierende Hydroxylgruppen aufweist.
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Bei einer Ausführungsform kann ein Hydroxyl der ersten
Verbindung, beispielsweise modifizierter PVA, mit
Glycidol derivatisiert werden. Mehrere Glycidolmoleküle
können unter Zugabe von Bortrifluoridetherat polymer an
das Hydroxyl der ersten Verbindung des Überzugs unter
Herstellung eines kovalenten Überzugs, das
Polymerketten mit mehreren Hydroxylen enthält, gebunden werden.
Die Hydroxyle des kovalent gebundenen Überzugs können
auch unter Herstellung mehrerer Carbonsäuregruppen
oxidiert werden. Bei einer anderen Ausführungsform kann
das Hydroxyl der ersten Verbindung auf dem Überzug mit
einer zweiten Verbindung, z. B. einem Epihalogenhydrin
wie Epibromhydrin, unter Herstellung eines endständigen
Halogenides, das mit einem Amin unter Herstellung eines
quaternären Amins umgesetzt werden kann, auf dem
kovalenten Überzug umgesetzt werden. Bei einer anderen
Ausführungsform kann die erste Verbindung
Po
ly(gylcidylmethacrylat), das frei ist von
Methacrylsäure, enthalten. Bei dieser Ausführungsform werden die
ungesättigten Gruppen des Poly(glycidylmethacralates)
mit den ungesättigten Gruppen der hydrophoben
Oberfläche des Polymeren unter Herstellung einer kovalenten
hydrophilen Überzug auf dem Polymeren umgesetzt. Die
Poly(glycicylmethacrylat)-Überzug kann unter
Herstellung einer hydrophilen Gruppierung wie Carbonsäure,
Sulfonsäure oder quaternäres Amin, z. B. durch Reaktion
der ungesättigten Gruppen der
Poly(glycidylmethacrylat)-Überzug mit einer ungesättigten Gruppe einer
zweiten Verbindung, die eine hydrophile Gruppierung
enthält, derivatisiert werden. Beispielsweise können
ungesättigte Gruppen der Poly(glycidylmethacrylat)-Überzug
mit einer ungesättigten Gruppe einer zweiten Verbindung
wie Acrylsäure,
2-Acrylamido-2-methyl-1-propansulfonsäure,
[3-(Methacryloylamino)propyl]trimethylammoniumchlorid, 2-Acrylamidoglycolsäure, Itaconsäure oder
Ethylvinylketon umgesetzt werden. Die Umsetzung einer
ungesättigten Gruppe von Poly(glycidylmethacrylat) mit
ungesättigten Gruppen des Polymeren und einer
ungesättigten Gruppe der zweiten Verbindung kann gleichzeitig
in einem Schritt durch eine freie radikalische Reaktion
durchgeführt werden. Kovalente
Poly(glycidylmethacrylat)-Überzugen auf der Oberfläche von PS-DVB können
also leicht synthetisiert und derivatisiert werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann demnach zum Aufbau
kovalenter hydrophiler Überzugen auf der Oberfläche
hydrophober PS-DVB-Polymere verwendet werden und zur
Behebung der Schwierigkeit der Bildung kovalenter
Bindungen zwischen Überzugen und den PS-DVB-Oberflächen. Das
erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen
Zusammensetzungen stellen ein hydrophiles beschichtetes
Polymeres bereit, das chemisch bei hohen und niedrigen
pH-Extrema stabil ist. Beschichtete Polymere werden
hergestellt, die leicht derivatisierbar sind und die in
einem breiten Bereich von chromatographischen
Anwendungen zur Herstellung von biologischen und anderen
Molekülen eingesetzt werden können.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Die Fig. 1A-1C stellen eine schematische Erläuterung
der Synthese einer hydrophilen Überzug, die kovalent an
die Oberfläche eines PS-DVB-Trägers gebunden ist, dar.
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Fig. 2 ist ein Reaktionsschema und erläutert die
Synthese von modifiziertem Polyvinylalkohol (PVA).
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Fig. 3 ist ein mögliches Reaktionsschema der
Vernetzung von modifiziertem PVA mit der Oberfläche eines PS-
DVB-Polymeren.
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Fig. 4 ist ein Reaktionsschema der Umsetzung eines
modifizierten PVA-beschichteten PS-DVB-Polymeren mit
Glycidol.
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Fig. 5 ist ein Reaktionsschema der Derivatisierung
einer PVA-beschichteten PS-DVB-Oberfläche unter
Herstellung von Carbonsäure-Gruppen unter Bildung eines
schwachen Kationen-Austauschers.
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Fig. 6 ist ein Reaktionsschema der Derivatisierung
einer PVA-beschichteten PS-DVB-Oberfläche zur Herstellung
quaternärer Amine unter Bildung eines starken Anionen-
Austauschers.
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Fig. 7 ist ein Reaktionsschema und erläutert die
Synthese von polymerem Glycidylmethacrylat.
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Fig. 8 ist ein Reaktionsschema der Reaktion von
Poly (glycidylmethacrylat) mit einer
PS-DVB-Polymeroberfläche.
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Die Fig. 9A und 9B sind ein mögliches
Reaktionsschema der Reaktion von PS-DVB mit
Poly(glycidylmethacrylat) und einer zweiten Verbindung, die eine
ungesättigte Gruppe und eine hydrophile funktionelle Gruppe
enthält.
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Die Fig. 10 und 11 sind graphische Darstellungen der
Peak-Höhe gegenüber der Injektionsanzahl in einer Reihe
von Protein-Adsorptionstests durch ein
Glycidolbehandeltes, PVA-beschichtetes PS-DVB-Polymeres.
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Fig. 12 ist eine graphische Darstellung des
Retentionsvolumen gegen die Ammoniumsulfat-Konzentration einer
Glycidol-behandelten PVA-Überzug auf PS-DVB.
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Fig. 13 ist eine graphische Darstellung des
Retentionsvolumens gegen die Ionenstärke von Phosphatpuffer
für Lysozym auf einem Glycidol-behandelten
PVAbeschichteten PS-DVB-Polymeren.
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Fig. 14 ist eine graphische Darstellung des
Retentionsvolumens gegen den pH-Wert für Lysozym auf einem
Glycidol-behandelten, PVA-beschichteten PS-DVB-
Polymeren.
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Fig. 15 ist ein Absorptionschromatogramm gegen die
Zeit bei einem Protein-Trenntest auf einem schwachen
Kationen-Austauscher mit einer Fließgeschwindigkeit von
1 ml/min.
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Fig. 15B ist ein Absorptionschromatogramm gegen die
Zeit bei einem Protein-Trenntest auf einem schwachen
Kationen-Austauscher bei einer Fließgeschwindigkeit von
4 ml/min.
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Fig. 16A ist ein Absorptionschromatogramm gegen die
Zeit bei einem Protein-Trenntest unter Verwendung eines
starken Anionen-Austauschers mit einer
Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min.
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Fig. 16B ist ein Absorptionschromatogramm gegen die
Zeit bei einem Protein-Trenntest unter Verwendung eines
starken Anionen-Auatauschers mit einer
Fließgeschwindigkeit von 4 ml/min.
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Fig. 17 ist eine graphische Darstellung der Peak-Höhe
(Absorptionsfähigkeit) gegen die Injektionsanzahl bei
einem Proteinadsorptionstest durch ein
Poly(glycidylmethacrylat)-beschichtete PS-DVB-Säule.
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Fig. 18 ist eine graphische Darstellung des
Retentionsvolumens gegen den pH-Wert für Ovalbumin und Lysozym
auf einer Poly(glycidylmethacrylat)-beschichteten PS-
DVB-Säule.
Ausführliche Beschreibung
A. Allgemeines
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Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung
hydrophiler Überzugen bereit, die kovalent an die
hydrophoben Oberflächen von Polymeren wie
Folystyroldivinylbenzol (PS-DVB) gebunden sind. Unter Anwendung der
erfindungsgemäßen Verfahren können hydrophile kovalent an
die hydrophoben Oberflächen gebundenen Überzugen
aufgebaut werden, die über einen breiten ph-Bereich stabil
sind und leicht derivatisierbar sind und bei einem
breiten Bereich von Protein-Trenntechniken angewandt
werden können.
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Zur Bildung der kovalenten hydrophilen Überzugen wird
ein Polymere mit einer hydrophoben Oberfläche, die eine
ungesättigte Gruppe aufweist, bereitgestellt. Eine
erste Verbindung wird ebenfalls bereitgestellt, die einen
hydrophilen und einen hydrophoben Bereich aufweist,
wo
bei der hydrophobe Bereich eine ungesättigte Gruppe
enthält. Bei einer Ausführungsform wird eine erste
Poly(glycidylmethacrylat)-freie Verbindung
bereitgestellt. Bei einer anderen Ausführungsform wird eine
erste Methacrylsäure-freie Verbindung bereitgestellt. Die
hydrophobe Oberfläche des Polymeren wird mit einer
flüssigen bezüglich der Oberfläche hydrophilen Phase,
die solvatisierte Moleküle der ersten Verbindung
enthält, zusammengebracht. Die Moleküle der ersten
Verbindung werden dabei auf der hydrophoben Oberfläche in
Orientierung mit ihren hydrophoben Bereichen, die in
Richtung der Oberfläche orientiert und darauf
adsorbiert sind und mit ihrem hydrophilen Bereich, der sich
von der Oberfläche in die flüssige Phase nach außen
erstreckt, orientiert, abgelagert. Die ungesättigte
Gruppe des hydrophoben Bereiches des Moleküls der ersten
Verbindung wird dann mit den ungesättigten Gruppen der
hydrophoben Oberfläche und der Herstellung einer
hydrophilen kovalent an die Oberfläche des Polymeren
gebundene hydrophile Überzug, z. B. über eine frei
radikalische Reaktion, vernetzt. Die Orientierung der
hydrophoben Bereiche, die die ungesättigte Gruppe enthalten
gegegenüber der hydrophoben Oberfläche, die eine
ungesättigte Gruppe enthält, erleichtert den
Vernetzungsschritt.
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Bei einer Ausführungsform können die hydrophilen
Überzugen kovalent an die Oberfläche von Polystyrol
gebunden sein, das mit Divinylbenzol (PS-DVB)-Teilchen
vernetzt ist. PS-DVB-Teilchen können durch in der Technik
beschriebene Verfahren hergestellt werden. (Siehe z. B.
Kun et al., J. PolmyerSci. PartC, Nr. 16, Seiten
1.457-1469 (1967); J. PolymerSci., Part A1, Bd. 6, Seiten
2689-2701 (1968) und Ugelstad, U. S. -Patentschrift
Nr. 4 186 120 (1980)). Diese und andere der Fachwelt
bekannte Techniken offenbaren die Bedingungen der
Emulsions- und Suspensionspolymerisation oder die in einer
Ugelstad Patentschrift offenbarte Hybrid-Technik, durch
die sich Polystyroldivinylbenzol-Teilchen herstellen
lassen. Nach dem Polymerisationsverfahren verbleiben
auf der PS-DVB-Oberfläche Doppelbindungen. Malinsky et
a. l., J. Macromol. Sci. Chem., A5: 1071 (1971). Der
Bruchteil des Divinylbenzols in dem Reaktionsgemisch kann
bei dem Polymerisationsverfahren erhöht werden, um die
mechanische Festigkeit von PS-DVB zu erhöhen und um die
Anzahl der Doppelbindungen zu erhöhen.
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Durch das erfindungsgemäße Verfahren können die
ungesättigten Gruppen der PS-DVB-Oberfläche mit einer
ungesättigten Gruppe eines hydrophoben Bereiches einer
Verbindung, die eine hydrophile Gruppe enthält, unter
Bildung einer hydrophilen kovalent an die
PS-DVB-Oberfläche gebundenen Überzug umgesetzt werden. Bei einer
Ausführungsform können die hydrophilen Überzugen kovalent
an perfusive POROS-PS-DVB-Teilchen (PerSeptive
Biosystems, Inc., Cambridge, MA) gebunden werden. Perfusive
PS-DVB-Teilchen sind in der U. S. -Patentschrift
Nr. 5 019 270 (1991.) beschrieben, deren Offenbarung
hiermit als Referenz mitumfaßt ist. Die Geometrien der
Poren der perfusiven PS-DVB-Teilchen sind zur
Bereitstellung einer hohen spezifischen Oberfläche zur
Wechselwirkung mit gelösten Stoffen und zur Zulassung sehr
hoher Fluidgeschwindigkeiten ohne einen
AuflösungsveriLust bei vielen chromatographischen Anwendungen
ausgelegt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform können
kovalent beschichtete POROS R/H-. und POROS R/M-perfusive
PS-DVB-Chromatographiematrixteilchen (PerSeptive
Biosystems, Inc., Cambridge, MA) hergestellt werden. Das H-
und M-Material enthält Teilchen von 10 um bzw. 20 um
Durchmesser. Die Dichte der oberflächlichen Vinyl-
Gruppen in diesen Produkten beträgt ungefähr
0,23 mmol/g, wie gemessen durch eine Quecksilberacetat-
Titrationsverfahren des bei Das, Anal. Chem., 26: 1086
(1954) offenbarten Typs. Diese Materialien sind demnach
bei der Durchführung geeignet, da sie eine hohe
Oberflächendichte ungesättigter Gruppen aufweisen.
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Durch das erfindungsgemäße Verfahren lassen sich
hydrophile Beschichten kovalent an die hydrophoben
Oberflächen von PS-DVB binden, die in einem breiten Bereich
von chromatographischen Bedingungen wie pH-Bereiche und
Ionen-Stärke stabil sind. Bei einer Ausführungsform
kann die hydrophile Überzug eine Fransenstruktur
aufweisen. Die Fig. 1A-1C erläutern schematisch den
Aufbau einer hydrophilen Überzug mit einer
Fransenstruktur, die kovalent an eine PS-DVB-Oberfläche
gebunden ist. Wie in Fig. 1A erläutert, wird ein Polymeres
mit hydrophoben und hydrophilen Bereichen in Lösung auf
der Oberfläche eines hydrophoben PS-DVB-Trägers
adsorbiert. Die hydrophilen Bereiche des Polymeren enthalten
hydrophile Gruppen, dargestellt durch die offenen
Kreise in Fig. 1. Die hydrophoben Bereiche, dargestellt
durch X des Polymeren sind auf der hydrophoben
Oberfläche über hydrophobe-hydrophobe Wechselwirkungen
adsorbiert. Ungesättigte Gruppen in dem hydrophoben Bereich
X des Polymeren werden dann durch eine freie
radikalische Reaktion mit ungesättigten Gruppen der Oberfläche
von PS-DVB unter Bildung einer kovalent gebundenen
hydrophilen Überzug umgesetzt, wie in Fig. 1B erläutert.
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Zur Erhöhung der Hydrophilie wird die Überzug dann
derivatisiert, so daß sie weitere hydrophile Gruppen
enthält. Zur Derivatisierung der Überzug können die
Reaktiven in Fig. 1 durch ein offenes Quadrat
dargestellten Gruppen der Polymer-Überzug mit einer Verbindung
umgesetzt werden, die weitere hydrophile Gruppen
(offerte Kreise) enthält. Dies erzeugt eine hydrophile
Überzug mit einer Fransenstruktur, die lange Polymer-Ketten
aufweist, die von der Oberfläche emporragen, wie in
Fig. 1C erläutert.
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Die hydrophile FransenÜberzug umhüllt die hydrophobe
Oberfläche und ist kovalent daran gebunden. Die
Polymer-Ketten, die die hydrophilen Gruppen aufweisen, sind
in der Überzug in einer Oberflächendichte vorhanden,
die zur wirksamen Maskierung der hydrophoben Oberfläche
und zur wesentlichen Eliminierung der hydrophoben
Wechselwirkung zwischen einer Protein-Lösung und Bereichen
der hydrophoben Oberfläche vorhanden. Die hydrophilen
Gruppen der Polymer-Ketten der FransenÜberzug können
z. B. ein Hydroxyl, Carbonsäure, quaternäres Amin oder
Sulfonsäure aufweisen. Hydrophile Überzugen können
demnach kovalent an hydrophobe Oberflächen von Polymeren
wie PS-DVB-Teilchen unter Herstellung von hydrophilen
beschichteten Teilchen gebunden werden, die bei einem
breiten Bereich von chromatographischen Anwendungen
eingesetzt werden können.
B. Modifizierte Polyvinylalkohol-basierende Überzugen
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Bei einer Ausführungsform kann eine erste Verbindung,
die modifizierten Vinylalkohol (PVA) enthält, kovalent
an die hydrophobe Oberfläche eines Polymeren wie
Polystyroldivinylbenzol (PS-DVB) unter Herstellung einer
kovalenten hydrophilen Überzug gebunden werden.
Modifizierte PVA-Moleküle können durch Tosylierung von
ungefähr einem Viertel der Hydroxyl-Gruppen des
Polyvinylalkohol (PVA)-Polymeren (75% hydrolysiert) unter
Herstellung guter Abgangsgruppen synthetisiert werden.
Anschließende wird t-Butoxid bei einer
Elminierungsreaktion unter Bildung ungesättigter Gruppen in den PVA-
Molekülen verwendet, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das
Reaktionsschema ist in Fig. 2 gezeigt. Bei der
Behandlung mit t-Butoxid in DMSO lieferten die tosylierten
sekundären Hydroxyl-Gruppen ausschließlich
Eliminierungsprodukte. Snider und Soho, J. Org. Chem., 29: 742
(1964). Wie in Fig. 2 erläutert, besitzt der
modifizierte Polyvinylalkohol einen hydrophilen Bereich, der
Hydroxyl-Gruppen enthält und einen hydrophoben Bereich,
der ungesättigte Gruppen enthält.
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Der modifizierte PVA kann zur Herstellung einer
kovalenten hydrophilen Überzug auf der hydrophoben
Oberflächen eines PS-DVB-Polymeren wie POROS RH (PerSeptive
Biosystems, Inc., Cambridge, MA) verwendet werden. Bei
dieser Ausführungsform werden PS-DVB-Polymerperlen
einer Lösung des modifizierten PVA, aufgelöst in einem
polaren Lösungsmittelsystem wie einem DMSO-Isopropanol-
Gemisch, zugesetzt, um die Adsorption der
Doppelbindungen der modifizierten PVA-Moleküle an die PS-DVB-
Oberfläche herbeizuführen, bis die Oberfläche von PS-
DVB vollständig beschichtet ist. Die Triebkraft ist die
Minimierung des hydrophoben Kontaktbereiches der hydro-
phoben Bereiche der modifizierten PVA-Moleküle und der
PS-DVB-Oberfläche mit dem polaren Lösungsmittel. Die
Hydroxyl-reichen hydrophoben Bereiche des modifizierten
PVA ragen im Gegensatz dazu in das Lösungsmittel
hinein. Im Gleichgewicht besitzen die adsorbierten
modifizierten PVA-Moleküle wahrscheinlich ein Schlingen- und
zugartiges Aussehen auf der PS-DVB-Oberfläche, wie in
Fig. 1A gezeigt. Die beschichteten PS-DVB-Perlen
können leicht in Wasser dispergiert werden.
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Das kovalente Vernetzen der ungesättigten Gruppen des
hydrophoben Bereiches der PVA-Moleküle mit den
ungesättigten Gruppen der POROSTM PS-DVB-Oberfläche kann bei
einer Ausführungsform durch eine freie radikalische
Reaktion unter Verwendung von Ammoniumpersulfat (APS) und
N,N,N',N' -Tetramethylethylendiamin (TEMED) in einem
wäßrigen Lösungsmittel unter Rückfluß durchgeführt
werden, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die kovalente
Bindung einer hydrophilen modifizierten PVA-Überzug an
einen PS-DVB-Träger ist schematisch in den Fig. 1A und
1B erläutert. Die Orientierung der ungesättigten
Gruppen in dem hydrophoben Bereich der modifizierten PVA-
Moleküle in der wäßrigen Lösung in Richtung der PS-DVB-
Oberfläche erleichtert die Reaktion. Kovalente
Bindungen können auch zwischen nebeneinander liegenden PVA-
Molekülen, die auf der PS-DVB-Oberfläche adsorbiert
sind, gebildet werden. Ein mögliches Reaktionsschema
des Vernetzungsprozesses ist in Fig. 3 gezeigt. Die
Verwendung von PVA ist zweckmäßig, da weitere
Derivati
sierungen über die Hydroxyl-Gruppen der Überzug
durchgeführt werden können.
C. Derivatisierung von modifizierten PVA-Überzugen
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Die Hydroxyl-Gruppen der kovalenten PVA-Überzug auf der
PS-DVB-Oberfläche können durch Umsetzung mit einer
zweiten Verbindung, die eine hydrophile Gruppierung
enthält, zur Erhöhung der Hydrophilie der Überzug
derivatisiert werden. Die Hydroxyl-Gruppen der PVA-Überzug
können derivatisiert werden, z. B. wie in Fig. 4
gezeigt, mit Molekülen von Glycidol über eine
Ringöffnungsreaktion mit Bortrifluoridetherat, wie in
Beispiel 1 beschrieben. Bei der Reaktion wird polymeres
Glycidol auf die Hydroxyl-Gruppen der Überzug über
Ether-Bindungen unter Herstellung einer gefransten
Oberfläche, die hydrophile Tentaceln aufweist, die von
der Oberfläche emporragen und schematisch in Fig. 1C
erläutert sind, gepfropft. Somit werden lange, fransige,
hydrophile Ketten, die mehrere Hydroxyl-Gruppen
enthalten, auf die kurzen hydrophilen Schleifen der
modifizierten PVA-Überzug gepropft. Dies verbessert die
Ladekapazität und Hydrophilie und maskiert wirksam eine
verbleibende hydrophobe Oberfläche. Die hydrophilen
Ketten, die Hydroxyl-Gruppen enthalten, maskieren die
hydrophobe Oberfläche des PS-DVB und erlauben eine
wirksamere Protein--Trennung. Die Glycidol-behandelte
PVA-Überzug ist hydrophil, neutral und in einem pH-
Bereich von 2-12 stabil.
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Modifizierte PVA-beschichtete PS-DVB-Polymere können
unter Bildung einer hydrophilen Überzug, die einen
Kationen- oder Anionen-Austauscher enthält, derivatisiert
werden. Hydrophil beschichtete POROS-Träger können
demnach synthetisiert werden, die die
Perfusionseigenschaften des unbehandelten POROS-Trägers beibehalten
und eine gute Leistung bei Protein-Trennungen zeigen.
Ein schwacher Kationen-Austauscher kann, wie in
Beispiel 1 beschrieben, hergestellt werden. Wie in Fig. 5
erläutert, können die Alkohol-Gruppen des
Glycidolbehandelten PVA-beschichteten PS-DVB mit Periodat und
Kaliumpermanganat unter Herstellung von Carbonsäure-
Gruppen unter Bildung eines schwachen
Kationen-Austauschers oxidiert werden. Die Matrix kann bei hohen
Fließgeschwindigkeiten, z. B. 4 ml/min. ohne
Auflösungsverlust verwendet werden.
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Bei einer anderen Ausführungsform kann das
modifizierte, PVA-beschichtete PS-DVB unter Bildung eines starken
Anionen-Austauschers derivatisiert werden. Ein starker
Anionen-Austauscher kann durch Einbau eines Halogens in
die PVA-Überzug und anschließenden Ersatz des Halogens
durch eine tertiäre Amin-Gruppe gebildet werden. Wie in
Fig. 6 erläutert, können die Hydroxyl-Gruppen der
modifizierten PVA-Überzug mit einem Epihalogenhydrin,
z. B. Epibromhydrin und einem Katalysator wie
Bortrifluoridetherat unter Herstellung kurzer halogenierter,
z. B. bromierter, Ketten in der PVA-Überzug reagiert
werden. Eine Substitutionsreaktion mit einem
nucleophilen Amin wie Dimethylethanolamin erzeugt dann
quaternäre Amine auf der Überzug, wie in Beispiel 1
beschrieben.
D. Poly(glycidylmethacrylat)-Überzugen
-
Bei einer anderen Ausführungsform können die
ungesättigten Gruppen auf der Oberfläche eines hydrophoben
Polymeren wie PS-DVB mit einer ersten Verbindung, die
Poiy(glycidylmethacrylat), das frei ist von
Methacrylsäure, unter Bereitstellung einer kovalenten, hydrophilen
Überzug auf der Oberfläche des PS-DVB umgesetzt werden.
Polymeres Glycidylmethacrylat wird aus
Glycidylmethacrylat über eine Ringöffnungspolymerisationsreaktion,
die durch ein Bortrifluoridetherat katalysiert wird,
wie z. B. in der U. S. -Patentschrift Nr. 5 030 325 (1991)
beschrieben, hergestellt. Das Reaktionsschema ist in
Fig. 7 gezeigt. Das resultierende Polymere besitzt
eine Polyether-Hauptkette mit Methacrylat-Gruppen an
jeder Wiederholungseinheit.
Plasma-Desorptionsmassenspektrometrie (PDMS)-Analyse des polymeren
Glycidylmethacrylat-Produktes zeigte, daß die Reaktion ein
Gemisch von Polymethacrylaten mit Kettenlängen von 3 bis
15, überwiegend 4 bis 11 hauptsächlich in linearer Form
statt in cyclischer Strukturen erzeugte.
-
Das PS-DVB wird einem Lösungsmittelgemisch von Wasser-
Isopropanol oder Wasser-PEG, das solvatisierte
Poiy(glycidylmethacrylat)-Moleküle enthält, zugesetzt.
Letzteres wird aufgrund der niedrigeren Viskosität und
der Neigung zu einer besseren Überzug bevorzugt. Kurzes
Entgasen und Ultraschallbehandeln sind zur
Dispergierung des PS-DVB in dem Lösungsmittelsystem, zur
Entfernung der in den Poren eingeschlossenen Luft und zum
Eindringenlassen des Polymeren in die Poren, notwendig.
-
In dem Lösungsmittelsystem orientieren sich die
Poiy (glycidylmethacrylat)-Moleküle mit ihren hydrophoben
Bereichen, die eine ungesättigte Gruppe enthalten, in
Richtung der hydrophoben Oberfläche von PS-DVB, was die
Reaktion erleichtert. Die Synthese von
Poly(glycidylrnethacrylat) und die Adsorption an PS--DVB unter Bildung
einer nicht kovalenten Überzug ist in der U. S.
-Patentschrift Nr. 5 030 352 (1991) beschrieben, deren
Offenbarung hiermit als Referenz mitumfaßt ist. Die Referenz
zeigt, daß die nicht kovalente
Poly(glycidylmethacrylat)-Überzug durch Umsetzung mit Methacrylsäure in
Gegenwart von Ammoniumpersulfat und TEMED derivatisiert
werden kann. Allerdings offenbart die Referenz nicht,
daß kovalente Bindungen zwischen der vernetzten
Poly(glycidylmethacrylat)-Überzug und der
PS-DVB-Oberfläche gebildet werden.
-
Die ungesättigten Gruppen des hydrophoben Bereiches des
Poly(glycidylmethacrylates) können anschließend mit
undesättigten Gruppen der PS-DVB-Oberfläche über eine
radikalische Vernetzungsreaktion vernetzt werden, was in
higur 8 gezeigt ist. Die radikalische
Vernetzungsreaktion kann in einer wäßrigen Lösung von
Ammoniumpersulfat (ABS) und TEMED durchgeführt werden. Die Vernetzung
der einzelnen Polymer-Ketten tritt ebenfalls auf.
Styrol und Methacrylate wurden über eine freie
radikalische Polymerisation copolymerisiert. H. R. Allcock und
F. W. Lampe, "Contemporary Polymer Chemistry", 2. Bd.,
Prentice-Hall Inc., 1990. Das beschichtete PS-DVB wurde
durch chromatographische Methoden bewertet und seine
Hydrophilie gezeigt. Bei der Reaktion reagieren die
Vinyl-Gruppen des PS-DVB-Polymeren unter Bildung von
FCohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen, was nicht umgesetzte
Vinyl-Gruppen in dem Polymeren eliminiert. Dies ist
zweckmäßig, da sich herausgestellt hat, daß Vinyl-
Gruppen die chromatographische Leistung von PS-DVB-
Polymeren verschlechtert, da sie unter einigen
Bedingungen Additionsreaktionen eingehen können. Das,
Anal. Chem:, 26: 1086 (1954).
-
Durch Hydrolyse der Poly(glycidylmethacrylat)-Überzug
in starker Base und anschließender Titration der
Carboxyl-Gruppen, die kovalent an PS-DVB gebunden sind,
hat sich herausgestellt, daß die Dichte der
Carbonsäure-Gruppen auf der PS-DVB-Oberfläche ungefähr
8,1 mmol/g beträgt. Dies zeigte, daß sich zwischen der
Poly(glycidylmethacrylat)-Überzug und dem PS-DVB-
Polymeren in dem Vernetzungsschritt Kohlenstoff-
Kohlenstoff-Bindungen bilden.
E. Derivatisierung von Poly(glycidylmethacrylat) -
Überzugen
-
Das Poly(glycidylmethacrylat)-beschichtete PS-DVB kann
durch Umsetzung mit einer zweiten Verbindung
derivatisiert werden, die eine hydrophile Gruppierung enthält
unter Herstellung einer Vielzahl von derivatisierten
beschichteten Polymeren. Die Reaktion von
Poly(glycidylmethacrylat) mit der PS-DVB-Oberfläche sowie mit
einer zweiten Verbindung, die eine hydrophile Gruppe
enthält, kann in einer Stufe erfolgen, wie in den
Fig. 9A und 9B gezeigt. Die zweite Verbindung enthält
eine ungesättigte Gruppe, die mit einer ungesättigten
Gruppe des Poly(glycidylmethacrylates) reagiert. Die
zweite Verbindung enthält auch eine funktionelle Gruppe
(als Symbol PS), die als stationäre Phase geeignet ist
und hydrophil ist.
-
Beispielsweise kann
Poly(glycidylmethacrylat)-beschichtetes PS-DVB mit einer zweiten Verbindung wie
Acrylsäure zum Einbau von Carbonsäure-Gruppen in die
Überzug unter Bildung eines schwachen
Kationen-Austauschers umgesetzt werden. Bei der Umsetzung werden
die ungesättigten Gruppen des
Poly(glycidylmethacrylates) mit ungesättigten Gruppen der Acrylsäure-Moleküle
umgesetzt. Das Vernetzen von PS-DVB mit
Poly(glycidylmethacrylat) und von Poly(glycidylmethacrylat) mit
Acrylsäure kann in einem Schritt mit einem
Radikalstarter erfolgen.
-
Bei einer anderen Ausführungsform wird ein starkes
Kationen-Austauschersorbenz durch Umsetzung der
ungesättigten Gruppen des Poly (glycidylmethacrylat)
-beschichteten PS-DVB mit ungesättigten Gruppen einer
zweiten Verbindung,
2-Acrylamido-2-methyl-1-propansulfonsäure, durch eine freie radikalische Reaktion
synthetisiert. Die
2-Acrylamido-2-methyl-1-propansulionsäure enthält eine hydrophile Sulfonsäure-Gruppe und
eine Doppelbindung. Alternativ kann die zweite
Verbindung 2-Acrylamidoglycolsäure enthalten, die beim
Vernetzen mit der Überzug einen schwach sauren Kationen-
Austauscher bildet. Itaconsäure, die zwei Carbonsäure-
Gruppen enthält, kann ebenfalls zur Herstellung eines
schwachen Kationen-Austauschermaterials verwendet
werden. Zur Bildung eines starken Anionen-Austauschers
kann die zweite Verbindung
[3-(Metha-cryolylamino)pro
pyl]trimethylammoniumchlorid enthalten. Alternativ kann
die zweite Verbindung jede funktionelle Gruppe
enthalten, die als chromatographische stationäre Phase
geeignet ist. Zur Bildung von Chromatographiematerialien mit
hydrophober Wechselwirkung (HIC) kann die zweite
Verbindung beispielsweise Ethylvinylketon enthalten.
-
Sämtliche derivatisierten Poly(glycidylmethacrylat)-
Überzugen besitzen eine fransige Oberfläche und eine
außergewöhnlich hohe Protein-Ladekapazität. Die
dynamische Ladekapazität der Kationen-Austauscher für Lysozym
beträgt 80 mg/g bis 144 mg/g und die dynamische
Ladekapazität für die Anionen-Austauscher für
Rinderserumalbumin betrug ungefähr 90 mg/g.
-
Somit ermöglichen es die hier offenbarten Methoden, daß
hydrophile Überzugen auf hydrophoben Oberflächen wie
PS-DVB hergestellt werden, die für einen breiten
Bereich von chromatographischen Bedingungen stabil sind
und die zur Verwendung in einem breiten Bereich von
chromatographischen Anwendungen derivatisiert werden
können. Bei einer Ausführungsform können kovalente
Überzugen auf hydrophoben perfusiven PS-DVB-Teilchen
unter Herstellung einer hydrophilen beschichteten
chromatographischen Matrix mit außergewöhnlicher
Ladekapazität aufgebaut werden, die es ermöglicht, daß Proteine
und andere Moleküle schnell bei hohen
Fließgeschwindigkeiten getrennt werden.
Beispiel 1: Modifiziertes PVA-beschichtetes PS-DVB
Synthese von modifiziertem PVA
-
Polyvinylalkohol (Aldrich, Milwaukee, WI; MW 2000, 75%
hydrolysiert, 1,02 g) wurde in 20 ml trockenem DMSO
aufgelöst, wozu p-Toluolsulfonylchlorid (Aldrich, 99%,
2, 48 g, 0, 013 mol) trockenes Pyridin (Aldrich, 0,5 ml)
und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) (Aldrich, 99%,
0,02 g) gegeben wurden. Das Gemisch wurde unter einer
Stickstoff-Atmosphäre 24 h bei Raumtemperatur gerührt.
Mehrere Tropfen Hexan wurden sodann zugetropft, um das
Polymere auszufällen, das anschließend filtriert und
Diethylether gewaschen wurde, schließlich wurde das
Polymere unter Vakuum getrocknet. Destilliertes N,N'-
Diisopropylethylamin (Aldrich, 1,2 ml) und Kalium-t-
butoxid (Aldrich, 1,46 g) wurden in 20 ml trockenem
DSMO vermischt und diese Lösung wurde in das
Reaktionsgemisch der ersten Reaktion über eine Spritze
übergeführt. Das Gemisch wurde 12 h bei Raumtemperatur
gerührt und anschließend 2 h bei 50ºC erhitzt. Zur
Isolierung des Produktes wurde das modifizierte Polymere
durch Zugabe mehrerer Tropfen n-Hexanen ausgefällt,
filtriert und mit 10 ml Hexanen gewaschen und
schließlich unter Vakuum getrocknet.
Synthese von modifiziertem PVA-beschichteten PS-DVB
-
Das Endprodukt der PVA-Modifikationsreaktion wurde in
einen 50 ml Rundkolben übergeführt und in 20 ml DMSO
gelöst. Isopropanol wurde zugegeben, bis die Lösung
leicht trübe wurde. POROS R/H Packmaterial (10 micron
Teilchengröße, PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA
1,5 g) wurde diesem Gemisch zugesetzt. Nach Entgasen
und kurzem Ultraschallbehandeln wurde das Gemisch 24 h
bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurde das
Packmaterial filtriert und in 40 ml Wasser
redispercriert. Nach Entgasen und Ultraschallbehandeln wurde APS
(Aldrich, 0,92 g) und TEMED (Bio-Rad, Richmond, CA)
(40 ul) zugesetzt und die Suspension wurde unter
sanftem mechanischem Rühren 20 h unter Rückfluß erhitzt.
Kaliumhydroxid (2,24 g) wurde dem Gemisch zugesetzt und
die Reaktion wurde unter Rückfluß für weitere 4 h
fortgesetzt. Das Packmaterial wurde abfiltriert und mit
Wasser, Methanol und Aceton gewaschen und unter Vakuum
getrocknet.
Glycidol-Behandlung von PVA-beschichtetem PS-DVB
-
Das PVA-beschichtete POROS R/H-Material (1,5 g) wurde
in 30 ml Dichlormethan, das 0,5 ml Glycidol (Aldrich)
enthielt, dispergiert. Das Gemisch wurde kurz entgast
und Ultraschallbehandeln. 2 ml Dichlormethan und 40 ul
Bortrifluoridetherat (Aldrich) caurden in einem
Teströhrchen gemischt und die Lösung tropfenweise der
Suspension unter konstantem Schwenken zugesetzt. Die
Reaktion wurde bei Raumtemperatur unter Schwenken für
20 min durchgeführt. Wasser (20 ml) wurde dem Gemisch
zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen und das
Packmaterial wurde filtriert und mit Wasser, Methanol und
Aceton bevor dem Trocknen unter Vakuum gewaschen.
-
Die Veresterung der Hydroxyl-Gruppen mit
Trifluoressigsäureanhydrid und die anschließende Mikroanalyse
zeigten, daß die Anzahl der Hydroxyl-Gruppen fast Sfach
anstieg, was nahelegte, daß die hydrophilen Ketten im
Durchschnitt 4-5 Einheiten lang waren.
-
Die Protein-Gewinnung des PVA-beschichteten POROSTM in
einer 50 · 4,6 mm-Säule nach Glycidol-Behandlung wurde
getestet. PS-DVB-Träger adsorbieren Proteine durch
hydrophobe Wechselwirkungen. Boardman and Patridge,
Biochem. J., 69: 543 (1955). Wiederholte Injektionen eines
Proteins sollten zu einer konstanten Peak-Höhe führen,
wenn die Adsorption von Proteinen nicht irreversibel
ist. Die Chromatographie wurde mit einem Varian 5000
gradienten Pumpsystem (Walnut Creek, CA) gekoppelt mit
einem Lamda-Max 481 variablen Wellenlängendetektor von
Waters (Milford, MA) durchgeführt. Die Proben wurden
mit einem Rheodyne (Cotati, CA) Injektorventil,
ausgestattet mit einer 20 ul-Schlinge, injeziert. Sämtliche
Trennungen wurden bei Umgebungstemperatur durchgeführt.
Die hydrophobe Adsorption von Protein-Lösungen (5 mg/ml
oder 1 mg/ml) von Cytochrom C, Ribonuclease A,
a-Chymotrypsinogen, Ovalbumin, Rinderserumalbumin und
Bacitracm (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) wurden getestet.
Die mobile Phase war 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7 bei
1 ml/min. mit einem Injektionsvolumen von 20 ul). Nach
jeder Injektion wurde die Säule mit 1%
Trifluoressigsäure gereinigt. Fig. 10 ist eine graphische
Darstellung der Peak-Höhe gegen die Injektionsanzahl für
diesen Test auf der Glycidin-behandelten modifizierten
PVA-Überzug. Wie in Fig. 10 erläutert, zeigten die
meisten Proteine keine oder eine geringe Adsorption.
-
Bei einem anderen Test wurde die Adsorption von Lysozym
bei 1% (w/v) und 0, 0001% (w/v) überprüft. Die
Ergebnisse sind in Fig. 11 gezeigt, die eine graphische
Darstellung der Peak-Höhe gegen die Injektionszahl ist.
Die Peak-Höhe war bei beiden Konzentrationen konstant,
was erläutert, das wenig oder keine Adsorption von
Lysozym auftrat. Da eine unbeschichtete POROS-Säule
derselben Größe 6400 ptg Lysozym adsorbieren konnte,
erläutert dies, daß die Glycidol-behandelte PVA-Überzug die
hydrophobe Wechselwirkung mit Proteinen im Vergleich zu
der unbeschichteten PS-DVB-Matrix wesentlich
verringerte. Die ausgefranste hydrophile Überzug maskiert
demnach die hydrophoben Gruppen auf dem PS-DVB und
verstärkt die chromatographische Leistung des
beschichteten Polymeren.
-
Die Hydrophilie des beschichteten Polymeren bei hoher
Ionenstärke wurde ebenfalls getestet. Fig. 9 ist eine
graphische Darstellung des Retensionsvolumens gegen die
Ammoniumsulfat-Konzentration der Glycidol-behandelten
PVA-Überzug für Rinderserumalbumin und Ovalbumin. Die
mobile Phase war Anmioniumsulfat in 0,01 M
Phosphatpuffer, pH 7 bei 1 ml/min. Fig. 12 erläutert, daß bei
hoher Ammoniumsulfat--Konzentration keine Änderung der
Flutionszeit für diese Proteine erfolgt. Dies zeigt,
daß bei hoher Ionenstärke keine hydrophobe
Wechselwirkung zwischen der Überzug und den Proteinen auftritt.
Die Glycidol-behandelte covalente PVA--Überzug ist
hydrophil auch bei hoher Tonenstärke.
-
Das Vorliegen von geladenen Gruppen auf der Oberfläche
der Glycidyl-behandelten PVA-Überzug wurde getestet.
Das Retensionsvolurnen der Proteine, Cytochrom C,
Ribonuclease A, α-Chymotrypsinogen, Ovalbumin,
Rinderserumalbumin und Bacitracin wurde bei pH 7 mit
Phosphatpuffer-Konzentrationen, die von 10 bis 500 mmol
variierten, getestet. Die Proteine zeigten keine Veränderung
des Elutionsvolumens, was nahelegt, daß keine ionische
Wechselwirkungen zwischen den Proteinen und der Überzug
besteht. Eine graphische Darstellung des
Retensionsvolumens gegen die Ionenstärke des Phosphatpuffers für
hysozym ist in Fig. 13 gezeigt. Das konstante
Elutionsvolumen über einen Bereich der Ionenstärke zeigt,
daß keine Säure-Gruppen auf der Oberfläche vorhanden
waren.
-
Die pH-Stabilität der Überzug wurde bei pH 2-12
überprüft. Konstante Elutionsvolumina für sowohl Säure als
auch basische Proteine (Cytochrom C, Ribonuclease A, α-
Chymotrypsinogen, Ovalbumine, Rinderserumalbumin und
Bacitracin) wurden über den gesamten pH-Bereich
erhalten. Fig. 14 ist eine graphische Darstellung des
Elutionsvolumens gegen den pH-Wert für Lysozym. Derselbe
Test wurde zweimal nach Waschen der Säule mit mobilen
Phasen von pH 2 und pH 12 24 h lang wiederholt.
Wiederum wurden dieselben Ergebnisse erhalten. Somit ist die
Überzug bei extremen pH-Werten stabil.
Herstellung eines schwachen Kationen-Austauschers
-
Die vicinalen Diole des Glycidoi-behandelten
PVAbeschichteten PS-DVB wurden durch Zugabe von
Kaliumperiodat (1,84 g, 8 mmol), Kaliumcarbonat (0,28 g,
2 mmol) und Kaliumpermanganat (0, 024 g, 0, 15 mmol) zu
1 l deionisiertem Wasser unter Schütteln zur Auflösung
der drei Komponenten oxidiert. Das Glycidol-behandelte
POROS-Packmaterial (1 g) wurde in 70 ml der
oxidierenden Lösung dispergiert und nach sorgfältigem Entgasen
und kurzer Ultraschallbehandlung wurde das Gemisch bei
Raumtemperatur 12 h geschüttelt. Anschließend wurde das
Packmaterial filtriert und sorgfältig mit Wasser
gewaschen. Der schwache Kationen-Austauscher besaß eine
statische Ladekapazität von 49 mg/g und eine dynamische
Ladekapazität von 44 mg/g. Die Säure-Base-Titration
zeigte, daß die Dichte der Carbonsäure-Gruppen
0,9 mmol/g betrug.
-
Fig. 15 zeigt die Trennung der Proteine Myoglobin (1),
Ribonuclease A (2), Cytochrom C (3) und Lysozym (4)
unter Verwendung des schwachen Kationen-Austauschers. Die
mobile Phase war: (A) 0,02 m Phosphatpuffer, pH 6,5;
und (B) A 0,5 M NaCl. Fig. 15A ist bei einer
Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min mit einem Gradienten von
0-100% B in 16 min erhaltenes Chromatogramm. Fig. 15B
ist ein bei einer höheren Fließgeschwindigkeit,
ml/min mit einem Gradienten von 0-100% B in 4 min
erhaltenes Chromatogramm. Fig. 15 zeigt, daß bei hoher
Geschwindigkeit der mobilen Phase kein
Auflösungsverlust auftrat. Bei einer Fließgeschwindigkeit von
ml/min wurde die Trennung der vier Proteine in
weni
ger als 3,5 min erreicht. Die meisten herkömmlichen
Ionenaustauscher erfahren einen Abfall in der Auflösung
bei einer Fließgeschwindigkeit von über 1 ml/min.
Afeyan et al., J. Chromatography, 519: 1 (1990).
Herstellung eines starken Anionen-Austauschers
-
Das PVA-beschichtete POROS R/H-Packmaterial (1 g) wurde
in 20 ml Dichlormethan dispergiert, entgast und kurz
einer Ultraschallbehandlung und anschließend der Zugabe
von Epibromhydrin (300 ul, Aldrich) unterzogen. Zwei ml
Dichlormethan und 30 ul Bortrifluoridetherat wurden in
einem Teströhrchem gemischt und diese Lösung wurde der
Packmaterial/Epibramhydrin-Suspension unter konstantem
Schwenken zugetropft. Die Reaktion wurde 20 min bei
Raumtemperatur unter Schwenken fortgesetzt. Das
Packmaterial wurde abfiltriert und mit Methanol und Aceton
gewaschen und schließlich unter Vakuum getrocknet. Das
bromierte POROS-Material wurde in 30 ml einer 10%igen
(v/v) Lösung von Dimethylethanolamin (Aldrich) in
Dimethylformamid (DMF) dispergiert. Nach Entgasen und
Ultraschallbehandeln wurde das Gemisch mechanisch 6 h bei
50ºC gerührt. Das Packmaterial wurde anschließend
abfiltriert und Methanol und Aceton vor dem Trocknen
unter Vakuum gewaschen. Der starke Anionen-Austauscher
besaß eine statische Ladekapazität von 50 mg/g und eine
dynamische Ladekapazität von 42 mg/g.
-
Die Trennung von Myoglobin (1), Conalbumin (2),
Ovalbumin (3) und Sojabohnentrypsin-Tnhibitor (4) wurde unter
Verwendung des starken Anionen-Austauschers und einer
mobilen Phase über eine 50 · 4, 6 mm Säule mit (A) 0, 01 M
Tris-HCl-Puffer, pH 8; und (B) A +0,05 M NaCl getestet.
Fig. 16A ist ein bei 1 ml/min mit einem Gradienten von
0-100%B in 16 min erhaltenes Chromatogramm. Fig. 16B
ist ein bei 4 ml/min mit einem Gradienten von 0-100%B
in 4 min erhaltenes Chromatogramm. Unter Verwendung des
starken Anionen-Austauschers konnten die vier Proteine
in weniger als 4 min getrennt werden. Somit behielt das
hydrophile beschichtete PS-DVB die Auflösung sogar bei
sehr hohen Fließgeschwindigkeiten bei.
Beispiel 2: Poly(glycidylmethacrylat)-beschichtetes PS-
DVB
Synthese von polymerem Glycidylmethacrylat
-
Ein ml frisch destilliertes Glycidylmethacrylat
(Aldrich) in 6 ml Dichlormethan wurde in einem 100 ml
Fundkolben vorgelegt. Fünf ul Bortrifluoridetherat in
2 ml Dichlormethan wurden anschließend der
Glycidylmethacrylat-Lösung langsam unter Rühren zugesetzt. Der
Fundkolben wurde in Aluminium-Folie eingeschlagen und
bei Raumtemperatur 24 h geschüttelt. 6 ml Wasser wurden
sodann zugesetzt, um die Reaktion zu beenden und
anschließend 4 ml Isopropanol. Dichlormethan wurde durch
Vakuumeindampfen aus dem Gemisch entfernt und etwa
16 ml einer Wasser/Isopropanol (70 : 30) Lösung wurden
zugesetzt, um das polymere Glycidylmethacrylat zu
erzeugen. Das Dichlormethan wurde durch Vakuumeindampfen
entfernt und das Polymere wurde mit drei 30 ml
Portionen Diethylether extrahiert. Die Extrakte wurden
verei
nigt über Wasser-freiem Natriumsulfat getrocknet und
filtriert. Diethylether wurde über Vakuumeindampfen
entfernt und das isolierte Polymere wurde unter
Hochvakuum getrocknet.
Synthese von Poly(glycidylmethacrylat)beschichtetem PS-
DVB
-
Ein Gramm POROS PS-DVB-Teilchen (PerSeptive BioSystems,
Cambridge, MA) mit einer Teilchengröße von 10 um und
einer Porengröße von 1000 A wurden dem Polymeren
Glycidylmethacrylat zugesetzt und nach kurzer
Ultraschallbehandlung und Entgasen wurde das Gemisch 24 h bei
Raumtemperatur geschüttelt. Nach Filtrieren und
dreimaligem Waschen mit 50 ml Wasser wurden die
Polymerbeschichteten PS-DVB-Perlen in einen Dreihalskolben
übergeführt. 30 ml 3% (w/v) Ammoniumpersulfat-Lösung
und 20 ul TEMED wurden zugesetzt. Nach dem Entgasen und
Ultraschallbehandlung wurde die Vernetzungsreaktion bei
Raumtemperatur 24 h unter Stickstoff durchgeführt. Die
beschichteten Polymer-Perlen wurden sorgfältig mit
Wasser und Methanol und Aceton gewaschen und getrocknet.
-
Ovalbumin, Rinderserumalbumin, Ribonuclease A,
Cyctochrom C und Lysozym (20 ul) wurden auf eine 50 · 4,6 mm
beschichtete Matrixsäule (1000 A, 10 um) mit einer
mobilen Phase von 0,05 M Phosphatpuffer bei pH 7,0 und
einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min aufgegeben. PS-
DVB-Träger adorbieren Proteine über hydrophobe
Wechselwirkungen. Boardman and Patridge, Biochem. J., 69: 543
(1955). Wiederholte Injektionen eines Proteins sollten
zu einer konstanten Peak-Höhe führen, wenn keine
irreversible Adsorption von Proteinen vorliegt. Die
Probenkonzentration betrug 0,5-1%. Die Ergebnisse sind in
Fig. 17 gezeigt, eine graphische Darstellung der Peak-
Höhe (Adsorption bei 280 nm UV) gegenüber der
Injektionszahl. Fig. 17 erläutert, daß der größte Teil der
getesteten Proteine keine Peak-Höhen-Zunahme zeigt,
außer Lysozym, was eine leichte Peak-Höhen-Zunahme von
der ersten zur zweiten Injektion zeigte. Dies bedeutet,
daß einige restliche hydrophobe Flecken noch vorhanden
waren.
-
Die chemische Stabilität der Überzug wurde durch Testen
des beschichteten Polymeren über den pH-Bereich von
2-10 bewertet. Fig. 18 ist eine graphische Darstellung
des Retentionsvolumens gegen den pH-Wert mit einer
mobilen Phase von 0,05 M Phosphatpuffer bei 1 ml/min für
Ovalbumin und Lysozym. Fig. 18 zeigt, daß über den
Bereich von pH 2-10 das Retentionsvolumen von Lysozym und
Ovalbumin konstant blieb, was bedeutet, daß die Überzug
in diesem pH-Bereich stabil ist.
Herstellung eines schwachen Ionen-Austauschers
-
Die beschichteten PS-DVB-Perlen wurden 30 ml 0,1%
(v/v) Acrylsäure-Lösung (Aldrich) zugesetzt und nach
Entgasen und Ultraschallbehandlung wurde 1 g
Ammoniumpersulfat zum Start der Vernetzung und Derivatisierung
zugesetzt. Die Reaktion wurde 23 h bei Raumtemperatur
durchgeführt, anschließend wurden 20 ul TEMED
zuge
setzt. Die Reaktion wurde von eine Stunde fortgesetzt.
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 ul Hydroquinon
gestoppt. Die Teilchen wurden mit Wasser, Methanol und
Aceton gewaschen und sodann filtriert und getrocknet.
Herstellung eines starken Kationen-Austauschers
-
Das Poly(glycidylmethacrylat)-beschichtete PS-DVB-
Packmaterial einer Porengröße von 1000 A und einer
Teilchengröße von 10 um wurde in 30 y.±l Wasser
dispergiert. Nach Entgasen und Ultraschallbehandeln wurden
0,45 g 2-Acrylamido-2-methyl-1-propansulfonsäure
(Aldrich) in dem Gemisch aufgelöst. APS (0,9 g) wurde
zugesetzt und das Gemisch wurde unter einer Stickstoff-
Atmosphäre 23 h mechanisch gerührt. 20 ul
Tetramethylethylendiamin (TEMED) wurden zugesetzt und die Reaktion
wurde noch eine Stunde fortgesetzt. Die Packmaterialien
wurden filtriert und mit Wasser, Methanol und Aceton
gewaschen.
Herstellung eines starken Anionen-Austauschers
-
Das Poly(glycidylmethacrylat)-beschichtete PS-DVB einer
Porengröße von 1000 A und einer Teilchengröße von 10 um
(1 g) wurde erneut in 30 ml Wasser dispergiert. Nach
Entgasen und Ultraschallbehandlung wurden 0,5 g [3-
(Methacryloylamino)propyl]trimethylammoniumchlorid
(Aldrich) und Ammoniumpersulfat (APS) (0, 9 g) mit dem
Gemisch vermischt. Das Gemisch wurde unter Stickstoff
23 h mechanisch gerührt, anschließend wurde TEMED
(20 ul) zugesetzt und die Reaktion wurde noch eines
Stunde gerührt. Das Packmaterial wurde filtriert und
mit Wasser, Methanol und Aceton gewaschen.
Herstellung eines schwachen Kationen-Austauschers
-
Das Poly(glycidylmethacrylat)-beschichtete Packmaterial
(1000 A, 10 um, 1 g) wurde in 30 ml Wasser wieder
aufgelöst. Nach Entgasen und Ultraschallbehandeln wurden
0,45 g 2-Acrylamidoglycolsäure (Aldrich) und APS
zugesetzt und das Gemisch wurde mechanisch unter
Stickstoff-Atmosphäre 23 h gerührt. 20 ul TEMED wurden
sodann zugesetzt und die Reaktion wurde noch eine Stunde
lang fortgesetzt. Die Packmaterialien wurden filtriert
und Wasser, Methanol und Aceton gewaschen.
-
Herstellung eines schwachen Kationen-Austauschers
1 g des Poly(glycidylmethacrylat)-beschichteten PS-DVB-
Packmaterials (POROS R/H, 10 um) wurden erneut in 30 ml
Wasser dispergiert. Nach Entgasen und
Ultraschallbehancieln wurde Itaconsäure (0, 03 g) und APS (0, 9 g)
zugesetzt und das Gemisch mechanisch unter einer
Stickstoff-Atmosphäre 23 h gerührt. TEMED (20 ul) wurde
sodann zugesetzt und die Reaktion noch eine Stunde
fortgesetzt. Diese Packmaterialien wurden filtriert und mit
Wasser, Methanol und Aceton gewaschen.
Herstellung von HIC-Packmaterial
-
Das Poly(glycidylmethacrylat)-beschichtete
PS-DVB-Polymere (1,5 g) wurde erneut in 40 ml Wasser dispergiert.
Nach Entgasen und Ultraschallbehandlung wurde frisch
destilliertes Ethylvinylketon (0, 08 ml) und 0, 5 ml THF
dem Gemisch zugesetzt. Die Reaktion wurde mit APS
gestartet und das Gemisch wurde mechanisch 23 h unter
einer Stickstoff-Atmosphäre gerührt. TEMED (30 ul wurde
zugesetzt und die Reaktion wurde noch eine Stunde lang
fortgesetzt. Die Packmaterialien wurden filtriert und
mit Wasser, Methanol und Aceton gewaschen.